之間有一個大約90°的二面角?；衔铮↖)中C-19(Sc63.5)、H-19[SH4.19(d，J = 9. OHz)，3.86 (d，J = 9. OHz) ] W及H-3 (M. 29)的化學(xué)位移表明C-3和C-19之間存在一個氧 橋。HMBC 譜中 C-19(Sc63.5)與 H-3(Sh4.29)W 及 C-3(Sc74.3)與 H-19a(SH4.19)的相關(guān)性驗(yàn)證 了上述推論。綜合HMBC、1h-1h C0SY、R0ESY等二維譜和相關(guān)文獻(xiàn)，確定該化合物結(jié)構(gòu)如圖1所 /J、- O
[0039] 本實(shí)施例的化合物主要用途是用于制備保護(hù)神經(jīng)的藥物。
[0040] 實(shí)施例2:化合物(I)藥理作用試驗(yàn) [00川一、試驗(yàn)方法
[0042] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0043] ?(：12細(xì)胞生長于含10%馬血清、5%胎牛血清的0-161/。12培養(yǎng)液(37心體積分?jǐn)?shù) 為0.05的C〇2，飽和濕度），常規(guī)傳代。實(shí)驗(yàn)時培養(yǎng)器皿用0.005 %化L溶液（分子量為150， 000-300，000)包被，增加 PCl 2細(xì)胞對培養(yǎng)器皿黏附力。
[0044] 2、A&日-3日凝聚態(tài)處理
[0045] A02日-3日溶于無菌雙蒸水，終濃度為2. Ommol/L，分裝，-20°C保存，臨用前，37°C解育 A-Ido
[0046] 3、藥物對PC12細(xì)胞的處理
[0047] 對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞按一定的密度分別接種于培養(yǎng)板中，待其生長穩(wěn)定后，將 細(xì)胞分組，即對照組，A02日-3日誘導(dǎo)調(diào)亡組W及化合物（I)干設(shè)A02日-3日誘導(dǎo)調(diào)亡組。其中A025-35 誘導(dǎo)調(diào)亡組，W培養(yǎng)液加入凝聚態(tài)的A025-35儲存液，配制一定濃度的工作液，分別加入細(xì)胞 培養(yǎng)板，每孔再分別加入細(xì)胞懸液，0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每小組均設(shè)3個平行孔；其次依據(jù)20y mol/LA&日-3日，設(shè)定化合物（I)干設(shè)調(diào)亡組，細(xì)胞W不同濃度化合物（I)預(yù)處理比，再分別予終 濃度20皿01/LA&日-3日培養(yǎng)。
[004引 4、MTT法測定細(xì)胞存活率
[0049] 取對數(shù)生長期的細(xì)胞W2-5 XioVmL的初始濃度分別接種于96孔培養(yǎng)板中每孔 160化，待其生長穩(wěn)定后，加入不同濃度的A02日-3日，細(xì)胞對照組只加等量培養(yǎng)液，每組設(shè)S個 平行孔。培養(yǎng)96小時，每孔加5mg/mL的MTT溶液(PBS配制）20化，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)也棄上清 液，每孔加 DMSO 0.2mL，振蕩IOmin，W空白對照孔調(diào)零，在490nm波長下測定各孔光密度值。
[0050] 5、LDH釋放量的測定
[0051] 接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞，經(jīng)藥物處理4她后，吸出各組上清液備用，各組細(xì) 胞加入0. l%NP-40 1血作用lOmin，收集上清液備用。按照LDH測定試劑盒說明，分別檢測各 組上清液和0. l%NP-40的LDH活性，LDH釋放率=O帖胃/(0帖胃+ODo.i%np-4〇) X 100%。
[0052] 6、流式細(xì)胞分析細(xì)胞調(diào)亡
[0053] 按AnnexinV門TC試劑盒說明操作：
[0054] (1)細(xì)胞處理一定時間后，2000巧m/min離屯、5min，細(xì)胞數(shù)1 -5 X 1〇5;
[005引 （2)用PBS清洗細(xì)胞二次，2000巧m離屯、5min;
[0056] (3)加入 SOOiiLBindingbuf fer 懸浮細(xì)胞；
[0057] (4)加入化LAnnexinV-門TC混勻后，加入扣L Propidium Iodide(PI),混勻，室溫， 避光反應(yīng)20min;
[0058] (5)流式細(xì)胞儀(Backmancoulter E：picsXL)檢測，激發(fā)波長488nm，發(fā)射光530nm.， 對散點(diǎn)圖進(jìn)行分析。
[0059] 7、統(tǒng)計分析
[0060] 結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（文卻康示，兩兩比較用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0061] 二、結(jié)果及結(jié)論
[0062] 1、MTT測定A&5-35對PC12細(xì)胞活性的影響
[0063] 從圖3可看出，A025-35處理PC12細(xì)胞4d后，MTT法檢測顯示20,40皿〇1/1^\阮5-35作用 組吸光值(A490)明顯降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)dMTT法檢測表示線粒體功能，結(jié)果 說明A&日-3日使PC12細(xì)胞線粒體功能降低，活細(xì)胞數(shù)減少，即A02日-3日對PC12細(xì)胞的活性有抑制 作用，并與作用濃度相關(guān)。結(jié)果見表1及圖3。
[0064] 表1 A防5-35對PC。細(xì)胞生長的抑制作風(fēng)；±s)
[0066] 2、LDH釋放量測定
[0067] 10、20、40皿O1/LA02日-3日作用PCl 2細(xì)胞4化后，通過檢測細(xì)胞LDH釋放率顯示細(xì)胞的 損傷程度，結(jié)果表明A025-35對PC12細(xì)胞的毒性作用，并與作用的濃度相關(guān)，20、40w〇l/LA 025-35作用組與對照組比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4)。選20皿O1/LA025-35作為損傷組，觀察 化合物（I)的干預(yù)作用，作用48h，結(jié)果表明，1 ^g/mL化合物（I)即能降低PCl2細(xì)胞LDH釋放 率，但差異不顯著；1 OOng/mL，1 OOOng/mL化合物（I)組明顯降低PC12細(xì)胞LDH釋放率【見圖5， 圖中標(biāo)號意義：UconhoK對照組）；2、20皿ol/L A02日-3日；3、20皿ol/L A02日-3日+1 .Ong/ml化 合物（I) ;4、20皿〇1/1 A02日-3日+lOng/ml化合物（I) ;5、20皿O1/LA02日-3日+lOOng/ml化合物（I); 6、20皿ol/LA025-35+lOOOng/ml化合物（I);其中 4、5、6S組與20皿ol/L A025-35組比較 1)< 0.05】。
[0068] 3、Annexin V-PI染色的流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞調(diào)亡
[0069] 各組PC12細(xì)胞經(jīng)處理后上流式細(xì)胞儀，并對散點(diǎn)圖進(jìn)行分析(M化ti巧CL軟件處 理），顯示對照組、10皿〇1/LA025-35、2O皿O1/LA025-35作用4化后，PC12細(xì)胞的調(diào)亡率分別為 2.1±0.3%，9.3±0.5%和18.6±3.4%，調(diào)亡率與4&5-35劑量成正相關(guān)，與對照組比較差別 具有顯著性意義，Wl(K)ng/mL化合物（I)預(yù)先處理，調(diào)亡率降低為11.2±3.7%，差別有統(tǒng)計 學(xué)意義（與對照組比較，*:P<0.05，**:P<0.01;與20皿ol/LA(625-35組比較，#:P<0.05)，顯示 化合物（I)抗A&日-3日致調(diào)亡作用。
[0070] 流式細(xì)胞術(shù)檢測PC12細(xì)胞調(diào)亡率（靈±S，n = 3)?？偨Y(jié)，本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用20皿ol/L A 化5-35能有效建立體外培養(yǎng)的大鼠嗜銘瘤細(xì)胞株P(guān)C12調(diào)亡模型；化合物（I)能部分對抗A 025-35誘導(dǎo)的PC12調(diào)亡。
[00川實(shí)施例3
[0072] 片劑的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或巧樣 酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的 比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0073] 實(shí)施例4
[0074] 口服液的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或巧 樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口 服液。
[007引實(shí)施例5
[0076] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒 石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑重 量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0077] 實(shí)施例6
[0078] 注射液的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或巧 樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾， 灌封滅菌制成注射液。
[0079] 實(shí)施例7
[0080] 無菌粉針的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水 中，攬拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安飯中，低溫冷凍干燥后無菌烙封 得粉針劑。
[0081] 本發(fā)明還提供一種W上所述的化合物（I)或其藥學(xué)上可接受的等價物為活性成 分，同時含有一種或多種藥學(xué)上可W接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。藥用組合物可特 別制成通過合適的給藥途徑給藥的制劑，如口服、直腸給藥、經(jīng)鼻給藥、肺部給藥、腹膜內(nèi)給 藥、陰道給藥和胃腸外給藥(包括皮下給藥、肌內(nèi)給藥、靜脈給藥和真皮內(nèi)給藥)途徑，優(yōu)選 口服給藥途徑。應(yīng)了解優(yōu)選的給藥途徑取決于所治療主體的整體條件和年齡、所治療疾病 和病癥的性質(zhì)和所選擇的活性成分。而本發(fā)明所指"藥學(xué)上可W接受的載體或稀釋劑"選自 藥物制劑中常用的賦形劑、輔料或溶劑，包括但不限于乳糖、薦糖、滑石粉、明膠、瓊脂、果 膠、阿拉伯樹膠、硬脂酸儀、硬脂酸、纖維素的低級烷基酸、玉米淀粉、馬鈴馨淀粉、樹膠、月旨 肪酸、脂肪酸胺、單硬脂酸甘油或二硬脂酸甘油脂、憐脂、橄攬油、花生油、糖漿、著色劑、矯 味劑、防腐劑、水、乙醇、丙醇、生理鹽水、葡萄糖溶液。
【主權(quán)項】
1. 一種如式（I)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備保護(hù)神經(jīng)的藥物中的應(yīng) 用，2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述化合物式(1)由以下方法獲得： a、 車前草粉碎，用85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙 酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； b、 步驟a中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，依次用20%乙醇和80%乙醇洗脫，收集 80 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得80 %乙醇洗脫物浸膏； c、 步驟b中80%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1、60:1、30:1、15:1 和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分； d、 步驟c中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、12:1和5:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分； e、 步驟d中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為65%的甲醇 水溶液等度洗脫，收集8-11個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I); 上述步驟中所述的85 %乙醇、20 %乙醇和80 %乙醇均是指體積百分濃度。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述化合物（I)或其藥學(xué)上可接受的鹽的 每日有效劑量為〇. 001-0. 〇〇6g/kg人體。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述化合物（I)或其藥學(xué)上可接受的鹽用 于制備預(yù)防或治療受神經(jīng)元損傷影響的疾病或病癥藥物方面的應(yīng)用。5. -種醫(yī)藥組合物在作為保護(hù)神經(jīng)的藥物中的應(yīng)用，所述醫(yī)藥組合物含有： i治療有效量的上述化合物（I)或其藥學(xué)上可接受的鹽或化合物（I)和其藥學(xué)上可接受 的鹽按任意比例的混合物；以及 ii藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑選自賦形 劑、輔料或溶劑。
【專利摘要】本發(fā)明涉及從車前草中分離得到的化合物及其鹽在制備保護(hù)神經(jīng)的藥物中的應(yīng)用，化合物的結(jié)構(gòu)如(Ⅰ)，可以從車前的干燥全草中提取、分離純化獲得。體外試驗(yàn)證明該化合物能對抗Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可以應(yīng)用在開發(fā)成保護(hù)神經(jīng)的藥物中。
【IPC分類】C07J71/00, A61K31/585, A61P25/00
【公開號】CN105477004
【申請?zhí)枴緾N201510621109
【發(fā)明人】朱正直
【申請人】朱正直
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2015年9月25日