應用番鴨肝炎病毒制備滅活疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種應用番鴨肝炎病毒GS14株制備番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫苗的制備方法。它以番鴨肝炎病毒GS14株為免疫原，以重組雞集落刺激因子為佐劑制得疫苗。番鴨肝炎病毒GS14株，于2016年4月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCC No:V201623。本發(fā)明的有益效果是該疫苗在使用時可肌肉或皮下注射，疫苗吸收快，無肉芽腫形成，對雛番鴨基本無應激反應，與蜂膠、油佐劑疫苗比較具有更好的安全性。用于預防，保護率90％以上，保護期長達3個月。且疫苗中作為免疫佐劑的重組雞集落刺激因子有刺激機體免疫細胞發(fā)育作用，能非特異性增強機體免疫功能。CCTCC No:V20162320160427
【專利說明】
應用番鴨肝炎病毒制備滅活疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗的制備方法，特別涉及一種應用番鴨肝炎病毒GS14株制備番 鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫苗的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自2013年以來，我國部分地區(qū)番鴨流行一種以臨床癥狀為采食量猛增而后基本絕 食，精神沉郁，喜伏臥，拉黃綠色稀便，偶見呼吸啰音，病鴨脫水、消瘦，死亡前有類似鴨病毒 性肝炎的神經(jīng)癥狀;剖檢癥狀為偶見心包積液、心肌出血和胰腺壞死，常見肝臟腫大、比同 日齡正常番鴨肝臟大至少20%，整個肝臟背景顏色為暗黃色或灰白色而非肝臟正常的暗紅 色，肝臟局部有密集出血點而出血點區(qū)域外則蒼白或整個肝臟有散在的針尖大小血點，膽 囊內(nèi)有深綠色膽汁、體積比同日齡正常番鴨膽囊增大2-5倍，脾臟腫大、有白色壞死點的疾 病，番鴨發(fā)病日齡最早為4-6日齡，發(fā)病率90%以上，死亡率30%以上，臨床上稱為番鴨"白 肝病"。
[0003] 番鴨肝炎病毒（"白肝病"）一旦感染，整群番鴨發(fā)病率大于90%，死亡率大于30 %。 臨床發(fā)病后按常規(guī)抗病毒結(jié)合抗菌的治療方案，效果不佳，治愈率低于40%，病程長，耐過 番鴨發(fā)育受阻，料肉比正常番鴨高20%以上，出欄時間延長15天以上，發(fā)育不整齊，嚴重影 響了番鴨養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提出了一種番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫苗的制備方法， 該疫苗在使用時可肌肉或皮下注射，疫苗吸收快，無肉芽腫形成，對雛番鴨基本無應激反 應，與蜂膠、油佐劑疫苗比較具有更好的安全性。用于預防，保護率90%以上，保護期長達3 個月。種番鴨在開產(chǎn)前時頸部皮下注射免疫0.8-1.0ml，而后每隔3個月免疫1次，可使子代 獲得對番鴨肝炎病毒的先天免疫，保護期至少15日。且疫苗中作為免疫佐劑的重組雞集落 刺激因子有刺激機體免疫細胞發(fā)育作用，能非特異性增強機體免疫功能。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：
[0006] -種應用番鴨肝炎病毒GS14株制備番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活 疫苗的制備方法，它以番鴨肝炎病毒GS14株為免疫原，以重組雞集落刺激因子為佐劑，其具 體步驟如下：
[0007] (1)制備抗原：將番鴨肝炎病毒GS14株毒種用生理鹽水5000~10000倍稀釋，經(jīng)尿 囊腔接種11~12日齡易感番鴨胚，0.1~0.2ml/胚，收集接種60~168小時死亡番鴨胚尿囊 液，無菌檢驗合格，即為抗原，然后于-20~-40°C保存；
[0008] ⑵抗原滅活:將步驟（1)中的抗原加入體積終濃度為0.1 %的甲醛溶液，在37 °C下 滅活24小時，期間振搖4次，每次3分鐘;所述甲醛溶液中甲醛的含量為36~40%;
[0009] (3)將步驟(2)中滅活后的抗原加入重組雞集落刺激因子并補充注射用水，使重組 雞集落刺激因子為lμg/ml~2μg/ml、抗原滅活前的病毒含量為UT^ELDso/OJml~10 一 5' °ELD5Q/0 ? 2ml，分裝，然后-4 °C 保存；
[0010] 所述番鴨肝炎病毒GS14株的保藏編號為CCTCC N〇:V201623。
[0011] 進一步的，所述步驟(3)中重組雞集落刺激因子為2iig/ml、抗原滅活前的病毒含量 為 10-5.0ELD5〇/O.2ml〇
[0012] 番鴨肝炎病毒GS14株經(jīng)易感番鴨胚傳代8代、鑒定，制備番鴨肝炎病毒重組集落刺 激因子滅活疫苗，進行了臨床預防試驗。雛番鴨在3日齡及以下時皮下或肌肉注射疫苗 0.3ml/只，在免疫后10天攻毒，可使雛番鴨得到保護，免疫保護期3個月，商品番鴨的飼養(yǎng)周 期為80天-100天，該疫苗可基本保護番鴨整個生長周期;種番鴨在開產(chǎn)前時頸部皮下注射 免疫0.8-1.0ml，而后每隔3個月免疫1次，可使子代獲得對番鴨肝炎病毒的先天免疫，保護 期至少15日。番鴨肝炎病毒重組集落刺激因子滅活疫苗為臨床預防番鴨"白肝病"提供了有 效手段。
[0013] 還可以用本發(fā)明類似方法制備番鴨肝炎病毒油乳劑滅活疫苗或蜂膠佐劑滅活疫 苗。但上述疫苗各有如下缺點，其一：油乳劑滅活疫苗一般推薦為皮下注射，如果不慎注射 到肌肉里，易在注射部位形成肉芽腫，屠宰后的番鴨酮體有疫苗殘留和肉芽腫，影響經(jīng)濟價 值和食品安全;如注射部位為腿部，有一定比例的番鴨會因疫苗壓迫神經(jīng)或血管，導致番鴨 腿部肌肉萎縮或瘸腿。其二:蜂膠滅活疫苗注射時應激較大，一般雛番鴨會有1天左右的采 食量下降及零星死亡，影響成活率和延續(xù)出欄時間，進而影響?zhàn)B殖效益。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0015] 本發(fā)明中的集落刺激因子是一組功能很強的骨髓造血細胞增殖因子，根據(jù)其作用 靶細胞，又分為很多種集落刺激因子，作用于粒細胞(G-CSF)即為其中一種，G-CSF具有刺激 粒系母細胞的增殖和分化，并可增強成熟粒細胞功能的作用，在增強機體非特異性免疫過 程中起重要作用。本發(fā)明用重組雞集落刺激因子(基因工程G-CSF)經(jīng)純化后作為疫苗佐劑， 起到非特異免疫增強劑作用。
[0016] 本發(fā)明的疫苗在使用時可肌肉或皮下注射，疫苗吸收快，無肉芽腫形成，對雛番鴨 基本無應激反應，與蜂膠、油佐劑疫苗比較具有更好的安全性。用于預防，保護率90%以上， 保護期長達3個月。種番鴨在開產(chǎn)前時頸部皮下注射免疫0.8-1.0ml，而后每隔3個月免疫1 次，可使子代獲得對番鴨肝炎病毒的先天免疫，保護期至少15日。且疫苗中作為免疫佐劑的 重組雞集落刺激因子有刺激機體免疫細胞發(fā)育作用，能非特異性增強機體免疫功能。
【具體實施方式】
[0017] 下面對本發(fā)明中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是 本發(fā)明的其中的幾個實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范 圍。
[0018] 一、制備實施例：
[0019] 原料：
[0020] 1、番鴨肝炎病毒GS14株:于2016年4月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 地址：中國武漢武漢大學，保藏編號為:CCTCC No:V201623;
[0021] 2、重組雞集落刺激因子:由南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院預防獸醫(yī)學系惠贈。
[0022] 實施例1:
[0023] -種番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫苗的制備方法，它以番鴨肝炎 病毒GS14株為免疫原，以重組雞集落刺激因子為佐劑，其具體步驟如下：
[0024] (1)制備抗原:將番鴨肝炎病毒GS14株毒種用生理鹽水10000倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接 種11~12日齡易感番鴨胚，0.2ml/胚，收集接種60~168小時死亡番鴨胚尿囊液，無菌檢驗 合格，即為抗原，然后于-40°C保存；
[0025] ⑵抗原滅活:將步驟(1)中的抗原加入體積終濃度為0.1 %的甲醛溶液，在37 °C下 滅活24小時，期間振搖4次，每次3分鐘;所述甲醛溶液中甲醛的含量為40% ;
[0026] (3)將步驟(2)中滅活后的抗原加入重組雞集落刺激因子并補充注射用水，使重組 雞集落刺激因子為lμg/ml、抗原滅活前的病毒含量為lO^ELDM/OmC保存。
[0027] 實施例2:
[0028] -種番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫苗的制備方法，它以番鴨肝炎 病毒GS14株為免疫原，以重組雞集落刺激因子為佐劑，其具體步驟如下：
[0029] (1)制備抗原:將番鴨肝炎病毒GS14株毒種用生理鹽水5000倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種 11~12日齡易感番鴨胚，0. lml/胚，收集接種60~168小時死亡番鴨胚尿囊液，無菌檢驗合 格，即為抗原，然后于-20°C保存；
[0030] ⑵抗原滅活:將步驟（1)中的抗原加入體積終濃度為0.1 %的甲醛溶液，在37 °C下 滅活24小時，期間振搖4次，每次3分鐘;所述甲醛溶液中甲醛的含量為36% ;
[0031] (3)將步驟(2)中滅活后的抗原加入重組雞集落刺激因子并補充注射用水，使重組 雞集落刺激因子為2μg/ml、抗原滅活前的病毒含量為lO^ELDM/omC保存。
[0032] 實施例3:
[0033] -種番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫苗的制備方法，它以番鴨肝炎 病毒GS14株為免疫原，以重組雞集落刺激因子為佐劑，其具體步驟如下：
[0034] (1)制備抗原:將番鴨肝炎病毒GS14株毒種用生理鹽水8000倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種 12日齡易感番鴨胚，0.15ml/胚，收集接種60~168小時死亡番鴨胚尿囊液，無菌檢驗合格， 即為抗原，然后于_30°C保存；
[0035] ⑵抗原滅活:將步驟(1)中的抗原加入體積終濃度為0.1 %的甲醛溶液，在37 °C下 滅活24小時，期間振搖4次，每次3分鐘;所述甲醛溶液中甲醛的含量為38% ;
[0036] (3)將步驟(2)中滅活后的抗原加入重組雞集落刺激因子并補充注射用水，使重組 雞集落刺激因子為lμg/ml、抗原滅活前的病毒含量為lO^ELDM/OmC保存。
[0037] 實施例4:
[0038] -種番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫苗的制備方法，它以番鴨肝炎 病毒GS14株為免疫原，以重組雞集落刺激因子為佐劑，其具體步驟如下：
[0039] (1)制備抗原:將番鴨肝炎病毒GS14株毒種用生理鹽水10000倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接 種12日齡易感番鴨胚，0.2ml/胚，收集接種60~168小時死亡番鴨胚尿囊液，無菌檢驗合格， 即為抗原，然后于-40 °C保存；
[0040] (2)抗原滅活:將步驟(1)中的抗原加入體積終濃度為0.1 %的甲醛溶液，在37 °C下 滅活24小時，期間振搖4次，每次3分鐘;所述甲醛溶液中甲醛的含量為38% ;
[0041] (3)將步驟(2)中滅活后的抗原加入重組雞集落刺激因子并補充注射用水，使重組 雞集落刺激因子為2μg/ml、抗原滅活前的病毒含量為lO^ELDM/omC保存。
[0042] 二、實驗例：
[0043] 1、將上述實施例1中制備的抗原進行鑒定，鑒定方法和結(jié)果如下：
[0044] 1.1病毒含量
[0045] 抗原用生理鹽水10倍系列稀釋，取10-5、10_6和10」3個稀釋度接種12日齡易感番 鴨胚，每個稀釋度各接種5枚，0.2ml/胚，用蠟封孔，于37°C靜置孵化，24小時以前死亡的番 鴨胚棄去不計，收集24~168小時死亡番鴨胚，按Reed-Muench法計算病毒含量為1(T 6-50ELD5〇/0.2ml〇 [0046] 1.2毒力
[0047] 抗原用生理鹽水10倍系列稀釋，取10-3、10_4、10- 5和10_64個稀釋度接種5日齡易 感番鴨，每個稀釋度各肌肉注射接種10只，0.5ml/只，上述番鴨分別隔離飼養(yǎng)，觀察10日，統(tǒng) 計各組番鴨死亡數(shù)，按Reed-Muench法計算病毒含量為10-4'4QLD5Q/0.5ml。
[0048] 1.3純凈性
[0049] 抗原按照現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》進行細菌、支原體和外源病毒檢驗合格。
[0050] 1.4特異性
[00511 抗原用生理鹽水稀釋至200ELD50/0.2ml，與等量抗番鴨肝炎病毒特異性血清混合， 37°C水浴中和1小時，尿囊腔接種12日齡易感番鴨胚10枚，0.2ml/胚;同時設(shè)病毒對照10枚， 接種同條件處理的病毒與生理鹽水混合液0.2ml/枚，上述番鴨胚用蠟封孔，于37°C靜置孵 育，觀察至168小時。中和組番鴨胚全部健活，對照組番鴨胚全部死亡。說明抗原能被抗番鴨 肝炎病毒特異性血清中和。
[0052] 1.5免疫原性
[0053] 1.5.1抗原滅活
[0054] 抗原加體積終濃度為0.1 %甲醛，37°C滅活24小時，期間振搖4次，每次3分鐘。
[0055] 1.5.2滅活檢驗
[0056] 1.5.2.1無菌按照現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》檢驗，無細菌生長。
[0057] 1.5.2.2安全檢驗滅活抗原皮下或肌肉注射5日齡番鴨10只，1.0ml/只。飼養(yǎng)觀察 14日，不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應。
[0058] 1.5.2.3免疫接種
[0059] 5日齡健康雛番鴨20只，分為2組，每組10只，1組番鴨頸部皮下接種滅活抗原接種 0.5ml/只，2組為對照組不做任何處理，上述兩組番鴨隔離飼養(yǎng)。接種滅活抗原后15日，1組 和2組番鴨用200LD5Q的番鴨肝炎病毒GS14株攻毒，觀察10日，統(tǒng)計2組番鴨發(fā)病和死亡情況。
[0060] 結(jié)果:第1組番鴨全部健活。第2組番鴨全部發(fā)病，死亡40%。結(jié)果說明抗原免疫原 性良好。
[0061] 將上述實施例2、實施例3和實施例4中制備的抗原進行鑒定，鑒定方法和結(jié)果均同 實施例1的鑒定結(jié)果一樣。
[0062] 2、將實施例1、實施例2和實施例3、實施例4制備的疫苗按下述方法進行檢驗：
[0063] 2.1無菌檢驗
[0064] 取疫苗，按按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》檢驗，均應無細菌生長。
[0065] 2.2安全性檢驗
[0066]取疫苗，分別皮下或肌肉注射5日齡健康番鴨10只，1.0ml/只。隔離飼養(yǎng)，觀察14 日，均未出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應。
[0067] 檢驗結(jié)果如下表1所示：
[0068]表1疫苗檢驗結(jié)果
[0070] 3、疫苗與保護率關(guān)系的研究
[0071] 3.1方法
[0072]實施例1疫苗
[0073]重組雞集落刺激因子lμg/ml，抗原滅活前的病毒含量為IO^ELDm/OII。
[0074]實施例2疫苗
[0075]重組雞集落刺激因子2μg/ml，抗原滅活前的病毒含量為IO^ELDm/OII。
[0076]實施例3疫苗
[0077]重組雞集落刺激因子lμg/ml，抗原滅活前的病毒含量為10+%0)5()/0.21111。
[0078]實施例4疫苗
[0079]重組雞集落刺激因子2μg/ml，抗原滅活前的病毒含量為1〇|%1北〇/0.21111。
[0080] 3日齡健康番鴨雛100只，分為5組，每組20只，1-4組分別經(jīng)肌肉注射上述實施例1 疫苗、實施例2疫苗、實施例3疫苗、實施例4疫苗，0.3ml/只，5組為對照組，不做任何處理。在 免疫后15天，對1-5組所有番鴨肌肉注射接種番鴨肝炎病毒GS14株100LD 5Q/只，接種病毒后 觀察10天，統(tǒng)計各組番鴨發(fā)病及死亡情況。
[0081] 3.2結(jié)果
[0082]當疫苗滅活前抗原的病毒含量2 lO^ELDso/OH、重組雞集落刺激因子含量2y g/ml時，可100 %保護，具體結(jié)果見表2。
[0083]表2各組番鴨發(fā)病率與保護率
[0085] 3.3結(jié)論
[0086] 對3日齡番鴨的預防保護試驗表明：接種相同劑量的番鴨肝炎病毒重組雞集落刺 激因子佐劑滅活疫苗的預防保護率與抗原滅活前的病毒含量和重組雞集落刺激因子含量 有關(guān)。在抗原滅活前的病毒含量相同條件下，重組雞集落刺激因子含量增加對提高疫苗保 護率有明顯作用。
[0087] 4、番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫苗免疫后產(chǎn)生保護性抗體最早 時間研究
[0088] 4.1方法
[0089] 3日齡健康番鴨雛120只，分為12組，每組10只，1-6組分別經(jīng)肌肉注射免疫實施例 2制備的番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫苗0.3ml/只，7-12組為對照組，不做 任何處理。在免疫后8、9、10、11、12、13天時，分別對1和7組、2和8組、3和9組、4和10組、5和11 組、6和12組的所有番鴨肌肉注射接種番鴨肝炎病毒GS14株100LD 5Q/只。上述各組接種病毒 后觀察10天，統(tǒng)計各組番鴨發(fā)病及死亡情況。
[0090] 4.2結(jié)果
[0091] 各攻毒對照組發(fā)病率100%、死亡率2 50%，免疫疫苗組100%保護是在免疫后10 天，具體結(jié)果見表3。
[0092]表3各組番鴨發(fā)病率與保護率
[0094] 5、番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫苗免疫持續(xù)期研究
[0095] 5.1方法
[0096] 3日齡健康番鴨雛80只，分為8組，每組10只，1-4組分別經(jīng)肌肉注射免疫實施例2制 備的番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫苗〇.3ml/只，5-8組為對照組，不做任何 處理。在免疫后1、2、3、4個月時，分別對1和5組、2和6組、3和7組、4和8組的所有番鴨肌肉注 射接種番鴨肝炎病毒GS14株100LD 5〇/只。上述各組接種病毒后觀察10天，統(tǒng)計各組番鴨發(fā)病 及死亡情況。
[0097] 5.2結(jié)果
[0098] 攻毒對照組番鴨發(fā)病率100%、死亡率2 60%，疫苗免疫組100%保護的持續(xù)期為3 個月，具體結(jié)果見表4。
[0099]表4各組番鴨發(fā)病率與保護率
[0102] 6、番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫苗保存期試驗
[0103] 6.1方法
[0104] 取于2-8°C保存的實施例2制備的番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫 苗，于保存6、8、10、12和15個月時分別接種10只3日齡健康番鴨0.3ml/只，同時設(shè)10只對照， 在接種疫苗后12日分別對免疫組和對照組番鴨肌肉注射接種番鴨肝炎病毒GS14株100LD 5〇/ 只，接種病毒后觀察10天，統(tǒng)計各組番鴨發(fā)病及死亡情況。
[0105] 6.2結(jié)果
[0106] 對照組番鴨發(fā)病率均為100%，死亡率>50%，保存6、8、10、12個月疫苗接種組番 鴨100%保護，保存15個月的疫苗接種組有2只番鴨發(fā)病，但未死亡。所以確定疫苗保存期 為:2-8 °C保存，有效期12個月。
[0107] 7、應用實施例2制備的番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫苗進行預防
[0108] (1)用于雛番鴨預防：
[0109] 廣東省肇慶市某番鴨養(yǎng)殖場，在2015年2月連續(xù)養(yǎng)殖2批次，各3500只/批，兩批雛 鴨間隔15天，雛番鴨均在11-15日開始發(fā)病，結(jié)合臨床癥狀和實驗室診斷為番鴨"白肝病"， 死亡高峰期在發(fā)病后4-7天，死亡率均大于60 %，剩余番鴨每天零星死亡至35日齡左右，至 出欄時，存活的部分番鴨瘦弱，成品率分別為17.6%和22.4%，給養(yǎng)殖戶造成了巨大經(jīng)濟損 失。
[0110]自2015年6月，該場經(jīng)清場消毒后又連續(xù)進番鴨雛3000只2批，兩批間隔15日，第一 批雛番鴨在進場當天皮下注射番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫苗0.3ml/只， 第二批沒有注射該疫苗，第二批飼養(yǎng)至9天時出現(xiàn)個別雛鴨拉稀、腳軟，跟不上大群，12天時 爆發(fā)性死亡371只，隨后5天內(nèi)共死亡1170只，剖檢癥狀與2月份發(fā)生的"白肝病"癥狀相同， 第二群至雛鴨20日齡時死亡率71.6%，而第一批則健康、未發(fā)病。結(jié)果說明該疫苗預防效果 良好。
[0111] (2)種鴨預防：
[0112] 廣東省高明市某番鴨養(yǎng)殖場的種番鴨2300只在開產(chǎn)前20日頸部皮下注射免疫 1.0ml，而后每隔3個月免疫1次，該批種鴨所產(chǎn)部分種蛋孵化的雛番鴨37000只，分到周邊16 個養(yǎng)殖場，經(jīng)跟蹤調(diào)查，幾乎未見發(fā)生番鴨"白肝病"癥狀，母源抗體保護率98 %以上。結(jié)果 說明該疫苗免疫種鴨后對雛鴨有較好的保護率。
[0113] 8、番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫苗質(zhì)量標準
[0114] 本品系用番鴨肝炎病毒GS14株接種番鴨胚培養(yǎng)，收獲接種后60~168小時死亡番 鴨胚的尿囊液，滅活，添加重組雞集落刺激因子制成滅活疫苗。用于番鴨肝炎病毒（臨床稱 為"白肝病"）的預防。
[0115] 【性狀】本品為微棕色至淡紅色液體，久置瓶底有微量沉淀。
[0116] 【無菌檢驗】按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》檢測，應無細菌生長。
[0117]【支原體檢驗】按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》檢測，應無支原體生長。
[0118] 【外源病毒檢驗】按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》檢測，應無外源病毒污染。
[0119] 【安全檢驗】用5日齡健康番鴨10只，每只皮下注射本品1.0ml，連續(xù)觀察14日，番鴨 應全部健活。
[0120] 【主要成分與含量】疫苗中含番鴨肝炎病毒GS14株和重組雞集落刺激因子，滅活前 的番鴨肝炎病毒含量2 10-6.0ELD50/0.2ml，重組雞集落刺激因子含量2μg/ml。
[0121 ]【甲醛殘留】按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》檢測，應符合規(guī)定。
[0122] 【規(guī)格】250ml/瓶。
[0123] 【貯藏與有效期】2~8°C貯存，有效期為12個月。
[0124] 9、番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫苗使用說明
[0125] 【作用與用途】用于預防番鴨肝炎病毒(臨床稱為"白肝病"），免疫保護期為3個月。
[0126] 【主要成分與含量】疫苗中含番鴨肝炎病毒GS14株和重組雞集落刺激因子，滅活前 的番鴨肝炎病毒含量2 HT^ELDm/O . 2ml，重組雞集落刺激因子含量2μg/ml。
[0127] 【性狀】為微棕色至淡紅色液體，久置瓶底有微量沉淀。
[0128] 【用法與用量】皮下或肌肉注射。3日齡及以內(nèi)雛番鴨，0.3ml/羽；種番鴨開產(chǎn)前20 天接種0.8-1.0ml/羽，而后每隔3個月免疫1次，可使子代獲得對番鴨肝炎病毒的先天免疫。
[0129] 【注意事項】
[0130] 1、本品用于接種健康番鴨。體質(zhì)瘦弱、患有其他疾病者，不應使用。
[0131] 2、使用前應先使疫苗恢復到常溫并充分搖勻。
[0132] 3、疫苗啟封后，限當日用完。
[0133] 4、本品不能凍結(jié)。
[0134] 5、注射針頭等用具，用前需經(jīng)消毒，注射部位應涂擦5%碘酒消毒。
[0135] 【規(guī)格】250ml/瓶。
[0136] 【貯藏與有效期】8~12°C貯存，有效期為12個月。
[0137] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種應用番鴨肝炎病毒GS14株制備番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激因子佐劑滅活疫 苗的制備方法，其特征在于:它以番鴨肝炎病毒GS14株為免疫原，以重組雞集落刺激因子為 佐劑，其具體步驟如下： (1) 制備抗原：將番鴨肝炎病毒GS14株毒種用生理鹽水5000~10000倍稀釋，經(jīng)尿囊腔 接種11~12日齡易感番鴨胚，0.1~0.2ml/胚，收集接種60~168小時死亡番鴨胚尿囊液，無 菌檢驗合格，即為抗原，然后于-20~-40°C保存； (2) 抗原滅活:將步驟（1)中的抗原加入體積終濃度為0.1 %的甲醛溶液，在37 °C下滅活 24小時，期間振搖4次，每次3分鐘;所述甲醛溶液中甲醛的含量為36~40%; (3) 將步驟(2)中滅活后的抗原加入重組雞集落刺激因子并補充注射用水，使重組雞集 落刺激因子為lμg/ml~2μg/ml、抗原滅活前的病毒含量為10- 6· qELD5Q/0.2ml~10-5 · qELD50/ 0.2ml，分裝，然后-4 °C保存； 所述番鴨肝炎病毒GS14株的保藏編號為CCTCC N〇:V201623。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用番鴨肝炎病毒GS14株制備番鴨肝炎病毒重組雞集落刺激 因子佐劑滅活疫苗的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中重組雞集落刺激因子為2yg/ ml、抗原滅活前的病毒含量為2 IO^ELDm/O . 2ml。
【文檔編號】A61K39/125GK105854009SQ201610285099
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月3日
【發(fā)明人】魏思遠, 趙光偉
【申請人】重慶三杰眾鑫生物工程有限公司