一種基于綠色電紡技術(shù)制備半乳糖殼聚糖-天然蛋白復(fù)合納米纖維仿生支架的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于肝組織工程支架的制備方法領(lǐng)域，特別涉及一種綠色電紡技術(shù)制備半乳糖殼聚糖-天然蛋白復(fù)合納米纖維仿生支架的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]組織工程支架應(yīng)該模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境，而細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是膠原蛋白和多糖，呈納米纖維狀排列，其纖維直徑分布在幾十到幾百納米。因此，天然蛋白和多糖組成的復(fù)合納米纖維被認(rèn)為可以較好的模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)。魚明膠、絲素和殼聚糖是來源廣泛的天然生物材料，具有優(yōu)良的生物相容性，是制備組織工程支架的優(yōu)選材料。研究表明，肝細(xì)胞表面有一種唾液酸糖蛋白受體可特異性識別半乳糖并與之產(chǎn)生特異性相互作用，肝細(xì)胞在含有半乳糖的材料上表現(xiàn)出更好的黏附與增殖行為。采用何種制備方法將材料制成支架是組織工程中的熱點(diǎn)問題，目前已有的較為成熟的方法包括多孔微載體、水熱法、去細(xì)胞化和靜電紡絲等。而目前研究表明靜電紡絲技術(shù)制備的納米支架具有高孔隙率、纖維直徑均一、力學(xué)性能和生物相容性都有很巨大的優(yōu)勢，同時設(shè)備簡單利于維護(hù)、制備過程很少或者基本不涉及到對生物體及環(huán)境有毒害的物質(zhì)、支架材料可以負(fù)載生長因子等活性物質(zhì)等特點(diǎn)，使靜電紡絲技術(shù)非常適合用于組織工程的研究和支架的生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于綠色電紡技術(shù)制備半乳糖殼聚糖-天然蛋白復(fù)合納米纖維仿生支架的方法，該方法克服目前的肝臟組織工程支架的不足，是能夠更有效的促進(jìn)肝細(xì)胞生長和維持功能，性能可靠的半乳糖殼聚糖復(fù)合物支架的辦法。
[0004]本發(fā)明的一種基于綠色電紡技術(shù)制備半乳糖殼聚糖-天然蛋白復(fù)合納米纖維仿生支架的方法，包括:
[0005](I)向半乳糖殼聚糖中加入純化后的天然蛋白，配制水溶液;其中，水溶液中天然蛋白的質(zhì)量濃度為10_80wt%，半乳糖殼聚糖的質(zhì)量濃度為2-7wt% ;
[0006](2)將步驟(I)中得到的水溶液電紡，得到半乳糖殼聚糖-天然蛋白復(fù)合納米纖維支架；其中，電紡工藝參數(shù)為:電壓為9-15KV，推進(jìn)速度為0.5-1.5ml/h，接收距離為15-25cm，溫度為20-40 °C，濕度為20-30 %。
[0007]所述步驟(I)中半乳糖殼聚糖的制備方法包括:LA溶解于pH = 4.7的TEMED溶液(HCl調(diào)解PH)，再由NHS和EDC的混合物激活;將殼聚糖以LA的當(dāng)量摩爾加入到溶解液中；室溫反應(yīng)72h;將產(chǎn)物透析，冷凍干燥后得到GalCS(半乳糖殼聚糖)。
[0008]所述步驟(I)中天然蛋白為絲素和魚明膠中的至少一種。
[0009]所述步驟(I)中水溶液中天然蛋白的質(zhì)量濃度為10-25wt%。
[0010]所述天然蛋白為絲素時得到的半乳糖殼聚糖-絲素復(fù)合納米纖維支架的后處理采用75%乙醇蒸汽熏蒸。
[0011]所述天然蛋白為魚明膠時得到的半乳糖殼聚糖-魚明膠復(fù)合納米纖維支架的后處理采用25%戊二醛蒸汽熏蒸。
[0012]所述步驟(I)中水溶液為去離子水配制的水溶液。
[0013]所述步驟(I)水溶液中加入聚環(huán)氧乙烷PEO，水溶液中PEO的質(zhì)量濃度為0.lwt% —
0.5wt% ο ο
[0014]本發(fā)明采用綠色電紡技術(shù)制備半乳糖殼聚糖-天然蛋白復(fù)合納米纖維仿生支架，該支架具有良好的細(xì)胞相容性，可促進(jìn)肝細(xì)胞的粘附與增殖，有望在肝臟組織工程等領(lǐng)域獲得良好應(yīng)用效果。
[0015]有益效果
[0016](I)本發(fā)明操作簡便，實(shí)驗(yàn)裝置簡易，制備時間短且條件溫和，利于大批量生產(chǎn)；
[0017](2)本發(fā)明制備的半乳糖殼聚糖-天然蛋白復(fù)合納米纖維仿生支架模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)與成分，具有良好的細(xì)胞相容性；
[0018](3)本發(fā)明制備的半乳糖殼聚糖-天然蛋白復(fù)合納米纖維仿生支架由于含有可被肝細(xì)胞膜受體特異性識別的半乳糖鏈有望促進(jìn)肝細(xì)胞的粘附和增殖，利于誘導(dǎo)肝組織再生與重建。
【附圖說明】
[0019]圖1為實(shí)施例1所得納米纖維仿生支架的掃描電鏡(SEM)圖；
[0020]圖2為實(shí)施例2所得納米纖維仿生支架的SEM圖；
[0021 ]圖3為肝細(xì)胞(RH35)在實(shí)施例1所得納米纖維仿生支架上生長情況的SEM圖；
[0022]圖4為肝細(xì)胞(RH35)在實(shí)施例2所得納米纖維仿生支架上生長情況的SEM圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0024]各實(shí)施例中半乳糖殼聚糖的合成步驟為:2.3gLA溶解于PH=4.7的50mlTEMED/(由HCl調(diào)解PH)，再由NHS(0.14g)和EDC(0.6g)的混合物激活;將2.2g殼聚糖(13.7mol)以LA的當(dāng)量摩爾加入到溶解液中；室溫反應(yīng)72h;將產(chǎn)物透析，冷凍干燥后得到GalCS(半乳糖殼聚糖)。
[0025]實(shí)施例1
[0026](I)配制絲素紡絲液(20wt% )，加入質(zhì)量濃度為0.2%的聚環(huán)氧乙烷(PEO)，并按照質(zhì)量比I %的比例加入半乳糖殼聚糖；
[0027](2)將步驟(I)中的紡絲液分別轉(zhuǎn)移到注射器中，調(diào)節(jié)電壓為11KV，推進(jìn)速度為1.0ml/h，接收距離為20cm，濕度在30%，溫度在25 °C，利用接收器接收，制得復(fù)合絲素蛋白-半乳糖殼聚糖納米纖維仿生支架。
[0028](3)所得納米纖維膜用75%乙醇蒸汽處理24h后即可使用。
[0029]圖1為本實(shí)施例中得到的納米纖維仿生支架的SEM圖，從圖中可以看出半乳糖殼聚糖(GC)混合所制備的混合納米纖維膜支架纖維表面光滑，大小均一，直徑為500-750nm
[0030]圖3為肝細(xì)胞(RH35)在本實(shí)施例所得納米纖維仿生支架上生長情況的SEM圖，從圖中可以看出在GC-SF納米纖維膜上的肝細(xì)胞RH35黏附與鋪展地良好，可見GC-SF納米纖維膜與肝細(xì)胞的生物相容性良好。
[0031]實(shí)施例2
[0032](I)配制魚明膠紡絲液(60wt % )，按照質(zhì)量比3%的比例加入半乳糖殼聚糖；
[0033](2)將步驟(I)中的紡絲液分別轉(zhuǎn)移到注射器中，調(diào)節(jié)電壓為IIKV，推進(jìn)速度為1.0mI/h，接收距離為20cm，濕度在30 %，溫度在25°C，利用接收器接收，制得復(fù)合魚明膠-半乳糖殼聚糖納米支架。
[0034](3)所得的納米纖維用25%的戊二醛蒸汽熏蒸12h，然后置于通風(fēng)櫥中通風(fēng)至少lh，再轉(zhuǎn)移到真空干燥箱中干燥2-3天即可使用。
[0035]圖2為本實(shí)施例中得到的納米纖維仿生支架的SEM圖，從圖中可以看出制備的復(fù)合纖維表面光滑，直徑均一，半乳糖-殼聚糖的加入對纖維形貌和直徑的無明顯影響，呈光滑的帶狀結(jié)構(gòu)。
[0036]圖4為肝細(xì)胞(RH35)在本實(shí)施例所得納米纖維仿生支架上生長情況的SEM圖，從圖中可以看出在GC-Gelatin納米纖維膜上的肝細(xì)胞RH35黏附與鋪展良好，可見GC-SF納米纖維膜與肝細(xì)胞的生物相容性良好。
[0037]實(shí)施例3
[0038](I)配制魚明膠-絲素紡絲液(60wt%，20wt% )，加入聚環(huán)氧乙烷ΡΕ0(0.2wt% )，并按照質(zhì)量比I %的比例加入半乳糖殼聚糖；
[0039](2)將步驟(I)中的紡絲液分別轉(zhuǎn)移到注射器中，調(diào)節(jié)電壓為IIKV，推進(jìn)速度為
1.0mI/h，接收距離為20cm，濕度在30 %，溫度在25°C，利用接收器接收，制得復(fù)合魚明膠-絲素-半乳糖殼聚糖納米支架。
[0040](3)所得的納米纖維用75%酒精蒸汽熏蒸24h，然后用25%的戊二醛蒸汽熏蒸12h，然后置于通風(fēng)櫥中通風(fēng)至少lh，用去離子水潤洗浸泡數(shù)次，再轉(zhuǎn)移到真空干燥箱中干燥2-3天即可使用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于綠色電紡技術(shù)制備半乳糖殼聚糖-天然蛋白復(fù)合納米纖維仿生支架的方法，包括: (1)向半乳糖殼聚糖中加入純化后的天然蛋白，配制水溶液;其中，水溶液中天然蛋白的質(zhì)量濃度為10_80wt%，半乳糖殼聚糖的質(zhì)量濃度為2-7wt% ; (2)將步驟(I)中得到的水溶液電紡，得到半乳糖殼聚糖-天然蛋白復(fù)合納米纖維支架；其中，電紡工藝參數(shù)為:電壓為9-15KV，推進(jìn)速度為0.5-1.51111/11，接收距離為15-25011，溫度為20-40 °C，濕度為20-30 %。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于綠色電紡技術(shù)制備半乳糖殼聚糖-天然蛋白復(fù)合納米纖維仿生支架的方法，其特征在于，所述步驟(I)中天然蛋白為絲素和魚明膠中的至少一種。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于綠色電紡技術(shù)制備半乳糖殼聚糖-天然蛋白復(fù)合納米纖維仿生支架的方法，其特征在于，所述天然蛋白為絲素，得到的半乳糖殼聚糖-絲素復(fù)合納米纖維支架的后處理采用75%乙醇蒸汽熏蒸。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于綠色電紡技術(shù)制備半乳糖殼聚糖-天然蛋白復(fù)合納米纖維仿生支架的方法，其特征在于，所述天然蛋白為魚明膠，得到的半乳糖殼聚糖-魚明膠復(fù)合納米纖維支架的后處理采用25%戊二醛蒸汽熏蒸。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于綠色電紡技術(shù)制備半乳糖殼聚糖-天然蛋白復(fù)合納米纖維仿生支架的方法，其特征在于，所述步驟(I)水溶液中加入聚環(huán)氧乙烷PEO，水溶液中PEO的質(zhì)量濃度為0.1wt % —0.5wt %。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于綠色電紡技術(shù)制備半乳糖殼聚糖-天然蛋白復(fù)合納米纖維仿生支架的方法，包括：向半乳糖殼聚糖中加入純化后的天然蛋白，配制水溶液，電紡，得到半乳糖殼聚糖-天然蛋白復(fù)合納米纖維支架。本發(fā)明的方法簡單，生產(chǎn)效率高，具有在生物人工肝和肝組織修復(fù)方面的良好應(yīng)用前景；制備得到的半乳糖殼聚糖-天然蛋白/復(fù)合納米纖維仿生支架，具有良好的生物相容性，可促進(jìn)肝細(xì)胞粘附與增殖。
【IPC分類】A61L27/22, D01D5/00, A61L27/20, D04H1/728
【公開號】CN105561388
【申請?zhí)枴緾N201510990389
【發(fā)明人】王紅聲, 余凡, 楊興興, 林思, 周曉菲, 范林鵬
【申請人】東華大學(xué)
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2015年12月24日