牛蒡苷元在調(diào)節(jié)pp2a 活性中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種牛蒡苷元在制備調(diào)節(jié)PP2A活性的試劑中的應(yīng)用。牛蒡苷元在制備調(diào)節(jié)PP2A活性試劑的應(yīng)用中，還可以具有這樣的特征：其中，牛蒡苷元的加入量為1～10μm，PP2A的活性在此范圍內(nèi)隨著牛蒡苷元的加入量的增加而提高。ATG作為一個(gè)能高度結(jié)合PP2A且能影響其活性的天然小分子化合物，具有良好的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
牛蒡苷元在調(diào)節(jié)PP2A活性中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種牛蒡苷元在調(diào)節(jié)PP2A活性中的應(yīng)用，屬于中醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛蒡苷元(ATG)是中藥牛蒡子中的主要單體化合物。牛蒡子被臨床廣泛用于糖尿 病的治療，但其作用機(jī)制和有效作用成分還不明確。本次研究發(fā)現(xiàn)ATG有明顯的減少糖尿病 小鼠蛋白尿的作用。
[0003] PP2A是絲氨酸蘇氨酸磷酸化酶，調(diào)節(jié)真核細(xì)胞中大部分的磷酸化酶。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中與其他磷酸化酶和激酶相互作用，構(gòu)成調(diào)節(jié)大分子調(diào)控下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在 糖尿病腎臟疾病(DKD)中P65是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵通路。PP2A可以通過(guò)去磷酸化P65,來(lái)發(fā) 揮治療DKD的作用。此外，目前有研究揭示PP2A與原癌基因 c-Myc之間有著密切的聯(lián)系。PP2A 調(diào)節(jié)亞基Β56α選擇性地與C-Myc的N端結(jié)合，引起c-Myc表達(dá)水平顯著降低。利用shRNA解除 Β56α與c-Myc的結(jié)合，可導(dǎo)致c-Myc過(guò)度表達(dá)、c-Myc Ser62磷酸化水平的提高及c-Myc功能 的增強(qiáng)等現(xiàn)象，依此很容易聯(lián)想到PP2A在細(xì)胞增殖分化調(diào)控中擔(dān)當(dāng)著某種關(guān)鍵的角色。ATG 與PP2A活性之間的關(guān)系在之前的研究中并未闡明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種ATG在調(diào)節(jié)PP2A活性中的應(yīng)用，是ATG的一種新應(yīng)用。 [0005]本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0006]本發(fā)明首先提供一種ATG在制備調(diào)節(jié)PP2A活性的試劑中的應(yīng)用。
[0007]進(jìn)一步，在ATG制備成調(diào)節(jié)PP2A活性試劑的應(yīng)用中，還可以具有這樣的特征:其中， ATG的加入量為1~10μπι，ΡΡ2Α的活性在此范圍內(nèi)隨著牛蒡苷元的加入量的增加而提高。
[0008] 本發(fā)明還提供一種提高293Τ細(xì)胞中ΡΡ2Α活性的方法，其特征在于:包括加入ATG的 步驟。
[0009] 進(jìn)一步，本發(fā)明的提高293Τ細(xì)胞中ΡΡ2Α活性的方法，還可以具有這樣的特征：其 中，ATG的加入量是ΙμΜ~ΙΟμΜ。
[0010] 本發(fā)明還提供一種ATG在回收ΡΡ2Α蛋白中的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟：
[0011 ] 步驟一，加入100μΜ~ΙΟΟΟμΜ的ATG刺激細(xì)胞。
[0012]步驟二，提取細(xì)胞并粉碎；
[0013] 步驟三，上樣并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；
[0014] 步驟四，切下與ΡΡ2Α分子量相對(duì)應(yīng)部分的凝膠條帶，回收蛋白。
[0015]進(jìn)一步，本發(fā)明的ATG在回收ΡΡ2Α蛋白中的應(yīng)用，還可以具有這樣的特征:其中，回 收蛋白時(shí)，將凝膠條帶用碾磨棒碾碎，在其中加入小于500μ1/塊膠的緩沖液，在4攝氏度靜 置10小時(shí)，然后5000-10000rpm離心10min，上清液中即含有ΡΡ2Α蛋白。
[0016]發(fā)明的有益效果
[0017] 本發(fā)明的ATG在調(diào)節(jié)PP2A活性中的應(yīng)用，提供了 ATG在調(diào)節(jié)PP2A活性中的新用途， ATG作為一個(gè)能高度結(jié)合PP2A且能影響其活性的天然小分子化合物，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1是DARTS-western雜交的結(jié)果圖。
[0019]圖2是不同濃度的ATG刺激后的PP2A活性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下結(jié)合【具體實(shí)施方式】詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0021] 1、ATG刺激293T的質(zhì)譜分析
[0022]使用 2 9 3 T細(xì)胞，用M-PER mammalian protein extraction buffer (785〇lThermoFisher)和磷酸酶抑制劑（5〇mM NaF, ΙΟηιΜβ-glycerophosphate，5mM sodium pyrophosphate，2mM Na3V04)消化297T細(xì)胞。在細(xì)胞裂解液中加入1 OX TNC緩沖液（500mM Tris-HCl pH 8.0,500mM NaCl，100mM CaC12)并用bradford法（500-0006Bi〇-rad)測(cè)量蛋 白質(zhì)濃度。在細(xì)胞裂解液中加或不加 ATG，加 ATG時(shí)嘗試膻300μΜ，一起放在室溫下培養(yǎng)lh。隨 后在細(xì)胞裂解液放入不同濃度的鏈霉蛋白酶at 1:1000(10165921001, Roche)室溫下放置 20分鐘裂解蛋白質(zhì)。兩組裂解液行質(zhì)譜檢測(cè)比較差異，結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0023]圖1:ATG干預(yù)后質(zhì)譜比較結(jié)果 [0024]
[0025]
[0026] 分析質(zhì)譜結(jié)果顯示，結(jié)合最多的2個(gè)蛋白是微管蛋白，由于本身細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的 含量很高，所以我們認(rèn)為是非特異性的。且由于正常狀態(tài)下PP2A在細(xì)胞中的含量很低，所以 我們認(rèn)為ATG和PP2A的結(jié)合率很高。
[0027] 2、ATG與PP2A結(jié)合的western blot實(shí)驗(yàn)。
[0028] ATG刺激293T細(xì)胞。選擇鏈霉蛋白酶最佳濃度為1:1000后，我們選擇了不同濃度的 ATG刺激293T細(xì)胞，來(lái)觀察ATG與PP2A的結(jié)合量能否隨著ATG濃度的增高而加大。根據(jù)ATG的 刺激濃度不同分為3組:01^0、10(^]\1，30(^]\1、100(^]\1。加入鏈霉蛋白酶的濃度為1 :1000。故 Western Blot-共分5組:空白組(未加鏈霉蛋白酶）、DMS0(鏈霉蛋白酶1:1000)、ATG100yM (鏈霉蛋白酶1:1000)、ATG300yM(鏈霉蛋白酶1:1000)、ATG1000yM(鏈霉蛋白酶1:1000)。結(jié) 果發(fā)現(xiàn)在鏈霉蛋白酶1:1000的條件(鏈霉蛋白酶可以消化蛋白，但是它消化未與ATG結(jié)合的 蛋白比消化已經(jīng)與ATG結(jié)合的蛋白多。我們測(cè)試了不同濃度的鏈霉蛋白酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1:1000 的濃度能夠幫助我們很好的發(fā)現(xiàn)與ATG結(jié)合和不與ATG結(jié)合蛋白的差異，這種用來(lái)研究小分 子化合物的結(jié)合蛋白的方法叫DARTS】?？梢园l(fā)現(xiàn)隨著ATG濃度的增加，PP2A結(jié)合也隨之增 加，結(jié)果見(jiàn)圖2。
[0029] 圖2:DARTS-western blot證實(shí)ATG與PP2AB結(jié)合，PP2A有3個(gè)結(jié)構(gòu)單元，ATG結(jié)合的 是催化劑單元。這個(gè)催化劑單元的蛋白叫PP2AB，基因叫PPP2CB。
[0030]如果需要提取PP2A蛋白，則不加鏈霉蛋白酶，采用如下步驟：
[0031] 步驟一，加入100μΜ~ΙΟΟΟμΜ的ATG刺激細(xì)胞。
[0032]步驟二，提取細(xì)胞并粉碎；
[0033]步驟三，上樣并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；
[0034]步驟四，切下與PP2A分子量相對(duì)應(yīng)部分的凝膠條帶，回收蛋白?；厥盏鞍讜r(shí)，將凝 膠條帶用碾磨棒碾碎，在其中加入小于500μ1/塊膠的緩沖液，在4攝氏度靜置10小時(shí)，然后 5000-10000rpm離心10min，上清液中即含有ΡΡ2Α蛋白。采用此種方法的蛋白回收率是70%。 [0035]步驟中的細(xì)胞可以是293T細(xì)胞，也可以是其它種類(lèi)的細(xì)胞。
[0036] 3、ATG對(duì)PP2A活性的影響
[0037] 用濃度分別為0、1. Ομπι、3.3μπι、ΙΟμπι的ATG刺激293T細(xì)胞，刺激時(shí)間為1小時(shí)，利用 ΡΡ2Α活性試劑盒（R&D systems，DYC3309-2)檢測(cè)ΡΡ2Α活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著ATG濃度增加， PP2A的活性也隨之增加，結(jié)果見(jiàn)表1和圖3。可見(jiàn)ATG能有效增加 PP2A的活性。隨著ATG用量的 增加，PP2A的活性也隨之增加。
[0038] 表1:PP2A活性值
[0039]
[0040] 注:P值是與DMS0比較。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 牛蒡苷元在制備調(diào)節(jié)PP2A活性的試劑中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于： 其中，所述牛蒡苷元的加入量為1~l〇wn，PP2A的活性在此范圍內(nèi)隨著牛蒡苷元的加入 量的增加而提高。3. -種提高293T細(xì)胞中PP2A活性的方法，其特征在于： 包括加入牛蒡苷元的步驟。4. 如權(quán)利要求3所述的提高293T細(xì)胞中PP2A活性的方法，其特征在于： 其中，所述牛蒡苷元的加入量是ΙμΜ~ΙΟμΜ。5. 牛蒡苷元在回收ΡΡ2Α蛋白中的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一，加入1〇〇μΜ~ΙΟΟΟμΜ的牛蒡苷元刺激細(xì)胞。 步驟二，提取細(xì)胞并粉碎； 步驟三，上樣并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳； 步驟四，切下與ΡΡ2Α分子量相對(duì)應(yīng)部分的凝膠條帶，回收蛋白。6. 如權(quán)利要求5中的牛蒡苷元在回收ΡΡ2Α蛋白中的應(yīng)用，其特征在于： 其中，回收蛋白時(shí)，將凝膠條帶用碾磨棒碾碎，在其中加入小于500μ1/塊膠的緩沖液， 在4攝氏度靜置10小時(shí)，然后5000-10000rpm離心10min，上清液中即含有ΡΡ2Α蛋白。
【文檔編號(hào)】A61K31/365GK105832719SQ201610278529
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年4月28日
【發(fā)明人】鐘逸斐
【申請(qǐng)人】上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院