源自產(chǎn)甲酸草酸桿菌的促分泌素的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種鑒定到的源自草酸鹽降解細菌的促分泌素化合物。本發(fā)明還設(shè)及 一種對需要的對象進行治療的方法，其中所述方法包括施用藥物組合物W減少對象中存在 的草酸鹽，所述藥物組合物包含源自草酸鹽降解細菌的一種或多種促分泌素并且還包含或 不含一種或多種草酸鹽降解細菌、草酸鹽降解酶、草酸鹽代謝中所設(shè)及的酶、輔助因子、底 物或其組合。本發(fā)明還包括制造足夠量的用于鑒定和預(yù)期用途的促分泌素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 草酸鹽是弱酸鹽且是通過腎排泄的代謝終產(chǎn)物。由于草酸鹽作為游離的草酸鹽和 作為草酸巧晶體兩者都傾向于損害腎實質(zhì)細胞，因此，人和動物中素亂的草酸鹽動態(tài)平衡 可W造成嚴重病癥；由此，在許多情況中造成不可逆的損害。草酸鹽動態(tài)平衡因諸如原發(fā)性 高草酸尿（PH)的先天性障礙而嚴重素亂。
[0003] 原發(fā)性高草酸尿（PH)是一種罕見的常染色體隱性遺傳的乙醒酸代謝先天性障 礙，發(fā)病率為百萬分之0. 1~0. 2。I型PH是因肝臟特定的過氧化物酶體丙氨酸/乙醒酸 轉(zhuǎn)氨酶（AGT)的活性不足或缺失造成的。在某些患者中，酶存在但錯誤地祀向線粒體，在線 粒體中它被代謝失活。
[0004] II型PH是因乙醒酸還原酶/徑基丙酬酸還原酶（GRHPR)的酶活性不足而發(fā)生的。 兩種類型的PH的特征都在于從出生就存在嚴重的高草酸尿?；颊呓?jīng)歷復(fù)發(fā)的草酸巧尿石 病、腎巧沉著癥和進行性腎衰竭。
[0005] 對于治療I型PH或II型PH中酶缺陷或酶功能障礙來說，沒有批準的療法。目前 的PH療法設(shè)及降低草酸鹽的產(chǎn)生或提高草酸巧的尿溶解度W保護腎臟功能。通過儀、巧樣 酸鹽和正憐酸鹽的補充W提高草酸巧的尿溶解度來對患者進行治療?；Υ际侨毕菪虯GT 的輔助因子且化唉醇的藥理學(xué)劑量可W降低患有I型PH的少數(shù)患者內(nèi)的尿草酸鹽水平。最 終僅有的治愈性療法是組合的腎和肝移植。
[0006] 繼發(fā)性高草酸尿包括草酸鹽相關(guān)的病癥，例如但不限于，高草酸尿、吸收性高草酸 尿、腸源性高草酸尿、特發(fā)性草酸巧腎結(jié)石疾?。蚴。⑼怅幫?、與終末期腎病相關(guān)的尿 酸鹽沉積癥、屯、臟傳導(dǎo)障礙、炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎W及由胃腸道手術(shù)、減肥手 術(shù)（用于肥胖癥的手術(shù)）和/或抗生素治療造成的/與它們相關(guān)的障礙/病癥。腎/尿道 結(jié)石疾?。蚴。┦侨蚍秶鷥?nèi)的主要健康問題。與尿石病相關(guān)的大部分結(jié)石由單獨的 草酸巧或草酸巧與憐酸巧構(gòu)成。
[0007] 腎或尿道結(jié)石疾病在西方國家中發(fā)生在多達12 %的人口中且約70%的運些結(jié)石 由草酸巧構(gòu)成或由草酸巧和憐酸巧構(gòu)成。某些個體（例如患有腸道疾病如克羅恩病、炎性 腸病或脂肪瀉的患者W及還有經(jīng)歷了空腸回腸（jejunoileal)或Roux-en-Y旁路手術(shù)的患 者）在其膳食中比其他個體吸收更多的草酸鹽。對于運些個體，草酸鹽尿石病的發(fā)病率明 顯更局。
[0008] 草酸鹽動態(tài)平衡是一個復(fù)雜的過程，尚未完全搞清楚，包括許多不同的身體器官 和機理。哺乳動物的腎W及腸道充當排泄途徑，因此降低了體內(nèi)草酸鹽的濃度。然而，通過 腎排泄草酸鹽，造成了腎實質(zhì)細胞存在毒物學(xué)影響的風(fēng)險和W腎結(jié)石的形式形成晶體的風(fēng) 險。由于被動和主動兩種草酸鹽轉(zhuǎn)運Ofatch和化eel, 2004 ;化eel等，2006) W及與定植 的草酸鹽降解細菌的共生關(guān)系，哺乳動物的腸道由此在草酸鹽控制方面發(fā)揮主要作用。
[0009] 先前已經(jīng)報道，包含產(chǎn)甲酸草酸桿菌化化rmigenes)(運是一種利用草酸作為其 唯一能量源的非致病專性厭氧細菌）的高度濃縮的凍干粉末能夠用于減少血漿和尿中的 草酸鹽（美國專利號：6, 200, 562B1 ;美國專利號：6, 355, 242B1)。已經(jīng)對草酸鹽的降解機 理進行了表征，所述機理設(shè)及=種獨特的蛋白質(zhì)：草酸鹽：甲酸鹽膜轉(zhuǎn)運蛋白、草酷基-CoA 脫簇酶（OXC)和甲酯基-CoA轉(zhuǎn)移酶（FRC)。草酸鹽降解蛋白的非常高的表達及其獨特的動 力學(xué)性質(zhì)使得產(chǎn)甲酸草酸桿菌成為已知的最有效的草酸鹽降解系統(tǒng)之一。
[0010] 產(chǎn)甲酸草酸桿菌是脊椎動物中健康的腸道微生物群的一部分，并因此顯著參與草 酸鹽動態(tài)平衡過程。在機理上，產(chǎn)甲酸草酸桿菌增加草酸鹽在胃腸道中的降解，創(chuàng)建合適 的跨上皮梯度，并促進草酸鹽的被動腸消除。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，平衡的腸道微生 物群的重要性是眾所周知的，另外還已知的是，微生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展已經(jīng)證實了人類腸道 中細菌促分泌素的影響的許多病例。例如，霍亂弧菌（Vibrio化olerae)和產(chǎn)腸毒素的 大腸埃希氏菌巧SCherichia COli)產(chǎn)生促分泌素化合物，簡單地說，所述促分泌素化合 物引起離子的外流并隨后引起體液進入腸腔而導(dǎo)致腹瀉（Flores, J.，Sha巧，G.W.，1976 ; Field, M.，Graf, L.H.等，1978)。其他腸道定植菌通過促分泌素的作用而誘發(fā)粘蛋白分泌 過多（例如化varro-Garcia, F.等，2010, C油allero-Franco, C.等，2006)。
[0011] 近來對化C26(溶質(zhì)連接的載體）基因家族進行了鑒定（Mount,化B.等，PfIugers Arch. 2004 ；447(5):710-721 ；Soleimani, M. , Xu, J. , Seminars in nephrology. 2006 ; 26巧）：375-385)。該基因家族編碼結(jié)構(gòu)相關(guān)的陰離子轉(zhuǎn)運蛋白：SLC26A1 (SATl)、 S化26A2 值TDST)、SLC26A3 值RA)、aX26A6(PATl 或 C陽訝、aX26A7 和 S化26A9，所述 轉(zhuǎn)運蛋白具有可測量的草酸鹽親和性并在GI道內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。另外，在匯合后和匯合 的 Caco-2 單層中分別觀察到了 SLC26A1 和 S化26A2 (Hatch, M.等，NIH Oxalosis and Hyperoxaluria Workshop, 2003；Morozumi,M.等,Kidney Stones:Inside&Out. Hong Kong:2004，Pp. 170-180)。盡管取得了運些目前的進展，但關(guān)于對離子在上皮膜上的復(fù)雜 平衡、不同草酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的作用W及它們對高草酸鹽病癥產(chǎn)生何種影響仍存在許多問題 化assan,H.A.,Am J Physiol Cell Physiol,302:C46-C58,2012;A;ronson,P.S.,JN^bol 2010 ；23(S16):S158-S164) 〇
[0012] 具有草酸鹽親和性的許多轉(zhuǎn)運蛋白也對其他底物表現(xiàn)出親和性并通常與細胞 內(nèi)的酸-堿平衡相聯(lián)系；例如：在瓜贍卵母細胞中所表達的DRA是一種Cl堿交換劑 (Chernova，M. N.等，J Physiol，549:3,2003)且研究表明 SO42是另一種底物度 yeon，M. K.等，Protein Expr化rif, 12:67, 1998);在瓜贍中所表達的小鼠PAT-I對Cl肥O3、 Cl Ox2、so/ Ox2 表現(xiàn)出不同的親和性狂ie Q.等，Am J Physiol Renal Physiol 283:F826, 2002);且 SLC26A4 基因編碼 Cl 甲酸鹽交換劑（Morozumi, M.等 In:Gohel MDI, Au DWT (eds) Ki化巧 stones: inside and out. Hong Kong, P. 170)。對草酸鹽不具有 親和性的許多其他轉(zhuǎn)運蛋白具有與草酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白相同的底物，例如：化7K+腺巧S憐酸 酶、化7H+交換劑（畑E)、化MT-2C1共轉(zhuǎn)運蛋白（NKCC) W及基底外側(cè)的K+通道和頂部 的Cl通道如囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑（CFTR) (Venkatasubramanian, J.等，化rr化in Gastroenterol, 26:123-128, 2010)?；痋 Cl、K\肥〇3的調(diào)節(jié)通過所列出的運眾多轉(zhuǎn)運蛋 白的相互作用和調(diào)節(jié)而在腸道內(nèi)是高度協(xié)調(diào)的，因為其也決定了水的運動。
[001引 在諸女日 W02007070052A2、Hoppe 等(Nephrol Dial Transplant, 2011，26:3609-3615)和US 20050232901A1的現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)對幾種降低草 酸鹽的藥物制劑進行了描述。其中包括腸溶包衣的組合物或其它組合物，所述組合物包含 已被建議作為降低草酸鹽濃度的手段的草酸鹽降解細菌或酶。利用運種治療的目的是使得 患者獲得更低或正?；哪虿菟猁}水平。
[0014] 此外，W02005097176A2描述了包含能夠存活的產(chǎn)甲酸草酸桿菌和/或其裂解物的 組合物。所述組合物可用于治療患有腎衰竭的動物對象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本文中描述的發(fā)明設(shè)及源自草酸鹽降解細菌的促分泌素組分或促分泌素化合物， 其在哺乳動物的腸道內(nèi)產(chǎn)生直接或間接效應(yīng)。所述效應(yīng)設(shè)及草酸鹽通過草酸鹽的被動流出 和/或主動轉(zhuǎn)運的促進而穿過腸道上皮的交換。本發(fā)明還描述了產(chǎn)生足夠量的用于高草酸 尿療法中的鑒定、分析和預(yù)期用途的運種促分泌素組分的制造方法。
[0016] 由于離子和轉(zhuǎn)運蛋白在腸道內(nèi)復(fù)雜的多組分相互作用、每種轉(zhuǎn)運蛋白識別多種底 物、W及取決于不同離子平衡的被動和主動流出，所W重要的是指出，從下面運個意義上 說，促分泌素效應(yīng)可能是間接的：鑒定到的促分泌素化合物可能通過標稱離子平衡和穩(wěn)態(tài) 的改變來發(fā)揮其效應(yīng)并由此改變草酸鹽離子的流出。
[0017] 產(chǎn)甲酸草酸桿菌是天然存在的草酸鹽降解細菌，存在于脊椎動物的GI道內(nèi)，其在 所述GI道內(nèi)參與與哺乳動物宿主的復(fù)雜共生。利用產(chǎn)甲酸草酸桿菌進行的研究表明，當定 植在大鼠和小鼠的腸道內(nèi)時，通過誘發(fā)草酸鹽從腸胃外位點到腸腔的經(jīng)上皮流出，能夠促 進草酸鹽的腸消除。此外，將產(chǎn)甲酸草酸桿菌施用于患有終末期腎病的人類對象表明，顯著 降低血漿的草酸鹽（W02005123116A2)。運些發(fā)現(xiàn)支持發(fā)明人在理論上的概念，即，分泌的化 合物W有利于產(chǎn)甲酸草酸桿菌在人類和曬齒動物的腸道內(nèi)存活的方式影響腸上皮細胞。
[0018] 對制造和使用潛在促分泌素的大規(guī)模方法進行了探索，運導(dǎo)致鑒定到具有所提出 的促分泌素效應(yīng)的蛋白質(zhì)化合物和如本文中所描述的發(fā)明。由于許多蛋白質(zhì)W較低的量存 在，所W大規(guī)模的制造方法和隨后的純化和分離使得鑒定變得可能。據(jù)我們（本發(fā)明人） 的知識所最佳了解的，目前本領(lǐng)域中未鑒定到關(guān)于產(chǎn)甲酸草酸桿菌的所描述的促分泌素化 合物且運是對其分離并鑒定W用于高草酸尿治療的首次嘗試。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明人的研究，已經(jīng)在足W鑒定的規(guī)模下制造了由產(chǎn)甲酸草酸桿菌產(chǎn)生的 化合物，所述化合物據(jù)預(yù)期造成誘發(fā)的分泌通量。已經(jīng)對所述化合物（促分泌素）進行了 純化和表征。
[0020] 由此，本發(fā)明還提供一種分離足夠量的用于鑒定和在高草酸尿治療中的預(yù)期用途 的促分泌素的方法。促分泌素的分離和富集能夠與草酸鹽降解細菌的分離組合；由此產(chǎn)生 的方法設(shè)及草酸鹽降解細菌的收獲W及由草酸鹽降解細菌在發(fā)酵期間分泌的化合物的富 集兩方面。
[0021] 源自產(chǎn)甲酸草酸桿菌的促分泌素化合物被鑒定為單獨或一起對哺乳動物腸道內(nèi) 的草酸鹽流出產(chǎn)生直接或間接影響的一種或多種促分泌素蛋白質(zhì)和膚，所述促分泌素化合 物應(yīng)W足W用于鑒定和用于高草酸尿治療的量產(chǎn)生。鑒定的化合物從細菌細胞中分泌出 來，或被維持在細胞內(nèi)并在細胞死亡后釋放入培養(yǎng)介質(zhì)中。細胞死亡是細胞培養(yǎng)物生長期 間的一個連續(xù)過程；因此，從不含細胞的培養(yǎng)介質(zhì)中鑒定到的具有提出的促分泌素效應(yīng)的 蛋白質(zhì)或其他化合物不可能固有地為分泌的化合物。
[0022] 促分泌素化合物在需要輔助因子的反應(yīng)中在腸道內(nèi)發(fā)揮其組合的或單獨的效應(yīng)。 因此，如果對于在哺乳動物腸道內(nèi)發(fā)揮促分泌素積極效應(yīng)來說是必要的，一種或多種輔助 因子（例如：NAD\NADP\FAD、CoA、ATP、ADP等）與一種或多種促分泌素的組合也被包括在 本發(fā)明內(nèi)。
[0023] 促分泌素化合物通過改變其他化合物如離子和小有機化合物的標稱通量而間接 發(fā)揮其組合的或單獨的促分泌素效應(yīng)并由此造成草酸鹽通量變化。因此，本文中所提及的 促分泌素化合物的間接效應(yīng)也被包括在本發(fā)明內(nèi)，所述促分泌素化合物通過例如離子或小 有機化合物的通量的變化而間接改變草酸鹽的通量。
[0024] W與草酸鹽降解細菌、草酸鹽降解酶、草酸鹽代謝中所設(shè)及的酶、輔助因子、底物 或其組合組合的方式可W提高促分泌素化合物的效應(yīng)。因此，如果對于在哺乳動物腸道內(nèi) 發(fā)揮促分泌素積極效應(yīng)來說是必要的，一種或多種草酸鹽降解細菌、草酸鹽降解酶、草酸鹽 代謝中所設(shè)及的酶、輔助