用于藥物傳遞的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于藥物傳遞的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊。它包含：復(fù)數(shù)個(gè)雙性蛋白質(zhì)、復(fù)數(shù)個(gè)納米氧化鐵及一親水性藥物及一疏水性藥物；其中，該藥物傳遞的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊由于以雙性蛋白質(zhì)做為材料，具有良好的生物兼容性，且其僅需單一乳化步驟即能形成納米級(jí)中空結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊具有良好的藥物承載量、具有同時(shí)包覆親水性及疏水性藥物的能力及藥物操控釋放的特性，故其可應(yīng)用于標(biāo)靶藥物傳遞、核磁共振顯影及熱療。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
用于藥物傳遞的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊，特別是一種用于藥物傳遞的蛋白質(zhì)納 米磁性殼核膠囊。
【背景技術(shù)】
[0002] 藥物載體將藥物傳遞至人體的病灶，以達(dá)到治療的效果。為了藥物的安全性及有 效性，藥物載體系統(tǒng)被廣泛地應(yīng)用于改善藥物釋放、吸收、分布與代謝上。近年來(lái)，隨著生物 技術(shù)的進(jìn)步，蛋白質(zhì)及基因藥物的使用越來(lái)越多，但蛋白質(zhì)藥物的傳輸容易被胃酸破壞，造 成藥效不佳；另一方面，抗癌藥物毒性高，藥物傳輸過(guò)程常造成正常細(xì)胞的毒害，而引發(fā)嚴(yán) 重的副作用；再者，慢性疾病的頻繁用藥，需要長(zhǎng)效劑型以減少服藥的頻率，上述相關(guān)問(wèn)題 為藥物載體開(kāi)發(fā)的重要考慮要點(diǎn)。
[0003] 在目前藥物載體的技術(shù)中，納米傳遞系統(tǒng)目前廣泛被應(yīng)用在醫(yī)藥及生技產(chǎn)業(yè)中， 以有機(jī)材料所制得的核殼納米結(jié)構(gòu)被應(yīng)用來(lái)攜帶藥物的載體，該些有機(jī)的核殼納米結(jié)構(gòu)， 例如是由雙脂肪層所構(gòu)成的微脂體（liposome)或由兩性高分子所構(gòu)成的微胞（micelle)， 然而，該些有機(jī)的核殼納米結(jié)構(gòu)具有結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、制程繁雜及不易控制等問(wèn)題。此外，這些 技術(shù)因使用高分子聚合物作為原料，并使用多種小分子的接口活性劑來(lái)穩(wěn)定接口，因此該 些材料還存有對(duì)人體造成毒性的問(wèn)題。
[0004] 現(xiàn)行使用的抗癌藥物常因?qū)φ＜?xì)胞的毒性，而在臨床使用上受到很大的限制。 因此，急需開(kāi)發(fā)方便使用且侵入性低的藥物載體，能增加患者使用藥物的便利性，并增加藥 物對(duì)人體的可用率，使藥物達(dá)到最佳的效果，同時(shí)還能減少副作用的產(chǎn)生，以改善患者對(duì)藥 物的不適。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明揭露一種藥物傳遞的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊，本發(fā)明的殼核 膠囊是利用單一雙性蛋白質(zhì)（amphiphilic protein)與納米氧化鐵進(jìn)行單一乳化步驟，BP 可形成納米級(jí)中空結(jié)構(gòu)，其中該雙性蛋白質(zhì)作用為穩(wěn)定劑與界面活性劑，故能形成具有高 包覆藥物效率的藥物載體，更佳地是，親水性藥物分子及疏水性藥物分子可同時(shí)存在于本 發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊內(nèi)。此種利用單一乳化步驟的殼核膠囊的合成省略傳統(tǒng)多 次以上的乳化步驟方式，且需要多種接口活性劑來(lái)穩(wěn)定接口。本發(fā)明僅需利用蛋白質(zhì)與納 米氧化鐵的單一乳化步驟即可形成，除了具有更好的生物兼容性，藥物載體更具多功能性。
[0006] 本發(fā)明提供用于藥物傳遞的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊，包含：復(fù)數(shù)個(gè)雙性蛋白質(zhì) (amphiphilic protein)、復(fù)數(shù)個(gè)納米氧化鐵、一親水性藥物及一疏水性藥物，其中該雙性 蛋白質(zhì)具有一親水端與一疏水端；其中該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊包含一水相核層，包含 該親水性藥物；以及一油相殼層，包含該復(fù)數(shù)個(gè)納米氧化鐵及疏水性藥物，而該油相殼層包 覆該水相核層，且一部份雙性蛋白質(zhì)介于該油相殼層與水相核層之間，另一部份雙性蛋白 質(zhì)圍繞于該油相殼層；其中該雙性蛋白質(zhì)與該納米氧化鐵的比例為1:0. 8至1:16. 7之間。
[0007] 在本發(fā)明的一實(shí)施例中，其中該一部份雙性蛋白質(zhì)的親水端界定形成該水相核 層，且該一部份雙性蛋白質(zhì)的疏水端與另一部份雙性蛋白質(zhì)的疏水端界定形成該油相殼 層。
[0008] 在本發(fā)明的一實(shí)施例中，其中于該油相殼層中該等雙性蛋白質(zhì)的疏水端與該納米 氧化鐵緊密交纏。
[0009] 在本發(fā)明的一實(shí)施例中，其中該雙性蛋白質(zhì)為胎牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin)或乳鐵蛋白（Lactoferrin) 〇
[0010] 在本發(fā)明的一實(shí)施例中，其中該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊具有磁操控特性。
[0011] 本發(fā)明更提供一種用于藥物傳遞的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的單乳化步驟的制 造方法，由以下步驟所組成：混合復(fù)數(shù)個(gè)雙性蛋白質(zhì)與一親水性藥物以形成一水相核層溶 液；分散復(fù)數(shù)個(gè)納米氧化鐵于一 CHC13溶液中，且加入一疏水性藥物于該CHC13溶液中混合 形成一油相殼層溶液；將該水相核層溶液及該油相殼層溶液混合進(jìn)行乳化步驟，以形成一 乳化液；以及把該乳化液中的CHC1 3完全揮發(fā)后，以水清洗，得到該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠 囊。
[0012] 本發(fā)明另提供一種藥物傳遞系統(tǒng)，包含該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊。
[0013] 本發(fā)明又提供一種核磁共振顯影劑，包含該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊。
[0014] 本發(fā)明再提供一種用于藥物傳遞的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊，包含：復(fù)數(shù)個(gè)雙性 蛋白質(zhì)（amphiphilic protein)、復(fù)數(shù)個(gè)納米氧化鐵、一親水性藥物及一疏水性藥物，其中 該雙性蛋白質(zhì)具有一親水端與一疏水端；其中一部份雙性蛋白質(zhì)的親水端界定一第一空 間，該一部份雙性蛋白質(zhì)的疏水端與圍繞于該一部份的另一部份雙性蛋白質(zhì)的疏水端共同 界定一第二空間，該第二空間包覆該第一空間，其中該第一藥物活性成分容置于該第一空 間，而該磁性納米粒子容置于該第二空間；其中該第一空間形成一水相核層，該第二空間形 成一油相殼層，且該油相殼層包覆該水相核層；該親水性藥物容置于該水相核層，該疏水性 藥物容置于該油相殼層；其中該雙性蛋白質(zhì)與該納米氧化鐵的比例為1:0. 8至1:16. 7之 間，且該雙性蛋白質(zhì)為胎牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin)或乳鐵蛋白（Lactoferrin) 〇
[0015] 本發(fā)明的用于藥物傳遞的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊為中空球狀結(jié)構(gòu)，具有水相核 層及油相殼層結(jié)構(gòu)，因此具有同時(shí)包覆親水性及疏水性藥物的能力。在疏水性的油相殼層 中，藉由雙性蛋白質(zhì)的疏水端和油相納米氧化鐵交纏，在乳化過(guò)程中納米氧化鐵協(xié)助油相 殼層穩(wěn)定，而該油相殼層除了可以增加結(jié)構(gòu)完整性以有效地保護(hù)藥物之外，相較于傳統(tǒng)技 術(shù)使用高分子載體，本發(fā)明的納米載體因含有納米氧化鐵而具有磁操控特性，可以藉由磁 場(chǎng)刺激來(lái)進(jìn)行熱療及載體的藥物釋放。
[0016] 由于蛋白質(zhì)受熱產(chǎn)生變性而引發(fā)載體團(tuán)聚的效應(yīng)，使本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼 核膠囊經(jīng)加熱后可達(dá)到更好的藥物累積及目標(biāo)治療效應(yīng)，此外，該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠 囊更可經(jīng)多次離心清洗后重新分散，顯示其穩(wěn)定性極佳。該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的油 相殼層是由雙性蛋白質(zhì)及納米氧化鐵緊密交纏而構(gòu)成，故該油相殼層除了有穩(wěn)定該蛋白質(zhì) 納米磁性殼核膠囊的殼核結(jié)構(gòu)的功能外，其所創(chuàng)造出殼層的強(qiáng)疏水性環(huán)境可以兼具避免水 相核層中的親水性藥物的自然釋放及攜帶疏水性藥物兩種功能。其中，油相殼層也可以經(jīng) 由表面修飾來(lái)增加標(biāo)靶能力或改變此載體的性質(zhì)，提高細(xì)胞攝入該膠囊的效率或該膠囊進(jìn) 入病灶的精確性，對(duì)于藥物治療具有相當(dāng)大的幫助。
[0017] 以下將配合圖式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，下述所列舉的實(shí)施例用以闡明本 發(fā)明，并非用以限定本發(fā)明的范圍，任何熟習(xí)此技藝者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)， 當(dāng)可做些許更動(dòng)與潤(rùn)飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視后附的申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所界定者為準(zhǔn)。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的示意圖；
[0019] 圖1中，1表示蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊；101表示油相殼層；102表示水相核層； 103表示雙性蛋白質(zhì)；104表示納米氧化鐵；105表示疏水性藥物；106表示親水性藥物。
[0020] 圖2顯示牛血清蛋白（BSA)的疏水片段可夾帶脂肪酸（Fatty Acids)、甲狀腺素 (Thyroxine)、二氮平（Diazepam)及f丐（Calcium) 〇
[0021] 圖3為本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的掃描式電子顯微鏡影像。
[0022] 圖4中（a)至（d)為本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的穿透式電子顯微鏡影 像；真空干在后的中空結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊在穿透式電子顯微鏡中，（a)及（b) 顯示油相殼層折迭部分對(duì)比較深，（c)及（d)顯示納米氧化鐵和牛血清蛋白致密交纏形成 穩(wěn)定油相殼層。
[0023] 圖5為本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的掃描式電子顯微鏡影像。
[0024] 圖6中（a)至⑷為本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的穿透式電子顯微鏡影 像；真空干在后的中空結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊在穿透式電子顯微鏡中，（a)及（b) 顯示油相殼層折迭部分對(duì)比較深，（c)及（d)顯示利用控制乳鐵蛋白濃度可制備實(shí)心球狀 結(jié)構(gòu)。
[0025] 圖7中（a)至（d)為成中空球狀結(jié)構(gòu)及實(shí)心球狀結(jié)構(gòu)的比較圖；其中，（a)為中空 球狀結(jié)構(gòu)及實(shí)心球狀結(jié)構(gòu)的粒徑分布圖；(b)為中空球狀結(jié)構(gòu)及實(shí)心球狀結(jié)構(gòu)的親水性藥 物（Doxorubicin)與疏水性藥物（Paclitaxol)的包覆率數(shù)據(jù)圖；（c)為中空球狀結(jié)構(gòu)及實(shí) 心球狀結(jié)構(gòu)的藥物釋放率；（d)為子宮頸癌Hela細(xì)胞株養(yǎng)在中空球狀結(jié)構(gòu)的本發(fā)明的蛋白 質(zhì)納米磁性殼核膠囊兩小時(shí)以后的影像圖；量子點(diǎn)以白色箭頭表示。
[0026] 圖8(a)至（c)顯示不同濃度的雙性蛋白質(zhì)（牛血清蛋白）對(duì)的蛋白質(zhì)納米磁性 殼核膠囊的影響；其中，（a)為牛血清蛋白的重量百分濃度< 1%、（b)為牛血清蛋白的重量 百分濃度1 %~4%及（c)為牛血清蛋白的重量百分濃度> 4%。
[0027] 圖9中（a)至（e)顯示調(diào)整胎牛血清蛋白的濃度及Fe304的濃度可以調(diào)整蛋白質(zhì) 納米磁性殼核膠囊大??；(a)及（b)為lwt% BSA、8. 35wt% Fe304的條件下形成的蛋白質(zhì)納 米磁性殼核膠囊的掃描式電子影像圖；（c)及（d)為2wt% BSA、16. 7wt% Fe304的條件下形 成的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的掃描式電子影像圖；(e)為該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的 粒徑分布圖。
[0028] 圖10為不同含鐵量的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的粒徑分布圖。
[0029] 圖11(a)至（f)顯示本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊在不同溫度下蛋白質(zhì)納米 磁性殼核膠囊型貌、表面電荷及水動(dòng)力半徑（Hydrodynamic radius) ; (a)至（d)為本發(fā)明 的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊在高溫下會(huì)有團(tuán)聚現(xiàn)象的掃描式電子影像圖；(a)及（c)為室 溫環(huán)境下；(b)及（d)為加熱至60°C;(e)為本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊在不同溫度 下的電荷分布圖；（f)為本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊在不同pH值下的粒徑分布圖。
[0030] 圖12為本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊在不同pH值下的水合半徑分布圖。
[0031] 圖13為肺癌A549細(xì)胞株分別在不同濃度的本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的 存活率的數(shù)據(jù)圖；控制組為不加蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊。
[0032] 圖14為子宮頸癌Hela細(xì)胞株分別培養(yǎng)在10mg/mL高濃度及3mg/mL低濃度的本 發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的影像圖；量子點(diǎn)以白色箭頭表示。
[0033] 圖15中（a)及（b)為本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的磁敏感特性的曲線(xiàn)圖； (a)為不同強(qiáng)度高周波磁場(chǎng)強(qiáng)度（16kA/m及8kA/m)刺激的藥物釋放曲線(xiàn)圖，（b)為利用磁 場(chǎng)的開(kāi)關(guān)可達(dá)到調(diào)控藥物釋放速度的藥物釋放曲線(xiàn)圖。16kA/m-Doxo及8kA/m-Doxo分別表 示該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊包覆親水性藥物（Doxorubicin)施加16kA/m或8kA/m磁場(chǎng) 10分鐘；16kA/m-PTX分別表示該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊包覆疏水性藥物（Paclitaxol) 施加16kA/m或8kA/m磁場(chǎng)10分鐘；DE-Doxo與DE-PTX表示未施加磁場(chǎng)的載體藥物釋放情 形。
[0034] 圖16中（a)及（b)為本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果；(a) 顯示該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊可累積于小鼠腫瘤位置的影像圖，（b)顯示該蛋白質(zhì)納 米磁性殼核膠囊可經(jīng)過(guò)30天的磁場(chǎng)治療可降低小鼠腫瘤生長(zhǎng)的曲線(xiàn)圖。H)-VN S表示含 有親水性藥物（Doxorubicin)與疏水性藥物（Paclitaxol)的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊； ro-VNs-MFx3及ro-VNs-MFxl分別表示3次或1次磁場(chǎng)治療的含親水性藥物與疏水性藥物 的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊；FO表示單純Doxorubicin與Paclitaxol ;VNs+MF表示該蛋白 質(zhì)納米磁性殼核膠囊加磁場(chǎng)；PD-VNs表示含Doxorubicin與Paclitaxol的蛋白質(zhì)納米磁 性殼核膠囊；Control為僅施打生理食鹽水的控制組。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊，該殼核膠囊利用單一雙性蛋白質(zhì) (amphiphilic protein)與納米氧化鐵進(jìn)行單一乳化步驟，即可形成納米級(jí)中空結(jié)構(gòu)。藥物 的包覆可在蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊制程中直接進(jìn)行，以提升藥物包覆率。除了可以同時(shí) 包覆疏水性及親水性二種截然不同特性的藥物進(jìn)行控制釋放之外，納米氧化鐵更能應(yīng)用核 磁共振顯影及熱療方面；該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊也可經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的修飾，使其具有標(biāo)靶 特定部位的功能。
[0036] 實(shí)施例1本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的制備
[0037] 本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊，其藉由單一雙性蛋白質(zhì)與納米氧化鐵，經(jīng)過(guò) 生物性考慮的揮發(fā)性溶劑的使用，即可以簡(jiǎn)單的單一乳化步驟形成一納米中空結(jié)構(gòu)。相較 于習(xí)知技術(shù)要形成中空結(jié)構(gòu)的技術(shù)，須經(jīng)過(guò)多次以上的乳化步驟，先形成水/油結(jié)構(gòu)，習(xí)知 技術(shù)再經(jīng)第二次乳化形成水/油/水的構(gòu)造；而本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊，其核層 與殼層都是雙性蛋白質(zhì)，所以制備方法只需要經(jīng)過(guò)一次乳化步驟即可形成水/油/水的中 空結(jié)構(gòu)，雙性蛋白質(zhì)和納米氧化鐵結(jié)合可以穩(wěn)定油相殼層，并具有同時(shí)包覆親水性及疏水 性藥物的能力。
[0038] 1. 1單一雙性蛋白質(zhì)以牛血清蛋白（Bovine serum albumin, BSA)為例
[0039] 本實(shí)施例以牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA)為材料與油相納米氧 化鐵，較佳為磁性納米鐵，來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的制程和應(yīng)用，其應(yīng) 用以疏水性藥物紫杉醇（Paclitaxel，PTX)和親水性藥物鹽酸多柔比星（Doxorubicin hydrochloride，D0X)為例。
[0040] 蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的制備方法如下：
[0041] 1 ·先配置BSA水溶液、D0X水溶液、紫杉醇（Pac 1 itaxe 1，PTX)溶液。
[0042] 2.合成5nm油相氧化鐵（Fe304)，將Fe304去除乙醇后，分散于100L的CHC1 3中，并 加入PTX溶液，作為油相（oil phase)備用。
[0043] 3.將BSA溶液和D0X溶液做為水相（water phase)，與步驟2油相（oil phase) 溶液混合，利用能量超音波進(jìn)行乳化30秒，待完全乳化后，置于通風(fēng)操作臺(tái)攪拌，于室溫將 CHC13完全揮發(fā)。
[0044] 4.將產(chǎn)物用Milli-Q超純水、8000rpm離心清洗三次后，再用Milli-Q超純水溶。
[0045] 經(jīng)由上述條件所乳化形成的本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊1為中空結(jié)構(gòu)，其 結(jié)構(gòu)如圖1所示，其由雙性蛋白質(zhì)103,較佳實(shí)施例為牛血清蛋白（BSA)親水端圍繞形成水 相核層102,油相殼層101包覆著水相核層102。其中，油相殼層101是由雙性蛋白質(zhì)103 及油相納米氧化鐵104,較佳實(shí)施例為牛血清蛋白與油相納米氧化鐵緊密交纏而構(gòu)成，故該 油相殼層101除了有穩(wěn)定該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊1的殼核結(jié)構(gòu)的功能外，其所創(chuàng)造出 油相殼層的強(qiáng)疏水性環(huán)境可以兼具避免水相核層102中的親水性藥物106的自然釋放、及 攜帶疏水性藥物105兩種功能。而油相納米氧化鐵104使該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊1具 有磁操控特性。
[0046] 雙性蛋白質(zhì)例如牛血清蛋白（BSA)序列具有親水性與疏水性的結(jié)構(gòu)域，疏水 結(jié)構(gòu)域可以攜帶油相分子，例如：脂肪酸（Fatty acid)、甲狀腺素（Thyroxine)、二氮平 (Diazepam)及|丐（Calcium)，如圖2所示，油相氧化鐵會(huì)與這些位置結(jié)合，而親水端許多含 0H官能基的胺基酸（amino acid)會(huì)朝向水溶液，因此牛血清蛋白可以存在于兩相之間。根 據(jù)界面活性劑的HLB值（hydrophilic-lipophilic balance value,親水-疏水平衡值）， BSA在特定濃度下具有穩(wěn)定油/水（HLB值：8~16)和水/油（HLB值：3~8)界面的特性， 能夠同時(shí)當(dāng)作水/油及油/水的乳化劑使用，因此能自組裝形成水-油-水的中空結(jié)構(gòu)。
[0047] 發(fā)明人分別利用掃描式電子顯微鏡及穿透式電子顯微鏡分析本發(fā)明的蛋白質(zhì)納 米磁性殼核膠囊的結(jié)構(gòu)，其結(jié)果如圖3及圖4所示，圖3為本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠 囊的掃描式電子顯微鏡影像，將本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊用去離子水洗凈后，真 空干燥所拍攝的影像，由于蛋白質(zhì)沒(méi)有鋼性性質(zhì)，故干燥后的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊會(huì) 有明顯的塌陷或皺縮的形貌，因?yàn)橛拖嗪醒趸F不會(huì)蒸發(fā)，顯示蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠 囊內(nèi)部確實(shí)為水相結(jié)構(gòu)。圖4中（a)至（d)為本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的穿透式 電子顯微鏡影像，其更可以清楚觀察蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊干燥皺縮后的透視結(jié)構(gòu)，對(duì) 比較深的黑色顆粒為氧化鐵，在氧化鐵外有一層對(duì)比較淡的部分則是牛血清蛋白（圖4中 (a)及（b))，氧化鐵和牛血清蛋緊密結(jié)合形成具有可撓性的油相殼層（圖4中（c)及（d))。
[0048] 1. 2雙性蛋白質(zhì)以乳鐵蛋白（Lactoferrin，Lf)為例
[0049] 本實(shí)施例以乳鐵蛋白（Lactoferrin，Lf)材料與油相納米氧化鐵，較佳為磁性 納米鐵，來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊和應(yīng)用，其應(yīng)用以疏水性藥物紫杉醇 (Paclitaxel，PTX)和親水性藥物鹽酸多柔比星（Doxorubicin hydrochloride)為例，其制 備方法如同實(shí)施例1. 1所述。
[0050] 經(jīng)由上述條件所乳化形成的本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊為中空結(jié)構(gòu)，該蛋 白質(zhì)納米磁性殼核膠囊也會(huì)呈現(xiàn)出殼核結(jié)構(gòu)，其中殼為乳鐵蛋白與氧化鐵所組成的復(fù)合 物，如圖5所示，該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊包覆親水性藥物（Doxorubicin)與疏水性藥物 (Paclitaxol)后，納米結(jié)構(gòu)依然保持于原來(lái)特性，其中空結(jié)構(gòu)經(jīng)干燥后產(chǎn)生凹陷，此結(jié)構(gòu)的 形成機(jī)制也與實(shí)施例1. 1的結(jié)果一致。
[0051] 不過(guò)由于利用乳鐵蛋白制造的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的粒徑大小與利用BSA 制造的不同，在穿透式電子顯微鏡觀察下，如圖6中（a)至（d)所示，利用乳鐵蛋白制造的 蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的粒徑大小約為160nm，真空干燥后的中空結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)納米磁 性殼核膠囊可精楚觀察到油相殼層折迭部分對(duì)比較深（圖6中（a)及（b));本發(fā)明并可利 用控制乳鐵蛋白的比例，降低乳鐵蛋白的濃度形成實(shí)心球狀結(jié)構(gòu)（圖6中（c)至（d))。
[0052] 本發(fā)明分析該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的粒徑，并以利用控制乳鐵蛋白的比例形 成中空球狀結(jié)構(gòu)及實(shí)心球狀結(jié)構(gòu)作比較，其中〇. 5wt% _8wt %乳鐵蛋白搭配氧化鐵可行成 中空球，0. lwt% -0. 5wt%形成實(shí)心球。如圖7中（a)所示，其中該蛋白質(zhì)納米磁性殼核 膠囊的中空球狀結(jié)構(gòu)的粒徑大小較大約為220nm，而本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的 實(shí)心球狀結(jié)構(gòu)的粒徑大小大約只有130nm，其粒徑會(huì)相較于穿透式電子顯微鏡下觀察較大， 其原因?yàn)檩d體的水合半徑造成量測(cè)不同。在包藥測(cè)試下，如圖7中（b)所示，親水性藥物 (Doxorubicin)與疏水性藥物（Paclitaxol)皆可以包覆于該些結(jié)構(gòu)當(dāng)中，由于中空結(jié)構(gòu)其 具有親水核，因此可以包覆更多親水性藥物。在長(zhǎng)時(shí)間藥物釋放測(cè)定下，如圖7中（c)所 示，兩種結(jié)構(gòu)的藥物釋放皆可以達(dá)到緩慢釋放的效果。此外，在子宮頸癌Hela細(xì)胞攝入實(shí) 驗(yàn)中，經(jīng)培養(yǎng)兩個(gè)小時(shí)后，如圖7中（d)所示，可以發(fā)現(xiàn)中空球狀結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)納米磁性殼 核膠囊可以大量的被癌細(xì)胞吞入，并分散在細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊量子 點(diǎn)以白色箭頭標(biāo)示，證實(shí)本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊具有標(biāo)靶功能。
[0053] 1. 3雙性蛋白質(zhì)的濃度對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的影響
[0054] 在上述制備方法中，在氧化鐵為0. 017g/mL的情況下，分別調(diào)整雙性蛋白質(zhì)的重 量百分濃度為< 1 %、1 %~4%及> 4%測(cè)試該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊是否形成。雙性蛋 白質(zhì)為牛血清蛋白測(cè)試結(jié)果陳列于表1及圖8中（a)至（c)、雙性蛋白質(zhì)為乳鐵蛋白測(cè)試結(jié) 果陳列于表2,皆顯示出當(dāng)雙性蛋白質(zhì)重量百分比在1%~4%時(shí)，會(huì)形成中空結(jié)構(gòu)，且該蛋 白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的粒徑大小低于200nm(圖8中（b));而當(dāng)雙性蛋白質(zhì)濃度過(guò)低或 過(guò)高時(shí)，該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊不易形成（圖8中（a)及（c))。
[0055] 表1、牛血清蛋白的濃度對(duì)的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的影響
[0056]
[0057] 表2、乳鐵蛋白的濃度對(duì)的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的影響
[0058]
[0059] 實(shí)施例2本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的粒徑大小
[0060] 本發(fā)明藉由調(diào)整Fe304的濃度、環(huán)境溫度、pH值改變蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊大 小，證實(shí)本發(fā)明蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊大小可以人為控制，提供更為廣泛的應(yīng)用。
[0061] 2. 1調(diào)整胎牛血清蛋白及Fe304的濃度
[0062] 本發(fā)明藉由在前述的范圍內(nèi)調(diào)整胎牛血清蛋白及Fe304的濃度可改變本發(fā)明實(shí)施 例1. 1的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊大小：圖9中（a)及（d)為利用動(dòng)態(tài)光散射儀分析本發(fā) 明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的結(jié)構(gòu)；圖9中（a)及（b)為lwt% BSA、8. 35wt% Fe304的條 件下形成的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊；圖9中（c)及（d)為2wt% BSA、16. 7wt% Fe304的條 件下形成的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊，證實(shí)隨著氧化鐵濃度的提升，合成蛋白質(zhì)納米磁性 殼核膠囊的粒徑亦隨之增加，該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的粒徑分布圖如圖9中（e)所示。
[0063] 本發(fā)明不同含鐵量的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊，有不同的外觀，藉由調(diào)整本發(fā)明 實(shí)施例1. 1的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的氧化鐵濃度，可以改變載體的粒徑分布與大小， 如圖10所示，不同含鐵量的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的粒徑分布圖，含鐵量越高粒徑越 大。
[0064] 2. 2改變溫度
[0065] 本發(fā)明實(shí)施例1. 1的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊在不同溫度下的形貌，如圖11中 (a)及（c)所示，該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊在室溫下為分散狀態(tài)；如圖11中（b)及⑷ 所示，該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊加熱樣品至60°C為團(tuán)聚狀態(tài)，故該蛋白質(zhì)納米磁性殼核 膠囊隨溫度升高會(huì)有團(tuán)聚現(xiàn)象產(chǎn)生。同時(shí)，本發(fā)明利用表面電位（zeta potential)檢測(cè)該 蛋白質(zhì)/氧化鐵納米磁性殼膠在不同溫度下的電荷變化，如圖11中（e)所示，增加該蛋白 質(zhì)納米磁性殼核膠囊的環(huán)境溫度，會(huì)造成電性減少而產(chǎn)生團(tuán)聚效應(yīng)；本發(fā)明利用動(dòng)態(tài)光散 射（dynamic light scattering)量測(cè)不同溫度下該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的水動(dòng)力半 徑（Hydrodynamic radius)變化，亦證實(shí)本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊經(jīng)加熱后產(chǎn)生 蛋白質(zhì)變性，而引發(fā)該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊載體團(tuán)聚的效應(yīng)，以達(dá)到更好的藥物累積 及目標(biāo)治療效應(yīng)。
[0066] 2. 3 改變 pH 值
[0067] 本發(fā)明實(shí)施例1. 1的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊在不同pH值下的水合半徑，如表3 及圖12所示，會(huì)隨pH值下降而逐漸增加，且該些水合半徑皆能維持本發(fā)明蛋白質(zhì)納米磁性 殼核膠囊原來(lái)的結(jié)構(gòu)；證實(shí)本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊在較酸的環(huán)境下亦可維持原 結(jié)構(gòu)特征。
[0068] 表3、不同pH值下的本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的水合半徑
[0069]
[0070] 實(shí)施例3本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的生物兼容性
[0071] 本發(fā)明利用肺癌A549細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)施例1. 1的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的生物 兼容性試驗(yàn)，肺癌A549細(xì)胞株分別在不同濃度蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的培養(yǎng)下，如圖13 所示，其存活率與不加蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的控制組比較幾乎沒(méi)有差異，證實(shí)本發(fā)明 的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的生物兼容性極佳。
[0072] 此外，本發(fā)明利用子宮頸癌Hela細(xì)胞株分別在含有10mg/mL高濃度及3mg/mL低 濃度實(shí)施例1. 1的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的培養(yǎng)基培養(yǎng)下，如圖14所示，該蛋白質(zhì)納米 磁性殼核膠囊量子點(diǎn)以白色箭頭標(biāo)示，細(xì)胞透過(guò)核體內(nèi)區(qū)隔（endosomal compartments)的 方式，可以攝取不經(jīng)過(guò)任何修飾的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊；且高濃度的蛋白質(zhì)納米磁性 殼核膠囊，或細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間越久，將增加該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊在細(xì)胞的累積量。因 此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊除具有極佳的生物兼容性外。
[0073] 實(shí)施例4本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的磁的敏感特性
[0074] 本發(fā)明為檢測(cè)該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的磁敏感特性，分別以不同強(qiáng)度高周波 磁場(chǎng)強(qiáng)度（16kA/m及8kA/m)刺激后，如圖15中（a)所示，16kA/m-Doxo表示該蛋白質(zhì)納米 磁性殼核膠囊包覆親水性藥物（Doxorubicin)施加16kA/m磁場(chǎng)10分鐘，而16kA/m-PTX表 示該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊包覆疏水性藥物（Paclitaxol)施加16kA/m磁場(chǎng)10分鐘，經(jīng) 由磁場(chǎng)刺激后，藥物皆能夠達(dá)到快速釋放的目的，圖15中（a)圖中DE-D 〇X〇與DE-PTX表示 未施加磁場(chǎng)的載體藥物釋放情形，其釋放相對(duì)緩慢。圖15中（b)則表示蛋白質(zhì)納米磁性殼 核膠囊包覆親水性藥物（Doxorubicin)或疏水性藥物（Paclitaxol)，在開(kāi)-關(guān)磁場(chǎng)下的藥 物釋放情形，可以發(fā)現(xiàn)藥物可以隨磁場(chǎng)快速釋放。
[0075] 本發(fā)明利用磁場(chǎng)的開(kāi)關(guān)可達(dá)到調(diào)控藥物釋放速度的目的，未給予磁場(chǎng)時(shí)，該蛋白 質(zhì)納米磁性殼核膠囊可將藥物良好包覆于核內(nèi)，當(dāng)磁場(chǎng)一開(kāi)啟，藥物迅速且精準(zhǔn)的大量釋 放。
[0076] 實(shí)施例5本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的動(dòng)物試驗(yàn)
[0077] 本發(fā)明將實(shí)施例1. 1的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊（PD-VNs)進(jìn)行熒光分子cy5. 5 標(biāo)定，該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊（PD-VNs)已含有親水性藥物（Doxorubicin)與疏水性 藥物（Paclitaxol);再將該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊利用尾靜脈注入裸鼠中，經(jīng)過(guò)3次磁 場(chǎng)治療（PD-VNs-MFx3)或1次磁場(chǎng)治療（PD-VNs-MFxl)。以用非侵入式活體分子影像系 統(tǒng)（Caliper IVIS system)作為觀測(cè)腫瘤、蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊分布，觀察動(dòng)物整體 的變化。并另以?xún)H用單純親水性藥物（Doxorubicin)與疏水性藥物（Paclitaxol) (PD)、 含有親水性藥物（Doxorubicin)與疏水性藥物（Paclitaxol)的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊 (ro-VNs)及該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊（不含藥）加磁場(chǎng)（VNs+MF)作為對(duì)照組，以及僅施 打生理食鹽水的控制組（control)。本實(shí)施例是方法為每只實(shí)驗(yàn)老鼠的體重及腫瘤大小將 固定一位成員觀察測(cè)量，每周觀察紀(jì)錄3次。由于腫瘤形成橢圓形狀，利用光標(biāo)尺測(cè)量腫瘤 直徑最長(zhǎng)為a，直徑最長(zhǎng)為b，故腫瘤體積的計(jì)算依下列公式=l/2ab2。
[0078] 結(jié)果如圖16中（b)所示，經(jīng)過(guò)3次磁場(chǎng)治療（PD-VNs_MFx3)或1次磁場(chǎng)治療 (ro-VNs-MFxl)，并持續(xù)觀察30天，其皆可達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的，以3次磁場(chǎng)治療為最 佳；而僅用單純親水性藥物（Doxorubicin)與疏水性藥物（Paclitaxol)的H)，貝lj因藥物被 代謝掉，造成藥物毒殺性質(zhì)不夠強(qiáng)，而顯示腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)。另外，該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠 囊（不含藥）加磁場(chǎng)（VNs+MF)、或含Doxorubicin與Paclitaxol的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠 囊（PD-VNs)且不外加磁場(chǎng)則有部分抑制效果；Control為僅施打生理食鹽水的控制組，無(wú) 抑制效果。
[0079] 另外，本發(fā)明將熒光染劑作為模擬藥物包覆于本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊 內(nèi)，再注射至小鼠體內(nèi)，如圖16中（a)所示，經(jīng)由影像可觀察到該其可累積于小鼠腫瘤位 置。
[0080] 經(jīng)由上述結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊具有良好的磁敏感特性，故 有益于長(zhǎng)時(shí)間的藥物控制。
[0081] 綜上所述，本發(fā)明的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊僅由一般的雙性蛋白質(zhì)所構(gòu)成，其 材料為雙性蛋白質(zhì)，極具生物兼容性；且氧化鐵媒介更可為該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊具 有藥物操控釋放及熱療的能力及核磁共振顯影劑的特性，再者，不須經(jīng)過(guò)繁復(fù)的改質(zhì)或聚 合，不同以往需要交聯(lián)反應(yīng)來(lái)增加結(jié)構(gòu)在溶液中的穩(wěn)定性；其制程十分簡(jiǎn)單，利用單一雙性 蛋白質(zhì)即可同時(shí)穩(wěn)定油/水及水/油的界面；藥物包覆也可于合成該蛋白質(zhì)納米磁性殼核 膠囊時(shí)一并完成，不僅簡(jiǎn)化制程，在包覆藥物的效率上也較高；且該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠 囊可同時(shí)包覆親水及疏水兩種特性的藥物，應(yīng)用性更為廣泛。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于藥物傳遞的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊，包含：復(fù)數(shù)個(gè)雙性蛋白質(zhì)、復(fù)數(shù)個(gè) 納米氧化鐵、一親水性藥物及一疏水性藥物，其中該雙性蛋白質(zhì)具有一親水端與一疏水 端； 其中，該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊包含一水相核層，包含該親水性藥物；以及一油相 殼層，包含該復(fù)數(shù)個(gè)納米氧化鐵及該疏水性藥物，而該油相殼層包覆該水相核層，且一部份 雙性蛋白質(zhì)介于該油相殼層與水相核層之間，另一部份雙性蛋白質(zhì)圍繞于該油相殼層； 其中該雙性蛋白質(zhì)與該納米氧化鐵的比例為1:0. 8至1:16. 7之間。2. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊，其中該一部份雙性蛋白質(zhì)的親水端 界定形成該水相核層，且該一部份雙性蛋白質(zhì)的疏水端與另一部份雙性蛋白質(zhì)的疏水端界 定形成該油相殼層。3. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊，其中于該油相殼層中該等雙性蛋白 質(zhì)的疏水端與該納米氧化鐵緊密交纏。4. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊，其中該雙性蛋白質(zhì)為胎牛血清蛋白 或乳鐵蛋白。5. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊，其中該等納米氧化鐵賦予該蛋白質(zhì) 納米磁性殼核膠囊具有磁操控特性。6. -種如權(quán)利要求1所述的用于藥物傳遞的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊的單乳化步驟 的制造方法，是由以下步驟所組成： 混合復(fù)數(shù)個(gè)雙性蛋白質(zhì)與一親水性藥物以形成一水相核層溶液； 分散復(fù)數(shù)個(gè)納米氧化鐵于一 CHC13溶液中，且加入一疏水性藥物于該CHC13溶液中混合 形成一油相殼層溶液； 將該水相核層溶液及該油相殼層溶液混合進(jìn)行乳化步驟，以形成一乳化液；以及 把該乳化液中的CHC13完全揮發(fā)后，以水清洗，得到該蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊。7. -種藥物傳遞系統(tǒng)，包含如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊。8. -種核磁共振顯影劑，包含如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊。9. 一種用于藥物傳遞的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊，包含：復(fù)數(shù)個(gè)雙性蛋白質(zhì)、復(fù)數(shù)個(gè) 納米氧化鐵、一親水性藥物及一疏水性藥物，其中該雙性蛋白質(zhì)具有一親水端與一疏水 端； 其中一部份雙性蛋白質(zhì)的親水端界定一第一空間，該一部份雙性蛋白質(zhì)的疏水端與圍 繞于該一部份的另一部份雙性蛋白質(zhì)的疏水端共同界定一第二空間，該第二空間包覆該第 一空間，其中該第一藥物活性成分容置于該第一空間，而該磁性納米粒子容置于該第二空 間； 其中該第一空間形成一水相核層，該第二空間形成一油相殼層，且該油相殼層包覆該 水相核層；該親水性藥物容置于該水相核層，該疏水性藥物容置于該油相殼層； 其中該雙性蛋白質(zhì)與該納米氧化鐵的比例為1:0. 8至1:16. 7之間。10. 如權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)納米磁性殼核膠囊，其中該雙性蛋白質(zhì)為胎牛血清蛋 白或乳鐵蛋白。
【文檔編號(hào)】A61K47/42GK105832702SQ201510015520
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2015年1月13日
【發(fā)明人】胡尚秀, 李昀庭, 方人弘
【申請(qǐng)人】胡尚秀