一種生物工程脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備及用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型的生物工程脫細(xì)胞真皮基質(zhì)及其制備方法。對(duì)豬的皮膚進(jìn)行預(yù)處理后得到真皮層皮片，真皮基質(zhì)脫細(xì)胞過程中全程使用混合保護(hù)液；采用高靜壓技術(shù)預(yù)分離真皮組織內(nèi)的細(xì)胞；采用復(fù)合核酸酶方法消化殘余細(xì)胞核；利用去垢劑脫除松散破碎細(xì)胞片；使用混合保護(hù)液進(jìn)行漂洗。本發(fā)明運(yùn)用適宜高效的物理手段，輔助少量的酶和去垢劑的方法充分脫去真皮中的細(xì)胞成分，在保護(hù)液的全程保護(hù)下，可以保證在細(xì)胞核脫凈的基礎(chǔ)上，最大限度地降低真皮基質(zhì)的免疫原性，且同時(shí)保留真皮基質(zhì)的正常三維膠原纖維結(jié)構(gòu)及排列極性，使制得的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)具有良好的穩(wěn)定性與生物相容性。
【專利說明】
一種生物工程脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備及用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物工程醫(yī)用材料的制備領(lǐng)域，具體為真皮基質(zhì)脫細(xì)胞的制備方法
【背景技術(shù)】
[0002]嚴(yán)重創(chuàng)傷、大面積燒傷和皮膚潰瘍等患者存在皮膚缺失的巨大創(chuàng)面或難愈合，而治療缺損的創(chuàng)面，基本上是以自體皮移植為主，但往往自體皮源緊張，尤其當(dāng)大面積皮膚缺損時(shí)獲取自體皮就更為困難。另一方面，取自體皮膚是對(duì)患者新的創(chuàng)傷;所以在這些病的治療過程中，采用皮膚替代物暫時(shí)或長(zhǎng)期覆蓋創(chuàng)面，成為臨床的需要。
[0003]天然真皮材料由于與人類皮膚相似，故成為皮膚移植的首選。其中異種皮價(jià)格低廉，來源廣泛，但存在著異體細(xì)胞抗原性，很容易發(fā)生強(qiáng)烈的免疫排斥，消除其抗原性才能成為理想的皮膚替代物。因此如何對(duì)異種皮膚脫細(xì)胞，去除異種皮膚抗原性，同時(shí)保其完整的真皮膠原纖維的三維結(jié)構(gòu)，成為目前組織工程真皮研制的熱點(diǎn)。
[0004]現(xiàn)有脫細(xì)胞真皮制造技術(shù)均為化學(xué)試劑處理的方法破壞其細(xì)胞，并結(jié)合戊二醛等交聯(lián)劑交聯(lián)降低免疫原性，存在著破壞膠原結(jié)構(gòu)、遺留生物毒性等缺點(diǎn)。近年來也提出了采用物理手段脫除異種皮細(xì)胞的方法，期望解決化學(xué)試劑處理方法制備真皮材料存在的缺點(diǎn)，然而這些脫細(xì)胞方法往往會(huì)導(dǎo)致組織內(nèi)在結(jié)構(gòu)遭到破壞，失去脫細(xì)胞組織原有的基本生物功能。
[0005]因此針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種既能夠降低真皮基質(zhì)的免疫原性，又保留真皮基質(zhì)的正常膠原結(jié)構(gòu)的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)及其制備方法是當(dāng)務(wù)之急。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種全程使用特殊保護(hù)液以及適宜高效的物理復(fù)合生物酶獲取脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法。
[0007]本發(fā)明的創(chuàng)新處在于:1、對(duì)豬的皮膚進(jìn)行預(yù)處理后得到真皮層皮片；2、真皮基質(zhì)脫細(xì)胞過程中全程使用包含一種或多種真皮結(jié)構(gòu)保護(hù)成分的混合保護(hù)液;3、采用高靜壓技術(shù)預(yù)分離皮膚組織內(nèi)的細(xì)胞;4、采用復(fù)合核酸酶方法消化殘余細(xì)胞核;5、利用去垢劑脫除松散破碎細(xì)胞片;6、使用混合保護(hù)液進(jìn)行漂洗。脫細(xì)胞步驟設(shè)定合適的溫度、時(shí)間以及去垢劑、消化酶濃度對(duì)結(jié)膜組織進(jìn)行處理。
[0008]各種保護(hù)性成分的用量為硫酸軟骨素的濃度為30_80g/L;透明質(zhì)酸的濃度為20-50g/L;甘油的濃度為100-500g/L;新霉素5-10mg/L。
[0009]高靜壓壓力條件為400_600MPa，高靜壓頻率為5?10次，每次為2?5分鐘。
[0010]DNA酶的濃度為2000-4000U/ml，核酸酶的濃度為2000-4000U/ml ANA酶或核酸酶的脫細(xì)胞核時(shí)間為3-6小時(shí)，處理溫度為15-30度。
[0011]去垢劑條件為Pluronic F68的濃度0.1_5%，十二烷基肌氨酸鈉的濃度0.1_5%，PEG 400的濃度5-10%。去垢劑處理時(shí)間為3-6小時(shí)。
[0012]可選擇性的同時(shí)或分開進(jìn)行酶和去垢劑的處理。
【附圖說明】
[0013]圖1為正常豬皮膚切片的HE染色圖
[0014]圖2為脫細(xì)胞豬皮膚切片的DAPI染色圖
[0015]圖3為皮膚組織脫細(xì)胞全程使用保護(hù)液的結(jié)果
[0016]圖4為皮膚組織脫細(xì)胞全程未使用保護(hù)液的結(jié)果
[0017]圖5為皮膚組織脫細(xì)胞過程中使用去垢劑的結(jié)果
[0018]圖6為皮膚組織脫細(xì)胞過程中未使用去垢劑的結(jié)果
[0019]圖7為皮膚組織脫細(xì)胞過程中使用消化酶的結(jié)果
[0020]圖8為皮膚組織脫細(xì)胞過程中未使用消化酶的結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，這些實(shí)施例只用于進(jìn)一步詳述說明本發(fā)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)做出非本質(zhì)的調(diào)整需本發(fā)明方授權(quán)。
[0022]本發(fā)明的實(shí)施例1
[0023]取豬背部皮，經(jīng)清洗、去毛后，留取厚度為0.3-0.5mm，寬度為l-5cm的中厚真皮皮片備用。
[0024]1、全程使用保護(hù)液對(duì)真皮組織進(jìn)行保護(hù)，保護(hù)液配方為:RPM1-1640培養(yǎng)基，添加硫酸軟骨素40g/L，透明質(zhì)酸20g/L，新霉素5mg/L，調(diào)pH值至7.2，滲透壓為380m0sm ；
[0025]2、將真皮皮片密封在盛有保護(hù)液的塑料袋中；
[0026]3、于400MPa高靜壓條件下，處理8次，每次時(shí)間為5分鐘；
[0027]4、將真皮取出后，置于含2%Pluronic F68+2000U/ml DNA酶的保護(hù)液中，溫度為30 0C，設(shè)定搖床速度為100轉(zhuǎn)/分鐘，處理4小時(shí)；
[0028]5、去垢劑與酶處理完畢后，取出結(jié)膜置于保護(hù)液中漂洗3小時(shí)。
[0029]本發(fā)明的實(shí)施例2
[0030]取豬背部皮，經(jīng)清洗、去毛后，留取厚度為0.3-0.5mm，寬度為l-5cm的中厚真皮皮片備用。
[0031]1、全程使用保護(hù)液對(duì)眼結(jié)膜組織進(jìn)行保護(hù)，保護(hù)液配方為:RPM1-1640培養(yǎng)基，添加硫酸軟骨素50g/L，甘油200g/L，新霉素5mg/L，調(diào)pH值至7.2，滲透壓為400m0sm ；
[0032]2、將真皮皮片密封在盛有保護(hù)液的塑料袋中；
[0033]3、于600MPa高靜壓條件下，處理5次，每次時(shí)間為3分鐘；
[0034]4、將真皮取出后，置于含5%十二烷基肌氨酸鈉+4000U/ml DNA酶的保護(hù)液中，溫度為25°C，設(shè)定搖床速度為100轉(zhuǎn)/分鐘，處理3小時(shí)；
[0035]5、去垢劑與酶處理完畢后，取出結(jié)膜置于保護(hù)液中漂洗6小時(shí)。
[0036]本發(fā)明的實(shí)施例3
[0037]取豬背部皮，經(jīng)清洗、去毛后，留取厚度為0.3-0.5mm，寬度為l-5cm的中厚真皮皮片備用。
[0038]1、全程使用保護(hù)液對(duì)眼結(jié)膜組織進(jìn)行保護(hù)，保護(hù)液配方為:RPM1-1640培養(yǎng)基，添加硫酸軟骨素30g/L，透明質(zhì)酸50g/L，新霉素5mg/L，調(diào)pH值至7.2，滲透壓為450m0sm ；
[0039]2、將真皮皮片密封在盛有保護(hù)液的塑料袋中；
[0040]3、于800MPa高靜壓條件下，處理5次，每次時(shí)間為2分鐘；
[0041 ] 4、將真皮取出后，置于含2%十二烷基磺酸鈉+2000U/ml DNA酶的保護(hù)液中，溫度為30°C，設(shè)定搖床速度為100轉(zhuǎn)/分鐘，處理5小時(shí)；
[0042]5、去垢劑與酶處理完畢后，取出結(jié)膜置于保護(hù)液中漂洗8小時(shí)。
[0043]以下對(duì)比結(jié)果均是按照實(shí)施例1的脫細(xì)胞步驟進(jìn)行設(shè)置。
[0044]圖3和圖4分別是真皮組織脫細(xì)胞全程使用保護(hù)液和全程未使用保護(hù)液的結(jié)果比較。未使用保護(hù)液組全程使用滅菌注射用水代替保護(hù)液。通過圖3和圖4，可見使用保護(hù)液組脫細(xì)胞完全，未使用保護(hù)液(滅菌注射用水)組有明顯細(xì)胞核殘余。
[0045]圖5和圖6分別是使用去垢劑及未使用去垢劑的結(jié)果比較。如圖5和圖6所示，使用去垢劑組脫細(xì)胞完全，而未使用去垢劑組有明顯的細(xì)胞核殘余。
[0046]圖7和圖8分別是使用消化酶及未使用消化酶的結(jié)果比較?？梢娛褂孟附M細(xì)胞脫干凈，未使用消化酶組有大量細(xì)胞核著色。
[0047]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種新型的生物工程脫細(xì)胞真皮基質(zhì)及其制備方法，具體步驟如下: (1)對(duì)豬的皮膚進(jìn)行預(yù)處理后得到真皮層皮片； (2)使用包含一種或多種真皮結(jié)構(gòu)保護(hù)劑的混合保護(hù)液； (3)采用高靜壓技術(shù)預(yù)分離真皮組織內(nèi)的細(xì)胞； (4)采用復(fù)合核酸酶方法消化殘余細(xì)胞核； (5)利用去垢劑脫除松散破碎細(xì)胞片； (6)在真皮基質(zhì)混合保護(hù)液進(jìn)行漂洗去除多余的生物酶和細(xì)胞殘留； (7)獲得具有正常膠原纖維的三維結(jié)構(gòu)及排列極性的帶有生物特性的脫細(xì)胞真皮層皮片。2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，取豬背部皮，經(jīng)清洗去毛后，留取厚度為0.3-0.5mm，寬度為l_5cm的中厚真皮皮片備用。3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，混合保護(hù)液如包括RPM1-1640培養(yǎng)基、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、甘油、新霉素等及其組合，并需調(diào)節(jié)Ph值與滲透壓到適宜值。4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，高靜壓技術(shù)包括不同的壓力、時(shí)間和頻率參數(shù)。5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，復(fù)合核酸酶包括DNA酶、RNA酶、其他核酸酶及其組合。6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，去垢劑包括聚乙二醇(PEG)、Plur0nic、十二烷基硫酸鈉、十二烷基肌氨酸鈉、樹膠、海藻酸鈉、環(huán)糊精、CHAPS中的一種或多種作為組合。7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，與真皮基質(zhì)混合保護(hù)液中漂洗的時(shí)間為3?8小時(shí)。8.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其各成分組成:RPM1-1640培養(yǎng)基含，但不完全包括硫酸軟骨素的濃度為30-80g/L;透明質(zhì)酸的濃度為10-50g/L;甘油100-500g/L;新霉素5-10mg/L，調(diào)節(jié)ph值為6.8-7.2之間，滲透壓為350-450m0sm。9.如權(quán)利要求4所述的制備方法，所述的高靜壓壓力條件為400-600MPa，高靜壓頻率為5?10次，每次為2?5分鐘；10.如權(quán)利要求5所述的制備方法，所述的復(fù)合核酸酶使用DN A酶時(shí)的濃度為2 O O O -4000U/ml，使用核酸酶時(shí)的濃度為2000-4000U/ml，DNA酶或核酸酶的脫細(xì)胞核時(shí)間為3-6小時(shí)，處理溫度為15-30 °C。11.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其中所述去垢劑PluronicF68濃度為0.1_5%，十二烷基肌氨酸鈉的濃度為0.1-5% ,PEG 400的濃度為5-10%。去垢劑使用時(shí)間為1-8小時(shí)。
【文檔編號(hào)】A61L27/60GK105833353SQ201610297083
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月9日
【發(fā)明人】史真, 史偉云
【申請(qǐng)人】拜歐迪賽爾（北京）生物科技有限公司