1-42 IOiig和化Ol化g，溶于生理鹽水）15min內注射完畢，留針I(yè)Omin后緩慢提出針頭，縫合， 75%乙醇溶液消毒。
[0043] 腦內注射后觀察動物外觀、飲食、飲水、自主活動情況，四周后進行行為學指標觀 察。
[0044] 2.3行為學指標檢測
[0045] 采用經(jīng)典的Morris水迷宮進行行為學指標觀察，觀察樹駒的學習記憶能力。
[0046] Morris水迷宮系統(tǒng)由盛水的圓形水槽迷宮，隱藏在水面下的平臺，視頻分析系統(tǒng) (包括攝像機、數(shù)字圖像采集卡、計算機系統(tǒng)和分析軟件）組成。水迷宮水池直徑150cm，深 60cm，攝像鏡頭安放于水池中屯、上方3m高度。按東南西北四個方向將水池平均劃分為4個象 限：東北(肥）、西北(NW)、東南（SE)、西南（SW)，將各象限水池壁中點標為入水點，入水點處 貼上醒目標記W區(qū)分不同象限。站臺半徑5畑1，高30畑1，純黑色塑料材質，固定放置于任一象 限的中央，水池中水面高出站臺平面0.5cm，將水槽中水用奶粉調成白色，W肉眼看不見平 臺為準，保持水溫(21±0.5)°C。房間內光照恒定，保持完全安靜，無光線直射在水池內。
[0047] 先對樹駒進行水迷宮適應性訓練，再進行正式指標檢測。
[004引 2.3.1水迷宮適應性訓練將樹駒頭朝池壁放入水中，引導樹駒找到水下平臺。放 入位置隨機取東、西、南、北4個起始位置之一。記錄動物找到水下平臺的時間（S)。在前幾次 訓練中，如果運個時間超過75s，則引導動物到平臺。讓動物在平臺上停留10s。連續(xù)訓練7d， 每天2次，篩選游泳能力好，能自主找到平臺的樹駒進行正式實驗。
[0049] 2.3.2正式指標檢測定位巡航實驗(navigation test)早上8: 30至10:00之間進 行，每次75s，連續(xù)測試4d。將樹駒隨機地頭朝池壁按東北(肥）、西北(NW)、東南（SE)、西南 (SW)4個象限輕輕放入池中，記錄動物尋找并爬上平臺所需的時間即逃避潛伏期和游泳速 度。動物找到平臺后使其在平臺上停留10s，讓其適應平臺站立和周圍環(huán)境，如果動物在75s 內未找到平臺，計算機停止跟蹤，記錄逃避潛伏期時間為75s，并由實驗者將動物引導至平 臺，讓其停留15s。每次訓練結束，迅速用吸水毛巾將動物毛發(fā)擦干，并用電吹風吹干，W防 動物低體溫。
[0050] 空間探索實驗(probe test):定位航行試驗結束后次日撤走平臺，任選一個入水 點將小鼠面向池壁放入水中，游泳時間均為90s，記下其穿越原平臺所在區(qū)域的次數(shù) (化equence)，W此作為空間記憶力的成績。
[0化1] 2.4病理學檢測
[0052]行為學指標檢測結束后，采用1%戊己比妥鋼溶液按0.15mL/100g體質量對樹駒腹 腔注射麻醉。待樹駒麻醉后固定，從樹駒胸骨劍突處開胸，經(jīng)左屯、室插管至主動脈，快速灌 注生理鹽水IOOmL沖洗血液，之后用4%多聚甲醒SOOmL灌注，取腦組織后立刻固定于4%中 性福爾馬林溶液中，常規(guī)石蠟切片，肥染色，觀察腦組織形態(tài)改變，神經(jīng)纖維纏結形成情況 用Bieloschsky鍛銀法檢測。
[0化3] 2.5統(tǒng)計分析
[0化4] 所有計量資料數(shù)據(jù)采用；±6表示，所有數(shù)據(jù)均用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計 學處理，進行單因素方差分析(ANOVA)根據(jù)方差齊性與否，分別選用不同的檢驗方法，即方 差齊的資料的兩兩比較用LS的去檢驗，方差不齊的資料的兩兩比較用Games-Howell法檢驗， W雙側a = 0.05為顯著性水準。
[0化5] 3.結果
[0056] 3.1行為學觀察
[0057] 3.1.1定位巡航實驗結果空白組與對照組的學習進度類似，隨著時間延長而潛伏 期下降，兩組之間沒有明顯的差別。模型組從第3天開始潛伏期明顯長于空白組，差異有顯 著性(P<0.05)，從第4天起與對照組也出現(xiàn)的明顯差異，見表1。
[0化引表1S組樹駒在定位巡航實驗中的逃避潛伏期(s)(x+s，n = 10)
[0060] 注:a與空白組比較，P<0.05結果達到顯著水平;b與對照組比較P<0.05，結果達到 顯著水平
[0061] 3.1.2空間探索實驗結果顯示在捜索策略上，空白組和對照組樹駒有一定的趨向 性，更傾向于在原有平臺的象限進行捜索，兩組之間無顯著差別;模型組則出現(xiàn)隨機捜索的 趨勢，模型組與空白組比較差異顯著(P<〇.05)。在游泳速率上，S組無明顯差別，見表2。
[0062] 表2S組樹駒空間探索實驗結果(S)(三± s，n = 10)
[0064] 注:a與空白組比較，P<0.05結果達到顯著水平;b與對照組比較P<0.05,結果達到 顯著水平。
[0065] 在對樹駒的水迷宮實驗結果進行分析后發(fā)現(xiàn)，模型組的學習記憶能力，有明顯的 下降，但沒有發(fā)現(xiàn)樹駒在水中的協(xié)調運動能力受到明顯影響。腦內注射制作神經(jīng)系統(tǒng)疾病 模型的缺陷之一就是腦內注射會對腦組織產(chǎn)生物理破壞，形成類似外傷的損害，從而產(chǎn)生 一定的干擾，利用微累注射技術能減小物理損傷，但也并不是完美的解決方案。為了排除注 射器貫穿腦組織對樹駒智力的損傷，本實驗設計了腦內注射生理鹽水的對照組，結果表明 生理鹽水腦內注射未對樹駒的水迷宮實驗表現(xiàn)產(chǎn)生明顯影響。證明模型組的學習記憶能力 下降確實是因為藥物毒性作用而引起的而非物理損傷所致。
[0066] 3.2樹駒海馬區(qū)膠質細胞增生及NTF形成情況
[0067] 3.2.1肥染色模型組樹駒海馬皮質肥染色切片可觀察到膠質細胞增生，而空白組 和對照組未見明顯病理改變，見圖1。
[0068] 3.2.2Bieloschsky鍛銀法Bieloschsky鍛銀法切片可W看到模型組樹駒海馬形 成NFT，而空白組、對照組均未看到明顯病理改變，見圖2。
【主權項】
1. 樹駒、D-半乳糖、β淀粉樣蛋白1-42、鵝膏蕈氨酸和戊巴比妥鈉在制備阿爾茨海默病 動物模型中的應用。2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于:所述樹駒為雄性。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于:所述樹駒的月齡為3月齡。4. 樹駒、D-半乳糖、β淀粉樣蛋白1-42、鵝膏蕈氨酸和戊巴比妥鈉在制備具有下述至少 一種特性的樹駒疾病模型中的應用： 1) 膠質細胞增生； 2) 神經(jīng)元纖維纏結； 3) 學習記憶能力下降。5. 根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于：用于制備所述樹駒疾病模型的樹駒為雄 性。6. 根據(jù)權利要求4或5所述的應用，其特征在于：用于制備所述樹駒疾病模型的樹駒的 月齡為3月齡。7. 樹駒在制備阿爾茨海默病動物模型中的應用。8. 樹駒在制備具有下述至少一種特性的樹駒疾病模型中的應用： 1) 膠質細胞增生； 2) 神經(jīng)元纖維纏結； 3) 學習記憶能力下降。9. 根據(jù)權利要求7或8所述的應用，其特征在于:權利要求7所述樹駒為雄性； 權利要求8中所述用于制備所述樹駒疾病模型的樹駒為雄性。10. 根據(jù)權利要求7或8或9所述的應用，其特征在于:權利要求7所述樹駒的月齡為3月 齡;權利要求8中所述用于制備所述樹駒疾病模型的樹駒的月齡為3月齡。
【專利摘要】本發(fā)明公開了樹鼩在制備阿爾茨海默病模型中的應用。本發(fā)明提供了以下技術方案：S1、樹鼩、D-半乳糖、β淀粉樣蛋白1-42、鵝膏蕈氨酸和戊巴比妥鈉在制備阿爾茨海默病動物模型中的應用。S2、樹鼩、D-半乳糖、β淀粉樣蛋白1-42、鵝膏蕈氨酸和戊巴比妥鈉在制備具有下述至少一種特性的樹鼩疾病模型中的應用：1)膠質細胞增生；2)神經(jīng)元纖維纏結；3)學習記憶能力下降。
【IPC分類】A61K49/00, A01K67/02
【公開號】CN105497920
【申請?zhí)枴緾N201510984868
【發(fā)明人】歐陽軼強, 梁振鑫
【申請人】廣西醫(yī)科大學
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月24日