一種含阿霉素七肽多孔微球的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于多孔微球領(lǐng)域，特別涉及一種含阿霉素七肽多孔微球的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由于多肽具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可以利用其肽鍵間氫鍵作用、靜電作用、疏水性作用以及31-31堆積作用等實(shí)現(xiàn)分子自組裝，自發(fā)組合形成具有某種理化性能的分子聚集體或超分子結(jié)構(gòu)。近年來(lái)多肽的自組裝逐漸成為材料學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，一系列可自組裝的離子短肽被發(fā)現(xiàn)或者被設(shè)計(jì)出來(lái)，獲得了各種各樣的自組裝結(jié)構(gòu)，包括纖維、膜和水凝膠等。多肽是生物體內(nèi)固有的生物活性分子，具有良好的生物相容性和降解性，利用多肽自組裝技術(shù)構(gòu)建的各種功能性材料在藥物控制釋放、組織工程支架材料以及基因治療等領(lǐng)域內(nèi)有著巨大的應(yīng)用前景。
[0003]鹽酸阿霉素(Doxorubicin，D0X)屬蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，是一種抑制DNA和RNA合成的抗腫瘤藥物。其對(duì)實(shí)體瘤的有效率約達(dá)70%，主要用于治療惡性淋巴瘤、急性白血病、肺癌、乳腺癌、骨及軟組織肉瘤、頭頸部腫瘤、肝癌、食道癌、胃癌等，抗瘤譜廣，應(yīng)用廣泛。然而，鹽酸阿霉素也有著傳統(tǒng)抗癌藥物的不良反應(yīng)，主要是消化道毒性、骨髓抑制、心臟毒性、脫發(fā)等問(wèn)題，少數(shù)患者有發(fā)熱、肝功能損傷與肌紅蛋白尿、紅斑以及色素沉著。因此，開(kāi)發(fā)一種具有很好的生物相容性和可降解性，同時(shí)又能實(shí)現(xiàn)高效載阿霉素及其可控釋放的生物材料很有必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種含阿霉素七肽多孔微球的制備方法，該方法操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和，制備得到的載藥復(fù)合物包封率高，且具有較好的釋放特性。
[0005]本發(fā)明的一種含阿霉素七肽多孔微球的制備方法，包括:
[0006](1)將七肽Fmoc-HP溶于1，1，1，3，3，3，-六氟-2-丙醇溶液中，得到Fmoc-HP溶液；將D0X加入到PTA水溶液中，得到含D0X的混合溶液；D0X的濃度范圍為0.1?5mg/ml ;
[0007](2)將步驟⑴中D0X的混合溶液加入到步驟⑴中Fmoc-HP溶液中，避光靜置，離心，冷凍干燥，得到DOXOFmoc-HP/PTA載藥復(fù)合物，即含阿霉素七肽多孔微球；其中，避光靜置的時(shí)間為2?24小時(shí)，F(xiàn)moc-HP和PTA總質(zhì)量與D0X的質(zhì)量比為5:1?1: 1。
[0008]所述步驟(1)中七肽的序列為Fmoc-1le-Gln-Ser-Pro-His-Phe-Phe。
[0009]所述步驟(1)中Fmoc-HP的濃度范圍為0.03?0.48M，PTA的濃度范圍為
0.025X 10 3?0.8X10 3M。
[0010]所述步驟(2)中加入為迅速加入。
[0011]所述步驟(2)中離心的轉(zhuǎn)速為lOOOOrpm，離心時(shí)間為5?10分鐘；離心除去未包裹的D0X。
[0012]所述步驟(2)中DOXOFmoc-HP/PTA載藥復(fù)合物分散于PBS緩沖液中，置于透析袋，放入PBS緩沖溶液環(huán)境中的溶出儀，于不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)吸光度，并補(bǔ)充緩沖液，測(cè)試藥物釋放；其中，所述PBS緩沖液的pH為7?7.5 ;透析工藝為采用透析袋，內(nèi)外液均為PBS緩沖液。
[0013]所述步驟⑵中DOXOFmoc-HP/PTA載藥復(fù)合物用于L-929細(xì)胞培育，測(cè)試細(xì)胞毒性；其中，在測(cè)試細(xì)胞毒性的過(guò)程中，DOXiFmoc-HP/PTA的PBS溶液中含D0X濃度為0?40 μ Μ。
[0014]有益效果
[0015](1)本發(fā)明利用Fmoc-HP和PTA自組裝過(guò)程中對(duì)D0X的化學(xué)吸附及物理包裹，制備了含D0X的多肽自組裝復(fù)合材料，制備方法簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)條件溫和；
[0016](2)本發(fā)明所使用的載體材料本身具有很好的生物相容性和可降解性，所制備的阿霉素七肽多孔微球復(fù)合材料藥物包封率高；
[0017](3)本發(fā)明所制備的阿霉素七肽多孔微球可以通過(guò)調(diào)控環(huán)境的pH值使載體的降解和藥物的釋放同步進(jìn)行。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為實(shí)施例1中(a) DOXiFmoc-HP/PTA的SEM圖；(b)釋藥20天后的SEM圖；(c)DOXiFmoc-HP/PTA熒光顯微鏡照片；
[0019]圖2為實(shí)施例1中D0X在不同質(zhì)量比下的上載率和包封率圖；
[0020]圖3為實(shí)施例2中D0X@Fmoc-HP/PTA在PBS緩沖溶液環(huán)境下D0X的釋放曲線圖；
[0021]圖4為實(shí)施例3中(a) D0X@Fmoc-HP/PTA的細(xì)胞毒性圖；(b) Fmoc-HP/PTA細(xì)胞毒性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
[0023]實(shí)施例1
[0024](1)分別取 lml D0X 濃度為 1.6、0.8、0.4 和 0.2mg/ml 的 PTA (0.6mg/ml)溶液，迅速加入到10 μ 1的Fmoc-HP (lmg/ml)溶液(1，1，1，3，3，3，-六氟-2-丙醇溶液)中，鋁箔紙避光，室溫下靜置反應(yīng)4h。然后將含D0X的多肽自組裝溶液lOOOOrpm下離心5min，并用去離子水洗滌數(shù)次，除去未包裹的D0X。
[0025](2)取制備好的DOXOFmoc-HP/PTA于硅片上，自然風(fēng)干，噴金制樣后用于SEM測(cè)試，圖 Ι-a 為 D0X@Fmoc-HP/PTA 的 SEM 圖；圖 l_b 為釋藥 20D 后的 SEM 圖；另取 D0X@Fmoc-HP/PTA于載玻片上，自然風(fēng)干，用于熒光顯微鏡測(cè)試；圖Ι-c為DOXOFmoc-HP/PTA的熒光顯微鏡圖。
[0026](3)收集所有(1)中離心洗滌后的殘液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其在波長(zhǎng)481nm處的吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出未上載的D0X的量，計(jì)算出D0X的上載率和包封率。圖2為Fmoc-HP和PTA與D0X在不同質(zhì)量比時(shí)的上載率和包封率圖，當(dāng)Fmoc-HP和PTA與D0X質(zhì)量比為2:1，D0X濃度為0.8mg/ml時(shí)，上載率和包封率均較高。
[0027]實(shí)施例2
[0028](1)取lml D0X濃度為0.8mg/ml的PTA (0.6mg/ml)水溶液，迅速加入到10 μ 1的Fmoc-HP (lmg/ml)六氟異丙醇溶液中，鋁箔紙避光，室溫下靜置4h，然后將含D0X的多肽自組裝溶液lOOOOrpm下離心5min，將未包裹的D0X除去。最后，將沉淀冷凍干燥后獲得D0X0Fmoc-HP/PTAο
[0029](2)稱取1.8mg干燥好的載藥復(fù)合物于2ml PBS緩沖液中，充分分散后放入透析袋(MW = 8，000?14，000)，并將透析袋放置在PBS環(huán)境下的溶出儀中，補(bǔ)加10ml的PBS溶液作為外液，溶出儀溫度設(shè)為37°C，轉(zhuǎn)速為90轉(zhuǎn)/分。分別于lh、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h取出lml透析液，并回補(bǔ)lml相應(yīng)的PBS緩沖溶液。用紫外_可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)取出的透析液進(jìn)行吸光度檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為481nm，收集數(shù)據(jù)并計(jì)算藥物釋放情況，圖3為該條件下D0X的釋放曲線圖。
[0030]實(shí)施例3
[0031](1)取lml D0X濃度為0.8mg/ml的PTA(0.6mg/ml)水溶液，迅速加入到10 μ 1的Fmoc-HP (lmg/ml)六氟異丙醇溶液中，鋁箔紙避光，室溫下靜置反應(yīng)4h。然將含D0X的多肽自組裝溶液lOOOOrpm下離心5min，將未包裹的D0X除去。
[0032](2)取 lml PTA (0.6mg/ml)水溶液，迅速加入到 10 μ 1 的 Fmoc-HP (lmg/ml)六氟異丙醇溶液中，室溫下靜置4h。然后將多肽自組裝溶液lOOOOrpm下離心5min。最后，將沉淀與(1)中的沉淀一起進(jìn)行冷凍干燥，分別獲得干燥的D0X@Fmoc-HP/PTA和Fmoc-HP/PTA。
[0033](3) DOXiFmoc-HP/PTA 和 Fmoc-HP/PTA 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn):稱取 1.3mg D0X 溶于 PBS 溶液中，配制成濃度為4、2、1和0.5 μΜ的D0X溶液。稱取2.lmg D0X@Fmoc-HP/PTA，配制成含D0X量為4、2、1和0.5 μ Μ的PBS溶液。另外，稱取1.6mg Fmoc-HP/PTA,配制成濃度為6.8236、3.4118、1.7059 和 0.8529mg/L 的 PBS 溶液，與前面 DOXiFmoc-HP/PTA 溶液中所含F(xiàn)moc-HP/PTA的量對(duì)等。
[0034](4)將(3)中的溶液滅菌后，測(cè)其對(duì)L-929細(xì)胞的毒性，以PBS處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。圖4-a為L(zhǎng)-929細(xì)胞分別用PBS、D0X和D0X@Fmoc-HP/PTA溶液培育24h后的細(xì)胞存活率圖，從圖上可以看出，隨著D0X濃度的增加，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞毒性均增強(qiáng)，表明DOXOFmoc-HP/PTA制備成功，并且能有效的釋放D0X ;圖4-b為L(zhǎng)-929細(xì)胞分別用PBS和Fmoc-HP溶液培育24h后的細(xì)胞存活率圖，從圖上可以看出，當(dāng)Fmoc-HP/PTA溶度在0.8529?3.4118mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率均高于PBS對(duì)照組，當(dāng)溶度為6.8236mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率略低于對(duì)照組，表明Fmoc-HP/PTA具有很好的生物相容性，顯示了其作為藥物載體的優(yōu)越性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種含阿霉素七肽多孔微球的制備方法，包括: (1)將七肽Fmoc-HP溶于1，1，1，3，3，3，-六氟-2-丙醇溶液中，得到Fmoc-HP溶液；將D0X加入到PTA水溶液中，得到含D0X的混合溶液，D0X的濃度范圍為0.1?5mg/ml ; (2)將步驟(1)中D0X的混合溶液加入到步驟(1)中Fmoc-HP溶液中，避光靜置，離心，冷凍干燥，得到DOXOFmoc-HP/PTA載藥復(fù)合物，即含阿霉素七肽多孔微球；其中，避光靜置的時(shí)間為2?24小時(shí)，F(xiàn)moc-HP和PTA總質(zhì)量與D0X的質(zhì)量比為5:1?1: 1。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含阿霉素七肽多孔微球的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中七肽的序列為 Fmoc-1le-Gln-Ser-Pro-His-Phe-Phe。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含阿霉素七肽多孔微球的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中Fmoc-HP的濃度范圍為0.03?0.48M，PTA的濃度范圍為0.025X 10 3?0.8X10 3Mo4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含阿霉素七肽多孔微球的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中離心的轉(zhuǎn)速為lOOOOrpm，離心時(shí)間為5?10分鐘。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含阿霉素七肽多孔微球的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中DOXOFmoc-HP/PTA載藥復(fù)合物分散于PBS緩沖液中，置于透析袋，放入PBS緩沖溶液環(huán)境中的溶出儀，于不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)吸光度，并補(bǔ)充緩沖液，測(cè)試藥物釋放。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含阿霉素七肽多孔微球的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中DOXOFmoc-HP/PTA載藥復(fù)合物用于Hela細(xì)胞培育，測(cè)試細(xì)胞毒性。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含阿霉素七肽多孔微球的制備方法，包括：將七肽Fmoc-HP溶于1,1,1,3,3,3,-六氟-2-丙醇溶液中，得到Fmoc-HP溶液；將DOX加入到PTA水溶液中，得到含DOX的混合溶液；將DOX的混合溶液加入Fmoc-HP溶液中，避光靜置，離心，冷凍干燥，即得。本發(fā)明的得到的多孔微球載藥復(fù)合物具有很好的生物相容性和可降解性，以及較好的載藥及藥物緩釋效果，用于藥物控制釋放研究，有著很好的實(shí)用價(jià)值。
【IPC分類】A61P35/00, A61K47/42, A61K31/704, A61K9/19
【公開(kāi)號(hào)】CN105395491
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511024595
【發(fā)明人】聶華麗, 肖瑞秋, 陳健良
【申請(qǐng)人】東華大學(xué), 佛山市迭蓓絲生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年3月16日
【申請(qǐng)日】2015年12月30日