伏立康唑在制備治療或預(yù)防癲癇藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是伏立康唑在制備治療或預(yù)防癲癇藥物中的 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 癲癇（印il印sy)是慢性反復(fù)發(fā)作性短暫腦功能失調(diào)綜合征，以腦神經(jīng)元異常放電 引起反復(fù)癇性發(fā)作為特征。癲癇發(fā)作可表現(xiàn)運(yùn)動(dòng)、感覺、意識(shí)、精神、行為和自主神經(jīng)等功能 異常。癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一，全球約5000萬患者，發(fā)病率約1%。癲癇可發(fā)生在任 何年齡段，與性別、社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位無關(guān)。癲癇死亡率約為20%，給家庭、社會(huì)造成很大的負(fù)擔(dān)。 目前，經(jīng)過現(xiàn)有的抗癲癇藥物治療，仍有大約30%的患者耐藥不能控制[1]。藥物不能控制 的癲癇即難治性癲癇的死亡率更高，可達(dá)50%，盡管對(duì)于藥物不能控制的癲癇目前多采用手 術(shù)治療，但適合手術(shù)的患者只占一小部分。因此，尋找有效和安全的抗癲癇治療藥物是生物 醫(yī)學(xué)重要的目標(biāo)之一 [2, 3]。
[0003] 嚙齒類癲癇模型包括最大電休克模型，點(diǎn)燃模型，戊四唑（PTZ)、海仁酸、青霉素等 誘導(dǎo)癲癇模型，這些模型對(duì)于癲癇藥物研發(fā)及機(jī)制研究起到了重要的作用。但是，現(xiàn)階段癲 癇依然是一個(gè)棘手的醫(yī)學(xué)問題，其機(jī)制尚不清楚。斑馬魚是一種脊椎動(dòng)物，與人類基因同源 性高達(dá)85%，其信號(hào)傳導(dǎo)通路與人類基本近似，生物結(jié)構(gòu)和生理功能與哺乳動(dòng)物高度相似， 具有體積小(可用微孔板分析)、發(fā)育周期短、體外受精、透明（可直接用肉眼和解剖顯微鏡 觀察)、單次產(chǎn)卵數(shù)較高等特點(diǎn)[4]。斑馬魚模型既具有體外實(shí)驗(yàn)快速、高效、低廉、用藥量小 等優(yōu)勢(shì)，又具有哺乳類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)性強(qiáng)、可比度高、可觀察多個(gè)器官等優(yōu)點(diǎn)，近年已在化 合物藥效、毒性評(píng)價(jià)中得到廣泛應(yīng)用[5, 6]。在斑馬魚胚胎發(fā)育早期多巴胺系統(tǒng)、5羥色胺 系統(tǒng)和Y-氨基丁酸(簡(jiǎn)稱GABA)系統(tǒng)發(fā)育，并且具有相應(yīng)的功能。這為斑馬魚在神經(jīng)系統(tǒng) 疾病中的應(yīng)用提供了可能[7]。PTZ是Y-氨基丁酸受體拮抗劑，而GABA是腦內(nèi)重要的抑 制性神經(jīng)遞質(zhì)，抑制GABA后可誘導(dǎo)癲癇發(fā)作。按照這種誘導(dǎo)機(jī)制，PTZ誘導(dǎo)大鼠癲癇模型可 篩選各種作用機(jī)制的抗癲癇藥物[8, 9]，癲癇的分級(jí)參照1972年Racine制定的標(biāo)準(zhǔn)可以分 為：一級(jí)：靜止不動(dòng)伴隨有嘴部/面部運(yùn)動(dòng)；二級(jí)：點(diǎn)頭及落水狗樣抖動(dòng)；三級(jí)：前肢陣攣； 四級(jí)：站立及雙側(cè)前肢陣攣；五級(jí)：持續(xù)站立及跌倒；六級(jí)：狂奔及尖叫[10]。Baraban and Berghmans應(yīng)用同樣的機(jī)制，建立了 PTZ誘導(dǎo)斑馬魚癲癇模型，可模擬哺乳動(dòng)物癲癇狀態(tài)， 斑馬魚表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)增加、快速的"渦旋行為"及陣攣發(fā)作[11，12]。多位研究者利用PTZ誘 導(dǎo)斑馬魚癲癇模型驗(yàn)證了多種作用機(jī)制的抗癲癇藥物在此模型中均能表現(xiàn)出一定的藥效， 包括鈉離子阻滯劑：卡馬西平、苯妥因納；鈣通道阻滯劑：加巴噴??；抑制囊泡釋放藥：左乙 拉西坦；GABA受體激動(dòng)劑：地西泮；改變GABA再攝取和分解的藥物：丙戊酸鈉等[9, 13]。 2012年國外研究者利用斑馬魚癲癇模型從2000個(gè)已知活性的化合物中，篩選出46個(gè)有潛 在抗癲癇作用的化合物。這些化合物包括留族化合物、抗炎、抗氧化、血管擴(kuò)張劑、殺蟲劑、 除草劑，相關(guān)藥物進(jìn)入后續(xù)研發(fā)階段[14]。因此，斑馬魚癲癇模型可以高通量高效篩選抗癲 癇藥物，這對(duì)癲癇藥物的研發(fā)意義重大。
[0004] 綜上所述，利用斑馬魚癲癇模型高通量篩選抗癲癇藥物，尋求新的化合物來有效 治療或預(yù)防癲癇已成為研發(fā)熱點(diǎn)，開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗癲癇藥物迫在眉睫。
[0005] 伏立康唑(英文名稱：Voriconazole ;中文名稱：伏立康唑；化學(xué)名稱： (2R，3S) -2- (2, 4-二氟苯基）-3- (5-氟嘧啶-4-基）-I- (1H-1，2, 4-三唑-1-基）-2- 丁醇； 分子式=C16H14F3N5O,分子量：349. 3)是廣譜抗真菌藥物，其作用機(jī)制是抑制真菌中由細(xì)胞色 素 P450介導(dǎo)的14 α -甾醇去甲基化，從而抑制麥角甾醇的生物合成。伏立康唑的化學(xué)結(jié)構(gòu) 式如下：
[0006] 至今尚未見有關(guān)伏立康唑抗癲癇活性及抗癲癇祀點(diǎn)活性的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供伏立康唑在制備治療或預(yù)防癲癇藥物中的新用途。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：現(xiàn)有化合物伏立康唑，結(jié)構(gòu)式如下：
本發(fā)明利用PTZ誘導(dǎo)斑馬魚癲癇模型進(jìn)行伏立康唑治療或預(yù)防癲癇藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。PTZ 是Y -氨基丁酸(簡(jiǎn)稱GABA)受體拮抗劑，PTZ誘導(dǎo)后，早期即刻基因 e-fas上調(diào)，斑馬魚 立即表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)增加、快速的"渦旋行為"及陣攣發(fā)作，這與人類癲癇發(fā)作癥狀相似。利用 View Point行為學(xué)分析儀記錄斑馬魚運(yùn)動(dòng)軌跡,利用該軟件分析快速運(yùn)動(dòng)距離,篩選抗癲 癇藥物。該方法簡(jiǎn)單，高效，高通量。本發(fā)明提供了伏立康唑在PTZ誘導(dǎo)斑馬魚癲癇模型中， 可以顯著的降低斑馬魚快速運(yùn)動(dòng)距離(相當(dāng)于哺乳動(dòng)物的癲癇狀態(tài))，對(duì)總的運(yùn)動(dòng)距離無影 響，說明在無毒濃度下，伏立康唑表現(xiàn)出較好的抗癲癇藥效，這表明伏立康唑可以治療或預(yù) 防癲癇的發(fā)生。
[0009] 本發(fā)明伏立康唑價(jià)格低廉、安全性高、原料來源廣泛，輔以藥學(xué)上可接受的輔料， 采用常規(guī)制劑技術(shù)即可制成各種口服、注射，具有良好的開發(fā)前景。
【附圖說明】
[0010] 圖I PTZ誘導(dǎo)斑馬魚癲癇模型軌跡圖。紅色代表V>20mm/sec的運(yùn)動(dòng)軌跡，綠色代 表4 mm/sec〈 V <20mm/sec的運(yùn)動(dòng)軌跡，黑色代表V <4mm/sec的運(yùn)動(dòng)軌跡。苯妥英鈉在 300 μΜ濃度下，能顯著降低快速運(yùn)動(dòng)距離，癲癇治療效率達(dá)59% (/?〈 0.01);篩選的化合 物Cmp3為伏立康唑，單濃素篩選中100 μ M濃度下，能顯著降低快速運(yùn)動(dòng)距離，癲癇治療效 率達(dá) 62% (/?〈0· 01)。
[0011] 圖2伏立康唑抗癲癇藥效柱狀圖?？瞻捉M快速運(yùn)動(dòng)距離為100 mm，溶劑組和模型 組與空白組相比，快速運(yùn)動(dòng)距離顯著增加(/?〈 0. 01， P〈 0. 01)，表明PTZ誘導(dǎo)斑馬魚癲 癇模型成功，且表現(xiàn)為快速運(yùn)動(dòng)距離增加。模型組與溶劑組相比，快速運(yùn)動(dòng)距離無差異，表 明溶劑DMS01. 0%對(duì)斑馬魚行為無影響。苯妥英鈉在300 μ M濃度下，能顯著降低快速運(yùn)動(dòng) 距離，癲癇治療效率達(dá)59% (/?〈 0.01);伏立康唑單濃素篩選中100 μ M濃度下，能顯著降 低快速運(yùn)動(dòng)距離，癲癇治療效率達(dá)62% (/?〈 0.01)。
[0012] 圖3伏立康唑在100 μ M濃度的對(duì)正常斑馬魚總的運(yùn)動(dòng)距離抑制率為2%，均無統(tǒng) 計(jì)學(xué)差異，結(jié)果表明其在此濃度下，斑馬魚無毒性反應(yīng)。
[0013] 圖4在PTZ誘導(dǎo)癲癇模型中，伏立康唑在100 μ M濃度抗癲癇抑制率分別為54% (ρ〈0. 01)，表現(xiàn)出較好的抗癲癇效果。
[0014] 圖5伏立康唑在100 μΜ濃度對(duì)PTZ誘導(dǎo)斑馬魚癲癇模型軌跡圖。紅色代表 V>20mm/sec的運(yùn)動(dòng)軌跡，綠色代表4 mm/sec〈 V <20mm/sec的運(yùn)動(dòng)軌跡，黑色代表V <4mm/ sec的運(yùn)動(dòng)軌跡。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于 此。
[0016] 實(shí)施例一定量觀察單濃度伏立康唑在斑馬魚癲癇模型中的藥效 斑馬魚： 本實(shí)施例使用的斑馬魚為野生型斑馬魚，飼養(yǎng)和使用標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格參照美國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理 和使用委員會(huì)（IACUC)的要求進(jìn)行。
[0017] 養(yǎng)魚水（Fish water): 配置方法：IL 反滲透水（reverse osmosis (RO) water)加入 0.3g 海鹽（Instant Ocean salts)〇
[0018] 二甲基亞砜（DMSO,分析純）： 購買于阿拉丁（貨號(hào)#1095515,批號(hào)#30573)。1% DMSO溶液（陰性對(duì)照）配置： 使用時(shí)，用養(yǎng)魚水配置成濃度為1. 〇%的工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0019] PTZ (戊四唑，誘導(dǎo)劑）： 購自美國sigma公司，批號(hào)069K1245。使用時(shí)，用0. 1% DMSO溶液配置成實(shí)驗(yàn)所需的濃 度，本實(shí)驗(yàn)中PTZ的使用濃度為10mM。
[0020] 苯妥英納（陽性對(duì)照藥）： 購自北京百靈威科技有限公司，批號(hào)GF01-FD。使用時(shí)，用I. 0% DMSO溶液配置成實(shí)驗(yàn) 所需的濃度，本實(shí)驗(yàn)中苯妥因納的使用濃度為300 μ M。
[0021] 伏立康唑（Ezetimibe): 購買于sigma公司，批號(hào)37485。使用時(shí)，用I. 0% DMSO溶液配置成100 μ M進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0022] 實(shí)驗(yàn)方法： (1)實(shí)驗(yàn)分組及幼魚處理：取96尾發(fā)育良好的斑馬魚幼魚，幼魚發(fā)育時(shí)相為受精后6 dpf (day-postfertilization，dpf),隨機(jī)分為12組（模型組、溶劑組、陽性藥物組、藥物 組），每組胚胎數(shù)量為8只。操作時(shí)將幼魚隨機(jī)分配至96孔細(xì)胞培養(yǎng)平板（Greiner,德國） 中，每孔1尾幼魚，每孔飼養(yǎng)用水200 μ L。
[0023] (2)藥物預(yù)處理：用移液器（量程100~lOOOPL，Eppendorf)迅速將預(yù)先配置好 的藥液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)平板對(duì)應(yīng)的孔中，每孔180 μ L。加藥液之前，用移液器（量程 10~100〇μL，Eppendorf)將96孔板中孵育胚胎的飼養(yǎng)用水盡力移出，此操作需在短時(shí)間 內(nèi)預(yù)先完成，以防止胚胎干燥。實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度控制在28. 5°C左右，相對(duì)濕度40~70%。然 后用錫箔紙將96孔板包裹好，做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記，迅速放置于斑馬魚培養(yǎng)