化合物pacma3在制備抗丙肝病毒感染藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種化合物PACMA31在制備抗丙肝病毒感染藥物中的應(yīng)用。所述抗丙肝病毒感染藥物為PACMA31作為唯一活性成分或包含PACMA31的藥物組合物。本發(fā)明通過實驗證實，PACMA31可在RNA水平和蛋白水平抑制丙型肝炎病毒的感染，能夠顯著抑制HCV入侵靶細(xì)胞。本發(fā)明為PACMA31提供一種制備抗丙型肝炎病毒感染藥物的用途。本發(fā)明為尋找抗丙型肝炎病毒藥物提供了新的來源。
【專利說明】
化合物PACMA3在制備抗丙肝病毒感染藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種化合物的用途，具體地說，是化合物PACMA31在制備抗丙肝病毒感 染藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] HCV(Hepatitis C virus，HCV)是單正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬， 主要經(jīng)血液傳播，是引起病毒性肝炎的重要病原體。HCV感染的慢性率超過80%，HCV慢性感 染可引起肝硬化和肝細(xì)胞癌，據(jù)報道病史20年以上的慢性丙型肝炎患者，肝硬化的年發(fā)生 率為10-15%，而每年約有1-7%的肝硬化患者發(fā)展為肝癌。干擾素聯(lián)合利巴韋林是治療丙型 肝炎的主要措施，然而該藥物組合僅對50-70%的HCV感染者有效，而且還存在費用高、副作 用大、病人依從性差的缺點。雖然近年來一些藥物公司相繼研發(fā)出直接抗病毒藥物 (direct-acting antiviral agents，DAAs)，在一定程度上促進了抗HCV治療，然而這些藥 物定價普遍較高，進一步加重了病人經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因而仍需探尋不同的治療藥物和手段。
[0003] PACMA31，全稱propynoic acid carbamoyl methyl amide，又稱為N-(2,4_ Dimethoxypheny1)-N-(l-〇x〇-2-propyn-1-yl)-2-(2-thienyl)glycy1-glycine ethyl ester，化學(xué)式C21H22N206S，CAS登陸號1401089-31-3,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
PACMA31是一種酰胺類化合物，來自南加州大學(xué)的研究者發(fā)現(xiàn)PACMA31是一種細(xì)胞毒 劑，對卵巢癌細(xì)胞有非常明顯的毒性。其作用機制是PACMA31能夠選擇性地抑制二硫鍵異構(gòu) 酶(Protein disulfide isomerase，Ρ?Ι)的活性。PDI在卵巢癌中高度表達，PACMA31 以]^1 為靶點，干預(yù)蛋白質(zhì)的折疊，當(dāng)癌細(xì)胞中出現(xiàn)許多錯誤折疊的蛋白后，就會引發(fā)細(xì)胞壓力， 最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。
[0004] 研究人員還發(fā)現(xiàn)PDI參與人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus， HIV)入侵靶細(xì)胞的膜融合過程，PDI能夠促進病毒入侵靶細(xì)胞。HIV通過膜蛋白gpl20與細(xì)胞 膜的CD4結(jié)合，膜蛋白gpl20和gp41的構(gòu)象在Η)Ι的作用下發(fā)生改變，進而病毒內(nèi)吞進入細(xì)胞 并通過膜融合釋放病毒基因組。抑制PDI活性的小分子化合物或roi抗體能夠抑制HIV病毒 的入侵和傳播，顯著抑制病毒的感染水平。
[0005] HCV作為有包膜的單正鏈RNA病毒，其入侵肝細(xì)胞時也經(jīng)過受體結(jié)合和膜融合，這 一特點與HIV感染細(xì)胞時非常相似。并且HCV的包膜蛋白E1E2上也存在二硫鍵，已有報道指 出E2的二硫鍵對于病毒的入侵是非常重要的。因此蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)在HCV入侵細(xì) 胞的過程中也可能參與重要作用，然而目前尚未見PDI與HCV相互作用的研究，也沒有關(guān)于 PDI抑制劑PACMA31與丙型肝炎病毒相關(guān)的文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供PACMA31在制備抗丙型肝炎病毒感染藥物中的應(yīng)用。本發(fā) 明所述PACMA31為酰胺類化合物，化學(xué)式C21H22N206S，CAS號為1401089-31-3,化學(xué)結(jié)構(gòu)式 如下
[0007] 本發(fā)明中PACMA31在制備抗丙型肝炎病毒感染藥物中的應(yīng)用體現(xiàn)為:所述抗丙肝 病毒感染藥物為PACMA31作為唯一活性成分或包含PACMA31的藥物組合物。
[0008] 上述藥物組合物中包括PACMA31和其他藥學(xué)上可接受的輔料。其中，所述藥物制劑 可以是注射制劑或口服制劑，所述注射制劑可以是凍干粉針劑，所述口服制劑可以為散片 劑、膠囊劑或顆粒劑。
[0009] 本發(fā)明通過實驗證實，PACMA31可在RNA水平和蛋白水平抑制丙型肝炎病毒的感 染，能夠顯著抑制HCV入侵靶細(xì)胞。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點在于:本發(fā)明為PACMA31提供一種制備抗丙型肝炎病毒感染藥物的 用途。本發(fā)明為尋找抗丙型肝炎病毒藥物提供了新的來源。
【附圖說明】
[0011] 附圖1為P A C M A 31劑量依賴性抑制丙型肝炎病毒復(fù)制的實驗結(jié)果圖，其中A為 PACMA31對Huh7細(xì)胞的細(xì)胞毒作用（CC50=200nM);B為PACMA31抑制HCV復(fù)制，半數(shù)有效濃度 為70 nM。
[0012]附圖2為PACMA31劑量時間依賴性抑制持續(xù)HCV感染的實驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0013] 下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。
[0014] 實施例1 本實施例為PACMA31抑制丙肝假病毒(HCVpp)感染的試驗。采用假病毒模式有助于更安 全地實驗，降低危害性。
[0015] 試驗藥物、試劑及材料如下： 1. 化合物:PACMA31 2. 細(xì)胞系Huh7:人肝癌細(xì)胞株(具體參照以下文章 ：Liu Y，Zou Z，Zhu B，et al. CXCL10 Decreases GP73 Expression in Hepatoma Cells at the Early Stage of Hepatitis C Virus (HCV) Infection. Int J Mol Sci. 2013 Dec 13;14(12):24230- 41.) 3. 細(xì)胞系293T:人胚腎細(xì)胞系（具體參照以下文章 ：Liu Y，Zou Z，Zhu B，et al. CXCL10 Decreases GP73 Expression in Hepatoma Cells at the Early Stage of Hepatitis C Virus (HCV) Infection. Int J Mol Sci. 2013 Dec 13;14(12):24230-41.) 4. 細(xì)胞培養(yǎng)液:配制，其含10%胎牛血清、0.03%谷氨酰胺、非必需氨基酸、氨芐青霉素和 鏈霉素 l〇〇U/ml，調(diào)pH至7.4。
[0016] 5.細(xì)胞消化液:配制，其含0.25%胰蛋白酶，用磷酸鹽緩沖液配制。
[0017] 7. HCVpp:HCV假病毒（具體參照以下文章 ：Wang W, Guan M, Liu Y, et al. Alanine scanning mutagenesis of hepatitis C virus E2 cysteine residues: Insights into E2 biogenesis and antigenicity. Virology. 2014 Jan 5;448:229-37.) 實驗方法包括如下步驟： (一)HCVpp的制備及感染實驗 1.將處于對數(shù)生長期的HEK293T細(xì)胞傳達接種于24孔板內(nèi)，置于37 °C 5%C02孵箱內(nèi)培 養(yǎng)過夜。
[0018] 2.觀察細(xì)胞生長狀況，待細(xì)胞生長至70%匯合時，進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將脂質(zhì)體2ul以 及小鼠白血病病毒gag質(zhì)粒、報告基因 GFP表達質(zhì)粒以及HCV包膜蛋白E1E2表達質(zhì)粒置于 100ul opti-MEM培養(yǎng)液中，混勻，室溫放置20min。
[0019] 3.吸除HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入400ul opti-MEM培養(yǎng)液，再加入脂質(zhì)體-質(zhì)粒 混合液，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0020] 4. 6h后吸除細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入500ul含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于孵箱內(nèi) 培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，高速離心去除細(xì)胞碎片。
[0021] 5.將Huh7細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，貼壁后每孔加入50ul含HCVpp的培養(yǎng)上清，6h后 換新鮮含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72h，于熒光顯微鏡下計數(shù)綠色熒光陽性細(xì) 胞個數(shù)。
[0022](二)PACMA31對HCVpp感染的抑制實驗 取對數(shù)生長期的Huh7細(xì)胞，接種96孔板，接種密度1 X 104個/孔，培養(yǎng)24h后加入化合物 及HCVpp，化合物按10、25、50、100 nM的濃度稀釋，培養(yǎng)6h后去除化合物及HCVpp混合液，更 換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72h后在免疫熒光顯微鏡下讀取各孔綠色熒光陽性細(xì)胞數(shù)。
[0023]抑制實驗的結(jié)果如下表所示： 表1 PACMA31對丙肝假病毒(HCVpp)的抑制活性
實施例2 本實施例為不同劑量PACMA31抑制丙肝病毒(HCVcc)感染的試驗 本實施例的試驗藥物、試劑及材料同實施例1 實驗方法如下： (一)HCVcc的制備 1.病毒擴增 J6JFH1嵌合型HCVcc(105ffu/ml)，取50ul感染接種于24孔板的huh7.5.1細(xì)胞，次日換 液，隨后根據(jù)細(xì)胞生長密度傳代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待病毒快速增殖導(dǎo)致的細(xì)胞病變 效應(yīng)(CPE)出現(xiàn)后，收集培養(yǎng)上清，12000rpm離心5min，棄去細(xì)胞碎片，0.45μπι濾膜過濾，取 適量用于病毒滴度測定，其余分裝后凍存于_80°C冰箱備用。
[0024] 2.病毒滴定 Huh7細(xì)胞接種24孔板，密度5X104個/孔，培養(yǎng)12h后，棄去培養(yǎng)上清，每孔加入100ul 10倍梯度稀釋的HCVcc，共孵育6h，更換為新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72h，通過免疫熒光法檢 測HCV陽性細(xì)胞，一抗用1:100稀釋的HCV抗體陽性病人血清，二抗用1:200稀釋的FITC標(biāo)記 的羊抗人IgG。在熒光顯微鏡下觀察發(fā)光細(xì)胞，并記錄最后一個可觀察到綠色熒光陽性細(xì)胞 的孔內(nèi)焚光陽性細(xì)胞數(shù)及相應(yīng)的稀釋梯度，計算出focus forming unit/ml(ffu/ml)數(shù)值， 以此代表HCVcc滴度。
[0025] 3. PACMA31對Huh7細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 為了評價PACMA31對Huh7細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，將Huh7細(xì)胞接種96孔板，接種密度5 X 104 個/孔，培養(yǎng)6小時后加入不同劑量的?401^31(0、10、25、50、100 1^)，共孵育6小時后，應(yīng)用 CCK8細(xì)胞活力檢測試劑盒檢測細(xì)胞活力，計算半數(shù)細(xì)胞毒性的藥物劑量（med ian cytotoxic concentration，CC50)〇
[0026] 4. PACMA31抑制HCV感染的實驗 取處于對數(shù)生長期的Huh7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X 105個/ml，取100μ1接種96孔板，培 養(yǎng)24h后加入化合物和HCVcc，化合物按0、10、25、50、100 ηΜ濃度稀釋，37度培養(yǎng)6小時后去 除化合物和HCVcc混合液，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng);48小時后進行實時定量PCR和western blot 法檢測Huh7細(xì)胞內(nèi)丙肝病毒RNA和蛋白水平，計算出半數(shù)有效濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50)〇
[0027] 通過細(xì)胞毒實驗和HCV感染實驗，我們發(fā)現(xiàn)化合物PACMA31劑量依賴性抑制HCVcc 的復(fù)制（如附圖1所示），EC50為70 nM，CC50約為200 ηΜ。
[0028] 實施例3 本實施例為PACMA31劑量時間依賴性抑制持續(xù)HCV感染的實驗 本實施例的試驗藥物、試劑及材料同實施例1。
[0029]實驗方法如下 1、HCVcc持續(xù)感染Huh7細(xì)胞構(gòu)建 Huh7細(xì)胞接種10cm培養(yǎng)皿，接種密度5X106個/孔，培養(yǎng)12小時后，以HCVcc感染(Μ0Ι = 2)，在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿平皿，以1比3傳代，繼續(xù)同條件培 養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)14天，即建立HCV持續(xù)感染的Huh7細(xì)胞株。
[0030] 2、PACMA31對持續(xù)性HCVcc感染細(xì)胞的病毒抑制實驗 將HCVcc持續(xù)感染的Huh7細(xì)胞接種96孔板，密度5 X 104個/孔，于C02孵箱內(nèi)培養(yǎng)6小時 后，加入化合物PACMA31(70 nM、100 nM)，繼續(xù)培養(yǎng)6小時，用100μ1完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，并于化合物加入后不同時間點（1天、2天、3天、5天、9天），收 集細(xì)胞，抽提細(xì)胞總RNA，以實時定量PCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)HCV的RNA水平。
[0031] 三、實驗結(jié)果 如附圖2所示，PACMA31對持續(xù)性HCVcc感染呈現(xiàn)時間劑量依賴性抑制作用。在藥物作用 第9天時，細(xì)胞內(nèi)HCV的RNA水平降低60%以上。
[0032] 上述實驗結(jié)果表明，化合物PACMA31能夠顯著的抗丙型肝炎病毒活性，因此可用于制備 抗丙型肝炎病毒的藥物。本發(fā)明為尋找抗丙型肝炎病毒藥物提供了新的來源。
[0033] 以上實施例僅僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施 例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于 本發(fā)明保護的范圍。同時，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思 想，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在【具體實施方式】及應(yīng)用范圍上均會有 改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
【主權(quán)項】
1.化合物PACMA31在制備抗丙肝病毒感染藥物中的應(yīng)用，所述PACMA31為酷胺類化合 物，化學(xué)式C21肥2N206S，CAS號為1401089-31-3,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下其特征在于:所述抗丙肝病毒感染藥物為PACMA31作為唯一活性成分或包含PACMA31的 藥物組合物。
【文檔編號】A61K31/381GK105832722SQ201610245898
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月20日
【發(fā)明人】劉媛
【申請人】劉媛