用于誘導(dǎo)葡萄糖攝取的方法【專利摘要】本發(fā)明提供用于通過(guò)抑制細(xì)胞中的Trim32蛋白誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取的方法，和用于通過(guò)增加細(xì)胞中的斑珠蛋白的豐度誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取的方法?！緦＠f(shuō)明】用于誘導(dǎo)葡萄糖攝取的方法發(fā)明領(lǐng)域[0001]本發(fā)明尤其涉及通過(guò)抑制Trim32蛋白和/或增加肌細(xì)胞中斑珠蛋白的豐度誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取的方法。[0002]發(fā)明背景[0003]骨骼肌和心肌的生長(zhǎng)，類(lèi)似于分裂細(xì)胞的生長(zhǎng)，很大程度上取決于通過(guò)胰島素/PI3K/Akt/Fox0途徑的信號(hào)傳導(dǎo)（signaling)。相反地，廢用、消耗或去神經(jīng)以及禁食和疾病狀態(tài)(例如癌癥惡病質(zhì)、膿毒癥和未治療的糖尿?。┲械娜砑∪庀臅r(shí)的具體肌肉的萎縮起因于此途徑活性的降低。該快速的肌肉質(zhì)量損失主要通過(guò)加速降解肌纖維蛋白和可溶性蛋白導(dǎo)致，但是在多數(shù)分解代謝狀態(tài)(例如禁食)中，蛋白質(zhì)合成也減少。[0004]Fox0(叉頭框0(forkheadbox0))轉(zhuǎn)錄因子--PI3K(磷脂酰肌醇_3激酶)/Akt[也稱為PKB(蛋白激酶B)]信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的主要下游介體中的一個(gè)一一在調(diào)控細(xì)胞穩(wěn)態(tài)(homoeostasis)中起重要作用。最近的研究已經(jīng)揭不了FoxO在骨中的重要性、FoxO與-聯(lián)蛋白的相互作用、以及經(jīng)由P13K/Akt機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的FoxO的失活。[0005]這些多種類(lèi)型的萎縮的發(fā)展需要通過(guò)FoxO轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄共同組的萎縮相關(guān)基因("萎縮基因（atrogene)"），其活化足以引起加速的蛋白酶解和萎縮。在萎縮肌肉中，泛素-蛋白酶體途徑（UPS)的多個(gè)組分，比如肌肉特異性泛素連接酶--MuRFl和Atroginl/MAFbx，被誘導(dǎo)并且它們的誘導(dǎo)對(duì)快速消耗是必不可少的。顯示對(duì)萎縮關(guān)鍵的另一種泛素連接酶是Trim32。如同MuRFl-樣，Trim32包含三聯(lián)基序(RING;B框(B-box);繞線式α螺旋），但是還具有帶有推定的蛋白結(jié)合特性的六個(gè)NHL重復(fù)，并且第三重復(fù)中的突變引起肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良2H。我們證明在肌肉消耗期間，MuRFl對(duì)包括粗肌絲在內(nèi)的蛋白質(zhì)的泛素依賴性降解是必不可少的，而Trim32催化結(jié)蛋白細(xì)胞骨架、Z帶和細(xì)肌絲蛋白的連鎖的（1inked)解裝配和降解，其是連鎖的過(guò)程?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取的方法，其包括抑制所述細(xì)胞中的Trim32蛋白的步驟，從而誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞是骨骼肌細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取進(jìn)一步包括肌纖維生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取是誘導(dǎo)細(xì)胞中胰島素受體的磷酸化。[0007]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取的方法，其包括增加細(xì)胞中斑珠蛋白的豐度的步驟，從而誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞是骨骼肌細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞是骨骼肌細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，增加細(xì)胞中斑珠蛋白的豐度導(dǎo)致肌纖維生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，增加細(xì)胞中斑珠蛋白的豐度導(dǎo)致誘導(dǎo)細(xì)胞中胰島素受體的磷酸化?！靖綀D說(shuō)明】[0008]圖1.抑制正常肌肉中的Trim32誘導(dǎo)快速生長(zhǎng)。ΤΑ肌肉電穿孔有shLacz或Trim32-DN并在六天后進(jìn)行分析。(A)條線圖，其顯示:表達(dá)Trim32-DN的肌肉的平均重量展示為與對(duì)照相比百分比增加。11=10，噸〈0.05。（8)顯微圖片一一其顯示代表性肌肉橫截面積，和條線圖--其顯示500個(gè)轉(zhuǎn)染有GFP-Trim32-DN的纖維的橫截面積(黑色)對(duì)在相同的肌肉中500個(gè)未轉(zhuǎn)染的纖維的橫截面積(空白）。11=6。層粘連蛋白染色是紅色的。比例尺=15μπι。[0009]圖2.斑珠蛋白存在于骨骼肌中。(Α)顯微圖片，其顯示來(lái)自進(jìn)食小鼠的石蠟包埋的TA肌肉的縱截面和橫截面(比例尺=20μπι)(上部），并且C2C12肌管使用抗斑珠蛋白染色（比例尺=15μπι)(下部）。0)凝膠顯微圖片，其顯示斑珠蛋白存在于肌肉的胞質(zhì)和膜部分。通過(guò)免疫印跡分析0.25%的膜部分和0.01%的胞質(zhì)部分。GAPDH充當(dāng)胞質(zhì)標(biāo)記物。[0010]圖3.禁食期間的Trim32下調(diào)抑制Ρ13K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)的減少。(A)是凝膠顯微圖片，其顯示在禁食期間，Trim32的抑制增強(qiáng)斑珠蛋白與p85/PI3K的相互作用。p85/PI3K從來(lái)自進(jìn)食或禁食小鼠的表達(dá)shLacz或Trim32-DN的肌肉的可溶部分免疫沉淀。通過(guò)免疫印跡分析沉淀物。（B)是凝膠顯微圖片，其顯示斑珠蛋白和p85/PI3K在心臟和肝臟中的相互作用。P85/PI3K從來(lái)自進(jìn)食小鼠的心臟和肝臟的可溶部分免疫沉淀，并且通過(guò)免疫印跡分析。(C)是凝膠顯微圖片，其顯示在禁食期間，Trim32的下調(diào)增加PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)。通過(guò)SDS-PAGE和免疫印跡分析表達(dá)shLacz或shTrim32的正常和萎縮肌肉的可溶部分。（D)是條線圖，其顯示Trim32的抑制減少禁食期間MuRFl和Atroginl表達(dá)。使用MuRFl和Atroginl的弓丨物對(duì)來(lái)自表達(dá)shLacz或Trim32-DN的萎縮和對(duì)照肌肉的mRNA制劑進(jìn)行定量RT-PCR。數(shù)據(jù)標(biāo)繪為相對(duì)于進(jìn)食對(duì)照的平均倍數(shù)變化。11=4。*?〈0.05對(duì)進(jìn)食中的shLacz#p〈0.05對(duì)禁食中的shLacz。[0011]圖4.斑珠蛋白下調(diào)減少PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)、葡萄糖攝取和纖維大小。（A)是凝膠顯微圖片，其顯示使用shJUP敲除斑珠蛋白導(dǎo)致減少的PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)。正常肌肉電穿孔有shLacz或斑珠蛋白shRNA(shJUP)，并且通過(guò)SDS-PAGE和免疫印跡分析可溶性提取物。（B)是條線圖，其顯示斑珠蛋白的下調(diào)誘導(dǎo)肌肉萎縮。500個(gè)轉(zhuǎn)染有shJUP的纖維(其表達(dá)GFP)(黑色條）的橫截面積對(duì)相同肌肉中的500個(gè)未轉(zhuǎn)染的纖維（空白條）的橫截面積。η=6。（〇是凝膠顯微圖片，其顯示在禁食期間，斑珠蛋白的下調(diào)減少由Trim32-DN誘導(dǎo)的PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)的增加。通過(guò)SDS-PAGE和免疫印跡分析表達(dá)單獨(dú)的shLacz、Trim32-DN連同shLacz、或Trim32-DN連同shJUP的肌肉的可溶性部分。（D)是條線圖，其顯示C2C12成肌細(xì)胞中的斑珠蛋白下調(diào)減少胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取。在表達(dá)shLaCZ、shJUP或斑珠蛋白的C2C12成肌細(xì)胞中測(cè)量[3H]2-脫氧-D-葡萄糖攝取(cpm)。為了測(cè)定胰島素依賴性葡萄糖攝取，從總攝取中減去在20μΜ松胞菌素B存在的情況下測(cè)量得到的值。η=3，*p〈0.05對(duì)shLacz，#p〈0.005對(duì)shLacz。（E)是凝膠顯微圖片，其顯示在正常肌肉中和禁食期間，斑珠蛋白與胰島素受體相關(guān)聯(lián)。斑珠蛋白從來(lái)自進(jìn)食或禁食小鼠的表達(dá)shLacz或Trim32-DN的肌肉的可溶性部分免疫沉淀。通過(guò)斑珠蛋白或胰島素受體的免疫印跡來(lái)分析沉淀物。(F)是凝膠顯微圖片，其顯示斑珠蛋白在心臟和肝臟中與胰島素受體相關(guān)聯(lián)。斑珠蛋白從來(lái)自進(jìn)食小鼠的心臟和肝臟的可溶性部分免疫沉淀，并且通過(guò)免疫印跡進(jìn)行分析。(G)是凝膠顯微圖片，其顯示在禁食期間，斑珠蛋白的過(guò)表達(dá)單獨(dú)地活化胰島素受體并增強(qiáng)PI3K/Akt/FoxO信號(hào)傳導(dǎo)。通過(guò)SDS-PAGE和免疫印跡分析表達(dá)shLacz或GFP-斑珠蛋白的正常和萎縮肌肉的可溶性部分。[0012]圖5.正常肌肉中的Trim32抑制增加PI3K/Akt/Fox0活性和葡萄糖攝取。（A)是顯微圖片，其顯示通過(guò)Trim32-DN抑制Trim32增加斑珠蛋白和PI3K/Akt/Fox0活性。通過(guò)SDS-PAGE和免疫印跡分析表達(dá)shLacz或Trim32-DN的正常TA肌肉的可溶性部分。（B)是條線圖，其顯示C2C12成肌細(xì)胞中的Trim32抑制增加胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取。在表達(dá)shLacz、Trim32或Trim32-DN的C2C12成肌細(xì)胞中測(cè)量[3H]2-脫氧-D-葡萄糖攝取，如在圖4D中，n=3，*p〈0·005對(duì)shLacz，#p〈0·005對(duì)shLacz。[0013]圖6.是提出的用于通過(guò)Trim32調(diào)控PI3K/Akt/Fox0途徑的新機(jī)制的方案。Trim32減少正常和萎縮肌肉中的PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)并調(diào)控生長(zhǎng)。Trim32除了在禁食期間在肌原纖維斷裂中的作用之外，還通過(guò)促進(jìn)斑珠蛋白自P85/PI3K快速解離作為PI3K/Akt/FoxO信號(hào)傳導(dǎo)的新型抑制劑起作用。因?yàn)門(mén)rim32和斑珠蛋白在大多數(shù)組織中表達(dá)，所以它們可能在調(diào)控其它細(xì)胞的生長(zhǎng)中發(fā)揮類(lèi)似的作用。此新型機(jī)制可能有助于禁食和分解代謝疾病(例如，糖尿病、膿毒癥)期間的胰島素耐受性，并且或許有助于在Trim32和斑珠蛋白突變情況下可見(jiàn)的肌病和心肌病。[0014]圖7·重組Trim32聚泛素化(polyubiquitinate)6His-斑珠蛋白。（A)是顯微圖片，其顯示自正常肌肉表達(dá)和純化并且然后與Trim32、UbcH5、泛素(1113丨911；[1:;[仙1:;[011)和41?溫育90分鐘的6His-斑珠蛋白。使用Ni柱分離6His-標(biāo)記的泛素化的斑珠蛋白，并且使用抗斑珠蛋白通過(guò)SDS-PAGE和免疫印跡進(jìn)行分析。（B)是條線圖，其顯示斑珠蛋白表達(dá)不在禁食期間減少。使用MuRFl和Atroginl的引物對(duì)來(lái)自表達(dá)shLacz或Trim32-DN的萎縮和對(duì)照肌肉的mRNA制劑進(jìn)行定量RT-PCR。數(shù)據(jù)標(biāo)繪為相對(duì)于進(jìn)食對(duì)照的平均倍數(shù)變化。η=4。*p〈0.005對(duì)進(jìn)食中的shLacz。[0015]圖8.肌肉中GFP-斑珠蛋白的分布。顯示GFP-斑珠蛋白在ΤΑ肌肉中表達(dá)的顯微圖片顯示了與內(nèi)源蛋白類(lèi)似的分布。[0016]圖9.在正常肌肉中過(guò)表達(dá)Trim32持續(xù)10天不誘導(dǎo)萎縮。（Α)條線圖，其顯示500個(gè)轉(zhuǎn)染有GFP-Trim32的纖維的橫截面積(黑色)對(duì)在相同肌肉中500個(gè)未轉(zhuǎn)染的纖維的橫截面積（空白）的結(jié)果。11=6。（8)凝膠顯微圖片，其顯示正常肌肉轉(zhuǎn)染有shLacz或HA-Trim32,并且通過(guò)SDS-PAGE和免疫印跡分析可溶性提取物。[0017]圖10.橋粒斑蛋白與斑珠蛋白相互作用，但是對(duì)PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)不是必不可少的。（A)凝膠顯微圖片，其顯示橋粒斑蛋白敲除不影響PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)。C2C12成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染有shLacz或橋粒斑蛋白的shRNA(shDSP)，并且通過(guò)SDS-PAGE和免疫印跡分析可溶性提取物。（B)凝膠顯微圖片，其顯示在禁食期間，而當(dāng)Trim32沒(méi)有被抑制時(shí)，斑珠蛋白和橋粒斑蛋白的關(guān)聯(lián)減少。斑珠蛋白從來(lái)自進(jìn)食或禁食小鼠的表達(dá)shLacz或Trim32-DN的肌肉的可溶性部分免疫沉淀。通過(guò)斑珠蛋白或橋粒斑蛋白的免疫印跡分析沉淀物。[0018]發(fā)明【具體實(shí)施方式】[0019]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取的方法，其包括抑制細(xì)胞中的Trim32蛋白的步驟，從而誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是萎縮肌肉內(nèi)的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是暴露于禁食條件的肌肉內(nèi)的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是患有糖尿病的對(duì)象的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是患有I型糖尿病的對(duì)象的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是患有II型糖尿病的對(duì)象的細(xì)胞。[0020]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的Trim32蛋白包括下列氨基酸序列或由下列氨基酸序列組成：[0021]Trim32蛋白是具有如本文所述的Trim32蛋白活性的SEQIDN0:1的片段。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Trim32蛋白是具有如本文所述的Trim32蛋白活性的SEQIDN0:1的突變體。[0022]在另一個(gè)實(shí)施方式中，誘導(dǎo)葡萄糖攝取是增強(qiáng)葡萄糖攝取。在另一個(gè)實(shí)施方式中，誘導(dǎo)葡萄糖攝取是增加葡萄糖攝取。在另一個(gè)實(shí)施方式中，誘導(dǎo)葡萄糖攝取是增加肌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的濃度。在另一個(gè)實(shí)施方式中，誘導(dǎo)葡萄糖攝取是增加細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖至少20%。在另一個(gè)實(shí)施方式中，誘導(dǎo)葡萄糖攝取是增加細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖至少30%。在另一個(gè)實(shí)施方式中，誘導(dǎo)葡萄糖攝取是增加細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖至少40%。在另一個(gè)實(shí)施方式中，誘導(dǎo)葡萄糖攝取是增加細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖至少50%。在另一個(gè)實(shí)施方式中，誘導(dǎo)葡萄糖攝取是增加細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖至少1.5倍。在另一個(gè)實(shí)施方式中，誘導(dǎo)葡萄糖攝取是增加細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖至少2倍。在另一個(gè)實(shí)施方式中，誘導(dǎo)葡萄糖攝取是增加細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖至少3倍。在另一個(gè)實(shí)施方式中，誘導(dǎo)葡萄糖攝取是增加細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖至少4倍。在另一個(gè)實(shí)施方式中，誘導(dǎo)葡萄糖攝取是增加細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖至少5倍。在另一個(gè)實(shí)施方式中，誘導(dǎo)葡萄糖攝取是增加細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖至少10倍。[0023]在另一個(gè)實(shí)施方式中，抑制Trim32蛋白是抑制Trim32蛋白的活性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抑制Trim32蛋白是抑制編碼Trim32蛋白的mRNA分子的翻譯。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抑制Trim32蛋白是抑制Trim32mRNA的轉(zhuǎn)錄。[0024]在另一個(gè)實(shí)施方式中，抑制Trim32蛋白是使肌細(xì)胞與針對(duì)Trim32的反義寡核苷酸(AS-0DN)接觸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抑制Trim32蛋白是使肌細(xì)胞與針對(duì)Trim32的核酶接觸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抑制Trim32蛋白是使肌細(xì)胞與針對(duì)Trim32的小干擾RNA(siRNA)接觸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抑制Trim32蛋白是使肌細(xì)胞與針對(duì)Trim32的RNA干擾(RNAi)分子接觸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抑制Trim32蛋白是使肌細(xì)胞與針對(duì)Trim32的antagomir反義物(antagomirantisense)接觸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抑制Trim32蛋白是使肌細(xì)胞與設(shè)計(jì)來(lái)沉默Trim32的microRNA接觸。[0025]在另一個(gè)實(shí)施方式中，抑制Trim32蛋白是使肌細(xì)胞與缺少Trim32活性的突變體蛋白Trim32蛋白接觸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抑制Trim32蛋白是使肌細(xì)胞與顯性失活的（DN)Trim32蛋白接觸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的顯性失活的（DN)Trim32蛋白包括下列氨基酸序列或由下列氨基酸順序組成：[0026]N0:2)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，DNTrim32蛋白是具有如本文所述的DNTrim32蛋白活性的SEQIDN0:2的片段。在另一個(gè)實(shí)施方式中，DNTrim32蛋白是具有如本文所述的Trim32蛋白活性的SEQIDN0:2的突變體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，DNTrim32蛋白是廢除如本文所述的Trim32蛋白活性的SEQIDN0:1的片段。在另一個(gè)實(shí)施方式中，DNTrim32蛋白是廢除如本文所述的Trim32蛋白活性的SEQIDN0:1的突變體。[0027]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的顯性失活的(DN)Trim32蛋白由如此DNA序列編碼，所述DNA序列包括下列核酸序列或由下列核酸序列組成：[0028]在另一個(gè)實(shí)施方式中，抑制Trim32蛋白是使肌細(xì)胞與缺少Trim32肌肉活性的突變體蛋白Trim32蛋白接觸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抑制Trim32蛋白是使肌細(xì)胞與廢除Trim32肌肉活性的小分子接觸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抑制Trim32蛋白是使肌細(xì)胞與Trim32競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑接觸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抑制Trim32蛋白是使肌細(xì)胞與使Trim32蛋白失活的Trim32抗體接觸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體是多克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體是單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體是針對(duì)Trim32蛋白的單鏈可變片段(scFv)。[0029]在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的抑制肌細(xì)胞中的Trim32蛋白導(dǎo)致肌細(xì)胞中斑珠蛋白濃度的增加。在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的抑制肌細(xì)胞中的Trim32蛋白導(dǎo)致誘導(dǎo)胰島素受體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的抑制肌細(xì)胞中的Trim32蛋白導(dǎo)致誘導(dǎo)細(xì)胞中胰島素受體的磷酸化。在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的抑制肌細(xì)胞中的Trim32蛋白導(dǎo)致增加肌細(xì)胞中的PI3K/Akt/FoxO信號(hào)傳導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的抑制肌細(xì)胞中的Trim32蛋白導(dǎo)致增強(qiáng)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取。在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的抑制肌細(xì)胞中的Trim32蛋白導(dǎo)致肌纖維生長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的抑制肌細(xì)胞中的Trim32蛋白導(dǎo)致誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的有絲分裂。[0030]在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是骨骼肌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是心肌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是平滑肌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是萎縮肌肉內(nèi)的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是患有消耗性疾病的對(duì)象的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是患有肌肉去神經(jīng)疾病的對(duì)象的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是禁食對(duì)象的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是患有惡病質(zhì)的對(duì)象的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是患有癌癥的對(duì)象的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是患有膿毒癥的對(duì)象的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是患有糖尿病的對(duì)象的細(xì)胞。[0031]在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是遭受肌肉質(zhì)量損失的對(duì)象的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是遭受肌纖維蛋白和可溶性蛋白的加速降解、和/或分解代謝狀態(tài)的對(duì)象的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是遭受低水平的IGF-I的對(duì)象的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌細(xì)胞是遭受低水平的胰島素的對(duì)象的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法抑制和/或下調(diào)Trim32,并且從而減少肌肉萎縮。[0032]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取的方法，其包括增加細(xì)胞中斑珠蛋白的豐度的步驟，從而誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取。在另一個(gè)實(shí)施方式中，增加細(xì)胞中斑珠蛋白的豐度進(jìn)一步導(dǎo)致誘導(dǎo)肌纖維生長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，增加細(xì)胞中斑珠蛋白的豐度導(dǎo)致誘導(dǎo)細(xì)胞中胰島素受體的磷酸化。在另一個(gè)實(shí)施方式中，增加細(xì)胞中斑珠蛋白的豐度是用包含編碼斑珠蛋白的核酸分子的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，增加豐度是增加濃度。在另一個(gè)實(shí)施方式中，增加豐度是增加活性。[0033]在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的PI3K/Akt/Fox0途徑的活化誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)，而其抑制減小細(xì)胞存活率，并且在肌肉中引起萎縮。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Trim32抑制誘導(dǎo)斑珠蛋白的積聚，其又結(jié)合胰島素受體和PI3K亞基--p85,并且促進(jìn)PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了穩(wěn)定斑珠蛋白以增強(qiáng)PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)。[0034]在另一個(gè)實(shí)施方式中，斑珠蛋白包括下列氨基酸序列或由下列氨基酸序列組成：ADDMDATYRPMYSSDVPLDPLDMHMDLD⑶YPMDTYSDGLRPPYPTADHMLA(SEQIDN0:3)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，斑珠蛋白是具有如本文所述的斑珠蛋白活性的SEQIDN0:3的片段。在另一個(gè)實(shí)施方式中，斑珠蛋白是具有如本文所述的斑珠蛋白活性的SEQIDN0:3的突變體。[0036]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明令人驚訝地提供了斑珠蛋白是骨骼肌的重要組成，其中其結(jié)合胰島素受體和PI3K的p85調(diào)控亞基二者，以通過(guò)PI3K/Akt/Fox0級(jí)聯(lián)增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)。因而，在一些實(shí)施方式中，斑珠蛋白水平的變化單獨(dú)地影響肌肉中的PI3K/Akt/Fox0途徑，并且從而引起肌肉生長(zhǎng)或阻斷萎縮。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明令人驚訝地提供了Trim32通過(guò)促進(jìn)斑珠蛋白的降解作為PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)的新型抑制劑起作用，所述斑珠蛋白對(duì)細(xì)胞中此途徑的活化是重要的。[0037]在另一個(gè)實(shí)施方式中，下調(diào)Trim32減少肌肉萎縮。在另一個(gè)實(shí)施方式中，下調(diào)Trim32通過(guò)電穿孔顯性失活的Trim32(Trim32-DN)實(shí)現(xiàn)，所述顯性失活的Trim32缺少催化RING結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方式中，過(guò)表達(dá)Trim32-DN導(dǎo)致與電穿孔的肌肉的重量相比重量增加（圖1A)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸分子通過(guò)體內(nèi)電穿孔遞送入靶肌組織。[0038]在一些實(shí)施方式中，本文所述的任何蛋白質(zhì)或多肽包含天然多肽(降解產(chǎn)物、人造合成的（syntheticallysynthesized)多肽或重組多肽）和類(lèi)肽(peptidomimetics)(通常為人造合成的多肽），以及擬肽和半擬肽，其是多肽類(lèi)似物，其在一些實(shí)施方式中具有修飾，所述修飾使多肽在體內(nèi)時(shí)甚至更穩(wěn)定或更能夠穿透入細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"和"多肽"可以互換地使用。[0039]在一些實(shí)施方式中，對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的修飾包括但不限于N末端修飾、C末端修飾、多肽鍵修飾、主鏈修飾和殘基修飾，所述多肽鍵修飾包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S=0、0=0順、012-〇、012-〇12、5=(：-順、01=01或0?=01。用于制備類(lèi)肽化合物的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，并且在例如QuantitativeDrugDesign，C.A.RamsdenGd.，Chapter17.2，F(xiàn).ChoplinPergamonPress(1992)中規(guī)定，其通過(guò)引用并入，如同完全在本文陳述一樣。關(guān)于此方面的進(jìn)一步細(xì)節(jié)在下文中提供。[0040]在一些實(shí)施方式中，多肽內(nèi)的多肽鍵(-C0-NH-)被取代。在一些實(shí)施方式中，多肽鍵被N-甲基化鍵(-N(CH3)-C0-)取代。在一些實(shí)施方式中，多肽鍵被酯鍵(-C(R)H-C-0-0-C(R)-N-)取代。在一些實(shí)施方式中，多肽鍵被酮基亞甲基(ketomethylen)鍵(_⑶-CH2-)取代。在一些實(shí)施方式中，多肽鍵被α-氮雜(aza)鍵(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R是任何烷基，例如，甲基、亞甲基胺基（carba)鍵(-CH2-NH-)。在一些實(shí)施方式中，多肽鍵被羥基亞乙基(hydroxyethylene)鍵(-CH(0H)-CH2_)取代。在一些實(shí)施方式中，多肽鍵被硫代酰胺鍵(_CS-NH-)取代。在一些實(shí)施方式中，多肽鍵被烯雙鍵(-CH=CH-)取代。在一些實(shí)施方式中，多肽鍵被反(retro)酰胺鍵(-NH-C0-)取代。在一些實(shí)施方式中，多肽鍵被多肽衍生物(-N(R)-CH2-C0-)取代，其中R是在碳原子上天然存在的"正常(normal)"側(cè)鏈。在一些實(shí)施方式中，這些修飾在沿著多肽鏈的鍵中的任一個(gè)處發(fā)生，和甚至同時(shí)在數(shù)個(gè)(2-3個(gè)鍵)處發(fā)生。[00411在一些實(shí)施方式中，多肽的天然芳族氨基酸比如Trp、Tyr和Phe被替換為合成的非天然酸比如苯基甘氨酸、1'10、仙口111：117161311；[116(1'101)、？116的環(huán)甲基化的衍生物、？116的鹵代衍生物、或0-甲基-Tyr。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽包括一個(gè)或多個(gè)修飾的氨基酸或一個(gè)或多個(gè)非氨基酸單體(例如脂肪酸、復(fù)合糖等）。[0042]在一個(gè)實(shí)施方式中，"氨基酸"理解為包括20種天然存在的氨基酸;經(jīng)常被體內(nèi)翻譯后修飾的那些氨基酸包括，例如，羥基脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸；和其它稀有(unusual)氨基酸，其包括但不限于2-氨基己二酸、羥基賴氨酸、異鎖鏈素、正-纈氨酸、正_亮氨酸和鳥(niǎo)氨酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，"氨基酸"包括D-氨基酸和L-氨基酸二者。[0043]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽被用于需要該多肽處于可溶形式的療法。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽包括一個(gè)或多個(gè)非天然或天然極性氨基酸，其包括但不限于絲氨酸和蘇氨酸，其由于它們的含羥基側(cè)鏈能夠增加多肽溶解度。[0044]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽以線性形式使用，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)的是，在其中環(huán)化(cyclicization)不嚴(yán)重地干擾多肽特性的情況下，還可以使用環(huán)狀形式的多肽。[0045]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽是生化地合成的，比如通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)的固相技術(shù)。在一些實(shí)施方式中，這些生化方法包括專有的固相合成、部分固相合成、片段縮合或經(jīng)典的溶液合成。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)多肽相對(duì)短(大約5_15kDa)和/或當(dāng)其不能通過(guò)重組技術(shù)(即，不由核酸序列編碼)生產(chǎn)并因此涉及不同的化學(xué)過(guò)程時(shí)，使用這些方法。[0046]在一些實(shí)施方式中，固相多肽合成過(guò)程對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的，并且由JohnMorrowStewart和JanisDillahaYoung,SolidPhasePolypeptideSyntheses(第2版，PierceChemicalCompany,1984)進(jìn)一步描述。在一些實(shí)施方式中，合成多肽通過(guò)制備型高效液相色譜[CreightonT.(1983)Proteins,structuresandmolecularprinciples.WHFreeman和Co.N.Y.]純化，并且其組成可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法經(jīng)由氨基酸測(cè)序確定。[0047]在一些實(shí)施方式中，重組蛋白技術(shù)用于生成本發(fā)明的多肽。在一些實(shí)施方式中，重組蛋白技術(shù)用于生成相對(duì)長(zhǎng)的多肽(例如，長(zhǎng)于18-25個(gè)氨基酸）。在一些實(shí)施方式中，重組蛋白技術(shù)用于生成大量的本發(fā)明的多肽。在一些實(shí)施方式中，重組技術(shù)由Bitter等（1987)MethodsinEnzymol.153:516_544、Studier等（1990)MethodsinEnzymol.185:60-89、131^88〇]1等（1984)似1：11代310:511-514、1&1^1]1&七811等（1987祀]\1130]\6:307-311、〇〇1'1122；[等(1984)EMB0J.3:1671-1680、和Brogli等（1984)Science224:838-843、Gurley等（1986)Mol.Cell.Biol.6:559-565、和Weissbach&Weissbach,1988,MethodsforPlantMolecularBiology，AcademicPress，NY，SectionVIII，pp421-463所描述。[0048]在一個(gè)實(shí)施方式中，使用編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸合成本發(fā)明的多肽。在一些實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸連接入表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括轉(zhuǎn)錄控制的順式調(diào)控序列(例如，啟動(dòng)子序列）。在一些實(shí)施方式中，順式調(diào)控序列適合用于指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的組成型表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，順式調(diào)控序列適合用于指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的組織特異性表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，順式調(diào)控序列適合用于指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的誘導(dǎo)型表達(dá)。[0049]在一些實(shí)施方式中，適合與本發(fā)明一起使用的組織特異性啟動(dòng)子比如肌肉特異性啟動(dòng)子包括在特定細(xì)胞群體中起作用的序列，比如神經(jīng)絲啟動(dòng)子[Byrne等（1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473-5477]。適合與本發(fā)明一起使用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括例如四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（Srour，M.A.等2003.Thromb.Haemost.90:398-405)。[0050]在一個(gè)實(shí)施方式中，短語(yǔ)"多核苷酸"是指單鏈或雙鏈核酸序列，其可以以RNA序列、互補(bǔ)多核苷酸序列(cDNA)、基因組多核苷酸序列和/或復(fù)合多核苷酸序列(例如，上面的組合）的形式分離或提供。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的cDNA編碼TRM32蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的cDNA編碼具有SEQIDNO:1的TR頂32蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的cDNA編碼DNTR頂32蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的cDNA編碼具有SEQIDNO:2的DNTRIM32蛋白。[0051]在一個(gè)實(shí)施方式中，"互補(bǔ)多核苷酸序列"是指如此序列，其源于使用逆轉(zhuǎn)錄酶或任何其它RNA依賴性DNA聚合酶的信使RNA的逆轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方式中，隨后可以使用DNA聚合酶體內(nèi)或體外擴(kuò)增該序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的cDNA編碼斑珠蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的cDNA編碼具有SEQIDN0:3的斑珠蛋白。[0052]在一個(gè)實(shí)施方式中，"基因組多核苷酸序列"是指衍生(分離）自染色體的序列并且因而其代表染色體的鄰接部分。[0053]在一個(gè)實(shí)施方式中，"復(fù)合多核苷酸序列"是指如此序列，其是至少部分互補(bǔ)的或至少部分基因組的。在一個(gè)實(shí)施方式中，復(fù)合序列可以包括編碼本發(fā)明的多肽所需的一些外顯子序列，以及插入其間的一些內(nèi)含子序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，內(nèi)含子序列可以是包含其它基因的任何來(lái)源，并且通常將包括保守的剪接信號(hào)序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，內(nèi)含子序列包括順式作用表達(dá)調(diào)控元件。[0054]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)一步包括編碼用于分泌本發(fā)明的多肽的信號(hào)肽的信號(hào)序列。在一些實(shí)施方式中，信號(hào)序列包括但不限于內(nèi)源信號(hào)序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，在表達(dá)和分泌后，信號(hào)肽從前體蛋白質(zhì)切割，其導(dǎo)致成熟蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的多核苷酸被轉(zhuǎn)移入靶組織/肌肉。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的多核苷酸被電轉(zhuǎn)移入靶組織/肌肉。[0055]在一些實(shí)施方式中，使用PCR技術(shù)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它方法或過(guò)程制備本發(fā)明的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，該過(guò)程包含連接兩個(gè)不同的DNA序列(參見(jiàn)，例如，"CurrentProtocolsinMolecularBiology"，eds.Ausubel等，Johnffiley&Sons,1992)〇[0056]在一個(gè)實(shí)施方式中，將本發(fā)明的多核苷酸插入表達(dá)載體（即，核酸構(gòu)建體）以能夠表達(dá)重組多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的表達(dá)載體包括使此載體適合在原核生物中復(fù)制和整合的額外序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的表達(dá)載體包括使此載體適合在真核生物中復(fù)制和整合的額外序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的表達(dá)載體包括使此載體適合在原核生物和真核生物二者中復(fù)制和整合的穿梭載體。在一些實(shí)施方式中，克隆載體包括轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列（例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子(enhance))，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子(例如，多腺苷酸化信號(hào)）。[0057]在一個(gè)實(shí)施方式中，多種原核或真核細(xì)胞可以用作宿主表達(dá)系統(tǒng)以表達(dá)本發(fā)明的多肽。在一些實(shí)施方式中，這些包括但不限于微生物，比如轉(zhuǎn)化有包含多肽編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體的細(xì)菌;轉(zhuǎn)化有包含多肽編碼序列的重組酵母表達(dá)載體的酵母;植物細(xì)胞系統(tǒng)，其感染有包含多肽編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒--CaMV;煙草花葉病毒--TMV)或轉(zhuǎn)化有包含多肽編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體，比如Ti質(zhì)粒。[0058]在一些實(shí)施方式中，非細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)（例如哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)比如CH0細(xì)胞）用于表達(dá)本發(fā)明的多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體是PCI-DHFR載體，其包括CMV啟動(dòng)子和新霉素抗性基因。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，在實(shí)施例1中描述了pCI-DHFR載體的構(gòu)建。[0059]在一些實(shí)施方式中，在本發(fā)明的細(xì)菌系統(tǒng)中，可以取決于表達(dá)的多肽的使用目的有利地選擇許多表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，大數(shù)量的多肽是期望的。在一個(gè)實(shí)施方式中，如下載體是期望的：其指導(dǎo)表達(dá)高水平的蛋白質(zhì)產(chǎn)物一一可能作為與疏水性信號(hào)序列的融合物(fusion)，所述疏水性信號(hào)序列指導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入細(xì)菌的周質(zhì)或培養(yǎng)基一一蛋白質(zhì)產(chǎn)物在其中容易被純化。在一個(gè)實(shí)施方式中，某些融合蛋白被改造具有特異性切割位點(diǎn)以幫助回收多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，適合這樣的操縱的載體包括但不限于PET系列的大腸桿菌表達(dá)載體[Studier等，MethodsinEnzymol.185:60-89(1990)]〇[0060]在一個(gè)實(shí)施方式中，使用酵母表達(dá)系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，包含組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的許多載體可以在如美國(guó)專利號(hào)5，932,447中公開(kāi)的酵母中使用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用促進(jìn)外源DNA序列整合入酵母染色體的載體。[0061]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的表達(dá)載體可以進(jìn)一步包括允許例如從單個(gè)mRNA比如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)翻譯多個(gè)蛋白質(zhì)的額外的多核苷酸序列，和用于基因組整合啟動(dòng)子-嵌合多肽的序列。[0062]在一些實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括但不限于可從Invitrogen獲得的pcDNA3、pcDNA3·1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/_)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/11^。/。7切4〇?3.145丨111^?5、0!1265、0冊(cè)84匪1'14^0'414匪了81，可從？1〇111683獲得的口(：1，可從Strategene獲得的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，可從Clontech獲得的pTRES、和它們的衍生物。[0063]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明使用包含來(lái)自真核病毒比如逆轉(zhuǎn)錄病毒的調(diào)控元件的表達(dá)載體。SV40載體包括pSVT7和pMT2。在一些實(shí)施方式中，源自牛乳頭瘤病毒的載體包括pBV-lMTHA，并且源自埃巴（EpsteinBar)病毒的載體包括pHEBO和p205。其它示例性載體包括pMSG、pAV009/A+、pMTOl0/A+、pMAMneo-5、桿狀病毒pDSVE、和在如下啟動(dòng)子指導(dǎo)下允許蛋白質(zhì)表達(dá)的任何其它載體:SV-40早期啟動(dòng)子、SV-40晚期啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒啟動(dòng)子、多角體蛋白啟動(dòng)子、或顯示對(duì)真核細(xì)胞中的表達(dá)有效的其它啟動(dòng)子。[0064]在一些實(shí)施方式中，重組病毒載體由于它們具有優(yōu)勢(shì)--比如橫向感染（lateralinfection)和祀向特異性--對(duì)本發(fā)明的多肽的體內(nèi)表達(dá)是有用的。在一個(gè)實(shí)施方式中，橫向感染在例如逆轉(zhuǎn)錄病毒的生命周期中是固有的，并且是單個(gè)感染的細(xì)胞通過(guò)其產(chǎn)生許多子代病毒體一一其出芽(budoff)并感染相鄰細(xì)胞一一的過(guò)程。在一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)果是大面積變得被快速感染，其大多數(shù)未被原始病毒顆粒最初感染。在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)生不能夠橫向擴(kuò)散的病毒載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，如果期望的目的是將特定基因引入僅局部數(shù)目的靶細(xì)胞，此特性可以是有用的。[0065]在一個(gè)實(shí)施方式中，多種方法可以用于將本發(fā)明的表達(dá)載體引入細(xì)胞。這樣的方法通常描述在Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborLaboratory,NewYork(1989，1992)、Ausube1等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons，Baltimore，Md·(1989)、Chang等，SomaticGeneTherapy，CRCPress，AnnArbor，Mich·(1995)、Vega等，GeneTargeting，CRCPress,AnnArborMich.(1995)、Vectors:ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses，Butterworths，BostonMass·(1988)、和Gilboa等[Biotechniques4(6):504-512，1986]中，并且包括，例如，穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔和感染有重組病毒載體。此外，對(duì)于陽(yáng)性-陰性選擇方法，參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5，464，764和5，487，992。[0066]在一些實(shí)施方式中，通過(guò)病毒感染引入核酸相對(duì)其它方法比如脂轉(zhuǎn)染和電穿孔提供了多個(gè)優(yōu)勢(shì)，這是因?yàn)榭梢杂捎诓《镜母腥拘再|(zhì)獲得更高的轉(zhuǎn)染效率。[0067]在一個(gè)實(shí)施方式中，將領(lǐng)會(huì)的是，如上所述的，本發(fā)明的多肽還可以采用任何合適的施用模式從施用至個(gè)體的核酸構(gòu)建體表達(dá)(即，體內(nèi)基因治療）。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸構(gòu)建體經(jīng)由適當(dāng)?shù)幕蜻f送運(yùn)載體/方法(轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、同源重組等)和根據(jù)需要的表達(dá)系統(tǒng)引入合適的細(xì)胞，并且然后將修飾的細(xì)胞在培養(yǎng)物中擴(kuò)增并返回至個(gè)體（即，離體基因治療)。[0068]在一個(gè)實(shí)施方式中，使用ΕΡ0的體內(nèi)基因治療已經(jīng)在動(dòng)物模型比如嚙齒動(dòng)物[Bohl等，Blood.2000;95:2793-2798]、靈長(zhǎng)類(lèi)[Gao等，Blood,2004,Volume103，Number9]中嘗試，并且已經(jīng)在人體臨床試驗(yàn)中證明對(duì)患有慢性腎衰竭的患者是成功的[Lippin等，Blood2005,106,Number7]〇[0069]在一個(gè)實(shí)施方式中，使用植物表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，多肽編碼序列的表達(dá)由許多啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。在一些實(shí)施方式中，使用病毒啟動(dòng)子比如CaMV的35SRNA和19SRNA啟動(dòng)子[Brisson等，Nature310:511-514(1984)]、或TMV的外殼蛋白啟動(dòng)子[Takamatsu等，ΕΜΒ0J.6:307-311(1987)]。在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用植物啟動(dòng)子比如，例如，RUBIS⑶的小亞基[Coruzzi等，ΕΜΒ0J.3:1671-1680(1984);和Brogli等，Science224:838-843(1984)]或熱激啟動(dòng)子，例如，大豆hspl7·5-E或hspl7·3_B[Gurley等，Mol.Cell.Biol.6:559-565(1986)]。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔和本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其它技術(shù)將構(gòu)建體引入植物細(xì)胞。參見(jiàn)，例如，Weissbach&Weissbach[MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,NY,SectionVIII，pp421-463(1988)]。本發(fā)明還可以使用本領(lǐng)域中眾所周知的其它表達(dá)系統(tǒng)，比如昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系統(tǒng)。[0070]將領(lǐng)會(huì)的是，除包含用于轉(zhuǎn)錄和翻譯插入的編碼序列（編碼多肽）的必需元件之外，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體還可以包括改造以使表達(dá)的多肽的穩(wěn)定性、產(chǎn)生、純化、產(chǎn)率或活性最優(yōu)化的序列。[0071]在一些實(shí)施方式中，多種方法可以用于將本發(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞系統(tǒng)。在一些實(shí)施方式中，這樣的方法通常描述在Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborLaboratory，NewYork(1989，1992)、Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,Md.(1989)、Chang等，SomaticGeneTherapy，CRCPress，AnnArbor，Mich.(1995)、Vega等，GeneTargeting,CRCPress,AnnArborMich.(1995)NVectors:ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses,Butterworths,BostonMass·(1988)、和Gilboa等[Biotechniques4(6):504-512,1986]，并且包括，例如，穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔、和感染有重組病毒載體。此外，對(duì)于陽(yáng)性-陰性選擇方法，參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,464,764和5，487,992。[0072]在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在有效條件下培養(yǎng)，其允許表達(dá)高量的重組多肽。在一些實(shí)施方式中，有效培養(yǎng)條件包括但不限于準(zhǔn)許蛋白質(zhì)產(chǎn)生的有效培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器、溫度、pH和氧條件。在一個(gè)實(shí)施方式中，有效培養(yǎng)基是指在其中培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生本發(fā)明的重組多肽的任何培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基通常包括具有可同化的碳、氮和磷源、和適當(dāng)?shù)柠}、礦物質(zhì)、金屬和其它營(yíng)養(yǎng)物比如維生素的水溶液。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞可以在常規(guī)的發(fā)酵生物反應(yīng)器、搖瓶、試管、微量滴定皿和培養(yǎng)板中培養(yǎng)。在一些實(shí)施方式中，在適于重組細(xì)胞的溫度、pH和氧含量下進(jìn)行培養(yǎng)。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域技術(shù)人員的專業(yè)知識(shí)內(nèi)。[0073]在一些實(shí)施方式中，取決于用于生產(chǎn)的載體和宿主系統(tǒng)，本發(fā)明的所得的多肽保留在重組細(xì)胞內(nèi)、分泌入發(fā)酵培養(yǎng)基中、分泌入兩層細(xì)胞膜之間的空間中一一比如大腸桿菌中的壁膜間隙，或保持在細(xì)胞或病毒膜的外表面上。[0074]在一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)預(yù)定時(shí)間后，實(shí)現(xiàn)回收重組多肽。[0075]在一個(gè)實(shí)施方式中，本文使用的短語(yǔ)"回收重組多肽"是指收集包含多肽的整個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)基，并且不需要暗指分離或純化的額外步驟。[0076]在一個(gè)實(shí)施方式中，使用多種標(biāo)準(zhǔn)的蛋白純化技術(shù)純化本發(fā)明的多肽，比如但不限于親和層析、離子交換層析、過(guò)濾、電泳、疏水作用層析、凝膠過(guò)濾層析、反相層析、伴刀豆球蛋白A層析、層析聚焦和差別增溶(differentialsolubilization)〇[0077]在一個(gè)實(shí)施方式中，為了助于回收，表達(dá)的編碼序列可以改造以編碼本發(fā)明的多肽和融合的可切割部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以設(shè)計(jì)融合蛋白，使得多肽可以通過(guò)親和層析容易地分離;例如，通過(guò)固定化在對(duì)可切割部分特異的柱上分離。在一個(gè)實(shí)施方式中，切割位點(diǎn)在多肽和可切割部分之間改造，并且通過(guò)使用在此位點(diǎn)處特異性地切割融合蛋白的適當(dāng)?shù)拿富蛟噭┨幚恚嚯目梢詮膶游鲋尫臶例如，參見(jiàn)Booth等，Immunol.Lett.19:65-70(1988);和Gardella等，J·Biol·Chem.265:15854-15859(1990)]〇[0078]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽以"基本上純的"形式取回。[0079]在一個(gè)實(shí)施方式中，短語(yǔ)"基本上純的"是指允許在本文所述的應(yīng)用中蛋白質(zhì)有效使用的純度。[0080]在一個(gè)實(shí)施方式中，還可以使用體外表達(dá)系統(tǒng)合成本發(fā)明的多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，體外合成方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且系統(tǒng)的組分是商業(yè)上可獲得的。[0081]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以提供至個(gè)體/對(duì)象自身。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以提供至個(gè)體作為藥物組合物的一部分，其中其與藥學(xué)上可接受的載體混合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以提供至個(gè)體作為藥物組合物的一部分，其中其與至少一種額外的抗炎劑和藥學(xué)上可接受的載體混合。[0082]在一個(gè)實(shí)施方式中，"藥物組合物"是指一種或多種本文所述的活性成分與其它化學(xué)組分比如生理學(xué)上合適的載體和賦形劑的制劑。藥物組合物的目的是助于將化合物施用至生物體。[0083]在一個(gè)實(shí)施方式中，"活性成分"是指感興趣的蛋白質(zhì)，其對(duì)生物效應(yīng)負(fù)責(zé)。[0084]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供組合的制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，"組合的制劑"尤其限定了"多部分的試劑盒（kitofparts)"，在這種意義上，如上所限定的組合伙伴(combinationpartner)可以獨(dú)立地給藥或通過(guò)使用具有區(qū)別量的組合伙伴的不同的固定組合給藥，即，同步地、同時(shí)地、分別地或順序地給藥。在一些實(shí)施方式中，例如，多部分的試劑盒的部分然后可以同時(shí)施用或按時(shí)間順序錯(cuò)開(kāi)施用，即在不同的時(shí)間點(diǎn)，并且對(duì)多部分的試劑盒的任何部分具有相同或不同的時(shí)間間隔。在一些實(shí)施方式中，該總量比率的組合伙伴可以以組合的制劑施用。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合的制劑可以變化，例如，為了應(yīng)對(duì)待治療的患者亞群的需求、或單個(gè)患者的需求，其不同的需求可以是由于如本領(lǐng)域技術(shù)人員容易知曉的具體的疾病、疾病的嚴(yán)重度、年齡、性別或體重。[0085]在一個(gè)實(shí)施方式中，可以互換使用的短語(yǔ)"生理學(xué)上可接受的載體"和"藥學(xué)上可接受的載體"是指不引起對(duì)生物體的顯著刺激性且不廢除施用的化合物的生物學(xué)活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。在這些短語(yǔ)下包括佐劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，包括在藥學(xué)上可接受的載體中的成分之一可以是例如聚乙二醇(PEG)--一種在有機(jī)介質(zhì)和水介質(zhì)二者中具有寬范圍的溶解度的生物相容性聚合物(Mutter等（1979))。[0086]在一個(gè)實(shí)施方式中，"賦形劑"是指添加至藥物組合物以進(jìn)一步助于施用活性成分的惰性物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，賦形劑包括碳酸鈣、磷酸鈣、多種糖與各種類(lèi)型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。[0087]用于配制和施用藥物的技術(shù)見(jiàn)于"Remington'sPharmaceuticalSciences,"MackPublishingCo.,Easton,PA的最新版本中，其通過(guò)引用并入本文。[0088]在一個(gè)實(shí)施方式中，合適的施用途徑，例如，包括口服、直腸、經(jīng)粘膜(transmucosal)、經(jīng)鼻、腸內(nèi)或腸胃外遞送，所述腸胃外遞送包括肌肉內(nèi)、皮下和髓內(nèi)注射以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。[0089]在一個(gè)實(shí)施方式中，制劑以局部方式而不是全身方式施用，例如，經(jīng)由將制劑直接地注射入患者身體的特定區(qū)域。[0090]在一些實(shí)施方式中，經(jīng)口組合物包括液體溶液、乳液、懸浮液等。在一些實(shí)施方式中，適于制備這樣的組合物的藥學(xué)上可接受的載體是本領(lǐng)域中眾所周知的。在一些實(shí)施方式中，液體口服組合物包括大約0.012%至大約0.933%的期望的一種或多種化合物，或在另一個(gè)實(shí)施方式中，包括大約0.033%至大約0.7%的期望的一種或多種化合物。[0091]在一些實(shí)施方式中，用于本發(fā)明的方法的組合物包括溶液或乳液，在一些實(shí)施方式中，其是包括安全和有效量的本發(fā)明的化合物和任選地其它化合物的水溶液或水乳液，旨在用于局部鼻內(nèi)施用。在一些實(shí)施方式中，組合物包括大約〇.〇1%至大約1〇.〇%w/v的對(duì)象化合物，更優(yōu)選地大約〇.1%至大約2.0的對(duì)象化合物，其用于通過(guò)鼻內(nèi)途徑全身遞送化合物。[0092]在另一個(gè)實(shí)施方式中，藥物組合物通過(guò)靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射液體制劑來(lái)施用。在一些實(shí)施方式中，液體劑型(formulation)包括溶液、懸浮液、分散液、乳液、油等。在一個(gè)實(shí)施方式中，靜脈內(nèi)施用藥物組合物，并且因而以適于靜脈內(nèi)施用的形式配制藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，動(dòng)脈內(nèi)施用藥物組合物，并且因而以適于動(dòng)脈內(nèi)施用的形式配制藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肌肉內(nèi)施用藥物組合物，并且因而以適于肌肉內(nèi)施用的形式配制藥物組合物。[0093]進(jìn)一步，在另一個(gè)實(shí)施方式中，藥物組合物局部地施用至身體表面，并且因而以適于局部施用的形式配制藥物組合物。合適的局部劑型包括凝膠、軟膏、霜?jiǎng)?cream)、洗劑、滴劑等。對(duì)于局部施用，本發(fā)明的化合物與額外的適當(dāng)?shù)囊环N或多種治療劑組合，以在具有或不具有藥學(xué)載體的生理學(xué)上可接受的稀釋劑中的溶液、懸浮液或乳液制備并施加。[0094]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物通過(guò)本領(lǐng)域中眾所周知的工藝制造，例如，借助于常規(guī)的混合、溶解、制粒、制糖衣(dragee-making)、研磨（levigating)、乳化、膠囊化、截留（entrapping)或凍干工藝。[0095]在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物使用包括賦形劑和助劑的一種或多種生理學(xué)上可接受的載體以常規(guī)方式配制，所述載體助于將活性成分加工成藥學(xué)上可以使用的制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，劑型取決于選擇的施用途徑。[0096]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的可注射物（injectable)在水溶液中配制。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的可注射物在生理學(xué)上相容的緩沖液比如漢克斯液、林格溶液或生理鹽緩沖液中配制。在一些實(shí)施方式中，對(duì)于經(jīng)粘膜施用，在劑型中使用對(duì)待穿透的屏障適當(dāng)?shù)臐B透劑。這樣的滲透劑是本領(lǐng)域中通常已知的。[0097]在一個(gè)實(shí)施方式中，本文所述的制劑配制用于腸胃外施用，例如，通過(guò)快速濃注(bolusinjection)或持續(xù)灌注。在一些實(shí)施方式中，用于注射的劑型以單位劑量形式存在，例如，在安瓿或多劑量容器中，其任選地具有添加的防腐劑。在一些實(shí)施方式中，組合物是在油性或水性運(yùn)載體中的懸浮液、溶液或乳液，并且包含配制劑(formulatoryagent)比如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。[0098]在一些實(shí)施方式中，組合物還包括防腐劑，比如氯化苯甲烴銨和硫柳汞等；螯合劑，比如乙二胺四乙酸鈉等;緩沖液比如磷酸鹽、檸檬酸鹽和醋酸鹽;張度劑比如氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇等;抗氧化劑比如抗壞血酸、乙酰半胱氨酸(acetylcystine)、焦亞硫酸(metabisulfote)鈉等；芳香劑(aromaticagent);粘度調(diào)節(jié)劑，比如聚合物，包括纖維素和其衍生物;和聚乙烯醇以及根據(jù)需要調(diào)節(jié)這些水性組合物的pH的酸和堿。在一些實(shí)施方式中，組合物還包括局部麻醉藥或其它活性物(active)。組合物可以用作噴劑、霧劑(mist)、滴劑等。[0099]在一些實(shí)施方式中，用于腸胃外施用的藥物組合物包括水溶形式的活性制劑的水溶液。另外地，在一些實(shí)施方式中，活性成分的懸浮液制備為適當(dāng)?shù)挠突蛩⑸鋺腋∫?。在一些?shí)施方式中，合適的親脂性溶劑或運(yùn)載體包括脂肪油比如芝麻油，或者合成脂肪酸酯比如油酸乙酯、甘油三酯或脂質(zhì)體。在一些實(shí)施方式中，水性注射懸浮液包含增加懸浮液的粘度的物質(zhì)，比如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。在另一個(gè)實(shí)施方式中，懸浮液還包含合適的穩(wěn)定劑或增加活性成分的溶解度以允許制備高濃度溶液的試劑。[0100]在另一個(gè)實(shí)施方式中，活性化合物可以在囊泡，特別是脂質(zhì)體中遞送（參見(jiàn)Langer,Science249:1527-1533(1990);Treat等，inLiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer，Lopez-Berestein和Fidler(eds·)，Liss，NewYork,pp.353-365(1989);Lopez-Berestein，同上，pp.317-327;通常參見(jiàn)同上）。[0101]在另一個(gè)實(shí)施方式中，在控釋系統(tǒng)中遞送的藥物組合物配制用于靜脈內(nèi)輸注、植入式滲透栗、經(jīng)皮貼劑、脂質(zhì)體或其它施用模式。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用栗（參見(jiàn)Langer，同上；Sefton，CRCCrit·Ref·Biomed·Eng.14:201(1987);BuchwaId等，Surgery88:507(1980);Saudek等，N.Engl.J.Med.321:574(1989)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用聚合物材料。在仍另一個(gè)實(shí)施方式中，控釋系統(tǒng)可以靠近治療靶標(biāo)一一即腦一一放置，因而僅需要全身劑量的一部分（參見(jiàn)，例如，Goodson,inMedicalApplicationsofControlledRelease，同上，vol·2,pp·115-138(1984))。其它控釋系統(tǒng)在Langer(Science249:1527-1533(1990))的綜述中討論。[0102]在一些實(shí)施方式中，活性成分在使用前處于粉末形式，用于與合適的運(yùn)載體，例如，無(wú)菌的、無(wú)熱原的水基溶液一起構(gòu)建。在一些實(shí)施方式中，組合物配制用于霧化和吸入施用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，組合物包含在具有附連的霧化裝置的容器中。[0103]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的制劑使用例如常規(guī)的栓劑基體比如可可脂或其它甘油酯以直腸組合物一一比如栓劑或保留灌腸劑一一配制。[0104]在一些實(shí)施方式中，適于在本發(fā)明的背景下使用的藥物組合物包括其中活性成分以有效實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的的量包含的組合物。在一些實(shí)施方式中，治療有效量意思是有效防止、緩解或改善疾病的癥狀或延長(zhǎng)正在治療的對(duì)象的存活率的活性成分的量。[0105]在一個(gè)實(shí)施方式中，治療有效量的確定充分地在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力內(nèi)。[0106]組合物還包括防腐劑，比如氯化苯甲烴銨和硫柳汞等;螯合劑，比如乙二胺四乙酸鈉等;緩沖液比如磷酸鹽、檸檬酸鹽和醋酸鹽;張度劑比如氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇等；抗氧化劑比如抗壞血酸、乙酰半胱氨酸、焦亞硫酸鈉等;芳香劑;粘度調(diào)節(jié)劑，比如聚合物，包括纖維素和其衍生物;和聚乙烯醇以及根據(jù)需要調(diào)節(jié)這些水性組合物的pH的酸和堿。組合物還包括局部麻醉藥或其它活性物。組合物可以用作噴劑、霧劑、滴劑等。[0107]在一些實(shí)施方式中，制劑的有效量或劑量最初可以從體外測(cè)定估計(jì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，劑量可以在動(dòng)物模型中配制，并且這樣的信息可以用于更準(zhǔn)確地確定在人中有用的劑量。[0108]在一個(gè)實(shí)施方式中，本文所述的活性成分的毒性和療效可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的體外制藥過(guò)程在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中確定。在一個(gè)實(shí)施方式中，從這些體外和細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定以及動(dòng)物研究中獲得的數(shù)據(jù)可以用于配制供人使用的劑量范圍。在一個(gè)實(shí)施方式中，劑量取決于采用的劑量形式和利用的施用途徑而改變。在一個(gè)實(shí)施方式中，精確的劑型、施用途徑和劑量可以由各個(gè)醫(yī)師參考患者的病癥進(jìn)行選擇。[參見(jiàn)例如，F(xiàn)ingl等，（1975)"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics"，Ch.1ρ·1]〇[0109]在一個(gè)實(shí)施方式中，取決于待治療的病癥的嚴(yán)重度和應(yīng)答性，給藥可以是單次或多次施用，而且療程持續(xù)數(shù)日至數(shù)周或直到實(shí)現(xiàn)治愈或達(dá)到疾病狀態(tài)的減輕。[0110]在一個(gè)實(shí)施方式中，待施用的組合物的量當(dāng)然將取決于正在治療的對(duì)象、病痛的嚴(yán)重度、施用方式、處方醫(yī)師的判斷等。[0111]在一個(gè)實(shí)施方式中，還制備了在相容性藥物載體中配制的包括本發(fā)明的制劑的組合物，將其放置在適當(dāng)?shù)娜萜髦校⑶覙?biāo)記用于治療指示的病癥。[0112]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物存在于包裝或分配器裝置中，比如Π)Α批準(zhǔn)的試劑盒，其包含含有活性成分的一個(gè)或多個(gè)單位劑量形式。在一個(gè)實(shí)施方式中，包裝例如包括金屬或塑料薄片，比如泡罩包裝(blisterpack)。在一個(gè)實(shí)施方式中，包裝或分配器裝置附帶施用說(shuō)明。在一個(gè)實(shí)施方式中，包裝或分配器附帶與容器相關(guān)聯(lián)的告知，所述容器是由調(diào)控藥物的制造、使用或出售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式，該告知反映機(jī)構(gòu)對(duì)組合物的形式或者人或獸醫(yī)施用的批準(zhǔn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，這樣的告知是由美國(guó)食品和藥品管理局批準(zhǔn)用于處方藥的標(biāo)志或是批準(zhǔn)產(chǎn)品插頁(yè)。[0113]在一個(gè)實(shí)施方式中，將領(lǐng)會(huì)的是，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以與額外的活性劑一起提供至個(gè)體以與單獨(dú)使用每個(gè)試劑治療相比實(shí)現(xiàn)改進(jìn)的治療效果。在另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)與聯(lián)合治療相關(guān)聯(lián)的不利副作用采取措施(例如，補(bǔ)充藥劑(complementaryagent)的給藥和選擇）。[0114]在審查下列實(shí)施例后，本發(fā)明的額外的目標(biāo)、優(yōu)勢(shì)和新的特征將對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，其不意欲是限制性的。另外地，如上文描繪的且如在權(quán)利要求部分中要求保護(hù)的本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式和方面中的每個(gè)在下列實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。實(shí)施例[0115]通常地，本文使用的命名法和在本發(fā)明中利用的實(shí)驗(yàn)室過(guò)程包括分子技術(shù)、生化技術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)和重組DNA技術(shù)。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中徹底地說(shuō)明。參見(jiàn)，例如，"MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrook等，（1989);"CurrentProtocolsinMolecularBiology"VolumesI-IIIAusubel，R.M.，ed.(1994);Ausubel等，"CurrentProtocolsinMolecularBiology"，JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning"Johnffiley&Sons,NewYork(1988);Watson等，"RecombinantDNA"，ScientificAmericanBooks，NewYork;Birren等(eds)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries"，Vols·l-4，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork(1998);如在美國(guó)專利4，666，828;4，683，202;4，801，531;5，192,659和5,272,057中陳述的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook"，VolumesI-IIICellis，J·E·，ed·(1994);Freshney的"CultureofAnimalCells-AManualofBasicTechnique"，Wiley_Liss，Ν·Υ·(1994)，ThirdEdition;"CurrentProtocolsinImmunology"VolumesI-IIIColiganJ·E·，ed·(1994);Stites等（eds)，"BasicandClinicalImmunology"（8thEdition)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994);Mishell和Shiigi(eds)，"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996);其全部通過(guò)引用并入。其它一般的參考文獻(xiàn)貫穿本文件提供。[0116]材料和方法[0117]體內(nèi)轉(zhuǎn)染[0118]根據(jù)NIΗ實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南的倫理準(zhǔn)則進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物護(hù)理由InstitutionalAnimalCare實(shí)驗(yàn)室中的專業(yè)人員提供。對(duì)成年⑶-1雄性小鼠（27_28g)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過(guò)注射20yg的質(zhì)粒DNA進(jìn)入成年小鼠脛骨前肌并施加電脈沖（12V，5次脈沖，200-ms間隔）來(lái)進(jìn)行體內(nèi)電穿孔。在禁食實(shí)驗(yàn)中，在電穿孔48小時(shí)后，食物從籠子移除4天。通過(guò)使用MetaMorph(MolecularDevices)測(cè)量500個(gè)轉(zhuǎn)染的纖維（表達(dá)GFP)的橫截面面積和相同的肌肉截面(10M1)中500個(gè)相鄰的未轉(zhuǎn)染的纖維的橫截面面積來(lái)測(cè)定纖維大小。[0119]抗體和構(gòu)建體[0120]Trim32和對(duì)照shRNA在先前描述（shTrim32-l，GGCTGATTGGTGTCACTGATA(SEQIDN0:5)；shTrim32-2,AGCTGCTGGTCTTGGACTGTT(SEQIDNO:6);shLacz，AAATCGCTGATTTGTGTAGTC(SEQIDN0:7))，并且使用Invitrogen的BLOCK-iTRNAi表達(dá)載體試劑盒以及pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體設(shè)計(jì)斑珠蛋白shRNA。抗斑珠蛋白、層粘連蛋白和GAPDH來(lái)自Sigma?？刮⒐艿鞍讈?lái)自Invitrogen，并且抗GFP來(lái)自abeam。抗Akt、P-Akt、PI3K-p85、P-PI3K-p85、F0X03和P-F0X03來(lái)自CellSignaling。[0121]蛋白質(zhì)分析[0122]如下進(jìn)行免疫印跡和免疫沉淀：來(lái)自脛骨前肌的胞質(zhì)部分用于免疫印跡(immunoblotiing)或免疫沉淀，并且通過(guò)SDS-PAGE和免疫印跡--使用與堿性磷酸酶綴合的特異性抗體和二次抗體進(jìn)行一一解析。來(lái)自肌肉的可溶性部分的斑珠蛋白或PI3K-p85的免疫沉淀測(cè)定在4°C下過(guò)夜進(jìn)行，并且然后添加蛋白質(zhì)A/G瓊脂糖(agaroze)持續(xù)4小時(shí)。除了免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和圖5A中印跡（ImMNa3V04和50mMNaF)之外，磷酸酶抑制劑圭添加至提取緩沖液。[0123]定量實(shí)時(shí)PCR[0124]從肌肉分離總RNA，并且通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)制造商的方案，使用特異性引物(表1)和DyNAmoHSSYBRGreenqPCR試劑盒(F_410S;Finnzymes)對(duì)小鼠革巴基因進(jìn)行實(shí)時(shí)qPCR。[0125]表1.在本研究中使用的qPCR引物和shRNA寡核苷酸(oligo)[0126][0127][0128]免疫熒光[0129]如下進(jìn)行石蠟包埋的肌肉截面的免疫熒光:來(lái)自進(jìn)食和禁食的小鼠的肌肉橫截面或縱截面包埋在石蠟中，并且然后在乙醇/PBS中逐漸地再水化。對(duì)于再水化樣品的免疫熒光，使用1:50稀釋的一次抗體和1:1000稀釋的Alexa555綴合的二次抗體。在圖2A中，C2C12細(xì)胞平板接種在玻璃底的12孔板(P12G-1.5-14-F，MatTekCorporation)上，其包被有5ug/ml纖連蛋白（fll41，Sigma)。細(xì)胞分化為肌管，并且然后在室溫下在4%PFA中固定15分鐘。在50mg/mlBSA/TBS-T中封閉15分鐘后，使用1:50稀釋的斑珠蛋白抗體和1:1000稀釋的Alexa555綴合的二次抗體進(jìn)行免疫熒光分析，其全部在封閉溶液中稀釋。使用具有PlanApol.4NA物鏡、545/30激發(fā)光濾光器與620/60發(fā)射光濾光器(Alexa555)、620/60激發(fā)光濾光器與700/75發(fā)射光濾光器（Alexa647)、Hamamatsu0RCA-R2冷卻式CCD照相機(jī)和MetaMorph7軟件的NikonTi-E倒置機(jī)動(dòng)顯微鏡，在室溫下收集圖像。[0130]葡萄糖攝取測(cè)定[0131]C2C12細(xì)胞平板接種在包被有5ug/ml纖連蛋白（fll41，Sigma)的6孔板上。轉(zhuǎn)染(1ipofectoamine2000)四十二小時(shí)后，細(xì)胞在溫PBS中清洗，在DMEM/0·1%BSA中饑餓6小時(shí)并再次清洗。在37°C下使用200nM胰島素/PBS(Sigma，I0516)處理30分鐘后，細(xì)胞被清洗并使用lyCi/ml2-脫氧-D-[3H]葡萄糖（NET328A250UC，PerkinElmer)和O.lmM冷的2-脫氧-D-葡萄糖(D8375，Sigma)在37°C下溫育10分鐘。將20nM的松胞菌素B(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑）(C6762，Sigma)添加至對(duì)照孔。然后，細(xì)胞在冷的PBS中清洗，在室溫下在0.2NNaOH中溶解2小時(shí)，并且使用閃爍液測(cè)定放射性。[0132]肌肉組織的分級(jí)分離[0133]工作在4°C下進(jìn)行。小鼠脛骨前肌在19體積的緩沖液C(20mMTris-HCl，pH7.6、5mMEDTA/NaOHpH7.4、100mMKCl、lmMDTT和ImM原釩酸鈉）中冰上均質(zhì)化30s，并且在2900Xg下旋轉(zhuǎn)20分鐘以使核和未破碎的組織沉淀。[0134]上清液在180，000Xg下離心90分鐘，并且在-80°C下儲(chǔ)存上清液（即，胞質(zhì)部分）。沉淀物在10體積的緩沖液M(20mMTris-HCl，pH7.6、5mMEDTA/NaOHpH7.4、100mMKC1、ImMDTT、0.25%脫氧膽酸鈉、1%NP_40和ImM原釩酸鈉）中重懸，在4°C下旋轉(zhuǎn)20分鐘并在100，000Xg下離心30分鐘。然后收集上清液（即，膜部分)并在-80°C下儲(chǔ)存。所有緩沖液包含蛋白酶抑制劑（l〇μg/ml抑酶醛肽、3mM芐脒、lμg/ml胰蛋白酶抑制劑和ImMPMSF)。0.25%的膜部分和〇.01%的胞質(zhì)部分在SDS-PAGE上分離用于蛋白質(zhì)印跡分析。[0135]統(tǒng)計(jì)分析和圖像采集[0136]數(shù)據(jù)展示為平均值土SEM。使用單尾配對(duì)的"學(xué)生"t檢驗(yàn)測(cè)定統(tǒng)計(jì)顯著性。α水平設(shè)定為0.05。使用正置熒光顯微鏡(Nikon80i)和單色照相機(jī)(HamamatsuC8484-03)在室溫下成像肌肉截面，并且使用NikonTi-E倒置機(jī)動(dòng)顯微鏡和Hamamatsu0RCA-R2冷卻式CCD照相機(jī)成像C2C12肌管。使用MetaMorph軟件進(jìn)行圖像采集和處理。使用AdobePhotoshopCS3的10.0.1版本軟件處理黑色和白色圖像。[0137]體外泛素化[0138]將編碼His-斑珠蛋白的質(zhì)粒DNA電穿孔入脛骨前肌，并且4天后，從籠子移除食物持續(xù)2天。His-斑珠蛋白使用Ni-柱自肌肉勻漿純化，并且在反應(yīng)緩沖液（2mMATP、20mMTris-HCl，pH7.6、20mMKCl、5mMMgC12和ImMDTT)中經(jīng)歷包含22·5ηΜΕ1、0·75μΜΕ2、0·4μΜTrim32、0.75yMUbcH5和59μΜ泛素的泛素化反應(yīng)。通過(guò)SDS-PAGE和使用斑珠蛋白抗體(Sigma)的免疫印跡分析斑珠蛋白泛素化。[0139]免疫熒光[0140]將編碼GFP-斑珠蛋白的載體電穿孔入成年野生型小鼠的脛骨前肌持續(xù)6天。肌肉橫截面如報(bào)道地被石蠟包埋，并且使用具有PlanFluor40X1.4NA物鏡、545/30激發(fā)光濾光器和620/60發(fā)射光濾光器（ChromaTechnologyCorp·)以及冷卻式CCD照相機(jī)（型號(hào)C8484-03;HamamatsuPhotonics)的正置焚光顯微鏡（型號(hào)80i;Nikon)在室溫下收集圖像。[0141]DNA構(gòu)建體[0142]使用Invitrogen的RNAi設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)橋粒斑蛋白shRNA，并且使用Invitrogen的BL0CK-iTRNAi表達(dá)載體試劑盒克隆入pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體。[0143]實(shí)施例l:Trim32抑制誘導(dǎo)正常肌肉生長(zhǎng)[0144]因?yàn)門(mén)rim32的下調(diào)減少肌肉萎縮，所以實(shí)驗(yàn)還通過(guò)電穿孔顯性失活的Trim32(Trim32-DN)--其缺少催化RING結(jié)構(gòu)域(Kano等，2008)--進(jìn)入正常的脛骨前肌(TA)來(lái)測(cè)定其是否還影響正常肌肉質(zhì)量。相對(duì)電穿孔有對(duì)照載體的肌肉的重量，過(guò)表達(dá)Trim32-DN持續(xù)6天導(dǎo)致15%的重量增加（圖1A)。由于沒(méi)有轉(zhuǎn)染所有纖維，由Trim32抑制誘導(dǎo)的生長(zhǎng)必定甚至更大。實(shí)際上，500個(gè)表達(dá)Trim32-DN的纖維的平均橫截面積比500個(gè)未轉(zhuǎn)染的纖維的平均橫截面積大得多（圖1B)。因而，Trim32必定正常地起作用以限制肌肉生長(zhǎng)，并且單獨(dú)地抑制此泛素連接酶可以誘導(dǎo)肌肉肥大。[0145]實(shí)施例2:斑珠蛋白存在于骨骼肌中[0146]本發(fā)現(xiàn)認(rèn)為T(mén)rim32底物在其下調(diào)時(shí)積聚，并且減少萎縮或誘導(dǎo)生長(zhǎng)。使用固定化的GST-Trim32和質(zhì)譜法，數(shù)個(gè)Trim32底物在肌肉提取物中被識(shí)別，其結(jié)合Trim32并可被Trim32泛素化，包括細(xì)肌絲和Z帶組分，加上細(xì)胞骨架蛋白一一結(jié)蛋白。令人驚訝地，固定化的Trim32也結(jié)合斑珠蛋白，其在其它組織中是橋粒復(fù)合物的組分。其存在是意料不到的，因?yàn)椴淮嬖跇蛄；蚱浣M分在骨骼肌中的先前報(bào)道。為了測(cè)定其是否被Trim32泛素化，使用包含El、E2(UbcH5)、ATP和6His-泛素的泛素化系統(tǒng)溫育GST-Trim32沉淀物。然后，使用鎳柱純化6His-標(biāo)記的泛素化蛋白。質(zhì)譜分析揭示斑珠蛋白被Trim32聚泛素化(如通過(guò)存在13個(gè)獨(dú)特的肽證明的）。此外，重組Trim32也使6His-斑珠蛋白聚泛素化，所述6His-斑珠蛋白自正常肌肉表達(dá)和純化(圖7)。[0147]在上皮細(xì)胞中，將PI3K結(jié)合至斑珠蛋白計(jì)劃增強(qiáng)PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)(Calautti等，2005;W〇〇dfield等，2001)。因?yàn)榇送緩绞羌∪赓|(zhì)量的主要調(diào)節(jié)物。然而，首先重要的是確認(rèn)斑珠蛋白實(shí)際上存在于衛(wèi)星細(xì)胞和肌纖維中。因此，其在正常脛骨前肌(TA)中的空間分布通過(guò)免疫熒光染色石蠟包埋的橫截面和縱截面進(jìn)行分析。在上皮細(xì)胞中，斑珠蛋白具有遍及細(xì)胞的點(diǎn)狀分布(Chen等，2002;Nathke等，1994)。類(lèi)似的斑點(diǎn)樣分布的斑珠蛋白發(fā)現(xiàn)在肌纖維內(nèi)，并且在纖維膜的平面中（圖2A)。因而，此蛋白質(zhì)，與肌纖維組分或結(jié)蛋白不同，不沿著肌節(jié)顯示特定的周期分布。在C2C12肌管中觀察到類(lèi)似的彌散分布的斑珠蛋白（圖2A)。此外，此蛋白質(zhì)在可溶相中和肌膜上的存在通過(guò)TA肌肉的分級(jí)分離被生化地確認(rèn)（圖2B)。[0148]實(shí)施例3:禁食中的Trim32敲除增加PI3K/Akt活性[0149]為了確定斑珠蛋白損失是否影響PI3K/Akt/Fox0途徑的活性，如已經(jīng)在角質(zhì)形成細(xì)胞中建議的（Calautti等，2005)，檢驗(yàn)斑珠蛋白是否與肌肉中的p85/PI3K相互作用的問(wèn)題。斑珠蛋白與來(lái)自正常肌肉的P85/PI3K共沉淀，但不是在禁食期間（圖3A)，其中PI3K/Akt/FoxO信號(hào)傳導(dǎo)（圖3C)減少。此效應(yīng)似乎需要Trim32,因?yàn)樵诮称陂g通過(guò)電穿孔Trim32-DN抑制Trim32導(dǎo)致斑珠蛋白與p85/PI3K的更大的關(guān)聯(lián)性（圖3A)。因而，在禁食期間，Trim32減少斑珠蛋白與肌肉中的p85/PI3K的相互作用。此外，確定這些相互作用對(duì)肌肉是否是獨(dú)特的或斑珠蛋白是否可能調(diào)控此信號(hào)傳導(dǎo)途徑。[0150]通過(guò)免疫共沉淀表明了在心臟和肝臟中p85/PI3K和斑珠蛋白之間類(lèi)似的相互作用（圖3B)，并且因而，該相互作用可能在大多數(shù)，可能所有細(xì)胞中起作用。[0151]進(jìn)一步的研究確定斑珠蛋白與P85/PI3K的相互作用是否實(shí)際上影響PI3K/Akt/FoxO信號(hào)傳導(dǎo)。在食物剝奪兩天后，PI3K、Akt和其靶標(biāo)Fox03的磷酸化明顯地減少（圖3C)(Sandri等，2004;Stitt等，2004)。然而，Trim32的下調(diào)幾乎完全地阻斷了此對(duì)禁食的應(yīng)答。實(shí)際上，磷酸化的PI3K、Akt和Fox03的水平與來(lái)自進(jìn)食小鼠的肌肉中的那些相似（圖3C)。正常地，在禁食期間，F(xiàn)oxO是活化的（去磷酸化的），并且刺激一組萎縮相關(guān)基因的表達(dá)，其包括泛素連接酶MuRFl和Atroginl，它們對(duì)快速纖維萎縮是必不可少的（Bodine等，2001;Gomes等，2001)(圖3D)。[0152]然而，通過(guò)過(guò)表達(dá)Trim32-DN的Trim32抑制導(dǎo)致在禁食期間TA肌肉中MuRFl和Atroginl表達(dá)的明顯減少（圖3D)。在禁食期間的萎縮基因的該抑制，連同正常的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)的維持可以解釋先前觀察到的肌肉消耗的急劇阻斷。因而，在禁食期間，Trim32功能必定在引起PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)的減少中是關(guān)鍵的，所述PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)引起蛋白質(zhì)合成的減少、FoxO介導(dǎo)的萎縮基因程序(atrogeneprogram)的表達(dá)、和肌肉消耗。[0153]為了得知禁食時(shí)PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)的這種減少是否取決于斑珠蛋白的存在，通過(guò)將shRNA(shJUP)轉(zhuǎn)染入正常肌肉來(lái)下調(diào)斑珠蛋白（圖4A)。所得的斑珠蛋白的下降導(dǎo)致減少的PI3K、Akt和F0X03的磷酸化。因而，斑珠蛋白對(duì)通過(guò)PI3K/Akt/Fox0途徑的正常的信號(hào)傳導(dǎo)必需。因此，當(dāng)使用shRNA下調(diào)正常肌肉中的斑珠蛋白持續(xù)6天時(shí)，肌纖維的萎縮變得明顯（圖48)。500個(gè)表達(dá)shJUP的纖維的平均橫截面積比500個(gè)未轉(zhuǎn)染的纖維的平均橫截面積?。▓D4B)。[0154]雖然表達(dá)Trim32-DN防止萎縮肌肉中的PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)的減少，但此效果通過(guò)同時(shí)下調(diào)斑珠蛋白明顯地減弱（圖4C)。因而，斑珠蛋白似乎對(duì)Trim32誘導(dǎo)的P13K、Akt和F0X03的磷酸化的減少是必不可少的（圖4C)。[0155]除調(diào)控細(xì)胞大小和蛋白質(zhì)平衡之外，PI3K/Akt/Fox0途徑還介導(dǎo)胰島素刺激葡萄糖-攝取進(jìn)入肌肉和脂肪組織。如所預(yù)測(cè)的，成肌細(xì)胞中的斑珠蛋白下調(diào)減少胰島素對(duì)葡萄糖攝取的刺激（圖4D)。雖然斑珠蛋白是明顯主要的，但是正常成肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)斑珠蛋白不進(jìn)一步地刺激此過(guò)程（圖4D)。為了檢驗(yàn)斑珠蛋白是否通過(guò)與胰島素受體相互作用介導(dǎo)胰島素依賴性葡萄糖攝取和活化PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)，斑珠蛋白從正常和萎縮肌肉免疫沉淀（圖4E)。胰島素受體連同斑珠蛋白從正常肌肉共沉淀。在禁食期間，當(dāng)Trim32是活性的時(shí)，斑珠蛋白保持與胰島素受體相關(guān)聯(lián)（圖4E)。斑珠蛋白因而結(jié)合至胰島素受體，并且似乎在其與PI3K的相互作用和PI3K的活化中充當(dāng)關(guān)鍵組分。斑珠蛋白和胰島素受體之間類(lèi)似的相互作用也在心臟和肝臟中觀察到（圖4F)，其暗示在許多組織中，斑珠蛋白起調(diào)控PI3K的胰島素依賴性活化的作用。同時(shí)，這些觀察預(yù)測(cè)在禁食期間增加斑珠蛋白的水平應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致胰島素受體和PI3K/Akt/Fox0途徑更大的活性。因此，在禁食期間，過(guò)表達(dá)GFP-標(biāo)記的斑珠蛋白（其顯示與內(nèi)源蛋白類(lèi)似的分布（圖8))單獨(dú)地增強(qiáng)胰島素受體的磷酸化(在Y1361處）和PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)的活化（圖4G)。因而，在禁食期間斑珠蛋白功能的Trim32依賴性調(diào)控是在低胰島素狀態(tài)中PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)減少的關(guān)鍵的新步驟。[0156]實(shí)施例4:Trim32抑制增強(qiáng)正常肌肉中的PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)[0157]考慮到禁食中的這些效果，確定Trim32是否還可以通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt/Fox0/mT0R活性影響正常肌肉質(zhì)量（圖1)。在將Trim32-DN電穿孔入正常ΤΑ持續(xù)6天后，斑珠蛋白積聚，并且PI3K、Akt和F0X0的磷酸化以及mTOR激酶活性的下游靶標(biāo)S6K增加（圖5Α)。此外，將Trim32-DN轉(zhuǎn)染入C2C12成肌細(xì)胞增強(qiáng)胰島素依賴性葡萄糖攝取高于表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞中的水平（圖5B)。因而，Trim32-DN的生長(zhǎng)促進(jìn)效果可能是由于增強(qiáng)的PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)和mTOR的活化。值得注意的是，正常肌肉中的Trim32過(guò)表達(dá)不獨(dú)自改變斑珠蛋白水平、PI3K/Akt/FoxO信號(hào)傳導(dǎo)、葡萄糖攝取或纖維大?。▓D5B和9)。因此，可能需要超出Trim32表達(dá)的額外的信號(hào)以促進(jìn)斑珠蛋白泛素化和降解一一可能是斑珠蛋白的磷酸化(Calautti等，2005;Woodfield等，2001)，如最近對(duì)通過(guò)Trim32的結(jié)蛋白的泛素化和降解找到的。[0158]這些研究已經(jīng)披露了調(diào)控PI3K/Akt/F〇x0/mT0R途徑的新的機(jī)制，其涉及橋粒組分斑珠蛋白和泛素連接酶Trim32(圖6)。因?yàn)闇p小斑珠蛋白含量減少葡萄糖攝取，而增加斑珠蛋白水平刺激此過(guò)程（圖4C、5A和4G)，所以Trim32介導(dǎo)的斑珠蛋白-ρ85/ΡΙ3Κ結(jié)合的損失也可以助于多種分解代謝狀態(tài)(例如糖尿病、代謝綜合征或膿毒癥）中的胰島素耐受性。因此，Trim32可以代表新的治療靶標(biāo)以阻斷如在疾病狀態(tài)(例如癌癥惡病質(zhì)、膿毒癥和腎衰竭）中發(fā)生的肌肉消耗和胰島素耐受性。[0159]在正常肌肉中，斑珠蛋白下調(diào)減少PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)并引起萎縮（圖4A和B)，而抑制Trim32穩(wěn)定斑珠蛋白、增加PI3K/Akt/Fox0活性、并誘導(dǎo)纖維過(guò)度生長(zhǎng)（圖1和5)。因而，除在萎縮中關(guān)鍵之外，Trim32活性還必然限制正常肌肉的生長(zhǎng)（圖6)。而且，Trim32和斑珠蛋白可能在調(diào)控其它細(xì)胞的生長(zhǎng)中發(fā)揮類(lèi)似的作用，這是因?yàn)槎叨荚诖蠖鄶?shù)一一如果不是全部--組織中表達(dá)(Cowin等，1986;Frosk等，2002)。實(shí)際上，斑珠蛋白已經(jīng)顯示為上皮生長(zhǎng)的重要調(diào)節(jié)物(Venkiteswaran等，2002)，并且如本文所示，其在心臟和肝臟中結(jié)合P85/PI3K(圖3B和4F)，如其在骨骼肌中一樣（圖3A)。有趣地，斑珠蛋白的近親同系物β-聯(lián)蛋白也可以結(jié)合？131(并增強(qiáng)？131(/^1^/^(?0信號(hào)傳導(dǎo)(1〇〇(1行61(1等，2001)，并且最近的研究報(bào)道β-聯(lián)蛋白在由地塞米松誘導(dǎo)的萎縮期間損失，并且在過(guò)度生長(zhǎng)期間積聚（Schakman等，2008)。斑珠蛋白和β-聯(lián)蛋白可以在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄中共同起作用（Winn等，2002;Zhurinsky等，2000a;Zhurinsky等，2000b)，并且可能地，β-聯(lián)蛋白也可以被Trim32調(diào)控。[0160]然而，值得注意的是，單獨(dú)的Trim32過(guò)表達(dá)不足以減小斑珠蛋白水平或引起萎縮(圖9)。因而，伴隨Trim32下調(diào)的PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)的增加必定涉及額外的信號(hào)，比如斑珠蛋白磷酸化，其已經(jīng)被報(bào)道(Calautti等，2005;Woodfield等，2001)。因此，已經(jīng)顯示在禁食期間由Trim32泛素化結(jié)蛋白還需要結(jié)蛋白磷酸化。在正常肌肉中和在禁食期間（圖4E)，如果Trim32被抑制，則斑珠蛋白的磷酸化可能對(duì)其與胰島素受體的關(guān)聯(lián)是必不可少的，并且可能對(duì)其充當(dāng)PI3K的?？课稽c(diǎn)（dockingsite)是必不可少的。在任何情況下，單獨(dú)地穩(wěn)定斑珠蛋白增加胰島素受體的磷酸化和PI3K/Akt/Fox0途徑的活性（圖4G)。[0161]此研究還提供了在骨骼肌中存在橋粒組分斑珠蛋白的第一個(gè)證據(jù)。在相關(guān)的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)此復(fù)合物的其它組分比如橋粒斑蛋白存在于肌纖維內(nèi)，但是橋粒斑蛋白水平--與斑珠蛋白不同--不改變PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)（圖10A)。在心臟中，斑珠蛋白是黏著復(fù)合物（即"橋粒"）的一部分，其位于連接相鄰的心肌細(xì)胞的閏盤(pán)。缺少斑珠蛋白的小鼠傾向于早死于心臟破裂(Ruiz等，1996)，并且在人中，斑珠蛋白（Norgett等，2000)或編碼橋粒蛋白的六個(gè)其它基因（Herren等，2009)的突變導(dǎo)致心律失常(Norgett等，2000)、減小的收縮性、和心力衰竭（即"致心律失常的右室心肌病/發(fā)育不全"的綜合征）。也許，這些病理學(xué)后遺癥部分地是由于通過(guò)PI3K/Akt/Fox0途徑的改變的信號(hào)傳導(dǎo)。通過(guò)靶向斑珠蛋白或也許在心臟中降解的其它橋粒組分，Trim32也可能具有重要的生理學(xué)或病理學(xué)作用。然而，在骨骼肌中，斑珠蛋白似乎不形成"典型的"橋粒，盡管此蛋白質(zhì)明顯地存在于表面膜上（圖2)，并且可以與胰島素受體、PI3K和Akt(圖3A和4E)以及橋粒的其它組分（圖10B)-起免疫?/Ιι?疋。[0162]除了引起肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良之外，Trim32突變還可以導(dǎo)致巴-比二氏綜合征，其特征在于心臟肥厚和擴(kuò)張性心肌病(Elbedour等，1994)。本發(fā)現(xiàn)將預(yù)測(cè)Trim32的缺乏可以導(dǎo)致過(guò)度的組織生長(zhǎng)和PI3K/Akt/Fox0信號(hào)傳導(dǎo)的可能的不適當(dāng)活化。令人驚訝地，Kudryashova等最近描述了Trim32缺失小鼠，其呈現(xiàn)出輕度肌病、神經(jīng)原性缺陷、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、和減少的肌肉生長(zhǎng)(Kudryashova等，2012;Kudryashova等，2011)，并且在禁食或廢用時(shí)(Kudryashova等，2012)，來(lái)自這些小鼠的肌肉如WT小鼠中一樣萎縮。這些令人驚訝的觀察在選擇性下調(diào)成年肌肉中的Trim32的效果上明顯地與本發(fā)現(xiàn)不同。推測(cè)地，發(fā)育期間Trim32的完全缺乏引起多個(gè)全身性缺陷，并且引發(fā)代償性應(yīng)答，但是這些Trim32缺乏肌肉經(jīng)歷萎縮的能力表明額外的泛素連接酶可以在許多反應(yīng)中替換Trim32。相反地，Trim32的表達(dá)在多種疾病中上升，這包括阿耳茨海默患者的腦(Yokota等，2006)、牛皮癬損傷(Liu等，2010)和多種癌癥，其中其增強(qiáng)侵入和轉(zhuǎn)移(Horn等，2004;Kano等，2008)。這些效應(yīng)還可以包括Trim32介導(dǎo)的斑珠蛋白的降解，因?yàn)榇说鞍踪|(zhì)的損失減少細(xì)胞黏著并增加細(xì)胞迀移和侵入(6〇8&丫;[等，2011;1(1111(111等，2008;￥;[11等，2005)0[0163]共同地，這些觀察指示萎縮期間細(xì)胞骨架和肌纖維組分的變化和細(xì)胞的主要生長(zhǎng)調(diào)控系統(tǒng)之間的緊密聯(lián)系(coupling)，其可能在其它病理學(xué)狀態(tài)中是重要的（圖6)。在萎縮期間，Trim32催化結(jié)蛋白細(xì)胞骨架的泛素化和解裝配，其與包括細(xì)肌絲和Z帶的蛋白質(zhì)的破壞相聯(lián)系。如果骨骼肌中的結(jié)蛋白絲也與斑珠蛋白（和其它橋粒蛋白）相連接，如它們?cè)谛呐K中一樣（Smith和？11^^，1998)，則斑珠蛋白-?85斤131(相互作用的損失和隨后的？131(/Akt/FoxO信號(hào)傳導(dǎo)的減少可能是導(dǎo)致細(xì)胞骨架的破壞并從而解裝配細(xì)肌絲的早期事件?！局鳈?quán)項(xiàng)】1.用于誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取的方法，其包括抑制所述細(xì)胞中的Trim32蛋白的步驟，從而誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肌細(xì)胞是骨骼肌細(xì)胞。3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抑制所述細(xì)胞中的Trim32是進(jìn)一步誘導(dǎo)肌纖維生長(zhǎng)。4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抑制所述細(xì)胞中的Trim32是誘導(dǎo)所述細(xì)胞中的胰島素受體的磷酸化。5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抑制Trim32是誘導(dǎo)斑珠蛋白的積聚。6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抑制所述細(xì)胞中的Trim32是在所述細(xì)胞中表達(dá)顯性失活的Trim32蛋白。7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抑制所述細(xì)胞中的Trim32是將抗Trim32抗體遞送入所述細(xì)胞。8.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述在所述細(xì)胞中表達(dá)顯性失活的Trim32蛋白是將編碼所述顯性失活的Trim32蛋白的合成mRNA分子插入所述細(xì)胞，所述合成mRNA分子包括5-甲基胞苷堿基、假尿苷堿基或其組合。9.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述在所述細(xì)胞中表達(dá)顯性失活的Trim32蛋白是經(jīng)由電穿孔將編碼所述顯性失活的Trim32蛋白的核酸分子遞送入所述細(xì)胞。10.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述在所述細(xì)胞中表達(dá)顯性失活的Trim32蛋白是經(jīng)由陽(yáng)離子載體將編碼所述顯性失活的Trim32蛋白的核酸分子遞送入所述細(xì)胞。11.用于誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取的方法，其包括增加所述細(xì)胞中的斑珠蛋白的豐度的步驟，從而誘導(dǎo)肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取。12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述肌細(xì)胞是骨骼肌細(xì)胞。13.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述增加所述細(xì)胞中的斑珠蛋白的豐度進(jìn)一步導(dǎo)致誘導(dǎo)肌纖維生長(zhǎng)。14.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述增加所述細(xì)胞中的斑珠蛋白的豐度導(dǎo)致誘導(dǎo)所述細(xì)胞中的胰島素受體的磷酸化。15.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述增加所述細(xì)胞中的斑珠蛋白的豐度是使用包含核酸分子的載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，所述核酸分子編碼所述斑珠蛋白。16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述載體包括組成型活性啟動(dòng)子。17.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述核酸分子是合成mRNA分子，其包括5-甲基胞苷堿基、假尿苷堿基或其組合。18.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞是經(jīng)由電穿孔進(jìn)入所述細(xì)胞。19.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述載體是陽(yáng)離子載體。【文檔編號(hào)】A61K38/53GK105848720SQ201480057030【公開(kāi)日】2016年8月10日【申請(qǐng)日】2014年9月11日【發(fā)明人】S·科恩,G·艾爾弗雷德【申請(qǐng)人】哈佛理事會(huì)