最新鑒定出的用于誘導(dǎo)幼年哺乳動物口服耐受性的肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及最新鑒定出的肽，所述肽能夠誘導(dǎo)對牛乳、尤其是對β?乳球蛋白的耐受性。所述肽可施用于哺乳動物，尤其是對牛乳蛋白有變態(tài)反應(yīng)風險的幼小嬰兒，以誘導(dǎo)對牛乳的口服耐受性；所述肽也可施用于對牛乳有變態(tài)反應(yīng)的兒童或成人，以允許發(fā)生對變應(yīng)原性乳蛋白、尤其是β?乳球蛋白的“脫敏”。所述肽也可用于誘導(dǎo)對山羊和水牛乳蛋白、尤其是β?乳球蛋白的耐受性。所述肽能夠調(diào)節(jié)哺乳動物對變應(yīng)原的免疫應(yīng)答。
【專利說明】
最新鑒定出的用于誘導(dǎo)幼年哺乳動物口服耐受性的肽
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及最新鑒定出的β-乳球蛋白肽，這些肽具備低變應(yīng)原性，但仍保留誘導(dǎo) 對天然蛋白的耐受性的能力。可將這些肽施用于所有嬰兒，尤其是有牛乳蛋白（具體為β-乳 球蛋白）變態(tài)反應(yīng)風險的嬰兒。這些肽能夠調(diào)節(jié)嬰兒對變應(yīng)原的免疫應(yīng)答。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛乳變態(tài)反應(yīng)(CMA)累及所有嬰兒的大約2.5%，被認為是該年齡組最為常見的食 物變態(tài)反應(yīng)[Sicherer SH et al.(2010)，F(xiàn)ood allergy, Sampson HA，J.Allergy Clin. Immunol · (125) (Sicherer SH等人，2010年，"食物變態(tài)反應(yīng)"，Sampson HA，《變態(tài)反應(yīng) 與臨床免疫學雜志》，第125卷）]。大約85%的兒童對牛乳的變態(tài)反應(yīng)隨著成長而逐漸消失， 在2至3歲之前不再出現(xiàn)。因此，CMA對其他年齡組的影響不太普遍。
[0003] 對牛乳和適宜滿足嬰兒需求的含牛乳配方食品的變態(tài)反應(yīng)是由于這樣的事實：牛 乳的蛋白質(zhì)不同于母乳的蛋白質(zhì)，因而可構(gòu)成變應(yīng)原。
[0004] 除母乳喂養(yǎng)外，預(yù)防CMA的主要建議是使用部分水解的低變應(yīng)原性配方食品，推薦 給特應(yīng)性父母所生的"高風險"無癥狀嬰兒服用這種配方食品。
[0005] 與用于嬰兒的標準牛乳配方食品相比，低變應(yīng)原性配方食品中的牛乳蛋白已被水 解，潛在變應(yīng)原性降低?，F(xiàn)已證實這種方法能有效地預(yù)防配方食品中存在的天然(全長)蛋 白（盡管含量比非水解配方食品中的低得多）的致敏作用。
[0006] 水解產(chǎn)物可被表征為"部分水解的"或"充分水解的"，具體取決于水解反應(yīng)進行的 程度。世界變態(tài)反應(yīng)組織(WA0)有關(guān)CMA的指南中所稱"充分水解產(chǎn)物"，目前還沒有約定的 法律/臨床定義，但已達成共識的是正如WA0所稱，現(xiàn)已證實經(jīng)水解的配方食品是可用于罹 患CMA的嬰兒、也被廣泛用于這類嬰兒的蛋白質(zhì)來源。在本發(fā)明中，部分水解產(chǎn)物的定義是： 其中60 %的蛋白質(zhì)/肽群體的分子量小于1000道爾頓的水解產(chǎn)物;充分水解產(chǎn)物的定義是： 其中至少95%的蛋白質(zhì)/肽群體的分子量小于1000道爾頓的水解產(chǎn)物。這些定義目前用于 本行業(yè)。
[0007] 目前市面上有許多基于酪蛋白或乳清、還具備低變應(yīng)原性的部分或充分水解配方 食品，例如雀巢公司(Nestle)出品的NAN-HA?(亦稱BEBA-HA?)、Alfare?、Alt6ra?，以及輝 瑞公司(Pf i zer)出品的S26-HA?。
[0008] 對于已表現(xiàn)CMA癥狀的嬰兒而言，非變應(yīng)原性代乳配方食品例如基于游離氨基酸 的配方食品（例如，雀巢公司（Nestle)出品的Vivonex?)或基于大豆的配方食品（例如紐約 輝瑞公司（Pf izer，New York)出品的S-26Soy?、NURS0Y?，以及雀巢公司（Nes11 ?)出品的 HESTLf: K GoodStart? ALSOY?)可為牛乳標準配方食品或低變應(yīng)原性配方食品的合適 替代品。
[0009] 因此，截至目前在向發(fā)生牛乳變態(tài)反應(yīng)的兒童提供營養(yǎng)方面的主要關(guān)注點，一直 是尋找不會誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)的制品，也就是提供非變應(yīng)原性配方。向嬰兒施用非變應(yīng)原性配 方食品（包含游離氨基酸、基于大豆的乳品或充分水解的牛乳蛋白）的缺點之一是，雖然此 類配方使對牛乳有變態(tài)反應(yīng)的嬰兒得以避免變態(tài)反應(yīng)，但它們無法使這些兒童產(chǎn)生對牛乳 蛋白變應(yīng)原的口服耐受性，所以這些兒童日后無法繼續(xù)飲用未改變的乳制品。
[0010] 口服耐受性是指事先經(jīng)口服途徑施用抗原，而特異性抑制細胞和/或體液對抗原 的免疫反應(yīng)。這是出生后前幾個月免疫系統(tǒng)發(fā)育的重要組成部分，可使嬰兒在吃東西時不 出現(xiàn)不良反應(yīng)。若未能建立口服耐受性，便引起變態(tài)反應(yīng)?？诜褪苄缘漠a(chǎn)生與正常的免疫 系統(tǒng)教育(減弱對食物抗原的反應(yīng))有關(guān)。
[0011]現(xiàn)已鑒定出了影響口服耐受性的誘導(dǎo)和維持的若干因素，這些因素包括食物蛋白 質(zhì)的結(jié)構(gòu)、抗原施用的劑量和頻率，以及宿主的免疫狀態(tài)。
[0012] 據(jù)信，可特別存在于部分水解嬰兒配方食品中的一些肽能夠與免疫系統(tǒng)相互作 用，因而誘導(dǎo)口服耐受性。
[0013] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，部分水解的乳配方不僅具有降低的變應(yīng)原性，還可誘導(dǎo)對乳蛋白的免 疫耐受性(EP 0827 679)。
[0014]因此，歐洲專利申請EP 2 332 428公開了一種配方，其包含能夠誘導(dǎo)口服耐受性 的含牛乳肽的水解產(chǎn)物。所討論的肽被鑒定為源自牛酪蛋白。
[0015] W0 00/42863描述了鑒定β-乳球蛋白（主要牛乳變應(yīng)原之一）的多種致耐受性肽的 方法，這些致耐受性肽能夠誘導(dǎo)口服耐受性，證據(jù)是與未接觸所討論的肽的小鼠相比，先前 接觸過所討論的肽的小鼠對該天然蛋白的免疫應(yīng)答(IgE)減弱。在該專利申請中，作者提到 了EP 0 629 350,其中公開了非變應(yīng)原性乳清蛋白水解產(chǎn)物的用途，據(jù)稱非變應(yīng)原性乳清 蛋白水解產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)牛乳蛋白耐受性。W0 00/42863的作者指出，盡管EP 0 629 350中表 明了基本上不含變應(yīng)原性蛋白的乳清蛋白水解產(chǎn)物可用于在有牛乳變態(tài)反應(yīng)風險的兒童 體內(nèi)誘導(dǎo)牛乳蛋白耐受性，但他們在分析其他非變應(yīng)原性乳清蛋白水解產(chǎn)物后發(fā)現(xiàn)，非變 應(yīng)原性不一定體現(xiàn)為誘導(dǎo)牛乳蛋白耐受性的能力。他們還表示，甚至一些表現(xiàn)出最高程度 非變應(yīng)原性的配方，也被發(fā)現(xiàn)不適于誘導(dǎo)牛乳蛋白耐受性。
[0016] 此外，已知的是，充分水解的配方食品失去了誘導(dǎo)長期口服耐受性的能力，也就是 說，水解以某種方式充分修飾了蛋白的性質(zhì)，導(dǎo)致該蛋白不再被免疫系統(tǒng)識別。這造成關(guān)鍵 有益效果損失。
[0017] 因此，需要進一步鑒定可影響口服耐受性的誘導(dǎo)的因素。非常希望提供低變應(yīng)原 性或非變應(yīng)原性組合物，這些組合物可用作母乳的補充或替代品，還能夠誘導(dǎo)嬰兒的口服 耐受性。
[0018] 需要提供可緩解(尤其是嬰兒的)變態(tài)反應(yīng)發(fā)展的合成營養(yǎng)液。需要誘導(dǎo)對多種變 應(yīng)原(包括乳變應(yīng)原和乳蛋白）的耐受性。
[0019] 還需要設(shè)計和制備營養(yǎng)干預(yù)(尤其是利用合成成分或成分的組合），這些營養(yǎng)干預(yù) 可在生命早期施用于嬰兒，降低以后生活中呈現(xiàn)或發(fā)生變態(tài)反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)發(fā)展的可能性 或嚴重程度。
[0020] 一般嬰兒群體以及體質(zhì)易發(fā)生變態(tài)反應(yīng)或發(fā)生過已公布變態(tài)反應(yīng)的嬰兒亞群都 有該需求。
[0021] 普遍需要緩解變態(tài)反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)癥狀，還需要開發(fā)誘導(dǎo)(尤其是兒童和嬰兒)對 常見變應(yīng)原例如乳變應(yīng)原的耐受性的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0022] 本發(fā)明提供了最新鑒定出的β-乳球蛋白（BLG)的肽，即SEQ ID No.l至SEQ ID No.5,這些肽用于在有蛋白變態(tài)反應(yīng)風險的個體以及已發(fā)生變態(tài)反應(yīng)的個體中誘導(dǎo)對乳蛋 白的耐受性。最新鑒定出的肽SEQ ID No. 1-5被HLA-DR(人白細胞抗原-DR)所識別并結(jié)合于 其上。因此，這些肽每一者都包含HLA表位，該HLA表位有利于被免疫細胞識別，還有利于誘 導(dǎo)哺乳動物對乳蛋白（尤其是乳球蛋白（BLG))的口服耐受性。乳蛋白可來自奶牛、綿羊、 山羊或水牛。
[0023] 因此，本發(fā)明涉及肽或肽的組合，所述肽具有五至十二個氨基酸的氨基酸長度并 包含選自SEQ ID No.1-5的序列，用于誘導(dǎo)哺乳動物對來自奶牛、綿羊、水?；蛏窖虻娜榈?白的口服耐受性。人類嬰兒尤其受到關(guān)注。
[0024] 為增強致耐受性效應(yīng)，可將具有五至十二個氨基酸的長度并包含表1中的序列a、b 和c之一的一種或多種肽，與上一段落中所述的基于SEQ ID No.1-5的肽或肽的組合聯(lián)合施 用。
[0025] 這些肽可按其純形式施用;稀釋于合適的液體中施用；或按藥物組合物、營養(yǎng)組合 物或營養(yǎng)補充劑的形式施用。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，這些肽為如下形式：（i)水解含BLG的蛋白類物質(zhì)所 得的分離的肽級分，和/或（i i)以合成方式制備的肽。
[0027] 這些肽的主要優(yōu)點是，可誘導(dǎo)哺乳動物對奶牛、綿羊、水牛或山羊乳蛋白（尤其是 乳球蛋白）的口服耐受性。這些哺乳動物可為幼年哺乳動物，特別是人類嬰兒，他們要么 因父母至少一方或至少一個同胞對牛乳有變態(tài)反應(yīng)，而有發(fā)展牛乳變態(tài)反應(yīng)的"高風險"， 要么沒有"高風險"。因此，本發(fā)明的肽有益于幼年哺乳動物的一般群體?？墒芤嬗谑┯帽景l(fā) 明的肽的另一組，是已對牛乳有變態(tài)反應(yīng)的成年哺乳動物。因此，有變態(tài)反應(yīng)的成年哺乳動 物在接觸本發(fā)明的致耐受性肽之后，可對天然變應(yīng)原"脫敏"。所以可將這些肽中的一種或 多種(兩種、三種、四種或所有五種)施用于哺乳動物，以誘導(dǎo)對乳蛋白（尤其是BLG)的口服 耐受性。
[0028] 可將這些肽施用于寵物，例如狗和貓。
[0029] 這些肽與之前從BLG鑒定出的肽(參見表1中的肽a、b、c)(參見W0 0042863)相比占 有優(yōu)勢。接觸BLG后，與之前鑒定出的肽a、b和c(參見圖1)相比，肽2-5更大程度下調(diào)了IgE的 表達(參見圖1)。
[0030]在一個優(yōu)選的實施方案中，所述肽或肽的組合為肽級分的形式，其包含肽SEQ ID No. 1至SEQ ID No.5中的至少一種?？蓪⑺鲭幕螂牡慕M合以0.4_50ymol/kg體重/天、優(yōu)選 0.9-40ymol/kg體重/天的劑量施用于幼年哺乳動物或成年哺乳動物。可每天施用一次、每 隔一天施用一次、每隔兩天施用一次，或每周施用一次并至少持續(xù)兩周，優(yōu)選至少持續(xù)一個 月，更優(yōu)選至少持續(xù)三個月?？沙掷m(xù)施用更長時間，例如最多三年。
[0031 ]對未接觸過BLG的受試者來說，"一次"施用便可有效誘導(dǎo)對BLG的口服耐受性。 [0032] 這些肽可按組合物的形式施用，該組合物為干品時，每克包含25至250yg肽，優(yōu)選 50至150yg肽?？蓪⑦@些肽加入基礎(chǔ)組合物中，該基礎(chǔ)組合物為1段嬰兒配方食品（starter infant formula)或較大嬰兒配方食品（follow-up infant formula)或成長乳（growing up milk)。所述基礎(chǔ)組合物可為"非變應(yīng)原性"或低變應(yīng)原性組合物。
[0033] 這些肽可按組合物的形式施用，所述組合物包含另外的成分或益生元，優(yōu)選地選 自菊粉、低聚果糖(F0S)、短鏈低聚果糖(短鏈F0S)、低聚半乳糖(G0S)、低聚木糖(X0S)、神經(jīng) 節(jié)苷脂、部分水解的瓜爾豆膠、阿拉伯樹膠、大豆膠或它們的混合物。
[0034] 這些肽可按組合物的形式施用，所述組合物包含另外的成分或益生菌，優(yōu)選地選 自副干酷乳桿菌(Lactobacillus paracasei )、乳桿菌(Lactobacillus)GG、鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus)、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum)、乳雙歧桿菌 (Bifidobacterium lactis)以及短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve)。
【附圖說明】
[0035]圖1:強飼天然β-乳球蛋白（nBLG)或合成肽、接著以實驗方式致敏的小鼠體內(nèi)的β- 乳球蛋白（BLG)特異性體液免疫應(yīng)答。
[0036]給小鼠強飼nBLG或合成肽，接著以實驗方式用nBLG致敏小鼠。定量測定第30天采 集的單獨血清中的BLG特異性IgE(A)抗體濃度。使用Kruskall-Wallis和Dunn多重比較事后 檢驗，結(jié)果顯示了指定組之間的統(tǒng)計顯著性(*P〈〇. 05，#0.01〈p〈0.001，*#p〈0.001)。
【具體實施方式】
[0037]在本發(fā)明中，術(shù)語"耐受性"應(yīng)被理解為特異性免疫無應(yīng)答性的狀態(tài)。免疫應(yīng)答的 體液(抗體)途徑和細胞介導(dǎo)(淋巴細胞等)途徑都可受到耐受性誘導(dǎo)的抑制?？诜褪苄允?破壞被認為是食物變態(tài)反應(yīng)的根本原因。
[0038]術(shù)語"變應(yīng)原"應(yīng)被理解為能夠引發(fā)哺乳動物、尤其是"高風險"幼年哺乳動物(包 括嬰兒或乳嬰）的變態(tài)反應(yīng)的蛋白或巨肽。如果父母至少一方或至少一個同胞為特應(yīng)性體 質(zhì)，則幼小嬰兒被認為有蛋白變態(tài)反應(yīng)的"高風險"。
[0039] 術(shù)語"致耐受性肽"應(yīng)被理解為這樣的蛋白片段，其對應(yīng)于天然蛋白的一部分，大 小為200至6000Da(3至50個氨基酸），優(yōu)選為500至3000Da，更優(yōu)選為500至1400Da，并能夠誘 導(dǎo)對天然蛋白的特異性口服耐受性。
[0040] 術(shù)語"非變應(yīng)原性"基礎(chǔ)組合物應(yīng)被理解為氮源包含均衡的氨基酸組成的組合物。 "非變應(yīng)原性"對于乳蛋白而言，被定義為單獨乳清蛋白不超過lppm的殘余變應(yīng)原性，以及 總酪蛋白不超過10ppm的殘余變應(yīng)原性。
[0041] 術(shù)語"致敏"意指變應(yīng)原特異性IgGl和/或IgE抗體的誘導(dǎo)/發(fā)展。
[0042] 本發(fā)明涉及多種最新鑒定出的肽，以及使用這些肽誘導(dǎo)幼年哺乳動物的一般群體 (包括被認為有發(fā)展CMA的"高風險"的群體和沒有發(fā)展CMA的"高風險"的群體）以及對牛乳 有變態(tài)反應(yīng)的成年哺乳動物產(chǎn)生對牛乳蛋白（尤其是對乳球蛋白）的口服耐受性。最新鑒 定出的肽也可誘導(dǎo)對來自綿羊、山羊或水牛的BLG的口服耐受性，因為這些肽也存在于綿羊 乳、山羊乳和水牛乳中。
[0043]本發(fā)明的肽具有五至十二個氨基酸的氨基酸長度，并包含選自SEQ ID No.1-5(參 見表1)的序列。所述肽因而具有特定長度(5至12個氨基酸）。
[0044]短于五聚物(長度為五個氨基酸）的肽可能無法提供致耐受性效應(yīng)，而長于12聚物 的肽被認為具有增大的變應(yīng)原性風險。
[0045]因此，所述肽可為包含選自SEQ ID No.1-5的序列中任一者的5聚物、6聚物、7聚 物、8聚物、9聚物、10聚物、11聚物或12聚物。因此，所述肽可為任一種這樣的肽:其為包含序 列IIAEK(SEQ ID No.l)、IVTQTM(SEQ ID No.l)、KGLDIQK(SEQ ID No.2)、DAQSAPLR(SEQ ID No.3)、VEELKPTPE(SEQ ID No.4)或IIAEK(SEQ ID No.5)的5聚物、6聚物、7聚物、8聚物、9聚 物、10聚物、11聚物或12聚物。
[0046]相似地，在與基于序列SEQ ID No. 1-5的上述肽一起施用時可提供增強效果的肽 是任一種這樣的肽:其為5聚物、6聚物、7聚物、8聚物、9聚物、10聚物、11聚物或12聚物，并包 含選自表1中的a、b和c的序列中任一者。
[0047] 因此，本發(fā)明的肽誘導(dǎo)哺乳動物對來自奶牛、綿羊、水牛或山羊的乳蛋白的口服耐 受性。
[0048] 肽的制備和表征
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，可采用技術(shù)人員已知的標準方法，以合成方式制備 分離的肽。另選地，根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，這些肽可從天然來源例如乳(如牛乳)或 乳級分濃縮、提取和/或分離，所述天然來源優(yōu)選地經(jīng)過改性、處理，以便例如產(chǎn)生或濃縮這 些肽。可采用本領(lǐng)域已知的方法生成其中乳蛋白已由酶或其他方式水解的乳水解產(chǎn)物。從 乳水解產(chǎn)物中提取、分離和鑒定包含本發(fā)明肽的肽級分的方法也是技術(shù)人員已知的。本發(fā) 明的肽可通過這些方法生成。
[0050] 例如，本發(fā)明的肽可使用US 5039532A中公開的方法制備。酶水解過程包含一個分 為兩步的水解反應(yīng)，在該水解反應(yīng)的兩個步驟之間有一個熱變性步驟，用于確保最終水解 產(chǎn)物基本上不含完整的變應(yīng)原性蛋白。例如，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶可用于這些方法，這 兩種酶可以是提取豬膜臟制備的制品、或利用重組DNA技術(shù)在細菌中制備的制品。
[0051] 例如，可使用包含乳清蛋白的任一種乳清原料進行酶水解。該原料可以是來自奶 酪制作過程的乳清，特別是甜乳清(例如用凝乳酶凝固酪蛋白得到的甜乳清）、用酸凝固酪 蛋白得到的酸乳清、或酸化發(fā)酵劑，甚至是在酸和凝乳酶共同作用下凝固得到的混合乳清。 該原料可以是通過離子交換和/或通過電滲析脫除了礦質(zhì)的乳清。該乳清可以是最多只含 一點乳糖的乳清蛋白濃縮物，其是例如通過超濾、任選地之后進行滲析而獲得的。該原料甚 至可為上述原料與乳糖的組合。該原料可為真正的水溶液或膠態(tài)水溶液的形式，或者粉末 的形式。若為粉末的形式，則粉末溶解于優(yōu)選被脫除了礦質(zhì)的水中，以形成水溶液。
[0052] 使用在堿性和中性范圍內(nèi)有活性的混合或純化的蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、胰 凝乳蛋白酶或胰酶），按已知的方式對該原料進行酶水解。該初步水解可使用少量酶(例如 占水解所用總量的10%)進行相對短的時間，優(yōu)選5至35分鐘，例如10分鐘。這能節(jié)省酶的用 量。在這種情況下，水解僅部分完成。該水解過程可在反應(yīng)器內(nèi)進行，或另選地在管內(nèi)進行。 [0053]如果待水解的底物在熱處理期間可能趨于凝固，則可將螯合劑(例如檸檬酸鈣或 檸檬酸鎂)加入該底物，如例如美國專利No. 4,748,034中指出的那樣。在6至8的pH值下，80 °(：至100°(：熱處理水解產(chǎn)物3至10分鐘。熱處理時間和溫度無疑是相關(guān)的，溫度下限對應(yīng)時 間上限，反之亦然。現(xiàn)已證實，在工業(yè)熱交換器中使用大約90°C的溫度和5分鐘左右的停留 時間，便足以使微量蛋白質(zhì)變性。實際上已發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)變性后更易接受后續(xù)的酶降解 處理。宜提及的是，熱處理使酶失活。
[0054] 然后將水解產(chǎn)物冷卻到40°C至60°C，優(yōu)選冷卻到大約55°C，55°C是保證水解活性 的最適溫度。優(yōu)選的是，通過添加堿的水溶液，將pH值調(diào)節(jié)至大約7.5。第二次水解的條件可 能有變。例如，可在恒溫控制的釜式反應(yīng)器中以分批方式不連續(xù)地進行。添加蛋白水解酶 (選自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰酶，或者胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶的混合物）水溶液之 后，水解60至180分鐘。
[0055]否則，第二次水解可在構(gòu)成紊流狀態(tài)反應(yīng)器的管中連續(xù)進行1至60分鐘，優(yōu)選2至 20分鐘。采用這種變型時，在管中反應(yīng)要獲得待水解產(chǎn)物的生產(chǎn)量所要求的一段時間，具體 時間量取決于管的長度。因此，必須將酶連續(xù)栗送到駐留管的入口。所得的高紊流狀態(tài)導(dǎo)致 酶與底物迅速而劇烈地接觸。不論選用何種模式(分批或連續(xù))執(zhí)行第二次水解，都對水解 產(chǎn)物進行熱處理，使酶失活。該熱處理包括將水解產(chǎn)物預(yù)熱到75°C或75°C以上，接著在該溫 度下(優(yōu)選在75°C至85°C下)保持約5分鐘以促進酶自身消化，有利的是在該處理之后滅菌， 優(yōu)選以注入蒸汽方式或在熱交換器中，在超高溫度下（例如125°C至135°C下）滅菌2至3分 鐘。然后，可例如通過噴霧干燥法或冷凍干燥法干燥水解產(chǎn)物，以用于不同應(yīng)用，或者甚至 可對水解產(chǎn)物進行后續(xù)處理。在后一種情況下，酶可在后續(xù)處理期間失活。
[0056] 肽的鑒定和表征
[0057]在實施例1中詳述的一組實驗中，本發(fā)明人鑒定出了負責誘導(dǎo)對乳蛋白（尤其是 BLG)的口服耐受性的BLG肽序列。在第一步中，使用基于細胞的測定法，將雀巢公司(Nestl ?)出品的部分水解嬰兒配方食品NAN HA?(另稱作BEBE HA?)與表達主要組織相容性復(fù)合 體(MHC) II類受體HLA-DR的人類細胞一起溫育。作為誘導(dǎo)口服耐受性的第一步，HLA受體將 肽序列呈遞給T細胞，從而誘導(dǎo)耐受性。因此，耐受性的產(chǎn)生很大程度上取決于MHC對肽序列 的識別。
[0058] MHC的肽結(jié)合區(qū)域識別由平均十個氨基酸、最少五個氨基酸構(gòu)成的肽序列或肽裝 配物。實際上，這些五肽可包含在更長的肽序列(甚至蛋白質(zhì)）中，因為這些肽序列在胃腸道 中會被消化，而得到這種5至18個氨基酸的較小肽尺寸。這部分解釋了游離氨基酸、二肽、三 肽和四肽所構(gòu)成的充分水解產(chǎn)物無法誘導(dǎo)口服耐受性的原因。
[0059]因此在本發(fā)明中，在存在NAN-HA?配方食品（經(jīng)證實對細胞無毒）的情況下培養(yǎng)表 達HLA-DR的人類細胞，利用免疫沉淀法分離結(jié)合于HLA受體的肽，然后通過質(zhì)譜和氨基酸測 序進行鑒定。
[0060] 最新鑒定出的肽來自BLG，列于表1中。
[0061]
[0062] 還通過該方法鑒定出了肽a 即IDALNENK、肽b 即VLDTDY和肽c 即EVDDEALEK。這些肽 之前在W0 20042863中被鑒定為口服耐受性的誘導(dǎo)物。這些肽在后一文獻中被鑒定為較長 肽序列的一部分。因此，這些已知的肽充當本實驗中的陽性對照。
[0063] 證實這些肽在體內(nèi)具有致耐受性
[0064] 利用BLG致敏實驗小鼠模型，進一步評估了這些肽序列在體內(nèi)誘導(dǎo)口服耐受性的 能力(參見實施例2和圖1)。
[0065] 該動物模型之前已用于展示天然BLG在強飼后誘導(dǎo)耐受性的功效[Patient，Ket et al.,(2011).Oral tolerance and Treg cells are induced in BALB/c mice after gavage with bovineP-lactoglobulin.Allergy ,66(10)，1312_1321(Patient，Ket等人， 2011年，"強飼牛β-乳球蛋白后在BALB/c小鼠中誘導(dǎo)口服耐受性和Treg細胞"，《變態(tài)反應(yīng)》， 第66卷，第10期，第1312-1321頁）]。有趣的是，在后一文章中，已展示經(jīng)過胰蛋白酶水解的 BLG不會誘導(dǎo)口服耐受性。
[0066] 小鼠模型用于測量全長天然BLG以及與牛BLG的序列（84-106)和（25-107)對應(yīng)的 兩種BLG合成肽誘導(dǎo)口服耐受性的水平。在第1天、第2天、第3天、第8天、第9天和第10天采用 強飼法，給小鼠喂食天然BLG或者合成肽(84-106)或(25-107)。然后在第14天通過腹膜內(nèi)施 用天然BLG，使這些小鼠致敏。在第30天與第33天之間測量血清IgE水平。
[0067] 從圖1可以看出，強飼天然BLG有效誘導(dǎo)了耐受性，從而防止在用BLG致敏后進一步 誘導(dǎo)BLG特異性IgE生成。肽(25-107)包含本發(fā)明的序列2、3、4、5,以及之前已知的肽a，其與 對照(PBS)相比導(dǎo)致血清IgE水平下降（ρ = 0·04)。肽(84-106)包含序列5、a、b和c，其與PBS 相比，展示出導(dǎo)致IgE水平下降的趨勢。
[0068] 本發(fā)明人推斷，與來源于序列(84-106)的肽(a、b和c)相比，來源于序列（25-107) 的肽1-5在該小鼠模型中誘導(dǎo)口服耐受性方面更為有效。這些較長的肽序列（25-107)和 (84-106) -旦被強飼給小鼠，就自然而然地被胰酶和蛋白酶加工，從而產(chǎn)生較小的肽，包括 含有序列SEQ ID如.1-5及序列&、13和(3的肽。
[0069] 該實驗展示，最新鑒定出的肽1-5被HLA-DR識別并結(jié)合于其上。然后這些肽可被呈 遞給T細胞。該過程允許誘導(dǎo)對包含這些序列的變應(yīng)原性蛋白（即BLG)的口服耐受性?，F(xiàn)已 基于誘導(dǎo)口服耐受性的能力，篩選了根據(jù)本發(fā)明的肽或肽1-5的組合。
[0070] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，為誘導(dǎo)口服耐受性而施用的肽或肽的組合選自序列 SEQ ID No.1-5。
[0071] 據(jù)推測，與選自表1中的已知肽a、b和c的一種或多種肽聯(lián)合施用時，肽所產(chǎn)生的致 耐受性效應(yīng)得到加強。與肽組a、b、c或1-5單獨服用時所誘導(dǎo)的效應(yīng)相比較，預(yù)期該組合在 誘導(dǎo)對BLG的口服耐受性方面提供增強的效應(yīng)。
[0072]因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，將選自SEQ ID No. 1-5的肽或肽組合與肽a、b 和c聯(lián)合施用。
[0073]序列SEQ ID No. 1-5已被鑒定為在如下物種的BLG中是高度保守的（序列同一性為 100%):奶牛、水牛、家山羊、綿羊和摩弗倫羊。因此，據(jù)信包含這些序列的這些乳源中的任 一種都可誘導(dǎo)對牛乳的口服耐受性，反之亦然。所以本發(fā)明人推測，本發(fā)明人鑒定出的肽可 誘導(dǎo)對來自這些源中任一源的BLG的口服耐受性。在許多國家，山羊乳和綿羊乳被用來替代 牛乳，或用來補充牛乳。市面上已有使用山羊乳乳清作為蛋白質(zhì)來源的嬰兒配方食品。因 此，將本發(fā)明的成果應(yīng)用于來自除奶牛之外物種的乳可能很有價值。
[0074]根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，以足以誘導(dǎo)對牛BLG的口服耐受性（優(yōu)選誘導(dǎo)對牛 BLG的完全口服耐受性）的量施用所述肽或肽的組合。BLG也可來自綿羊或山羊。完全口服耐 受性指的是，在用牛乳(特別是牛BLG)進行DBPCFC(雙盲安慰劑對照食物激發(fā)試驗）后未觀 察到變態(tài)反應(yīng)。
[0075]根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，這些肽的含量可為總蛋白的0.01 %至5%，優(yōu)選 0.1% 至 0.5%〇
[0076]根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，這些肽的組合包含一種或兩種或三種或四種或更多 種肽。
[0077] 所述肽或肽的組合可被單獨地（以其純的形式，或稀釋于例如水或母乳中）或作為 組合物直接經(jīng)口施用于幼年哺乳動物，所述組合物為嬰兒乳品配方食品或食物補充劑(例 如人乳強化劑）。所述肽或肽的組合也可在營養(yǎng)性喂養(yǎng)期間所用的任何乳載體、非乳基嬰兒 配方食品、嬰孩米粉或酸奶、嬰孩餐奶酪布丁、乳制品或果汁飲料、冰沙、小吃、餅干或其他 烘焙食品中施用。所述肽或肽的組合可被以飲料、食物或食物補充劑的形式施用于成人。所 述肽或肽的組合也可以在寵物食物和飲料(例如任何干燥食物或粗磨食物、濕潤食物或罐 裝食物、或者補充劑）中施用。
[0078] 合成肽和/或由人工方法濃縮的肽可為人造嬰兒配方食品、人造水解嬰兒配方食 品（部分或充分水解)或一般性人造營養(yǎng)組合物的一部分。此類組合物可為本發(fā)明的實施方 案。
[0079] 此類組合物可按指示的劑量用作營養(yǎng)液或藥物，以誘導(dǎo)尤其是對乳蛋白的口服耐 受性。可將此類組合物施用于嬰兒，或呈現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)癥狀或變態(tài)反應(yīng)易感性的嬰兒亞群。這 樣誘導(dǎo)口服耐受性，可在中期（治療期間或在治療后1、6、12或18個月內(nèi)）緩解變態(tài)反應(yīng)。另 選地或此外，所誘導(dǎo)的口服耐受性在以后生活中（例如，治療后24、36、48、72個月），尤其是 在免疫系統(tǒng)已成熟后，可能有積極的效果。
[0080] 劑量
[00811根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，這些肽的劑量在0.4至50ymol/kg體重/天的范圍內(nèi)， 優(yōu)選在0.9至40ymol/kg體重/天的范圍內(nèi)。例如，如果這些肽作為粉末狀嬰兒配方食品的一 部分施用，則這些肽在該配方食品中的濃度可為50至150yg/g粉末。供嬰兒食用的嬰兒配方 食品的典型劑量是:對五個月大的嬰孩來說，每天三瓶，每瓶七勺粉末;對六個月大或六個 月以上的嬰孩來說，每天兩瓶，每瓶七勺粉末。所述劑量以下列嬰孩平均體重為基礎(chǔ):六個 月大時，約8千克;十二個月大時，約9.5千克。
[0082] 施用時間
[0083] 本發(fā)明的肽的施用時間可為連續(xù)的或不連續(xù)的。要獲得更持久的效果，優(yōu)選連續(xù) 施用。然而，據(jù)推測，不連續(xù)模式(例如，在每月某一周內(nèi)每日施用，或者每施用一周(每日施 用)停用一周)可為幼年哺乳動物或成年哺乳動物帶來積極效果。
[0084] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，對尚未接觸BLG的幼年哺乳動物（"初治受試者"）來 說，據(jù)推測，本發(fā)明的肽或肽組合的"一次劑量"可足以誘導(dǎo)對BLG的口服耐受性。更一般地 說，建議采用更長的持續(xù)時間，例如，在一至三周內(nèi)每天施用。
[0085]在已接觸BLG的幼年哺乳動物中，優(yōu)選地采用更長的施用時間。一般來講，雖然預(yù) 計采用相對較短的施用持續(xù)時間（例如，在一至四周內(nèi)每天施用）就能得到積極效果，但據(jù) 信更長的持續(xù)時間能使效果增強(例如，對人類來說三至六個月的持續(xù)時間，以及對其他哺 乳動物來說相對應(yīng)的時間）。
[0086] 對于已對BLG有變態(tài)反應(yīng)的成年哺乳動物而言，可能需要至少一個月的施用時間 才能實現(xiàn)"脫敏"。
[0087] 優(yōu)選地，施用方式為每日服用（每日服用一次或兩次）或每周服用（每周服用四次 或三次或兩次或一次）。
[0088] 與其他化合物一起施用
[0089] 這些肽可單獨地施用（以其純形式施用，或稀釋于例如水或乳(包括人乳）中），或 與其他化合物(諸如膳食補充劑、營養(yǎng)補充劑、藥物、載體、調(diào)味劑、易消化或不易消化的成 分)混合施用。
[0090] 這些肽可例如作為組合物的一部分施用給幼小嬰兒，該組合物為人乳強化劑或其 他營養(yǎng)補充劑。如果要將這些肽施用給成人，則這些肽可作為食物、飲料或膳食補充劑的一 部分施用。這些肽也可在藥物組合物中施用給所有受試者(幼年哺乳動物或成年哺乳動物 等)。
[0091] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，這些肽可加入到或包含在基礎(chǔ)組合物中，該基礎(chǔ)組 合物為用于哺乳動物、特別是人類和寵物的低變應(yīng)原性組合物。因此，其中添加有或可含有 這些肽的基礎(chǔ)配方食品可為低變應(yīng)原性(HA)配方食品或非變應(yīng)原性配方食品，在低變應(yīng)原 性(HA)配方食品中，乳蛋白被部分水解，而在非變應(yīng)原性配方食品中，乳蛋白被充分水解， 或被替換為游離氨基酸或牛乳替代品諸如基于大豆的乳品。這種基礎(chǔ)配方食品可例如為用 于具有特定生理/病理狀態(tài)的兒童的嬰兒配方食品、較大嬰兒配方食品或營養(yǎng)組合物。
[0092] 在一個實施方案中，基礎(chǔ)配方食品是元素性嬰兒配方食品，并且該基礎(chǔ)配方食品 不包含肽或蛋白質(zhì)，而僅包含氨基酸。在一個實施方案中，基礎(chǔ)配方食品的蛋白質(zhì)部分地或 完全地來源于已去除cGMP的甜乳清。在這方面可參見EP880902,其中的一種工藝允許去除 牛乳清中幾乎所有酪蛋白糖巨肽(富含蘇氨酸且色氨酸含量很低的級分），從而提高α-乳白 蛋白比例(色氨酸非常豐富的級分）。通過將該改性甜乳清級分與脫脂乳相結(jié)合，同時加入 一些游離L-組氨酸和L-精氨酸（以便達到EC指令所要求的這些氨基酸的最小量），使得根據(jù) 本發(fā)明的配方具有更接近人乳的氨基酸分布，其特征具體地講在于具有相當?shù)纳彼岷吞K 氨酸水平，從而允許將其蛋白質(zhì)含量調(diào)整為人乳的蛋白質(zhì)含量。
[0093] 當與上述優(yōu)化的蛋白質(zhì)分布一起施用時，應(yīng)當理解，這些肽可與優(yōu)化的蛋白質(zhì)協(xié) 同地作用，從而不僅實現(xiàn)口服耐受性的誘導(dǎo)，同時還提供優(yōu)化的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值(這可通過 以最適定量方式滿足蛋白質(zhì)需求來增強這些肽的效果）。
[0094] 當與元素性氨基酸一起施用時，應(yīng)當理解，這些肽的效果不會因存在潛在變態(tài)反 應(yīng)誘導(dǎo)性蛋白質(zhì)而被隱匿或抑制。
[0095]可將這些肽例如作為嬰兒配方食品的一部分以每克粉末中50yg-150yg肽的濃度 施用。
[0096] 其中加有這些肽的基礎(chǔ)低變應(yīng)原性組合物可包含作為氮源的肽或游離氨基酸，尤 其是來自奶?；蛏窖蚧蚓d羊的乳蛋白，諸如乳清蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、牛血清白 蛋白、酪蛋白酸、酪蛋白酸鹽、或α、β、κ_酪蛋白。氮源可提供總能量的至少7%至25%。
[0097] 維生素和礦物質(zhì)是典型膳食補充劑的示例。在一個優(yōu)選的實施方案中，該組合物 與其他化合物一起施用，所述其他化合物能增強對幼年哺乳動物或有變態(tài)反應(yīng)的成年哺乳 動物的免疫力的所述效果。此類化合物可以是協(xié)同地或單獨地影響嬰兒的免疫應(yīng)答并且/ 或者增強這些肽的效果的其他活性化合物，諸如益生菌和益生元。
[0098] 已知的益生菌化合物的示例是芽孢桿菌屬（Bac i 1 1 u s )、雙歧桿菌屬 (Bifidobacterum)、乳桿菌屬（Lactobacillus)、酵母屬（Saccharomyce)、嗜熱鏈球菌 (Streptococcus thermophilus)、屎腸球菌（E.Faecium)、大腸桿菌（E.Coli)Nissle。具體 地講，益生菌和非復(fù)制型益生菌，諸如乳桿菌屬、雙歧桿菌屬或它們的組合，例如副干酪乳 桿菌、乳桿菌GG、鼠李糖乳桿菌、長雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、短雙岐桿菌或它們的組合，以及 這些細菌的應(yīng)用。
[0099] 已知的益生元化合物的示例是選自如下物質(zhì)的碳水化合物：菊粉、低聚果糖 (F0S)、短鏈低聚果糖(短鏈F0S)、低聚半乳糖(G0S)、低聚木糖(X0S)、神經(jīng)節(jié)苷脂、部分水解 的瓜爾豆膠(PHGG)、阿拉伯樹膠、大豆膠或它們的混合物?？纱嬖谄渌妓衔?，諸如與 第一碳水化合物協(xié)同作用的第二碳水化合物，其選自低聚木糖(X0S)膠、阿拉伯樹膠、淀粉、 部分水解的瓜爾豆膠或它們的混合物。所述一種或多種碳水化合物可以約lg至約20g存在， 或者以占組合物日劑量的1 %至80 %或20 %至60 %存在。另選地，碳水化合物以干燥組合物 的10%至80%存在。
[0100] 在一個實施方案中，根據(jù)W02007/090894(-般教導(dǎo)內(nèi)容，特別是實施例1)，基礎(chǔ)配 方食品或最終營養(yǎng)組合物包含低聚糖的混合物。其可特別地與G0S聯(lián)合使用?；A(chǔ)配方食品 可提供低聚糖混合物，該低聚糖混合物包含5重量％_7〇重量％的選自6&1嫩(^1，36&101， 4Glc和Gaim，6GalNAcal，3Gaim，4Glc的至少一種N-乙?；途厶?、20重量％-90重量％的 選自6&101，6631、63101，663101，461〇63101，663101，661。、63101，363101，361。、63101， 3Gaim，4Glc、Gaim，6Gaim，6Gaim，4Glc、Gaim，6Gaim，3Gaim，4Glc Gaim，3Gaim， 6Gaim，4Glc和Gaim，3Gaim，3Gaim，4Glc的至少一種中性低聚糖，以及5重量％-50重 量％的選自NeuAca2，3Gaim，4Glc和NeuAca2，6Gaim，4Glc的至少一種唾液酸化低聚糖。 [0101 ]在一個實施方案中，基礎(chǔ)配方食品的混合物或最終營養(yǎng)組合物的混合物包含10重 量％-70重量％的指定N-乙?；途厶?、20重量％_80重量％的指定中性低聚糖以及10重 量％-50重量％的指定唾液酸化低聚糖。更優(yōu)選地，該混合物包含15重量％-40重量％的^ 乙?；途厶恰?0重量％ -60重量％的其他中性低聚糖以及15重量％ -30重量％的唾液酸化 低聚糖。特別優(yōu)選的混合物包含30重量％的^乙?；途厶恰?0重量％的中性低聚糖以及 20重量％的唾液酸化低聚糖。
[0102] 另選地，該混合物可適宜地包含5重量％_20重量％的指定N-乙?；途厶恰?0重 量％-90重量％的指定中性低聚糖以及5重量％-30重量％的指定唾液酸化低聚糖。
[0103] 本發(fā)明的低聚糖混合物可由一種或多種動物乳制備。所述乳可得自任何哺乳動 物，特別是得自奶牛、山羊、水牛、馬、大象、駱駝或綿羊。
[0104] 另選地，低聚糖混合物可通過購買并混合單獨的組分來制備。例如，合成的低聚半 乳糖諸如Gaim，6Gaim，4Glc Gaim，6Gaim，6Glc、Gaim，3Gaim，4Glc、Gaim，6Gaim， 6Gaim，4Glc、Gaim，6Gaim，3Gaim，4Glc和Gaim，3Gaim，6Gaim，4Glc以及它們的混合 物可以商標Vivind?和Elix'Or?商購獲得。低聚糖的其他供應(yīng)商為Dextra實驗室(Dextra Laboratories)、西格瑪奧德里奇化學有限責任公司（Sigma-Aldrich Chemie GmbH)和協(xié)和 發(fā)酵工業(yè)株式會社(1^0￥3他1^〇1((^7〇(：0.，1^(1)。另選地，可使用特定糖基轉(zhuǎn)移酶(例如 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)來生產(chǎn)中性低聚糖。
[0105] 可通過將氨基葡糖苷酶和/或氨基半乳糖苷酶作用于N-乙?；咸烟呛?或N-乙 ?；肴樘莵碇苽銷-乙?；途厶恰Ｍ瑯拥?，N-乙酰基-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和/或N-乙?；?半 乳糖基轉(zhuǎn)移酶也可用于此目的。N-乙?；途厶沁€可通過發(fā)酵技術(shù)使用相應(yīng)的酶(重組酶 或天然酶)和/或微生物發(fā)酵制得。在后一種情況下，微生物可表達其天然酶和底物，或者可 被工程改造成能夠產(chǎn)生相應(yīng)的底物和酶?？墒褂脝我晃⑸锱囵B(yǎng)物或混合培養(yǎng)物?？梢宰?初具有任意聚合度(DP)的受體底物為起始物，逐步聚合(從DP=1開始)形成N-乙?；途?糖。另一種選擇是將游離的己酮糖或與低聚糖(如，乳酮糖)結(jié)合的己酮糖(如，果糖)化學轉(zhuǎn) 化成N-乙酰己糖胺或包含N-乙酰己糖胺的低聚糖，如Wrodnigg，Μ· ; Stutz，A· E · (1999) Angew.Chem. Int .Ed. 38:827_828(Wrodnigg，Τ·Μ·、Stutz，Α·Ε·，1999年，《德國應(yīng)用化學》， 第38卷，第827-828頁）中所述。
[0106] 可通過層析或過濾技術(shù)從天然來源例如動物乳中分離唾液酸化低聚糖，即3'唾液 酸化乳糖和6'唾液酸化乳糖。另選地，也可通過利用特異性唾液酸轉(zhuǎn)移酶的生物技術(shù)方法， 通過基于酶的發(fā)酵技術(shù)(重組酶或天然酶)或微生物發(fā)酵技術(shù)來制備唾液酸化低聚糖。在后 一種情況下，微生物可表達其天然酶和底物，或者可被工程改造成能夠產(chǎn)生相應(yīng)的底物和 酶?？墒褂脝我晃⑸锱囵B(yǎng)物或混合培養(yǎng)物。可以最初具有任意聚合度(DP)的受體底物為 起始物，逐步聚合(從DP = 1開始)形成唾液酸化低聚糖。
[0107] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，將上述低聚糖混合物摻入食物產(chǎn)品中。在本發(fā)明的上 下文中，術(shù)語"食物產(chǎn)品"旨在涵蓋任何可食用的物質(zhì)。因此，"食物產(chǎn)品"可為旨在供人類食 用的產(chǎn)品，特別是嬰兒配方食品、較大嬰兒配方食品、嬰孩食物諸如嬰兒米粉等等。具體地 講，可將本發(fā)明的低聚糖混合物摻入嬰兒配方食品、脫水奶粉或米粉混合物中。
[0108] 上述低聚糖以某種方式呈現(xiàn)出增強受試者免疫狀態(tài)(上調(diào)或下調(diào)）的有利效果，使 得受試者更易接收這些肽對口服耐受性的誘導(dǎo)。該增強效果可直接作用于免疫系統(tǒng)或炎癥 途徑，或可通過由低聚糖選擇性地促進的腸益生菌介導(dǎo)。
[0109] 該組合物中可包含一種或多種必需長鏈脂肪酸(LC-PUFA)?？商砑拥腖C-PUFA的示 例為二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(AA)?？蓪C-PUFA以一定濃度加入，使得它們占 該組合物中存在的脂肪酸的0.01 %以上。
[0110]如果需要，可在營養(yǎng)組合物中包含一種或多種食品級乳化劑;例如，二乙?；剖?酸單和雙甘油酯、卵磷脂及單和雙甘油酯，或它們的混合物。相似地，可包含合適的鹽和/或 穩(wěn)定劑?？蓪⒄{(diào)味劑加入該組合物中。 Com]這些肽可摻入到或存在于如下組合物中：該組合物為適用于未足月產(chǎn)下的嬰兒或 在出生時體重低的嬰兒的嬰兒"早產(chǎn)兒配方食品"、"1段嬰兒配方食品"或"較大嬰兒配方食 品"。在實施例3中給出了此類1段嬰兒配方食品的示例。
[0112] 實施例1:分離和鑒定能夠誘導(dǎo)對BLG的口服耐受性的肽
[0113] 細胞培養(yǎng)
[0114] 為了評估兩種不同人類單核細胞(U937和Thpl)中的MHC受體表達情況，在冰上用 APC綴合的抗HLA_DR(Santa Cruz Biotechnologies(圣克魯斯生物技術(shù)公司），clone L243)對細胞染色30分鐘，用補充有0.5%?05(411^1116(1，8丨〇(3〇1^6?丨（百康特公司））的冷1^3 lX(Sigma(西格瑪公司））洗滌兩次，然后在流動分析儀BD Fortessa(BD(碧迪公司））上進行 分析。
[0115] 為了評估MBA-HA嬰兒配方食品對U937和Thpl細胞系的毒性，將細胞與在完全 RPMI1640培養(yǎng)基中復(fù)原的各種濃度的BEBA-HA產(chǎn)品（在10mg至lng的范圍內(nèi)）一起溫育。將細 胞以1 X 106個細胞/mL的濃度接種于24孔板中，在存在5%C02的情況下以37°C溫育24h。將細 胞離心沉降下來，并用補充有〇.5%FCS的PBS IX洗滌兩次，然后用PE膜聯(lián)蛋白V細胞凋亡檢 測試劑盒I(BD Pharmingen(碧迪醫(yī)藥公司））進行染色。最后，在BD Fortessa(BD(碧迪公 司））上通過流式細胞術(shù)對細胞進行分析。結(jié)果表明，在實驗所用的劑量下，BEBA-HA對細胞 是無毒的。
[0116] 將Thpl和U937細胞以1X106個細胞/mL的濃度接種于T175cm2(Falcon)中含L-谷氨 酰胺(Sigma(西格瑪公司））且補充有10%熱滅活?03(細;[1]16(1，13;[0001106口1:(百康特公司））和 青霉素/鏈霉素(Sigma(西格瑪公司））的20mL RPMI-1640培養(yǎng)基中，在存在5%C02的情況下 以37°C溫育24小時，所述培養(yǎng)基分別加有l(wèi)yg/mL和100yg/mL的BEBA-HA(Nestl6(雀巢公 司），批號L02680742AP)。將細胞離心沉降下來，并收集用于進行MHC-肽復(fù)合體的免疫沉淀。
[0117] 蛋白質(zhì)裂解物和免疫沉淀
[0118] 簡而言之，對于所測試的每種條件(對于兩種細胞系，均不在對照中加入BEBA-HA， 而在樣品中加入BEBA-HA)，均將2 X 107個細胞重懸于冰冷TBS中并洗滌三次。然后將細胞沉 淀物重懸于包含1 % CHAPS和蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中。在裂解后，收集上清液，并與抗 體-PAS微珠混合，該抗體-PAS微珠事先通過如下方式制備:將60μ1的PAS微珠與50yg對HLA- DR分子具有特異性的MHC II單克隆抗體(Clone L243) -起溫育。在4°C下伴隨輕柔振蕩過 夜溫育裂解物和Ab-微珠。在親和捕獲后，將微珠離心沉降下來，并棄去上清液。分別使用如 下條件進行若干次洗滌：lXlmL 1%CHAPS緩沖液，lXlmL 20mM Tris/50mM NaCl，lXlmL 20mM Tris pH 8.0。洗滌后，將200μ1的10%乙酸溶液加入微珠中，溫和地渦旋，然后在70°C 下溫育15min。將微珠在14000g下離心5min沉降下來。重復(fù)該步驟一次。將兩次的上清液合 并，然后使用10kDa截留分子量的超濾管(Amicon 1]11:瓜，]/[;[11丨口0代(密理博公司））進行過 濾。將滲余物(主要包含HLA-DR抗體和HLA-DR分子)和濾液(包含HLA-DR呈遞肽)保持在20 °C 下，以用于進一步的LC-MS/MS分析。
[0119] MS 分析
[0120]在MS分析之前，使用反相C18(The Nest group，USA(美國雀巢集團））或混合模式 0ASIS (Water s，USA (美國沃特世公司））脫鹽柱，按照制造商手冊中所述的方法，對HLA-DR肽 進行脫鹽。脫鹽后，使用與Orbitrap XL儀器連接的用于肽分離(2-35%乙腈/0.1%甲酸，在 30分鐘內(nèi)）的內(nèi)部Magic C18柱（150 X 0.075mm)，通過納米級LC-MSMS分析肽。使用每次全掃 描含量最高的五種離子的數(shù)據(jù)依賴性采集技術(shù)，選擇肽進行碎片化。開啟動態(tài)排除，排除持 續(xù)時間為30秒。使用碰撞誘導(dǎo)解離(CID)以35%碰撞能量進行碎片化。最后通過對牛乳數(shù)據(jù) 庫進行Sequest數(shù)據(jù)庫搜索，對肽進行鑒定，并且基于光譜質(zhì)量和得分進行手動驗證。
[0121] 實施例2:強飼nBLG或合成肽、接著以實驗方式致敏的小鼠體內(nèi)的BLG特異性體液 免疫應(yīng)答
[0122] /Mj
[0123] 將無特定病原（SPF)的BALB/cJ小鼠（3至4周齡雌鼠 ，Centre d'Elevage Ren6 Janvier，Le Genest Saint-Isle,France(法國勒熱內(nèi)斯圣伊斯爾的勒內(nèi)·讓維耶畜牧中 心））圈養(yǎng)在過濾飼養(yǎng)籠中，處于正常SPF飼養(yǎng)條件下(高壓滅菌的墊料和無菌水），馴化兩周 后進行實驗。用適當飲食飼養(yǎng)這些小鼠，所述飲食去除了動物蛋白質(zhì)，并且使用專門的夾心 免疫測定法未在其中檢出BLG。所有動物實驗根據(jù)歐共體動物管理規(guī)定進行，并且獲得了 French Veterinary Services(法國獸醫(yī)局）的授權(quán)91-368。所有實驗均由（Veterinary Inspection Department of Essonne, France(法國埃松省獸醫(yī)檢查部門））的協(xié)議 N〇.2009-DDSV_074(2009年 10 月 29 日）涵蓋。
[0124] 施用BLG和合成肽的效果
[0125] 給各組小鼠（每組6只或7只）施用4mg的天然牛BLG，或等量（即，0.22μπι〇1)的分離 的合成BLG肽。施用與牛BLG序列編號84-106(Mff 2731Da)對應(yīng)的0.6mg的合成肽(84-106)或 者與牛BLG序列編號25-107(MW 9440Da)對應(yīng)的2mg的合成肽(25-107)(n = 7/組）。九只對照 小鼠接受PBS。將合成肽(25-107)和(84-106)稀釋于PBS中。使用動物喂養(yǎng)針(Popper&sons， NY(紐約波普父子公司））以胃內(nèi)強飼的方式在第1、2、3、8、9和10天進行施用。對照小鼠接受 PBS(陰性對照小鼠，n= 16)。然后在第14天通過腹膜內(nèi)施用5yg吸附到明礬上的天然牛BLG (錯膠3 %，Superf os，Danemark(丹麥舒泊弗斯公司），lmg/小鼠），使所有小鼠致敏。
[0126] 通過如下方式評估小鼠致敏的效力：在第30-33天之間對處于淺麻醉（異氟烷， Baxter(百特公司））狀態(tài)的小鼠從眼窩后靜脈叢采集單獨血清樣品，對該樣品的BLG特異性 IgE抗體進行定量測量。非特異性結(jié)合是使用來自10只初次實驗的小鼠的單獨血清來確定， 并且根據(jù)用免疫血清測得的吸光度值來推斷的。
[0127] 使用非配對t檢驗及Welch校正進行統(tǒng)計分析，分析表明接受肽(25-107)的小鼠和 PBS組的BLG特異性IgE抗體濃度之間存在顯著性差異(p = 0.04)(參見圖1)。
[0128] 統(tǒng)計分析
[0129] 所有統(tǒng)計分析均使用適用于Windows的GraphPad Pr i sm版本4 · 00 (GraphPad Software，San Diego，CA，USA(美國加利福尼亞州圣地亞哥GraphPad軟件公司））進行。首先 使用Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗檢查正態(tài)分布，之后再用單因素方差分析和Tukey多重比較 事后檢驗進行統(tǒng)計顯著性的分析。當數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布時，使用Kruskal-Wallis檢驗，然后 使用Dunn多重比較檢驗(DMCT)，來進行非參數(shù)檢驗。當p〈0.05時，則視為各組之間存在顯著 差異。使用非配對t檢驗對兩個特定組進行比較，并且對對數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)進行Welch校正，從而 獲得可比較的變異性。
[0130] 實施例3:
[0131] 下面給出了根據(jù)本發(fā)明使用的嬰兒配方食品的組成的實施例。該組成僅以舉例的 方式給出。
【主權(quán)項】
1. 用于誘導(dǎo)哺乳動物對來自奶牛、綿羊、水?；蛏窖虻娜榈鞍椎目诜褪苄缘碾幕蛩?述肽的組合，所述肽具有五至十二個氨基酸的氨基酸長度并且包含選自SEQ ID No.1-5的 序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽或肽的組合，其中所述肽或肽的組合還與具有五至十二個 氨基酸的氨基酸長度并且包含選自a、b和c的序列的一種或多種肽相組合。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的肽或肽的組合，其中所述哺乳動物為人類嬰兒。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的肽的組合，其中所述組合由兩種、或三種、或四 種、或更多種肽組成。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的肽或肽的組合，其中所述一種或多種肽來源于 乳，特別是來源于乳球蛋白。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中所述肽或肽的組合以如 下形式存在：（i)水解包含變應(yīng)原性蛋白，特別是乳球蛋白的蛋白質(zhì)類物質(zhì)所得的分離的 肽級分，和/或（ii)合成制備的一種或多種肽。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中在事先、同時或后續(xù)用 β-乳球蛋白致敏時，所述肽或肽的組合下調(diào)哺乳動物中的IgE表達。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中所述肽或肽的組合以 0.4_50ymol/kg體重/天、優(yōu)選地0.9_40ymol/kg體重/天的劑量施用。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中所述肽或肽的組合每 天施用一次，或每隔一天施用一次，或每隔兩天施用一次，或每周施用一次，并持續(xù)至少一 周的時間，優(yōu)選地至少一個月，更優(yōu)選地至少三個月。11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中所述肽或肽的組合施 用于對牛乳有變態(tài)反應(yīng)風險的嬰兒或兒童，或?qū)εＨ橛凶儜B(tài)反應(yīng)的成人。12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中所述肽或肽的組合施 用于伴侶動物。13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中所述肽或肽的組合以 其純形式施用，或稀釋于水或人乳中，或加入到或包含于作為營養(yǎng)補充劑、人乳強化劑或嬰 兒配方食品的組合物中施用。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的肽或所述肽的組合，其中所述組合物為"非變應(yīng)原性"或低 變應(yīng)原性組合物。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的肽或所述肽的組合，其中所述"非變應(yīng)原性"或低變應(yīng)原性 組合物為1段嬰兒配方食品（starter infant formula)、或較大嬰兒配方食品（follow-up infant formula)或成長乳（growing up milk) 〇16. 根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中所述肽或肽的組合 在組合物中施用，所述組合物包含25-250yg肽/克干燥組合物，優(yōu)選地50-150yg肽/克干燥 組合物。17. 根據(jù)權(quán)利要求13至16中任一項的所述肽或肽的組合，其中所述組合物包含另外的 成分或益生元，優(yōu)選地選自菊粉、低聚果糖（F0S)、短鏈低聚果糖（短鏈F0S)、低聚半乳糖 (G0S)、低聚木糖(X0S)、神經(jīng)節(jié)苷脂、部分水解的瓜爾豆膠、阿拉伯樹膠、大豆膠或它們的混 合物。18. 根據(jù)權(quán)利要求13至17中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中所述組合物包含另 外的成分或益生菌，優(yōu)選地選自副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei )、乳桿菌 (Lactobacillus)GG、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamno sus )、長雙歧桿菌 (Bif idobacterium longum)、乳雙歧桿菌（Bifidobacterium 1 act is)以及短雙岐桿菌 (Bifidobacterium breve)〇19. 包含選自序列SEQ ID No.1-5的至少一種肽的組合物用于誘導(dǎo)哺乳動物對奶牛、水 牛或山羊乳蛋白的口服耐受性。20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述奶牛、水牛或山羊乳蛋白為β-乳球蛋白。
【文檔編號】A61K38/08GK105828830SQ201380081636
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2013年12月16日
【發(fā)明人】C·布蘭卡特, S·努特恩, A·潘喬德
【申請人】雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司