一種獐芽菜苷鞘磷酸一胺醇受體拮抗劑的抗炎用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及獐芽菜苷對鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑的抗炎用途。
【背景技術(shù)】
[0002] S1P 受體（sphingosine-1-phosphate receptor，S1PR)是 G 蛋白偶聯(lián)受體家族成 員之一，包括S1P1~S1P5,主要與G蛋白α亞型偶聯(lián)發(fā)揮作用。
[0003] 炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)為炎癥。血管反應(yīng) 是炎癥過程的中心環(huán)節(jié)。炎癥是臨床常見的一個病理過程，可以生于機體各部位的組織和 各器官。急性炎癥平時具有紅、腫、熱、痛、機能掩藏等變化，同隨時常伴有發(fā)熱、白細(xì)胞增多 等全身反應(yīng)。是機體對于刺激的一種防御反應(yīng)。
[0004] 炎癥的產(chǎn)生實質(zhì)上是機體與致炎因子進行抗?fàn)幍姆从?。這種分歧抗?fàn)庁灤┭装Y過 程的始終。致炎因子作用于機體后，一方面引發(fā)組織細(xì)胞的損壞，使局部組織細(xì)胞顯現(xiàn)變 性、壞死；另一方面，誘導(dǎo)機體抗病機能增加，以益于清除致炎因子，使受損組織得到修復(fù)， 從而使機體的內(nèi)環(huán)境以及內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境之間達(dá)到新的均衡。S1PR通過激活多條細(xì)胞內(nèi)信 號途徑發(fā)揮不同的生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞迀移、增殖、凋亡及細(xì)胞內(nèi)鈣離子動員、炎癥 因子和黏附分子表達(dá)，以及調(diào)控血管發(fā)生、血管緊張度和通透性等，進而對心血管系統(tǒng)發(fā)揮 重要影響。S1P1廣泛表達(dá)于各種組織和細(xì)胞，在保持血管通透性等方面具有協(xié)調(diào)作用。
[0005] 目前研究認(rèn)為鞘氨醇-1-磷酸受體拮抗劑與多種細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，在免疫 調(diào)節(jié)方面具有促進淋巴細(xì)胞歸巢、抑制淋巴細(xì)胞外流，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，并能影響樹突狀 細(xì)胞及調(diào)節(jié)性Τ細(xì)胞功能另小鼠實驗顯示S1P1在血管重建、神經(jīng)形成、免疫細(xì)胞迀移、內(nèi)皮 細(xì)胞屏障功能等方面發(fā)揮重要作用。所以建立S1P1拮抗劑篩選模型對治療炎癥和心血管 等疾病具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明在采用鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑高通量篩選模型，通過功能性驗證尋 找先導(dǎo)化合物，發(fā)現(xiàn)了一類二咖啡酰基奎尼酸類鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑，為新型的抗 炎藥開發(fā)提供先導(dǎo)化合物。本發(fā)明可為此類臨床抗炎治療藥物的開發(fā)提供先導(dǎo)化合物，為 新型抗炎藥物開發(fā)提供線索和實驗依據(jù)。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：在中國倉鼠卵巢癌細(xì)胞（CH0)內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鞘氨醇-1-磷酸 1受體，建立鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑靶向激動劑高通量篩選模型，初篩，復(fù)篩，構(gòu)效關(guān) 系分析，得到一類具有抗炎作用的候選藥物。具體步驟如下：
[0008] 步驟一：建立及培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鞘氨醇-1-磷酸1受體的CH0細(xì)胞株。
[0009] 步驟二：激動劑模型建立及陽性藥驗證，確定激動劑的ECS。。
[0010] 步驟三：拮抗劑模型建立及陽性性藥驗證。
[0011] 步驟四：采用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和實驗確定的最佳檢測條件對化合物進行鞘氨醇-1-磷 酸1受體拮抗劑的高通量篩選，得到有明顯量效關(guān)系的化合物。
【附圖說明】：
[0012] 圖1 :激動劑量效曲線
[0013] 圖2 :詰抗劑量效曲線
[0014] 圖3 :先導(dǎo)化合物量效曲線
【具體實施方式】
[0015] 1.實驗材料
[0016] (1)完全培養(yǎng)：DMEM ;10% FBS ;100U/mL Penicillin ;100 μ g/mL Str印tomycin ; 1000 yg/mL G418〇
[0017] (2)Stimulation Buffer(SB):含 ImM IBMX 的 DMEM〇
[0018] (3)主要儀器：C02培養(yǎng)箱；384 孔板；Paradigm ? Detection Platform。
[0019] 2.建立及培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鞘氨醇-1-磷酸1受體的CH0鞘氨醇-1-磷酸1細(xì)胞株。
[0020] 3.最佳細(xì)胞數(shù)確定
[0021] (1)配制Forskolin梯度稀釋液：需要用Forskolin對細(xì)胞進行刺激，所以應(yīng)將 Forskolin儲備液逐級稀釋為最終濃度的2倍。
[0022] (2)配制不同濃度的細(xì)胞稀釋液：用SB將1. (7)中重懸好的細(xì)胞分別稀釋為 200cells/yL、400cells/yL及 800cells/yL。
[0023] (3)加樣：將3. (1)中稀釋好的Forskolin溶液按每個濃度2個復(fù)孔，5 μ L每孔加 入384孔板中，再加入2孔每孔各5 yL的SB作為cell negative control (CNC)。接著向 不同濃度的Forskolin溶液及CNC中加入3. (2)配制好的不同濃度的細(xì)胞稀釋液各5 μ L。 將384孔板在500rpm下離心15s，使10 μ L試劑混合均勻以充分反應(yīng)。為防止試劑蒸發(fā)造 成損失，將TopSeal-A膜貼于板面并將板放于室溫下使之孵育45min。
[0024] (4)終止試劑：用 Lysis buffer (LB)將 cAMP-d2 稀釋 40 倍，將 anti-cAMP 稀釋 20 倍。取適量LB與稀釋好的anti-cAMP溶液按1 : 1混合，向CNC中每孔各加入10 μ L ;將 剩余cAMP-d2溶液與anti-cAMP溶液按1 : 1混勻后加入到其余各孔，每孔10 μ L。將384 孔板在500rpm下離心15s，使20 μ L試劑混合均勻以充分反應(yīng)。重新貼上TopSeal-A膜并 將板放于室溫下繼續(xù)孵育60min。
[0025] (5)檢測：孵育時間到達(dá)后，揭去TopSeal-A膜，將板放于設(shè)定好程序的Paradigm? Detection Platform上檢測。處理數(shù)據(jù)，確定最佳細(xì)胞數(shù)及Forskolin的ECS。。
[0026] 4.激動劑模型建立及陽性藥驗證，確定激動劑的ECS。：
[0027] (1)S1P1激動劑CS 2100使用DMS0配制成5mM儲備液，因 S1P1偶聯(lián)Ga i，需加入 Forskolin刺激cAMP產(chǎn)生。首先根據(jù)3. (5)中Forskolin的ECS。配制FSB，再用FSB逐級 稀釋為最終濃度的2倍。
[0028] (2)配制含最佳細(xì)胞數(shù)的溶液：用SB將細(xì)胞稀釋為3. (5)中得到的最佳細(xì)胞濃 度。
[0029] (3)加樣：將4. (1)中稀釋好的CS 2100溶液按每個濃度2個復(fù)孔，5 μ L每孔加入 384孔板中，再加入4孔每孔各5 μ L的SB，其中2孔作為CNC，另2孔作為non-stimulated contro 1 (NSC)。將4. (2)配制的細(xì)胞溶液按每孔5 μ L加入384孔板中。將384孔板在500rpm 下離心15s，使10 μ L試劑混合均勾以充分反應(yīng)。為防止試劑蒸發(fā)造成損失，將TopSeal-A 膜貼于板面并將板放于室溫下使之孵育45min。
[0030] (4)按3.⑷配制終止試劑。向CNC中每孔加入10 μ L LB/anti-cAMP溶液（1 : 1)， 向NSC及其余各孔每孔加入10yL cAMP-d2/anti-cAMP溶液（1 : 1)。將384孔板在500rpm 下離心15s使20 μ L試劑混合均勻以充分反應(yīng)。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于室溫下 繼續(xù)孵育60min。
[0031 ] (5)孵育時間到達(dá)后，揭去TopSeal-A膜，將板放于設(shè)定好程序的Beckman Paradigm上檢測。處理數(shù)據(jù)，確定CS 2100的EC5。及EC s。。
[0032] 5.拮抗劑驗證
[0033] (1) S1P1拮抗劑W146使用1Μ NaOH溶液配制成10mM儲備液，以SB逐級稀釋為最 終濃度的4倍。
[0034] (2)配制含最佳細(xì)胞數(shù)的溶液：用SB將細(xì)胞稀釋為3. (5)中得到的最佳細(xì)胞濃 度。
[0035] (3)加樣：將5. (1)中稀釋好的W146溶液按每個濃度2個復(fù)孔，2. 5 μ L每孔加入 384孔板中，再加入4孔每孔各5 μ L的SB，其中2孔作為CNC，另2孔作為NSC，再加入2孔 每孔各2.5 yL的SB，作為cell positive control (CPC)。將5. (2)配制的細(xì)胞溶液按每 孔5 μ L加入384孔板中。將384孔板在500rpm下離心15s，使7. 5 μ L試劑（CNC及NSC為 10 μ L)混合均勻以充分反應(yīng)。為防止試劑蒸發(fā)造成損失，將TopSeal-A膜貼于板面并將板 放于室溫下使之孵育30min。
[0036] (4)根據(jù) 3. (5)中 Forskolin 的 ECS。配制 FSB，用 FSB 按 4. (5)中 CS 2100 的 EC 80配制CS 2100溶液。向CPC中加入FSB，每孔2.5 yL;其余各孔加入CS 2100溶液，每孔 2. 5 μ L ;CNC及NSC不加操作。將384孔板在500rpm下離心15s，使10 μ L試劑混合均勾以 充分反應(yīng)。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于室溫下繼續(xù)孵育45min。
[0037] (5)按3.⑷配制終止試劑。向CNC中每孔加入10 μ L LB/anti-cAMP溶液（1 : 1)， 向吧(：、0?(：及其余各孔每孔加入1(^1^〇41^-(12/^1^1-〇41^溶液（1:1)。將384孔板在 500rpm下離心15s使20 μ L試劑混合均勻以充分反應(yīng)。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于 室溫下繼續(xù)孵育60min。
[0038] (6)孵育時間到達(dá)后，揭去TopSeal-A膜，將板放于設(shè)定好程序的Paradigm? Detection Platform上檢測。處理數(shù)據(jù)，確定詰抗劑的IC5。。
[0039] 6.采用摸索的最佳檢測條件在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中對鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑進行初 篩與復(fù)篩。處理數(shù)據(jù)，計算所篩選化合物IC5。。對篩選出的有效的化合物進行構(gòu)效關(guān)系分 析。
[0040] 鞘氨醇-1-磷酸1受體活性篩選實驗結(jié)果
[0041 ] 篩選得到的鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑為獐芽菜苷化合物，其結(jié)構(gòu)式與1(：5。如 下：
[0042]
[0043] 先導(dǎo)化合物對鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗活性：
【主權(quán)項】
1. 式（I)的化合物或其藥學(xué)上可以接受的鹽用于制備鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑的 用途；2. 按照權(quán)利要求1的用途，作為鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑，用于治療炎癥的用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及式(I)的鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。此類化合物可以拮抗鞘氨醇-1-磷酸1受體，有效地產(chǎn)生抗炎作用。
【IPC分類】A61K31/7048, A61P29/00
【公開號】CN105287615
【申請?zhí)枴緾N201510828310
【發(fā)明人】嚴(yán)明, 汪豪, 高鵬, 張陸勇
【申請人】中國藥科大學(xué)
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月20日