苯扎托品及其藥學上可接受的鹽的新應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及苯扎托品及其藥學上可接受的鹽的新應用，苯扎托品及其藥學上可接受的鹽對乳腺癌細胞系MCF?7，4T1?luc2，MDA?MB?231，SKBR3有很強的抑制作用，而且整體動物實驗也有明顯效果，以證明苯扎托品及其藥學上可接受的鹽可應用于制備抗乳腺腫瘤、抑制乳腺腫瘤轉移的疾病或腫瘤的藥物。
【專利說明】
苯扎托品及其藥學上可接受的鹽的新應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及藥物的新應用，特別是涉及苯扎托品及其藥學上可接受的鹽的新應 用。
【背景技術】
[0002] 1998年Wessler提出非神經(jīng)元性膽堿能系統(tǒng)的概念，非神經(jīng)元性Ach，從細胞中分 泌出來，通過自分泌或旁分泌機制，作用于自身或鄰近細胞上的nAChR和mAChR，調(diào)節(jié)細胞的 基本功能，如基因表達、擴增、分化、細胞骨架的形成、細胞間接觸等，近年研究發(fā)現(xiàn)非神經(jīng) 元膽堿能系統(tǒng)與多種腫瘤的形成和發(fā)展密切相關。
[0003] 目前文獻報道支配乳腺的神經(jīng)主要是感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)，副交感神經(jīng)或者是迷 走神經(jīng)對乳腺的支配還不清楚。交感神經(jīng)影響乳腺癌的轉移，在小鼠乳腺癌模型中，不同的 壓力應激如游泳應激、手術應激、社交沖突和低溫均能夠促進腫瘤向肺轉移，注射腎上腺 素能夠促進乳腺癌的轉移;更為重要的是，非留體抗炎藥吲哚美辛，和腎上腺素拮抗劑納 多洛爾(nadolol )，能夠阻止癌細胞向其他器官轉移，因此癌細胞向其他器官轉移這種效應 能夠被腎上腺素能信號所調(diào)節(jié)。
[0004] 膽堿能信號是否調(diào)節(jié)乳腺生理還不清楚，但影響乳腺癌生長和轉移確有文獻報 道，如膽堿能信號通過a9_nAChR影響細胞Ca 2+機制激活蛋白激酶A(protein kinase A， PKA)，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，磷酸肌醇3激酶（phosphoinositide_3kinases， PI3K)/Akt，和絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)等信號 通路促進腫瘤發(fā)生和生長。
[0005] 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，痛苦的生活經(jīng)歷增加了婦女患乳腺癌的幾 率，多種腫瘤低生存率和高死亡率與慢性抑郁相關聯(lián)，精神壓力興奮交感神經(jīng)系統(tǒng)從而影 響乳腺功能是清楚的。
[0006] 苯扎托品也是多巴胺轉運體抑制劑，可應用于可卡因成癮。最近研究還揭示了苯 扎托品的新用途，其對繼發(fā)型多發(fā)性硬化癥有較好的治療效果，其作用機制不是通過抑制 煙堿型乙酰膽堿受體和組胺的釋放，也不是通過抑制多巴胺的再攝取，而是作為一種毒蕈 堿型受體抑制劑，促進少突前體細胞(oligodendrocyte precursor cells)的分化成熟而 發(fā)揮藥理作用。
[0007] 甲橫酸苯扎托品[End0-3_(diphenylmethoxy )-8-methyl-8_azabicyclo[3，2，1 ] octane methanesulfonate，benztropine mesylate]，結構式為：
*. ?是苯扎托品（benztropine)的甲磺酸鹽，為 阿托品類衍生物，可以穿過血腦屏障，具有中樞性抗膽堿、抗組胺及輕度局麻等藥理作用， 用于治療帕金森綜合癥。
[0009] 目前，由于腫瘤生長和治療的復雜性，尚未有關于苯扎托品及其藥學上可接受的 鹽可用于制備抗乳腺腫瘤、抑制乳腺腫瘤轉移等的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 基于此，有必要針對上述問題，提供一種苯扎托品及其藥學上可接受的鹽的新應 用。
[0011] 具體技術方案如下：
[0012] 本發(fā)明提供了苯扎托品及其藥學上可接受的鹽在制備抗乳腺腫瘤的藥物中的應 用。
[0013] 在其中一些實施例中，所述苯扎托品藥學上可接受的鹽為甲磺酸苯扎托品。
[0014] 在其中一些實施例中，所述乳腺腫瘤為乳腺癌。
[0015] 本發(fā)明還提供了苯扎托品及其藥學上可接受的鹽在制備抑制乳腺腫瘤轉移的疾 病或腫瘤藥物中的應用。
[0016] 在其中一些實施例中，所述苯扎托品藥學上可接受的鹽為甲磺酸苯扎托品。
[0017] 在其中一些實施例中，所述乳腺腫瘤轉移的疾病或腫瘤為乳腺腫瘤向腹股溝淋巴 結轉移的疾病或腫瘤。
[0018] 在其中一些實施例中，所述乳腺腫瘤轉移的疾病或腫瘤為乳腺腫瘤向肝臟轉移的 疾病或腫瘤。
[0019] 本發(fā)明還提供一種防治乳腺腫瘤的藥物，其活性成分為苯扎托品或其藥學上可接 受的鹽。
[0020] 在其中一些實施例中，所述苯扎托品藥學上可接受的鹽為甲磺酸苯扎托品。
[0021] 本發(fā)明相較現(xiàn)有技術的優(yōu)點以及有益效果為：
[0022] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)苯扎托品及其藥學上可接受的鹽對乳腺癌細胞系MCF-7,4Tl-luc2， MDA-MB-231，SKBR3有很強的抑制作用，而且整體動物實驗也有明顯效果，以證明苯扎托品 及其藥學上可接受的鹽可應用于制備抗乳腺腫瘤、抑制乳腺腫瘤轉移的疾病或腫瘤的藥 物；由于腫瘤生長和治療的復雜性，苯扎托品及其藥學上可接受的鹽可應用制備的抑制乳 腺腫瘤轉移的疾病或腫瘤的藥物為抑制乳腺腫瘤向腹股溝淋巴結以及肝臟轉移的藥物。
[0023] 苯扎托品藥學上可接受的鹽，如甲磺酸苯扎托品，其發(fā)揮藥效的為主結構苯扎托 品，但其相較苯扎托品具有水溶性大，可增加藥物在人體內(nèi)的吸收的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0024] 圖1為苯扎托品對細胞增殖的影響示意圖；
[0025] 圖2為苯扎托品對在體腫瘤生長和轉移的作用示意圖，其中A為重量大小變化示意 圖，B為腫瘤重量變化示意圖，C為小鼠體重變化示意圖。
【具體實施方式】
[0026] 以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。
[0027] 以下實施例中所用原料均為市售普通原料。
[0028] 實施例
[0029](一)苯扎托品對乳腺癌細胞增殖的影響
[0030] 1 材料
[0031] 1.1實驗細胞系 4Tl-luc2cells，MDA-MB-231cells，SKBR3cells，MCF_7cells，均來 源于ATCC公司。
[0032] 1 ? 2試劑CCK-8試劑盒、DMEM。
[0033] 1.3儀器15mL離心管、1.5mL EP管、lmL和200yL槍頭、排槽，在實驗前準備好，121°C 30min滅菌后置于超凈臺中；
[0034] 96孔培養(yǎng)板為一次性塑料制品；
[0035]超凈臺、C02培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、離心機、單道及八道移液槍、凍存管、細胞計數(shù) 板，酶聯(lián)免疫檢測儀等。
[0036] 1.4藥品甲磺酸苯扎托品。
[0037] 1.5實驗方法
[0038] 細胞培養(yǎng)
[0039] 一、復蘇
[0040] 1、把裝有 4Tl-luc2cells，MDA-MB-231cells，SKBR3cells，MCF_7cells 四個細胞系 的凍存管分別從液氮中取出來，立即投入37°C水浴鍋中，輕微搖動;液體都融化后(大概1~ 1.5分鐘），拿出來噴點酒精放到超凈工作臺里；
[0041] 2、把上述細胞懸液吸到裝10ml培養(yǎng)基的15ml的離心管中（用培養(yǎng)基把凍存管洗一 遍，把粘在壁上的細胞都洗下來），1000轉離心5分鐘；
[0042] 3、把上清液倒掉，加lml培養(yǎng)基把細胞懸浮起來，吸到裝有10ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng) 皿中前后左右輕輕搖動，使培養(yǎng)皿中的細胞均勻分布；
[0043] 4、標好細胞種類和日期、培養(yǎng)人名字等，放到C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁后換培 養(yǎng)基；
[0044] 5、3天換一次培養(yǎng)基。
[0045] 二、傳代
[0046] 1、培養(yǎng)皿中的細胞覆蓋率達到80 %~90 %時傳代；
[0047] 2、把原有培養(yǎng)基吸掉；
[0048] 3、加適當?shù)囊鹊鞍酌?能覆蓋細胞就行），消化1~2分鐘；
[0049] 4、細胞都變圓后加入等體積的含10%牛胎兒血清卬85，11^1讓(^611)的培養(yǎng)基 (Gibco)終止消化；
[0050] 5、用移液槍吹打細胞，把細胞都懸浮起來；
[0051 ] 6、把細胞吸到15ml的離心管中，1000轉離心5分鐘；
[0052] 7、倒掉上清液，加1~2ml培養(yǎng)基，把細胞都吹起來；
[0053] 8、把細胞傳到五個培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0054] 三、凍存
[0055]把細胞消化下來并離心（離心條件同上）；用配好的凍存液把細胞懸浮起來，分裝 到滅菌的凍存管中，靜止幾分鐘，寫明細胞種類，凍存日期;4 °C 30min，-20 °C 30min，-80 °C過 夜，然后放到液氮灌中保存。
[0056] 凍存液的配制：70%的完全培養(yǎng)基（Gibco)+20%FBS+10%DMS0;DMS0(二甲基亞 砜)要慢慢滴加，邊滴邊搖。
[0057] CCK8法實驗步驟
[0058](一)按常規(guī)CCK8法來進行細胞活性檢測實驗，步驟如下：
[0059] 1、在96孔板中加入100yl細胞懸液，將培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(在37°C，5% C02的條件下）；
[0060] 2、向每孔中加入1 Oyl CCK-8溶液(比例是10 :1)，同時設置空白對照孔；（注意，不 要在孔中生成在氣泡，它們會影響0D值的讀數(shù)）
[0061 ] 3、將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，在酶聯(lián)免疫檢測儀0D450nm處測量各孔的吸光 值。
[0062](二)按常規(guī)CCK8法來進行細胞增值-毒性檢測實驗，步驟如下：
[0063] 1、在96孔板中加入100yl細胞懸液，將培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(在37°C，5% C02的條件下）；
[0064] 2、向培養(yǎng)板加入不同濃度梯度的甲磺酸苯扎托品，每孔lOOiil，設5個復孔；
[0065] 3、5%C02,37°C孵育6天，倒置顯微鏡下觀察；
[0066] 4、每孔加入10yl CCK溶液；（注意，不要在孔中生成在氣泡，它們會影響0D值的讀 數(shù)）
[0067] 6、將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，在酶聯(lián)免疫檢測儀0D450nm處測量各孔的吸光 值。
[0068]活力計算：
[0069] 細胞活力*( % ) = [A(加藥)_A(空白）]x100
[0070] A(加藥）：具有細胞、CCK8溶液和藥物溶液的孔的吸光度
[0071 ] A(空白）：具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細胞的孔的吸光度
[0072] A(0加藥）：具有細胞、CCK8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度
[0073] *細胞活力:細胞增殖活力或細胞毒性活力
[0074]實驗結果
[0075] 采用CCK-8法檢測細胞活力和藥物對細胞增殖的影響，在MCF-7細胞系，苯扎托品 0 ? 1，1，10，50，100yM 處理6天，測定 IC50是7 ? 2yM。
[0076] 隨后在4!'1-1此2，]\0^-]\?-231，501?3三種細胞系（41'1-11^2〇6118，]\0^-]\?-231cells以及SKBR3cells)上進行了同樣的實驗，結果見圖1(圖中的縱坐標Cell viability代表細胞活力），分別為在4Tl-luc2，MDA-MB-231，SKBR3三種細胞系的DMS0(未加 藥前)對照組與不同濃度的甲磺酸苯扎托品（benztropine mesylate)組的細胞活力對比， 與對照組相比，#P〈〇. 01，*#P〈〇. 001，結果表明苯扎托品處理6天有顯著的抑制細胞增殖 作用。
[0077] (二)苯扎托品在體抑制小鼠乳腺癌的生長和轉移
[0078] 1 材料
[0079] 1.1實驗動物
[0080] BALB/c 小鼠
[0081] 1.2儀器與藥品
[0082] PBS，紫杉醇（paclitaxel)，甲橫酸苯扎托品（benztropine mesylate)，0.9%生理 鹽水(0.9%8&1丨1^)，41'1細胞以了〇：)，光學檢測儀器。
[0083] 1.3實驗方法
[0084]小鼠活體成像檢測
[0085]用0.0 lmol/1的PBS洗滌4T1細胞兩次后，用PBS將細胞密度調(diào)至丨」1.0 X 106/ml，注射 0.2ml細胞懸浮液至BALB/c小鼠乳腺脂肪墊，定期用活體成像法檢測小鼠體內(nèi)腫瘤的生長 和轉移情況。
[0086] 1.4統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)用SPSS 11.0軟件和Excel2003進行統(tǒng)計，進行配對t檢 驗。
[0087] 2、實驗結果
[0088] 在BALB/c小鼠接種4T1細胞建立乳腺癌模型（4Tltumor model)，連續(xù)腹腔注射紫 杉醇（pacl itaxel) (10mg/kg)，甲橫酸苯扎托品（benztropine mesylate)(l. 5mg/kg)， 0 ? 9 %生理鹽水(0 ? 9 % sal ine)做對照。
[0089] 結果請見圖2,圖A(其中橫坐標表示給藥后的天數(shù)，縱坐標表示腫瘤大?。?、B(其中 縱坐標表示腫瘤重量）、C(其中縱坐標表示小鼠體重，橫坐標表示給藥后的天數(shù)）分別為 benztropine mesylate( 1 ? 5mg/kg)，paclitaxel(10mg/kg)以及0 ? 9%saline給藥后的腫瘤 大?。ˋ)，腫瘤重量(B)和小鼠體重（C)變化，x土SD(n= 10)，甲磺酸苯扎托品與對照組比 較，*?〈0.05，**?〈0.01，***?〈0.001，？&(：1^&叉61組與對照組比較，#牝〈0.01，##牝〈0.001 ; 通過活體成像檢測的轉移小鼠數(shù)量請見表1。
[0090] 表1活體成像檢測的轉移小鼠數(shù)量表
[0092] 上表中與對照組(0 ? 9%生理鹽水組)相比，*p〈0 ? 05，林*p〈0 ? 001。
[0093] 由圖2以及表1可知，從15天開始，與對照組比，給藥組紫杉醇(paclitaxel)和甲磺 酸苯扎托品（benztropine mesylate)顯著減少了腫瘤大小和瘤重(p〈0.01)，甲磺酸苯扎托 品組小鼠體重與對照組沒有顯著性差別；甲磺酸苯扎托品組顯著抑制了乳腺腫瘤向腹股溝 淋巴結和肝臟轉移，但對肺和腋窩淋巴結的轉移抑制作用不顯著。
[0094] 以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實 施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存 在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。
[0095] 以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來 說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護 范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1. 苯扎托品及其藥學上可接受的鹽在制備抗乳腺腫瘤的藥物中的應用。2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述苯扎托品藥學上可接受的鹽為甲磺酸 苯扎托品。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述乳腺腫瘤為乳腺癌。4. 苯扎托品及其藥學上可接受的鹽在制備抑制乳腺腫瘤轉移的疾病或腫瘤藥物中的 應用。5. 根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于，所述苯扎托品藥學上可接受的鹽為甲磺酸 苯扎托品。6. 根據(jù)權利要求4或5所述的應用，其特征在于，所述乳腺腫瘤轉移的疾病或腫瘤為乳 腺腫瘤向腹股溝淋巴結轉移的疾病或腫瘤。7. 根據(jù)權利要求4或5所述的應用，其特征在于，所述乳腺腫瘤轉移的疾病或腫瘤為乳 腺腫瘤向肝臟轉移的疾病或腫瘤。8. -種防治乳腺腫瘤的藥物，其特征在于，其活性成分為苯扎托品或其藥學上可接受 的鹽。9. 根據(jù)權利要求8所述的防治乳腺腫瘤的藥物，其特征在于，所述苯扎托品藥學上可接 受的鹽為甲磺酸苯扎托品。
【文檔編號】A61P35/00GK105853420SQ201610211586
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月5日
【發(fā)明人】崔繼紅, 項輝, 王瑞霞
【申請人】中山大學