白頭翁皂苷b4作為ev71病毒抑制劑在制備抗手足口病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及白頭翁皂巧B4作為EV71病毒抑制劑在制備抗手足口病藥物中的應(yīng)用， 屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口病（hand-foot-mouth disease,HFMD)是腸道病毒所引起的嚴(yán)重危害5歲 W下嬰幼兒急性傳染病，自2008年納入國家疫情報(bào)告系統(tǒng)W來，每年報(bào)告手足口病發(fā)病數(shù) 均有100余萬例，截至2015年末，全國累計(jì)報(bào)道手足口病發(fā)病近1400萬例，嬰幼兒死亡達(dá) 3300多例，發(fā)病率排在法定傳染病的第一位，病死率排在前5位，對(duì)社會(huì)穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造 成重大影響，引起廣泛關(guān)注。手足口病的主要表現(xiàn)為發(fā)熱、口腔黏膜潰瘍性瘤疹及四肢末端 水瘤樣皮疹，個(gè)別患者因病毒侵襲屯、臟與大腦而引發(fā)屯、肌炎、肺水腫等致命性并發(fā)癥，其中 柯薩奇病毒A16 ( Coxsackie A16，CA16 )和腸道病毒71 型（Enterovirus 71，EV71)是本 病的主要致病原，而EV71型腸病毒危害更大。近年來，在亞洲爆發(fā)流行的病原體主要是 EV71，其流行呈上升的趨勢(shì)，目前尚無特效藥物。因此，開發(fā)有效的抗EV71病毒的藥物用 于治療手足口病迫在眉睫。
[0003] 相對(duì)于價(jià)格高昂、抗病毒活性不甚理想的傳統(tǒng)西藥，中藥具有價(jià)格低廉、藥源廣 泛、活性顯著等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)中藥材能抑制病毒復(fù)制、阻止病毒致細(xì)胞病變、調(diào)節(jié)免疫功能、改 善肺循環(huán)、鎮(zhèn)痛抗炎等。目前，隨著篩選和分離技術(shù)的提高，從中藥中尋找具有抗病毒活性 的成分已經(jīng)成為開發(fā)抗病毒藥物的重要途徑之一。
[0004] 大量的體外抗病毒篩選和臨床研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，某些復(fù)方及單味中藥均顯示出良好 的抗EV71病毒活性。研究表明清開靈、雙黃連等很多中藥復(fù)方及單味藥能緩解EV71手足口 病病情和縮短病程。如注射用雙黃連粉針，主要由連翅、銀花、黃琴等提取制成，具有辛涼解 毒清熱之功效，易世紅等對(duì)雙黃連粉針劑的體外抗病毒藥效學(xué)研究表明，其具有明顯抑制 新腸道病毒71型的作用，在治療手足口病的臨床應(yīng)用中具有良好的療效。張聞等將79例確 診為小兒手足口病的患兒隨機(jī)分為2組，對(duì)照組給予利己韋林顆粒，觀察組給予清開靈顆 粒，觀察2組的療效及副反應(yīng)，結(jié)果顯示2組療效無顯著性差異，但對(duì)照組的不良反應(yīng)發(fā)生 率明顯高于治療組，運(yùn)表明清開靈顆粒用于治療小兒手足口病效果好于利己韋林。牛兒苗 科植物老鶴草的主要成分之一，中醫(yī)古籍《日華子本經(jīng)》、《本草綱目》、《濱南本草》均有記載 其清熱解毒等功效。現(xiàn)代藥理顯示其抗病毒、抗菌、護(hù)肝藥效，實(shí)驗(yàn)表明老鶴草在體內(nèi)和體 外抗EV71均有較好的效果。細(xì)胞實(shí)驗(yàn):使用10 yg/mL的藥物可在RD細(xì)胞上明顯抑制EV71病 毒復(fù)制，動(dòng)物實(shí)驗(yàn):老鶴草可W明顯降低EV71感染小鼠死亡率，減輕其臨床癥狀，并降低其 組織病毒復(fù)制。
[000引 白頭翁是毛良科(Ranunculaceae)白頭翁屬植物白頭翁（Pulsatilla chinensis (Bunge) Regel)的干燥根，具有清熱解毒、涼血止頻的功效。白頭翁的主要藥理作用包括抗 菌作用、抗阿米己原蟲作用、抗病原體作用、抗癌作用、殺精子作用和鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用。白頭翁 的主要有效成分包括白頭翁素和白頭翁皂巧等，其中白頭翁皂巧可通過水提或醇提得到。 現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，白頭翁皂巧具有增強(qiáng)免疫功能、抗炎、抗腫瘤、抗病原微生物等作用，因 此受到廣泛的研究和關(guān)注，但目前尚未有病毒活性的白頭翁皂巧單體化合物的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供白頭翁皂巧B4作為EV71病毒抑制劑在抗制備抗手足口病藥 物中的應(yīng)用。
[0007] 白頭翁皂巧B4，分子式：C日姐96〇26，英文名：Anemoside B4，化學(xué)名：3-0-a-k化喃鼠 李糖基-(1 一2)-日-心化喃阿拉伯糖基-30，23-二徑基羽扇豆燒-A 20(29)締-28-0-日寸-化 喃鼠李糖-(1 一 4)-e-D-化喃葡萄糖-(1 一 6)-e-D-化喃葡萄糖巧。
[0008] 白頭翁皂巧B4在抗制備抗手足口病藥物中的應(yīng)用是通過抑制EV71病毒感染引起 的細(xì)胞調(diào)亡與壞死的活性達(dá)到的，本發(fā)明的白頭翁皂巧B4作為EV71病毒抑制劑在治療手足 口病中的應(yīng)用屬于首次公開，屬于純天然制劑，安全可靠無毒副作用，對(duì)WEV71病毒抑制劑 為祀標(biāo)的手足口病藥物開發(fā)具有潛在的價(jià)值。
[0009] 本發(fā)明通過具體實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)證明了白頭翁皂巧B4作為EV71病毒抑制劑具有 治療手足口病的作用。
【附圖說明】
[0010] 圖1:白頭翁皂巧B4的結(jié)構(gòu)式。
[00川圖2: EV71病毒感染畑細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)調(diào)亡與壞死分析 圖3:白頭翁皂巧B4對(duì)EV71病毒的抑制作用的調(diào)亡比例統(tǒng)計(jì)分析 圖4:不同濃度的白頭翁皂巧B4對(duì)EV71病毒抑制作用的巧光顯微鏡致病變效應(yīng)分析 圖5:不同濃度的白頭翁皂巧B4對(duì)EV71病毒抑制作用的調(diào)亡比例統(tǒng)計(jì)分析。 具體實(shí)施例
[0012] W下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí) 施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加 W限定。
[001引實(shí)施例1:白頭翁皂巧B 4體夕晰EV71的活性現(xiàn)憶。
[0014] (1)病毒感染 感染模式:RD細(xì)胞(人橫紋肌瘤細(xì)胞），EV71能在RD細(xì)胞中感染并復(fù)制，引起RD細(xì)胞調(diào)亡 與壞死，EV71主要感染人的肌肉與神經(jīng)組織，體外用EV71感染畑細(xì)胞可W模擬手足口病模 型。
[001引感染方法:EV71感染RD細(xì)胞引起RD細(xì)胞調(diào)亡與壞死將RD細(xì)胞種在6孔板，待細(xì)胞貼 壁后，濃度達(dá)到80%，EV71感染細(xì)胞，正常培養(yǎng)的RD細(xì)胞作為空白對(duì)照。在感染后不同時(shí)間取 樣，用倒置巧光顯微鏡觀察病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)(切topathic Effect, CPE)觀察，用流式 細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的調(diào)亡與壞死。流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果如說明書附圖2所示。
[0016]結(jié)果分析:在本實(shí)驗(yàn)感染復(fù)數(shù)下，24小時(shí)內(nèi)細(xì)胞基本沒有出現(xiàn)明顯的調(diào)亡與壞死， 24小時(shí)后調(diào)亡與壞死急劇增加，到第36小時(shí)，大部分細(xì)胞已裂解，或收縮變圓，或脫壁，顯 示RD細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的調(diào)亡與壞死(調(diào)亡結(jié)果中未計(jì)算已裂解的細(xì)胞）。
[0017] (2)白頭翁皂巧B4對(duì)EV71的抑制作用(病毒感染與藥物處理同步） 實(shí)驗(yàn)方法:將RD細(xì)胞種在6孔板，待細(xì)胞貼壁后，濃度達(dá)到80%，正常培養(yǎng)的RD細(xì)胞與僅 加 B4的孔作為空白對(duì)照；只感染EV71的孔作為陽性對(duì)照;在感染EV71的同時(shí)加入B4作為實(shí) 驗(yàn)組。B4處理濃度為50 ng/血，36小時(shí)后取樣，流式細(xì)胞測(cè)定調(diào)亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如說明書附圖 3所示： 結(jié)果分析:B4具有明顯的抑制EV71感染引起的細(xì)胞調(diào)亡與壞死的活性。
[001引（3)白頭翁皂巧B4對(duì)EV71的抑制作用(先感染后用藥物處理） 實(shí)驗(yàn)方法:使用同樣的感染模型，將RD細(xì)胞種在6孔板，待細(xì)胞貼壁濃度達(dá)到80%，先用 EV71感染18小時(shí)，然后再分別用不同濃度（1 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL)的白頭翁皂巧B4 藥物處理EV71感染的細(xì)胞，用倒置巧光顯微鏡觀察病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic Effect, CPE)現(xiàn)象。倒置巧光顯微鏡觀察效果結(jié)果(如說明書附圖4所示），18小時(shí)后用流式 細(xì)胞儀分析細(xì)胞的調(diào)亡與壞死情況(如說明書附圖5所示）。
[0019] 結(jié)果分析:倒置巧光顯微鏡觀察效果在低濃度(1 ng/mL)時(shí)，略有保護(hù)作用但不明 顯，在中高濃度(25 ng/mL和50 ng/mL)有明顯的保護(hù)作用，且高濃度保護(hù)作用較中濃度略 強(qiáng)。流式細(xì)胞儀分析顯示相同的感染模式與給藥處理方式，不同濃度的白頭翁皂巧B4對(duì)細(xì) 胞活性無明顯影響，低濃度保護(hù)作用不明顯，中高濃度具有明顯的保護(hù)作用。
[0020] 實(shí)施例2:白頭翁皂巧B 4體內(nèi)抗EV71的活性測(cè)定 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:2日齡ICR小鼠，平均體重在1.6-1.8克。
[0021] (2)感染方法:取2日齡乳鼠，禁食5小時(shí)后，EV71病毒腹腔注射。
[0022] (3)實(shí)驗(yàn)分組:共分成9組：陰性組(未感染病毒組），模型組(感染病毒后，每天腹腔 注射等體積的生理鹽水），陽性對(duì)照組(感染病毒后，每天利己韋林腹腔注射治療，100 mg/ kg/天），實(shí)驗(yàn)組1(感染病毒24小時(shí)后，每天腹腔注射白頭翁皂巧B4 1次，劑量分別為50， 100, 200 mg/kg/天），實(shí)驗(yàn)組11(感染病毒72小時(shí)后，每天腹腔注射白頭翁皂巧B4 1次，劑 量分別為50，100, 200 mg/kg/天）。每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為12只，給藥體積為10 yL/g。
[0023] (4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 狀態(tài)觀察結(jié)果:感染病毒2天后，模型組所有動(dòng)物一側(cè)后肢明顯僵直，略呈繞圈爬行，飲 食正常，實(shí)驗(yàn)組I各劑量組癥狀不明顯。感染病毒3天后，模型組和實(shí)驗(yàn)組II中所有動(dòng)物雙后 肢僵直，爬行略困難，生長變慢，體重相對(duì)陰性組明顯下降，個(gè)體大小表現(xiàn)明顯差異，胃內(nèi)依 然有食物殘留；實(shí)驗(yàn)組I中僅低劑量組巧0 mg/kg/天)有5只出現(xiàn)一側(cè)后肢僵直，其它劑量組 動(dòng)物的癥狀不明顯。
[0024] 各組成活數(shù)目統(tǒng)計(jì):數(shù)據(jù)見表1和表2,感染病毒7天后，模型組和陽性對(duì)照組所有 動(dòng)物均已死亡;實(shí)驗(yàn)組I中的低劑量組存活動(dòng)物1只，但有一側(cè)后肢僵直;實(shí)驗(yàn)組I中的中劑 量組存活動(dòng)物6只，但個(gè)體平均體重僅陰性組一半，有4只動(dòng)物出現(xiàn)一側(cè)后肢僵直，2只動(dòng)物 兩后肢均僵直，前肢均正常，胃內(nèi)殘留食物量少;實(shí)驗(yàn)組I中的高劑量組存活動(dòng)物9只，且有6 只動(dòng)物體重與陰性組間無明顯差異，2只動(dòng)物出現(xiàn)一側(cè)后肢略有僵直癥狀且體重較輕，1只 動(dòng)物出現(xiàn)一側(cè)后肢明顯僵直癥狀;實(shí)驗(yàn)組II中僅高劑量組存活動(dòng)物4只，且雙后肢有明顯僵 直，體重僅陰性組一半左右。
[0〇2引表1:病毒感染24小時(shí)后給藥白頭翁皂巧B4,各組小鼠存活數(shù)統(tǒng)計(jì)
表2:病毒感染72小時(shí)后給藥白頭翁皂巧B4，各組小鼠存活率統(tǒng)計(jì)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 白頭翁皂苷Μ在制備抗手足口病藥物中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的的應(yīng)用，其特征在于：白頭翁皂苷Μ是通過抑制EV71病毒感染引 起的細(xì)胞凋亡與壞死的活性達(dá)到的。
【專利摘要】本發(fā)明公開了白頭翁皂苷B4作為EV71病毒抑制劑在制備抗手足口病藥物中的應(yīng)用，白頭翁皂苷B4在制備抗手足口病藥物中的應(yīng)用是通過抑制EV71感染引起的細(xì)胞凋亡與壞死的活性產(chǎn)生的，本發(fā)明的白頭翁皂苷B4作為EV71病毒抑制劑在治療手足口病中的應(yīng)用屬于首次公開，屬于純天然制劑，安全可靠無毒副作用，對(duì)治療手足口病藥物研發(fā)具有潛在價(jià)值。
【IPC分類】A61P31/14, A61K31/704
【公開號(hào)】CN105535004
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610069887
【發(fā)明人】劉琦
【申請(qǐng)人】劉琦
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年2月2日