裸花紫珠顆粒在抗呼吸性病毒方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及裸花紫珠顆粒的新應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 裸花紫珠（CallicarpanudifloraHook,etArn.)為馬鞭草科（Verbenaceae)紫 珠屬植物，主產(chǎn)于我國(guó)海南，是一種海南地道藥材，我國(guó)廣東、廣西也有分布。目前有研究表 明裸花紫珠藥材的主要成分為黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)、萜類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)等，其中萜類(lèi)和黃酮能增加血 小板的數(shù)量，縮短出血和凝血時(shí)間，對(duì)纖溶系統(tǒng)具有顯著的抑制作用，收縮血管、止血效果 顯著，對(duì)炎癥早期的滲出、腫脹有明顯的抑制作用，加快創(chuàng)面滲出的吸收，促進(jìn)傷口的愈合， 對(duì)金黃色葡萄球菌、傷寒沙門(mén)氏菌、肺炎雙球菌、綠膿桿菌等均有較強(qiáng)的抑菌作用；而鞣質(zhì) 能使創(chuàng)面的微血管收縮，具有局部止血作用。臨床上常用于治療細(xì)菌感染引起的炎癥，急性 傳染性肝炎，消化道出血等疾病。
[0003] 裸花紫珠顆粒是江西普正藥業(yè)有限公司研發(fā)的中藥制劑，臨床應(yīng)用中在抗炎止血 方面取得非常好的療效，并已經(jīng)列入了國(guó)家藥品部頒標(biāo)準(zhǔn)。其制備方法為取裸花紫珠干浸 膏，加蔗糖粉適量，混勻，用60%乙醇制成顆粒，干燥，制成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是裸花紫珠顆粒在制備抗呼吸性病毒方面藥物的應(yīng)用。所述呼 吸性病毒選自（包括但不限于）：鼻病毒（HRV)、艾柯病毒、冠狀病毒、腸道病毒、人正粘病毒 (例如流感病毒（A、B和C))、副粘病毒(例如副流感病毒（HPIV)和肺病毒)、呼吸合胞體病毒 (RSV)等。
[0005] 在本發(fā)明中，所述裸花紫珠顆?？梢酝ㄟ^(guò)商業(yè)渠道獲得，也可以自行制備。其制備 方法為： 1) 取裸花紫珠，加水煎煮兩次，每次加10倍量水，第一次2小時(shí)，第2次1小時(shí)，合并煎 液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度1. 30~1. 35 (80°C)的稠膏，干燥成干浸膏， 2) 取裸花紫珠干浸膏，加蔗糖粉適量，混勻，用60%乙醇制成顆粒，干燥，制成。
[0006] 在本發(fā)明中，所述的抗呼吸性病毒方面，其不僅是指裸花紫珠顆?？梢灾委熓芎?吸性病毒感染的個(gè)體，并且裸花紫珠顆粒也可以預(yù)防和減輕呼吸性病毒對(duì)機(jī)體的感染；尤 其是降低機(jī)體對(duì)呼吸性病毒的易感性。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，裸花紫珠顆粒在體外實(shí)驗(yàn)中具有明顯的抗病毒作用，并且 在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中裸花紫珠顆?？梢越档托∈髮?duì)病毒的感染、縮短小鼠的發(fā)病時(shí)間并且極大的 提高了小鼠生存率。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 下面將進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。需要指出的是，以下說(shuō)明僅僅是對(duì)本發(fā)明要求 保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說(shuō)明，并非對(duì)這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附 權(quán)利要求書(shū)記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0009] 在本發(fā)明實(shí)施例中，所使用的裸花紫珠顆粒均購(gòu)自江西普正藥業(yè)有限公司 實(shí)施例1裸花紫珠顆粒體外抗病毒實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞株凍存管從液氮罐取出，立即投入37°C~42°C溫水中融化(遵循慢凍速溶原則)， 超凈工作臺(tái)內(nèi)將凍存管中液體移入離心管中，l〇〇〇r/min，5min，棄凍存液，加入8ml濃度 10%的1640細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕將下層沉淀細(xì)胞吹打混勻，用移液管轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在37°C、 5%C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后進(jìn)行傳代。
[0010] 將RSV病毒接種于己經(jīng)長(zhǎng)成單層的Hep-2細(xì)胞上，加1640維持液8ml置37°C、 5%C02病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并設(shè)細(xì)胞對(duì)照，逐日觀察。待細(xì)胞出現(xiàn)80%以上的病變時(shí)，反復(fù) 凍融3次，用吸管輕輕吹打，1000r/min，5min，取上清液定量分裝于小青瓶中，膠布封口，放 于一 80 °C冰箱凍存?zhèn)溆谩?br>[0011]病毒毒力的測(cè)宙：將病毒用1640維持液做10倍比系列稀釋不同濃度，縱向重復(fù)4 孔，依次接種于己長(zhǎng)成單層的ifep-2細(xì)胞的96孔板中，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照。37°C、5%C02病毒培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下逐日觀察，連續(xù)觀察5d，將板孔內(nèi)液體吸棄，加1%中性紅50μ1， 37°(：、5%0)2培養(yǎng)箱中1小時(shí)，棄染液，用洗液將多余染料充分洗漆，加脫色液100μ1，室溫 脫色lOmin，用酶標(biāo)儀在540mn波長(zhǎng)測(cè)定0D值。根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算病毒液的半數(shù) 感染濃度TCID5。。
[0012] 細(xì)胞存活率=各組0D值/正常細(xì)胞0D值X100% 細(xì)胞病變率=1 一細(xì)胞存活率 細(xì)胞比距=(高于50%病變率一 50%) / (高于50%病變率一低于50%病變率）X100%TCID5c]=Antilog(log高于50%CPE百分率病毒稀釋度+比距X稀釋因子對(duì)數(shù)） 結(jié)果表明：RSV病毒TCID5。為10 ;因此將病毒原液稀釋100倍用于實(shí)驗(yàn)。
[0013]藥物對(duì)細(xì)朐毒件測(cè)宙：將待測(cè)藥物用1640維持液按二倍比稀釋7個(gè)濃度梯度，依 次接種于己經(jīng)長(zhǎng)成單層的ifep-2細(xì)胞的96孔板中，并設(shè)4個(gè)復(fù)孔及細(xì)胞對(duì)照孔；37 °C、5%C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變，連續(xù)觀察3d，計(jì)算藥物的最大無(wú)毒濃度。細(xì)胞出現(xiàn) 病變者判為藥物毒性，中性紅染色，用酶標(biāo)儀在540nm波長(zhǎng)測(cè)定0D值，應(yīng)用Reed-Muench公 式計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度（TC5。)，并確定最小無(wú)毒濃度（TC。)。
[0014]TC5Q=[Antilog(log高于50%CPE百分率病毒稀釋度+比距）]XC 抗病毒實(shí)驗(yàn)：待測(cè)藥物從無(wú)毒濃度起用RPMI1640二倍比系列稀釋7個(gè)濃度，每孔 50μ1接種于已長(zhǎng)成單層Η印-2細(xì)胞的96板孔中，每孔再加入50μ1RSV病毒液，同時(shí)設(shè)利 巴韋林陽(yáng)性對(duì)照組、板藍(lán)根顆粒對(duì)照組、病毒對(duì)照組及空白細(xì)胞對(duì)照組，每組4個(gè)復(fù)孔；病 毒對(duì)照組和空白細(xì)胞組加入等量的空白培養(yǎng)基。5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，待病 毒對(duì)照出現(xiàn)90%以上的病變時(shí)，1%中性紅染色，并用酶標(biāo)儀在540nm波長(zhǎng)測(cè)定0D值。應(yīng)用 Reed-Muench方法計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度（EC50)和治療指數(shù)（TI)。
[0015]EC50=[Antilog(log高于50%CPE百分率病毒稀釋度的值-比距）]XC TI=半數(shù)毒性濃度（TC50) /半數(shù)有效濃度（EC50) 具體結(jié)果如下： 病毒感染24小時(shí)后病毒組開(kāi)始出現(xiàn)病變，藥物組也開(kāi)始顯現(xiàn)病變，細(xì)胞在無(wú)毒濃度范 圍內(nèi)隨著藥物濃度的降低，RSV感染細(xì)胞表現(xiàn)明顯，脫落或細(xì)胞間融合，變圓、腫脹、破碎，48 小時(shí)病毒對(duì)照組90%病變，藥物組幾個(gè)濃度梯度孔被完全保護(hù)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好。各組藥物的 治療指數(shù)如下：
實(shí)施例2 按照實(shí)施例1的方法，采用人正常肺上皮細(xì)胞系（BEAS-2B)進(jìn)行裸花紫珠顆粒的抗RSV實(shí)驗(yàn)，具體結(jié)果如下： 實(shí)施例3
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用雄性，體重13-15g的SPE級(jí)4周齡昆明小鼠（KMmice)，環(huán)境溫度控制為 23±2°C，相對(duì)濕度為75±10%，照明時(shí)間12h/d(7:00-19:00)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常 組、病毒組、裸花紫珠顆粒低劑量組（病毒+裸花紫珠顆粒，12mg/kg/day)，裸花紫珠顆粒 高劑量組（病毒+裸花紫珠顆粒，24mg/kg/day)，除空白組小鼠5只外，實(shí)驗(yàn)各組使用動(dòng) 物為11~14只。除正常對(duì)照組外，其他組在乙醚輕度麻醉下，以2XLD50的RSV病毒液滴 鼻感染，35μL/只，同時(shí)空白對(duì)照組小鼠滴鼻同量的生理鹽水，感染后立即給藥，每天給藥 一次，連續(xù)給藥7天。從感染病毒當(dāng)天開(kāi)始連續(xù)觀察21天，并記錄小鼠體重，死亡數(shù)目以 及死亡時(shí)間。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean土SD表示，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分 析，各組小鼠的組間參數(shù)用ANOVA進(jìn)行檢驗(yàn)，P〈0. 05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。感染后21天期 間各組小鼠的發(fā)病率和死亡率用GraphPadPrism5生存分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
[0016] 具體結(jié)果如下： 裸花紫珠顆粒對(duì)RSV病毒感染小鼠發(fā)病率的影響
裸花紫珠顆粒對(duì)病毒感染小鼠死亡率的影響
實(shí)施例4裸花紫珠顆粒的臨床應(yīng)用研究 于兒科門(mén)診收集小兒呼吸道合胞病毒性肺炎100例，男63例，女37例，年齡在6個(gè)月 到3歲之間，隨機(jī)分為對(duì)照組（50例）和治療組（50例)，對(duì)照組給予利巴韋林注射液治療， 劑量為l〇mg/kg，治療組給予口服裸花紫珠顆粒(江西普正藥業(yè)有限公司），每次1袋(每袋 中含有裸花紫珠提取物800mg)，每天兩次。對(duì)照組和治療組各連續(xù)給藥10天并進(jìn)行療效學(xué) 評(píng)價(jià)。
[0017] 療效標(biāo)準(zhǔn)： 顯效：肺部啰音消失，呼吸恢復(fù)正常，X線檢查肺部炎癥反應(yīng)陰影基本吸收，呼吸道病 毒學(xué)檢測(cè)陰性； 有效：肺部啰音減少，呼吸基本恢復(fù)正常，X線檢查肺部炎癥反應(yīng)陰影部分吸收，呼吸 道病毒學(xué)檢測(cè)陰性； 無(wú)效：上述癥狀沒(méi)有明顯改善。
[0018] 具體結(jié)果如下：
本
【發(fā)明內(nèi)容】
僅僅舉例說(shuō)明了要求保護(hù)的一些具體實(shí)施方案，其中一個(gè)或更多個(gè)技術(shù)方 案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技 術(shù)方案也在本申請(qǐng)保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容 中具體記載一樣。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 裸花紫珠顆粒在制備抗呼吸性病毒方面藥物的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述呼吸性病毒選自（包括但不限于）:鼻 病毒（HRV)、艾柯病毒、冠狀病毒、腸道病毒、人正粘病毒(例如流感病毒（A、B和C))、副粘病 毒(例如副流感病毒（HPIV)和肺病毒)、呼吸合胞體病毒（RSV)等。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述呼吸性病毒選自呼吸合胞體病毒。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，裸花紫珠顆?？梢灾委熓芎粑圆《靖?染的個(gè)體，并且裸花紫珠顆粒也可以預(yù)防和減輕呼吸性病毒對(duì)機(jī)體的感染；尤其是降低機(jī) 體對(duì)呼吸性病毒的易感性。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及裸花紫珠顆粒在制備抗呼吸性病毒方面藥物的應(yīng)用。所述呼吸性病毒選自（包括但不限于）：鼻病毒（HRV）、艾柯病毒、冠狀病毒、腸道病毒、人正粘病毒（例如流感病毒（A、B和C））、副粘病毒（例如副流感病毒（HPIV）和肺病毒）、呼吸合胞體病毒（RSV）等。
【IPC分類(lèi)】A61P31/14, A61K36/85, A61P31/16, A61P11/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105395712
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510982768
【發(fā)明人】侯林, 田景振, 崔清華, 肖軍平, 吳永忠, 杜建松, 陳梁, 陳金德, 毛金娣
【申請(qǐng)人】普正藥業(yè)股份有限公司
【公開(kāi)日】2016年3月16日
【申請(qǐng)日】2015年12月24日