向家蠶絲素蛋白溶液中添加質(zhì)量為家蠶絲素蛋白溶液中絲素蛋白質(zhì)量的40%的聚乙二醇二縮水甘油醚，攪拌均勻，倒入一平整的聚苯乙烯平皿或圓柱形的模具中，-80°C冷凍24?48小時(shí)后凍干，得絲素蛋白多孔材料。
[0037]步驟5):將絲素蛋白多孔材料制備一定體積的正方形或立方體或圓柱體，測(cè)定其飽和吸水能力(體積V)，按體積V及氯化鈣與絲素蛋白質(zhì)量比為1:20(鈣離子:絲素蛋白》1:56，質(zhì)量比)配置氯化鈣水溶液，緩慢加入到絲素蛋白多孔材料中，于_80°C冷凍24小時(shí)后凍干，再用去離子水浸漬去除氯離子，冷凍干燥得家蠶絲素止血材料。
[0038]步驟6):對(duì)制備的加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料進(jìn)行血液凝固試驗(yàn)，血液凝固試驗(yàn)方法:家蠶絲素止血材料0.05g，加入Iml新鮮兔血血小板血漿，放到37°C水浴至凝固。結(jié)果顯示:以氯化鈣與絲素蛋白質(zhì)量比為1:20(鈣離子:絲素》1:56，質(zhì)量比)加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料處理血漿后的凝固物量與明膠海綿相近，小于藻酸鈣，但比沒(méi)有加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料增加一倍。絲素蛋白加載鈣離子后凝血性能顯著提高。
[0039]步驟7):對(duì)制備的加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料進(jìn)行兔耳朵止血試驗(yàn)，兔耳朵止血試驗(yàn)方法:用手術(shù)刀在兔耳部密集分布有血管部位劃開(kāi)皮膚，傷口均為lcm，深度相同，迅速將材料覆蓋于傷口處，直至傷口處無(wú)血液再流即為止血，記錄止血時(shí)間。結(jié)果顯示:以氯化鈣與絲素蛋白質(zhì)量比為1:20(鈣離子:絲素》1:56，質(zhì)量比)加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料止血時(shí)間為38s，與明膠海綿38s相同，比藻酸鈣24s時(shí)間長(zhǎng)，比沒(méi)有加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料的49s短得多。絲素蛋白加載鈣離子后凝血性能明顯提高。
[0040]實(shí)施例四:
[0041 ]步驟I):將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1:50(g/mL)的浴比放入濃度為0.2%的碳酸鈉水溶液中，于98?100°C溫度下處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水將絲充分清洗干凈，拉松，置于60°C烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。
[0042]步驟2):稱(chēng)取脫膠后的家蠶絲素纖維，按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩爾比1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液中，70°C溫度下溶解2小時(shí)得家蠶絲素溶解液。
[0043]步驟3):將家蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為12.0?16.0kDa范圍，將灌注了家蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔I?2小時(shí)用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析4天，得到純化后的家蠶絲素蛋白溶液。在實(shí)施例一和二的基礎(chǔ)上，選擇家蠶絲素蛋白溶液濃度為6 %的多孔材料用于加載鈣離子。
[0044]步驟4):向家蠶絲素蛋白溶液中添加質(zhì)量為家蠶絲素蛋白溶液中絲素蛋白質(zhì)量的40%的聚乙二醇二縮水甘油醚，攪拌均勻，倒入一平整的聚苯乙烯平皿或圓柱形的模具中，-80°C冷凍24?48小時(shí)后凍干，得絲素蛋白多孔材料。
[0045]步驟5):將絲素蛋白多孔材料制備一定體積的正方形或立方體或圓柱體，測(cè)定其飽和吸水能力(體積V)，按體積V及氯化鈣與絲素蛋白質(zhì)量比為1:10(鈣離子:絲素蛋白》1:28，質(zhì)量比)配置氯化鈣水溶液，緩慢加入到絲素蛋白多孔材料中，于_80°C冷凍24小時(shí)后凍干，再用去離子水浸漬去除氯離子，冷凍干燥得家蠶絲素止血材料。
[0046]步驟6):對(duì)制備的加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料進(jìn)行血液凝固試驗(yàn)，血液凝固試驗(yàn)方法:家蠶絲素止血材料0.05g，加入Iml新鮮兔血血小板血漿，放到37°C水浴至凝固。結(jié)果顯示:以氯化鈣與絲素蛋白質(zhì)量比為1:10(鈣離子:絲素》1:28，質(zhì)量比)加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料處理血漿后的凝固物量為明膠海綿和藻酸鈣的2倍和1.6倍，為沒(méi)有加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料的4.5倍左右。絲素蛋白加載鈣離子后凝血性能顯著提高。
[0047]步驟7):對(duì)制備的加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料進(jìn)行兔耳朵止血試驗(yàn)，兔耳朵止血試驗(yàn)方法:用手術(shù)刀在兔耳部密集分布有血管部位劃開(kāi)皮膚，傷口均為lcm，深度相同，迅速將材料覆蓋于傷口處，直至傷口處無(wú)血液再流即為止血，記錄止血時(shí)間。結(jié)果顯示:以氯化鈣與絲素蛋白質(zhì)量比為1:10(鈣離子:絲素》1:28，質(zhì)量比)加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料止血時(shí)間為25s，明顯短于明膠海綿，與藻酸鈣24s時(shí)間相當(dāng)，為沒(méi)有加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料止血時(shí)間的一半。絲素蛋白加載鈣離子后凝血性能顯著提高。
[0048]實(shí)施例五:
[0049]步驟I):將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1:50(g/mL)的浴比放入濃度為0.2%的碳酸鈉水溶液中，于98?100°C溫度下處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水將絲充分清洗干凈，拉松，置于60°C烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。
[0050]步驟2):稱(chēng)取脫膠后的家蠶絲素纖維，按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩爾比1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液中，70°C溫度下溶解2小時(shí)得家蠶絲素溶解液。
[0051 ]步驟3):將家蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為12.0?16.0kDa范圍，將灌注了家蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔I?2小時(shí)用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析4天，得到純化后的家蠶絲素蛋白溶液。在實(shí)施例一和二的基礎(chǔ)上，選擇家蠶絲素蛋白溶液濃度為6 %的多孔材料用于加載鈣離子。
[0052]步驟4):向家蠶絲素蛋白溶液中添加質(zhì)量為家蠶絲素蛋白溶液中絲素蛋白質(zhì)量的40%的聚乙二醇二縮水甘油醚，攪拌均勻，倒入一平整的聚苯乙烯平皿或圓柱形的模具中，-80°C冷凍24?48小時(shí)后凍干，得絲素蛋白多孔材料。
[0053]步驟5):將絲素蛋白多孔材料制備一定體積的正方形或立方體或圓柱體，測(cè)定其飽和吸水能力(體積V)，按體積V及氯化鈣與絲素蛋白質(zhì)量比為3:20(鈣離子:絲素蛋白》1:
18.5，質(zhì)量比)配置氯化鈣水溶液，緩慢加入到絲素多孔材料中，于-80°C冷凍24小時(shí)后凍干，再用去離子水浸漬去除氯離子，冷凍干燥得家蠶絲素止血材料。
[0054]步驟6):對(duì)制備的加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料進(jìn)行血液凝固試驗(yàn)，血液凝固試驗(yàn)方法:家蠶絲素止血材料0.05g，加入Iml新鮮兔血血小板血漿，放到37°C水浴至凝固。結(jié)果顯示:以鈣離子與絲素蛋白質(zhì)量比約為I: 18.5加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料處理血漿后的凝固物量為明膠海綿和藻酸鈣的2.6倍和2.1倍，為沒(méi)有加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料的5.7倍左右。絲素蛋白加載鈣離子后凝血性能顯著提高。
[0055]步驟7):對(duì)制備的加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料進(jìn)行兔耳朵止血試驗(yàn)，兔耳朵止血試驗(yàn)方法:用手術(shù)刀在兔耳部密集分布有血管部位劃開(kāi)皮膚，傷口均為lcm，深度相同，迅速將材料覆蓋于傷口處，直至傷口處無(wú)血液再流即為止血，記錄止血時(shí)間。結(jié)果顯示:以鈣離子與絲素蛋白質(zhì)量比約為1:18.5加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料止血時(shí)間為24s，明顯短于明膠海綿，與藻酸鈣24s時(shí)間相當(dāng)，為沒(méi)有加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料止血時(shí)間的一半，與以鈣離子與絲素蛋白質(zhì)量比約為1:28加載鈣離子的絲素蛋白多孔材料變化不大。
[0056]上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種家蠶絲素止血材料的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟: 步驟I):將家蠶蠶絲或蠶繭進(jìn)行脫膠、溶解后，灌注于透析袋內(nèi)并用去離子水透析，過(guò)濾濃縮為濃度為4?10 %的家蠶絲素蛋白溶液； 步驟2):向步驟I)得到的家蠶絲素蛋白溶液中加入親水性膠黏劑攪拌均勻，-80°C溫度下冷凍24?48小時(shí)，取出冷凍干燥，得到絲素蛋白多孔材料； 步驟3):向步驟2)得到的絲素蛋白多孔材料中加入氯化鈣溶液，冷凍干燥后，再用去離子水浸漬去除氯離子，最后得到家蠶絲素止血材料。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠶絲素止血材料的制備方法，其特征在于，步驟I)中所述脫膠的具體方法如下: 將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1: 50g/mL的浴比放入濃度為0.2%的碳酸鈉水溶液中，在98?100°C溫度下處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水清洗干凈，拉松，置于60°C烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的家蠶絲素止血材料的制備方法，其特征在于，步驟I)中所述溶解的具體方法如下: 稱(chēng)取脫膠后的家蠶絲素纖維，按1:10g/mL的浴比溶解于摩爾比為1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液中，70°C溫度下溶解2小時(shí)得到家蠶絲素溶解液。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠶絲素止血材料的制備方法，其特征在于，步驟I)中所得到的家蠶絲素蛋白溶液的濃度為6%。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠶絲素止血材料的制備方法，其特征在于，步驟2)中所述的親水性膠黏劑選自聚乙二醇二縮水甘油醚，且所述聚乙二醇二縮水甘油醚的質(zhì)量為所述家蠶絲素蛋白溶液中絲素蛋白質(zhì)量的40%。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠶絲素止血材料的制備方法，其特征在于，步驟3)中所述家蠶絲素止血材料中的氯離子與絲素蛋白的質(zhì)量比為1:18.5?56。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種家蠶絲素止血材料的制備方法，包括以下步驟：1)：將家蠶蠶絲或蠶繭進(jìn)行脫膠、溶解后，灌注于透析袋內(nèi)并用去離子水透析，過(guò)濾濃縮為濃度為4～10％的家蠶絲素蛋白溶液；2)：向1)得到的家蠶絲素蛋白溶液中加入親水性膠黏劑攪拌均勻，-80℃溫度下冷凍24～48小時(shí)，取出冷凍干燥，得到絲素蛋白多孔材料；3)：向2)得到的絲素蛋白多孔材料中加入氯化鈣溶液，冷凍干燥，再用去離子水浸漬去除氯離子，得到家蠶絲素止血材料；本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，具有優(yōu)良的生物相容性和吸水性，沒(méi)有細(xì)胞毒性，同時(shí)穩(wěn)定地結(jié)合鈣離子，遇到血液后部分鈣離子可以釋放出來(lái)，具有優(yōu)異的綜合止血性能，且可以制備成各種形貌應(yīng)用于體內(nèi)、體外各種止血要求。
【IPC分類(lèi)】A61L24/10
【公開(kāi)號(hào)】CN105521520
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510908164
【發(fā)明人】王建南, 王瓊玉, 裔洪根
【申請(qǐng)人】蘇州大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年4月27日
【申請(qǐng)日】2015年12月10日