小檗堿在制備Hedgehong信號通路抑制劑中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)及腫瘤藥理學(xué)領(lǐng)域。具體涉及小檗堿在制備Hedgehong信號通路抑制劑中的用途。本發(fā)明提供了小檗堿(Berberine，以下簡稱BBR)在作為Hedgehog通路抑制劑的應(yīng)用，特別是在抗髓母細(xì)胞瘤生長方面具有較明顯的抑制作用。本發(fā)明所述的BBR可以單獨(dú)成藥，或?qū)BR作為有效成分制備抗腫瘤藥物，所述藥物制成片劑，膠囊劑，口服液，脂質(zhì)體等劑型；擴(kuò)大BBR的應(yīng)用領(lǐng)域。
【專利說明】
小檗堿在制備Hedgehong信號通路抑制劑中的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)及腫瘤藥理學(xué)領(lǐng)域，涉及小檗堿（Berberine，以 下簡稱BBR)的新的藥物用途，具體涉及小檗堿在制備Hedgehong信號通路抑制劑中的用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)公開了 Hedgehog(Hh)是1980年由Christianey與Eric在果繩大規(guī)模 基因突變篩選中發(fā)現(xiàn)的體節(jié)極性基因。通常Hh信號通路參與了昆蟲胚胎體節(jié)形成和附肢 發(fā)生，同時(shí)在哺乳動物神經(jīng)管分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，以及參與細(xì)胞的自我更新與修復(fù)； 研究顯示，Hh信號通路持續(xù)異常激活有致癌作用。特別是最近通過Hh信號通路的研究，顯 示Hh信號通路異常活化在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程都起了重要作用，例如在成神經(jīng)管細(xì) 胞瘤、基底細(xì)胞癌、急性粒細(xì)胞白血病等的發(fā)生發(fā)展過程中。因此，阻斷腫瘤細(xì)胞中Hh信號 傳導(dǎo)通路將為人類腫瘤的治療提供一個(gè)新的有效手段。
[0003] 已知Hedgehog家族蛋白是一種高度保守的分泌性信號分子。在哺乳動物中 存在三種同源蛋白分別為 Sonic Hedgehog (Shh)，Indian Hedgehog (Ihh)和 Desert Hedgehog(Dhh) ;Hedgehog的受體為十二次跨膜蛋白Patched(PTCH)，在哺乳動物中有兩種 同源蛋白PTCH1和PTCH2。研究表明，PTCH1是三種Hedgehog蛋白的主要受體，其基因突變 后會引起多種的出生缺陷。研究還顯示，PTCH下游的Smoothed(SM0)是Hh通路激活的關(guān) 鍵效應(yīng)因子，為七次跨膜的G蛋白耦聯(lián)受體，在沒有Hh信號分子時(shí)，PTCH抑制SM0活性，Hh 通路處于關(guān)閉狀態(tài)；一旦Hh與PTCH結(jié)合后，PTCH對SM0的抑制作用解除，SM0激活將信號 向細(xì)胞內(nèi)傳遞?；罨腟mo將信號傳遞到核轉(zhuǎn)錄因子Gli，下游的Gli轉(zhuǎn)錄因子被激活，以 全長形式轉(zhuǎn)入核內(nèi)引起靶基因的轉(zhuǎn)錄。
[0004] BBR是中藥黃連的有效成分之一，通常作為腹瀉的一種非處方藥。迄今，尚未見有 關(guān)BBR可確切抑制腫瘤的生長的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供小檗堿（Berberine，以下簡稱BBR)的新的藥物用途，具體涉 及小檗堿在制備Hedgehong信號通路抑制劑中的用途。進(jìn)一步將所述的小檗堿用于制備治 療腫瘤的藥物，特別是治療某些實(shí)體瘤的藥物。
[0006] 本發(fā)明的小檗堿（簡稱BBR)為天然中藥黃連的有效成分之一，其具有下述結(jié)構(gòu)：
[0007]
[0008] 本發(fā)明中進(jìn)行了 BBR對體外細(xì)胞Hedgehog信號通路的特異性抑制作用實(shí)驗(yàn)， 和BBR對Hh依賴的髓母細(xì)胞瘤的體內(nèi)抗瘤效應(yīng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：所述的BBR能顯著抑制 NIH3T3細(xì)胞中Hedgehog信號活性，尤其抑制Gli lucifearse的活性并呈劑量依耐性；以及 BBR對Hh信號通路有特異性抑制作用，尤其能顯著抑制C3H10T1/2中堿性磷酸酶的活性，抑 制效果呈明顯劑量關(guān)系；所述的BBR對Smoothened過表達(dá)激活的Gli-luciferase活性有 抑制作用，并呈現(xiàn)良好量效關(guān)系，而對SmoM2激活的Gli-luciferase活性無抑制作用，提示 BBR是Smoothened的拮抗劑；以及，所述的BBR在100mg/kg劑量時(shí)對同種異體移植的髓母 細(xì)胞瘤具有較為明顯的抗瘤效應(yīng)。
[0009] 本發(fā)明所述的BBR可以單獨(dú)成藥，或?qū)BR作為有效成分制備抗腫瘤藥物，特別是 制備抗髓母細(xì)胞瘤藥物，所述藥物制成片劑，膠囊劑，口服液，脂質(zhì)體等劑型。
[0010] 本發(fā)明提供了小檗堿（BBR)在作為Hedgehog通路抑制劑的應(yīng)用，能有效抑制與 Hedgehog信號通路活化相關(guān)的腫瘤，特別是在抗髓母細(xì)胞瘤生長中具有較明顯的抑制作 用?？蛇M(jìn)一步將BBR制備成或改造成新的抗腫瘤藥，擴(kuò)大BBR的應(yīng)用領(lǐng)域。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是：
[0012] 1.本發(fā)明為Hedgehog信號通路提供了一種新的抑制劑。
[0013] 2.本發(fā)明提供了 BBR在治療腫瘤方面的應(yīng)用，特別是Hedgehog信號通路異常激活 腫瘤的應(yīng)用。本發(fā)明在抑制腫瘤生長方面取得了較好的效果，同時(shí)來源廣，價(jià)格低，對細(xì)胞 毒性小，有利于臨床應(yīng)用。
[0014] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，可以更清楚地理解本發(fā)明，但 并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【附圖說明】
[0015] 圖1為不同濃度下，BBR作用于NIH3T3細(xì)胞36h后Gli-luciferase活性抑制的 量效曲線，結(jié)果表明其對SHH刺激的Gli luciferase活性抑制的IC50為4. 66uM，對SAG活 化 Smoothened 激活 Hedgehog 信號的 IC50 為 8. 70uM。
[0016] 圖2為不同濃度下，BBR作用于NIH3T3細(xì)胞24h后Glil mRNA表達(dá)的柱形圖，呈 現(xiàn)良好的量效關(guān)系。
[0017] 圖3為不同濃度下，BBR作用于C3H10T1/2細(xì)胞72h后對堿性磷酸酶表達(dá)的抑制 的柱形圖，呈現(xiàn)良好的劑量關(guān)系，進(jìn)一步表明其對Hh信號通路活性的抑制作用。
[0018] 圖 4 為轉(zhuǎn)染 Smoothened 質(zhì)粒與 Smoothened M2 (W535L)質(zhì)粒激活 Hedgehog 信號 后，用不同濃度的BBR作用NIH3T3細(xì)胞36h后，抑制Smoothened激活的Gli luciferase 活性；然而對SmoothenedM2(W535L)激活的Gli luciferase活性沒有抑制作用，呈現(xiàn)良好 量效曲線，提示BBR是Smoothened的詰抗劑。
[0019] 圖5為BBR與Bodipy-cyclopamine的相互作用的情況，結(jié)果表明BBR與 cyclopamine競爭性結(jié)合Smoothened，進(jìn)一步說明了 BBR是Smoothened的詰抗劑。
[0020] 圖6為從裸小鼠身上的髓母細(xì)胞瘤組織分離得到的髓母瘤細(xì)胞，用BBR處理24h 后顯著抑制GlilmRNA的表達(dá)。
[0021] 圖7為BBR(100mg/kg灌胃給藥，每天一次）給藥21天對裸小鼠接種的髓母細(xì)胞 瘤的生長抑制效應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下列實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐，用于示范本發(fā)明的模式，而不 應(yīng)將本發(fā)明理解為限定于這些實(shí)施例的范圍。
[0023] 應(yīng)特別指出的是在下列實(shí)施例中，使用的分子生物學(xué)技術(shù)和動物實(shí)驗(yàn)技術(shù)是本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員所熟知的，并可在諸如Rudin，C.M.et al. Treatment of medulloblastoma with hedgehog pathway inhibitor GDC-0449.N. Engl. J. Med. 361，1173 - 1178 (2009) 及 Kim J, Tang JY. et al.Itraconazole, a commonly used antifungal that inhibits Hedgehog pathway activity and cancer growth. Cancer Cell. 2010 Apr 13; 17 (4) : 388-99等參考文獻(xiàn)中獲得。
[0024] 實(shí)施例1 :BBR對體外細(xì)胞Hedgehog信號通路的特異性抑制作用
[0025] 1. BBR對體外細(xì)胞Hedgehog信號通路的抑制作用：
[0026] 1) :Gli-luciferase雙熒光素酶報(bào)告基因測試
[0027] NIH3T3 (American Type Culture Collection)細(xì)胞用含 10 % (v/v)新生牛血 清（GIBC0)的 Dulbecco' s modified Eagle' s medium(DMEM) (GIBC0)，青霉素 / 鏈霉素 (Hyclone)，37°C，5 % C02恒溫培養(yǎng)。接種3 X 104個(gè)細(xì)胞于48孔板中。24h后用轉(zhuǎn)染試劑 lipo2000 (Invitrogen)車專染Gli-dependent firefly luciferase reporter和 TK-Renilla luciferase reporter vectors。轉(zhuǎn)染后48h，換成含0.5%新生牛血清（GIBC0)的培養(yǎng)基， SAG(lOOnM)或Shh_N conditioned medium(ShhN-CM)及配制成不同濃度的BBR對細(xì)胞進(jìn)行 處理。36h后終止反應(yīng)。熒光素酶活性按照雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（Promega)的說明書使用 化學(xué)發(fā)光儀T20(p r〇mega)檢測。本實(shí)驗(yàn)每組3個(gè)復(fù)孔，至少重復(fù)三次；
[0028] 結(jié)果顯示：BBR能顯著抑制NIH3T3細(xì)胞中Hedgehog信號活性，表現(xiàn)為抑制Gli lucifearse的活性并呈劑量依耐性，其對SHH刺激的Gli luciferase活性抑制的IC50為 4. 66uM，對 SAG 活化 Smoothened 激活 Hedgehog 信號的 IC50 為 8. 70uM(如圖 1 所示）；
[0029] 2):實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(RT-qPCR)
[0030] NIH3T3細(xì)胞以4X105接種于六孔板中，24h后換成1 %新生牛血清（GIBC0)的DMEM 培養(yǎng)基，同時(shí)加入10% Shh_N conditioned medium(ShhN-CM)，細(xì)胞以不同濃度的BBR處 理，24h后用Trizol (北京鼎國生物）提取總RNA，以內(nèi)源性的⑶SB作為參照，用逆轉(zhuǎn)錄試劑 盒（PrimeScript* RT Master Mix，Takara)逆轉(zhuǎn)錄，用SYBR? Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)(Takara)按照說明書實(shí)時(shí)定量，使用iCycler iQ system(Bio-Rad)實(shí)時(shí)焚光定量 PCR儀，對Hedgehog的靶基因Glil mRNA進(jìn)行定量測定，本實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，至少重 復(fù)三次。計(jì)算出基因的相對表達(dá)水平；
[0031] 結(jié)果顯示：BBR能抑制NIH3T3中Hedgehog信號通路活性，表現(xiàn)Glil mRNA相對比 表達(dá)降低，且呈明顯量效關(guān)系（如圖2所示）；
[0032] 3):堿性磷酸酶實(shí)驗(yàn)：
[0033] C3H10T1/2(ATCC)細(xì)胞用含 10% (V/V)胎牛血清（GIBC0)的Dulbecco's modifies Eagle' s medium(DMEM) (GIBC0)，青霉素 / 鏈霉素（Hyclone)，37°C，5% C02 恒溫培養(yǎng)，以 4X 104個(gè)細(xì)胞于48孔板中，24h后加入5% Shh-N CM及配制成不同濃度的BBR對細(xì)胞進(jìn)行 處理，孵育72h后，用堿性磷酸酶試劑盒測定堿性磷酸酶的活性（碧云天），本實(shí)驗(yàn)每個(gè)濃度 設(shè)三個(gè)復(fù)孔，至少重復(fù)三次，
[0034] 結(jié)果顯示：BBR對Hh信號通路有特異性抑制作用，表現(xiàn)為能顯著抑制C3H10T1/2 中堿性磷酸酶的活性，抑制效果成明顯劑量關(guān)系（如圖3所示）；
[0035] 2. BBR抑制Hedgehog信號通路作用靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)：
[0036] 1) :BBR對Smoothened活化從而激活Hedgehog信號通路的抑制
[0037] NIH3T3細(xì)胞以3X104個(gè)/孔種在48孔板中，24h后用轉(zhuǎn)染試劑lipo2000同 時(shí)車專染 hSmo (Origene)、Gli-dependent firefly luciferase reporter 和 TK-Reni 11a luciferase reporter vectors，轉(zhuǎn)染后36h，換成含0.5%新生牛血清（GIBC0)的DMEM培養(yǎng) 基，用不同濃度的BBR對細(xì)胞進(jìn)行處理36h后，用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)測定Gli-luciferase 的相對活性，本實(shí)驗(yàn)每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，至少重復(fù)三次；
[0038] 結(jié)果顯示：BBR對Smoothened過表達(dá)激活的Gli-luciferase活性有抑制作用，并 呈現(xiàn)良好量效關(guān)系，而對SmoM2激活的Gli-luciferase活性未見有抑制作用（如圖4所 示），提示BBR是Smoothened的詰抗劑；
[0039] 2) :BBR 與 Bodipy-cyclopamine 的相互作用
[0040] 293T(ATCC)細(xì)胞用含 10% (V/V)胎牛血清（GIBC0)的 DMEM(GIBCO)，青霉素 / 鏈霉素，37°C，5% C02恒溫培養(yǎng)，以1X105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，24h后用轉(zhuǎn)染試劑 lipo2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染 hsmo(0rigene)500ng，轉(zhuǎn)染后 24h，換成含 1 % 新生牛血清 (GIBC0)的 DMEM 培養(yǎng)基，加入 Bodipy-cyclopamine (Biovision) (luM)以及不同濃度的 BBR 對細(xì)胞進(jìn)行處理，37°C，5% C02恒溫孵育10h后，細(xì)胞用1XPBS洗2次，4%多聚甲醛固定 lOmins，0? 1 % Triton 冰上孵育 lOmins，0? 5ug/ml DAPI (鼎國昌盛）染色 5mins, 1 XPBS 洗 2次，封片；
[0041 ] 結(jié)果顯示：BBR與Bodipy-cyclopamine存在競爭性結(jié)合（如圖5所示），進(jìn)一步表 明BBR位Smoothened的詰抗劑。
[0042] 實(shí)施例2 :BBR對Hh依賴的髓母細(xì)胞瘤的體內(nèi)抗瘤效應(yīng)實(shí)驗(yàn)
[0043] 1.BBR對髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Glil mRNA表達(dá)的抑制
[0044] 選取生長良好Ptch+/ P53 / C57B/L小鼠自發(fā)生長的髓母細(xì)胞瘤組織分離得到瘤細(xì) 胞（MB 細(xì)胞），Neurobasal-A Medium(GIBCO)，B-27 添加劑（GIBC0)，丙酮酸鈉（GIBC0)， L-谷氨酰胺（GIBC0)，青霉素/鏈霉素（Hyclone)，37°C，5 % C02恒溫培養(yǎng)，接種5 X 106個(gè)細(xì) 胞于六孔板中，24h后細(xì)胞加以不同濃度的BBR，作用24h后用Trizol提取總RNA，以內(nèi)源性 的基因⑶SB作為參照，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prim&Script? RT Master Mix，Takara)逆轉(zhuǎn)錄， 用 SYBR* Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)(Takara)按照說明書實(shí)時(shí)定量，使用 iCycler iQ system(Bio-Rad)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，對Hedgehog的靶基因Glil mRNA進(jìn)行定量測 定，本實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，至少重復(fù)三次。計(jì)算基因的相對表達(dá)水平；
[0045] 結(jié)果顯示：BBR能抑制MB細(xì)胞中Hedgehog信號通路活性，表現(xiàn)Glil mRNA相對比 表達(dá)降低，且呈明顯量效關(guān)系（如圖6所示）；
[0046] 2. BBR對髓母細(xì)胞瘤生長的抑制
[0047] 取生長良好的Ptch+/ P53 / C57B/L小鼠，待髓母細(xì)胞瘤長到合適大小，取出，剪切 成1.5_左右，在無菌條件下，接種于5周齡雌性裸鼠（華阜康）的左側(cè)腋窩皮下，待移植 瘤體積長至110mm 3左右，剔除移植瘤過大、過小以及未見生長的裸小鼠，隨機(jī)分組給藥，實(shí) 驗(yàn)組按照lOOmg/kg灌胃給藥，每天一次，陰性對照組同時(shí)給等量的溶媒0. 5% CMC-Na。腫 瘤體積（tumor volume，TV)的計(jì)算公式為：TV = 1/2X長X寬2,根據(jù)測量的結(jié)果計(jì)算相 對瘤體積（relative tumor volume，RTV)，計(jì)算公式為：RTV = Vt/V。其中V0為分籠給藥時(shí) 測量所得的腫瘤體積，Vt為每一次測量時(shí)的腫瘤體積；
[0048] 結(jié)果顯示：BBR在100mg/kg劑量時(shí)對同種異體移植的髓母細(xì)胞瘤具有較為明顯的 抗瘤效應(yīng)（如圖7所示）。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 如下式結(jié)構(gòu)的小檗堿（BBR)在制備Hedgehong信號通路抑制劑中的用途，W - 〇2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的BBR抑制NIH3T3細(xì)胞中Hedgehog信 號活性。3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的BBR特異性抑制Hh信號通路，其中 包括抑制C3H10T1/2中堿性磷酸酶的活性，抑制Smoothened過表達(dá)激活的Gli-luciferase 活性。4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的BBR對SmoM2激活的Gli-luciferase 活性無抑制作用。5. 如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的BBR用于制備Smoothened的詰抗劑。6. 權(quán)利要求1所述結(jié)構(gòu)的小檗堿（BBR)在制備抗腫瘤藥物中的用途。7. 如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤是髓母細(xì)胞瘤。8. 如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的藥物制成片劑，膠囊劑，口服液或脂 質(zhì)體。
【文檔編號】A61P35/00GK105853416SQ201510031124
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月21日
【發(fā)明人】譚文福, 王娟, 彭元求, 劉原, 楊君
【申請人】復(fù)旦大學(xué)