香豆素β抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及香豆素 β抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在醫(yī)學(xué)上，癌是指起源于上皮組織的惡性腫瘤，是惡性腫瘤中最常見(jiàn)的一類(lèi)。相對(duì) 應(yīng)的，起源于間葉組織的惡性腫瘤統(tǒng)稱(chēng)為肉瘤。腫瘤是機(jī)體在各種致瘤因素作用下，局部組 織的細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控導(dǎo)致異常增生與分化而形成的新生物。新 生物一旦形成，不因病因消除而停止生長(zhǎng)，他的生長(zhǎng)不受正常機(jī)體生理調(diào)節(jié)，而是破壞正常 組織與器官，這一點(diǎn)在惡性腫瘤尤其明顯。與良性腫瘤相比，惡性腫瘤生長(zhǎng)速度快，呈浸潤(rùn) 性生長(zhǎng)，易發(fā)生出血、壞死、潰瘍等，并常有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，造成人體消瘦、無(wú)力、貧血、食欲不振、 發(fā)熱以及嚴(yán)重的臟器功能受損等，最終造成患者死亡。
[0003] 癌細(xì)胞的繁殖速度很快，遠(yuǎn)超過(guò)傳統(tǒng)藥物殺滅癌細(xì)胞的速度，因此，使用傳統(tǒng)藥 物，防止癌細(xì)胞擴(kuò)散效果并不明顯。放化療的時(shí)候射線(xiàn)殺死的是照射范圍內(nèi)的所有細(xì)胞，而 不僅是腫瘤細(xì)胞，也殺死人體的正常細(xì)胞。放、化療常見(jiàn)的毒副作用：惡心、嘔吐、腹瀉、脫 發(fā)、白細(xì)胞下降、放射性胃腸炎、肺纖維化、肝功能受損等。不少腫瘤病人并不是死于腫瘤本 身，而是死于放、化療引起的并發(fā)癥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了香豆素 β抑制腫瘤生長(zhǎng)的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明涉及香豆素 β抑制腫瘤生長(zhǎng)的應(yīng)用，所述癌細(xì)胞為MG-63骨肉瘤細(xì)胞、肺 腺癌細(xì)胞Α549、乳腺癌MCF-7、肝癌細(xì)胞HEPG2、膀胱癌細(xì)胞EJ、T24、人宮頸癌細(xì)胞HELA、人 結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、人胰腺癌細(xì)胞PANC-1、人乳腺癌細(xì)胞MDA。
[0006] 使用滅菌PBS配置lmg/ml的PBS香豆素 β溶液，選取各種癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng) 試驗(yàn)，使用ΜΤΤ方法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
[0007] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0008] 1、本發(fā)明的香豆素 β對(duì)實(shí)驗(yàn)用到的三種骨肉瘤細(xì)胞均有抑制作用，且均強(qiáng)于同 濃度下的臨床用藥甲氨蝶呤的抑制活性，香豆素 β對(duì)于MG-63的抑制活性最強(qiáng)，達(dá)到75% 左右。
[0009] 2、本發(fā)明的香豆素 β可以引起MG-63細(xì)胞的凋亡發(fā)生，并有濃度依賴(lài)性，主要引 起細(xì)胞進(jìn)入早期凋亡，由E，F(xiàn)可以看出香豆素 β對(duì)細(xì)胞周期無(wú)明顯影響。
[0010] 3、本發(fā)明的香豆素 β對(duì)肺腺癌細(xì)胞Α549系有最強(qiáng)的抑制作用，對(duì)人乳腺癌MCF-7 的抑制作用其次，對(duì)人肝癌細(xì)胞HEPG2、膀胱癌細(xì)胞EJ和Τ24有一點(diǎn)抑制作用，對(duì)人宮頸癌 細(xì)胞HELA、人結(jié)腸癌細(xì)胞ΗΤ29、人胰腺癌細(xì)胞PANC-1、人乳腺癌細(xì)胞MDA有輕微抑制活性。
[0011] 4、本發(fā)明的香豆素 β對(duì)這人成纖維細(xì)胞HSF、人肝星形細(xì)胞LX-2、人胚腎Τ細(xì)胞 293t、人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞huvec等四種人正常細(xì)胞的生長(zhǎng)影響不大，對(duì)HSF和LX-2有 輕微抑制。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為香豆素 β (ab)和對(duì)骨肉瘤的抑制作用圖；
[0013] 圖2為香豆素 Mab)對(duì)MG-63骨肉瘤細(xì)胞凋亡和周期的作用圖；
[0014] 圖3為香豆素 Mab)對(duì)癌細(xì)胞抑制作用圖；
[0015] 圖4為香豆素 β (AB)對(duì)正常細(xì)胞抑制作用圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的一種香豆素 β抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的應(yīng)用做進(jìn)一步的詳 細(xì)說(shuō)明。
[0017] 實(shí)施例1 :香豆素 β和對(duì)三種骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用
[0018] 骨肉瘤是一種多見(jiàn)于年輕人的惡性腫瘤，現(xiàn)在主要的治療方法是切除和放射治 療，還沒(méi)有成熟的化療方案，傳統(tǒng)的一線(xiàn)抗癌藥，如順鉑，對(duì)骨肉瘤的治療效果不理想，現(xiàn)在 臨床上主要使用甲氨蝶呤來(lái)進(jìn)行輔助治療。于是想使用從箭毒木分出來(lái)的新化合物香豆素 Μ本外檢測(cè)下其對(duì)骨肉瘤是否有細(xì)胞毒性。使用滅菌PBS配置lmg/ml的PBS香豆素 β溶 液，選取各種肺癌癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)，設(shè)置4個(gè)重復(fù)，使用ΜΤΤ方法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情 況，陽(yáng)性對(duì)照使用甲氨蝶呤，結(jié)果數(shù)據(jù)使用T-test分析差異顯著性，使用的細(xì)胞介紹如下。
[0019] 表1實(shí)驗(yàn)使用到的骨肉瘤亞型：
[0021] 結(jié)果由圖1可以看出，香豆素 β (ab)對(duì)實(shí)驗(yàn)用到的三種骨肉瘤細(xì)胞均有抑制作 用，且均強(qiáng)于同濃度下的臨床用藥甲氨蝶呤的抑制活性，香豆素 β對(duì)于MG-63的抑制活性 最強(qiáng)，達(dá)到75 %左右。
[0022] 實(shí)施例2:香豆素 β對(duì)的凋亡和細(xì)胞周期的影響
[0023] 由于香豆素 β對(duì)MG-63有最強(qiáng)的藥效，使用Annexin V-FITC/PI雙探針來(lái)檢測(cè)香 豆素 β對(duì)MG-63骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響。其檢測(cè)原理為：在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨 酸（phosphotidylserine，PS)位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS從細(xì)胞膜的 內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V (膜聯(lián)蛋白-V)與PS高親和力 結(jié)合?？赏ㄟ^(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。
[0024] 碘化丙啶（Propidium Iodide，PI)不能透過(guò)正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì) 胞膜，但可以透過(guò)凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此，將Annexin V與PI 聯(lián)合使用時(shí)，前者可以分辨活細(xì)胞（Annexin V-/PI-)和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-)， 而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被FITC和PI結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽(yáng)性（Annexin V+/PI+)。同 時(shí)通過(guò)70 %乙醇處理的細(xì)胞，PI可以透過(guò)細(xì)胞膜然后將核酸染色，通過(guò)流式細(xì)胞可以對(duì)細(xì) 胞內(nèi)染色體的數(shù)量進(jìn)行定量，以對(duì)細(xì)胞的周期情況進(jìn)行分析。
[0025] 將MG-63細(xì)胞均勻鋪于12孔板中，8小時(shí)后加入20 μ g/ml，40 μ g/ml，80 μ g/ml的 香豆素 β。48小時(shí)后，使用Annexin V-FITC/PI方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期的情況。結(jié)果如 下：
[0026] 如圖2所示，香豆素 Mab)對(duì)MG-63骨肉瘤細(xì)胞凋亡和周期的作用。圖中，A : MG_63control的凋亡情況。Β :5 μ g/ml香豆素 β處理MG-63細(xì)胞的凋亡情況。C :10 μ g/ ml香豆素 β處理MG-63細(xì)胞的凋亡情況。D :20 μ g/ml香豆素 β處理MG-63細(xì)胞的凋亡 情況。E :MG-63control的細(xì)胞周期情況。F :10 μ g/ml香豆素 β處理MG-63細(xì)胞的細(xì)胞周 期情況。G:香豆素 β處理MG-63細(xì)胞的細(xì)胞周期情況統(tǒng)計(jì)。
[0027] 由圖2可以看出，香豆素 β可以引起MG-63細(xì)胞的凋亡發(fā)生，并有濃度依賴(lài)性，主 要引起細(xì)胞進(jìn)入早期凋亡，由E，F(xiàn)可以看出香豆素 β對(duì)細(xì)胞周期無(wú)明顯影響。
[0028] 實(shí)施例3:香豆素 β對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用
[0029] 使用滅菌PBS配置lmg/ml的PBS香豆素 β溶液，選取各種貼壁癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞 生長(zhǎng)試驗(yàn)，設(shè)置4個(gè)重復(fù)，使用ΜΤΤ方法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，陽(yáng)性對(duì)照使用紫衫醇，結(jié)果數(shù)據(jù) 使用T-test分析差異顯著性，結(jié)果如圖3所示。
[0030] 其中，香豆素 β溶液濃度均為23. 6 μ mol (10 μ g/ml)，紫杉醇（toxal)濃度均為 11.8ymol(10μg/ml)〇
[0031] 由圖3可以看出，香豆素 β (ab)對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549系有最強(qiáng)的抑制作用，對(duì)人乳 腺癌MCF-7的抑制作用其次，對(duì)人肝癌細(xì)胞HEPG2、膀胱癌細(xì)胞EJ和T24有一點(diǎn)抑制作用， 對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HELA、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、人胰腺癌細(xì)胞PANC-1、人乳腺癌細(xì)胞MDA有輕微 抑制活性。
[0032] 實(shí)施例4:香豆素 β對(duì)普通細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用
[0033] 選取各種人正常細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，陽(yáng)性對(duì)照使用紫衫醇，設(shè)置4個(gè)重復(fù)，使用ΜΤΤ方 法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，結(jié)果數(shù)據(jù)使用T-test分析差異顯著性，結(jié)果如圖4所示。其中，香豆 素 β溶液濃度均為23. 6 μ mol (10 μ g/ml)，紫杉醇（toxal)濃度均為11. 8 μ mol (10 μ g/ ml)
[0034] 由圖4可以看出，香豆素 β (AB)對(duì)這四種人正常細(xì)胞（人成纖維細(xì)胞HSF、人肝星 形細(xì)胞LX-2、人胚腎T細(xì)胞293t、人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞huvec)的生長(zhǎng)影響不大，對(duì)HSF 和LX-2有輕微抑制，對(duì)另兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。
[0035] 香豆素 β抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的應(yīng)用，用于開(kāi)發(fā)治療骨肉瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、膀 胱癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等；香豆素 β治療癌癥的劑型包括但不僅限于散劑、片劑、顆 粒劑、膠囊劑、溶液劑、乳劑、混懸劑等。
[0036] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 香豆素β抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的香豆素β抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的應(yīng)用，其特征在于：所述癌細(xì)胞為 MG-63骨肉瘤細(xì)胞、肺癌細(xì)胞Α549、乳腺癌MCF-7、肝癌細(xì)胞HEPG2、膀胱癌細(xì)胞EJ、Τ24、人 宮頸癌細(xì)胞HELA、人結(jié)腸癌細(xì)胞ΗΤ29、人胰腺癌細(xì)胞PANC-1、人乳腺癌細(xì)胞MDA。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種香豆素β對(duì)實(shí)驗(yàn)用到的三種骨肉瘤細(xì)胞均有抑制作用，且均強(qiáng)于同濃度下的臨床用藥甲氨蝶呤的抑制活性，香豆素β對(duì)于MG-63的抑制活性最強(qiáng)，達(dá)到75％左右；可以引起MG-63細(xì)胞的凋亡發(fā)生，并有濃度依賴(lài)性，主要引起細(xì)胞進(jìn)入早期凋亡，香豆素β對(duì)細(xì)胞周期無(wú)明顯影響；香豆素β對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549系有最強(qiáng)的抑制作用，對(duì)人乳腺癌MCF-7的抑制作用其次，對(duì)人肝癌細(xì)胞HEPG2、膀胱癌細(xì)胞EJ和T24有一點(diǎn)抑制作用，對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HELA、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、人胰腺癌細(xì)胞PANC-1、人乳腺癌細(xì)胞MDA有輕微抑制活性。
【IPC分類(lèi)】A61P35/00, A61K31/37
【公開(kāi)號(hào)】CN105287510
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510793622
【發(fā)明人】賴(lài)仞, 王淦, 容明強(qiáng)
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所
【公開(kāi)日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年11月18日