一種不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑及其動物疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及提供一種不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑，所述不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑按重量份計，包括如下組分：注射用油60～95份；乳化劑A 0.1～20份；乳化劑B 0.1～20份；助乳化劑0～5份。本發(fā)明所提供的新型乳化劑構(gòu)建的疫苗體系由于采用高性能的乳化劑，能與疫苗中的其他組分更好的配伍，形成獨特的乳液結(jié)構(gòu)，整個乳液體系由均勻微小的油滴組成，將油滴變小后，佐劑就具有更大的表面積來吸附抗原，與現(xiàn)有油佐劑相比，可有效的增加吸附面積，因此在不增加佐劑濃度的情況下，具有更大的抗原結(jié)合面積。
【專利說明】
一種不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑及其動物疫苗
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及疫苗佐劑領(lǐng)域，提供了一種不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑及其動 物疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 佐劑是指與抗原同時或預(yù)先應(yīng)用，能增強機體針對抗原的免疫應(yīng)答能力，或改變 免疫反應(yīng)類型的物質(zhì)。佐劑對疫苗起著至關(guān)重要的作用，它能同時對抗原和機體起作用，適 當(dāng)運用佐劑可以調(diào)節(jié)甚至改變機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗原特異性的體液和/或細胞免疫應(yīng)答 的類型。對于機體而言，佐劑是外源性物質(zhì)，除了所需要的免疫刺激作用外，佐劑還能引起 不良反應(yīng)。將佐劑摻入疫苗制劑以增強疫苗免疫原性的裨益必須與其引起不良反應(yīng)的危險 性進行權(quán)衡。局部不良反應(yīng)有炎癥、結(jié)節(jié)、膿腫等，全身不良反應(yīng)有過敏、發(fā)熱、免疫抑制，甚 至有致畸、致癌、致突變等危險。在實驗動物中觀察到的對佐劑的全身反應(yīng)包括不適、發(fā)熱、 佐劑性關(guān)節(jié)炎和前眼色素層炎等。這些反應(yīng)常由佐劑與抗原本身的相互作用而引起，或可 能由于佐劑引起的對特定抗原的應(yīng)答類型，或疫苗中佐劑引起的細胞因子類型。
[0003] 油佐劑可通過幾種機制提高免疫力和延長免疫期：油乳劑中含有油和乳化劑，抗 原包被在油相形成的微結(jié)構(gòu)內(nèi)，使之形成貯存庫而緩慢釋放，刺激機體細胞產(chǎn)生抗體；油乳 劑刺激局部產(chǎn)生肉芽腫或炎癥反應(yīng)，吸引巨噬細胞等聚集，這些細胞產(chǎn)生大量的活性介質(zhì)， 這些活性物質(zhì)又增強了體液和細胞免疫。因此，疫苗的安全性和效力高低，直接與佐劑中的 乳化劑組成和乳化效果的好壞有關(guān)。產(chǎn)品乳化后的穩(wěn)定性，反映了乳化后對疫苗的保護力 及疫苗注入機體后的緩釋能力。
[0004] 佐劑中的乳化劑作為其重要組成部分，一直是佐劑領(lǐng)域研究的重要內(nèi)容。隨著免 疫學(xué)研究的深入，重組亞單位疫苗、合成肽疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗等新型疫苗相繼 開發(fā)并投入使用，新型疫苗免疫原性較低，往往更需要佐劑的協(xié)助作用，才能引起有效的細 胞和體液免疫應(yīng)答，而佐劑中乳化劑的選擇及應(yīng)用成為制約佐劑性能的關(guān)鍵因素。在當(dāng)前 應(yīng)用的佐劑配方選擇中往往采用含有聚氧乙烯基的乳化劑體系，如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸 酯類（吐溫系列乳化劑），聚氧乙烯脂肪酸酯類，這些類型的乳化劑具有一定的溶血性，所 以注射后易引起組織炎性反應(yīng)，將引起動物的副反應(yīng)。而作為疫苗使用的實際情況，疫苗的 安全性往往比效力和持續(xù)時間更重要。因此在提高疫苗的效力持續(xù)時間，以確保防止發(fā)生 疾病發(fā)生或發(fā)揮出疫苗作用的基礎(chǔ)上應(yīng)選用刺激性小，安全性高的乳化劑應(yīng)用于佐劑。
[0005] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一目的是制備出動物應(yīng)急反應(yīng)小，安全高效的疫苗佐劑，以針對不同 的進行動物免疫，且所述佐劑中不含聚氧乙烯基乳化劑。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑，按重量份計，包括如下組分：
[0009] 注射用油 60 ~ 95份 乳化劑A 0.1 ~ 20份 乳化猶B 0.1 ~ 30份 助乳化劑 0~5份；
[0010] 所述乳化劑A為一種或多種多元糖的脂肪酸酯；
[0011] 所述乳化劑B為一種或多種聚甘油酯脂肪酸酯；
[0012] 所述助乳化劑為直鏈或有支鏈的脂肪酸或脂肪醇。
[0013] 在本發(fā)明所描述的體系中的配比比例均按重量比計算，疫苗佐劑中優(yōu)選各組分的 總用量為100份。
[0014] 其中，優(yōu)選所述不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑按重量份計，包括如下組分：
[0015] 注射用油 77 ~ 91價 乳化劑A 1~12份 乳化劑B 3 ~20份 助乳化劑 1~1.5份。
[0016] 更優(yōu)選按重量份計，包括如下組分：
[0017] 注射用油 77~85份 乳化劑A 2~10份 乳化劑B 4 ~ 7.9份 助乳化刻 1 ~ 1.5份。
[0018] 以上所述的佐劑配方中，注射用油選自一種或多種礦物油，優(yōu)選杭煉白油、MARC0L 52及S0NNEB0RN 40oil的一種或兩種。
[0019] 本發(fā)明所描述的佐劑可以提供水包油，油包水，水包油包水等多種劑型。
[0020] 以上所述的佐劑配方中：
[0021] 乳化劑A優(yōu)選為山梨醇單油酸酯，山梨醇雙油酸酯，山梨醇三油酸酯，山梨醇單月 桂酸酯，山梨醇雙月桂酸酯，山梨醇三月桂酸酯，山梨醇單硬脂酸酯，山梨醇單硬脂酸酯，麥 芽糖醇油酸酯，蔗糖油酸酯等中一種或多種的混合物，更優(yōu)選山梨醇單油酸酯、山梨醇單月 桂酸酯、山梨醇單硬脂酸酯及蔗糖油酸酯。此類乳化劑在油中溶解度大，易形成油包水型乳 劑，能起到一定的緩釋效果。
[0022] 乳化劑B中所述聚甘油酯中聚甘油選自二聚甘油，三聚甘油，四聚甘油，五聚甘 油，六聚甘油，七聚甘油，八聚甘油，九聚甘油，十聚甘油，十一聚甘油，十二聚甘油中的一種 或多種的混合物；所述脂肪酸酯中脂肪酸選自硬脂酸、異硬脂酸、軟脂酸、油酸、亞油酸、月 桂酸、蓖麻醇酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、乙酸，酒石酸。
[0023] 其中，優(yōu)選所述乳化劑B選自二聚甘油硬脂酸酯，三聚甘油單硬脂酸酯，三聚甘油 二硬脂酸酯，三聚甘油單異硬脂酸酯，三聚甘油二異硬脂酸酯，三聚甘油單軟脂酸酯，三聚 甘油三油酸酯，四聚甘油三硬脂酸酯，四聚甘油五硬脂酸酯，四聚甘油異硬脂酸酯，五聚甘 油單硬脂酸酯，六聚甘油單月桂酸酯，六聚甘油單油酸酯，十聚甘油雙棕櫚酸酯，十聚甘油 十油酸酯，十聚甘油單異硬脂酸酯，十聚甘油二異硬脂酸酯，聚甘油辛癸酸酯，二乙酰酒石 酸雙甘油酯，聚甘油乙酸酯中的一種或多種，更優(yōu)選三聚甘油單硬脂酸酯、六聚甘油單月桂 酸酯、十聚甘油單異硬脂酸酯、六聚甘油單油酸酯和三聚甘油三油酸酯。聚甘油酯的耐熱 性、粘度比其它多元醇系脂肪酸酯高。其水溶液不會因存在酸或鹽而發(fā)生凝聚作用，且耐水 解性能好，具有良好的安全性、耐酸性、耐水解性和藥理物質(zhì)的相容性等特點，可起到乳化、 增溶、滲透的協(xié)同效果。
[0024] 本發(fā)明所述助乳化劑為直鏈或有支鏈的脂肪酸或脂肪醇，碳鏈長度為5-22 ; 優(yōu)選所述脂肪酸選自硬脂酸、異硬脂酸、軟脂酸、油酸、亞油酸、月桂酸、蓖麻醇酸、棕櫚 酸、肉豆蔻酸、琥珀酸中的一種或多種。優(yōu)選所述脂肪醇選自PEG100, PEG200, PEG400， PEG600, PEG800, PEG1000, PEG2000,正辛醇，正壬醇，正癸醇，^^一烷醇，十二烷醇（月桂 醇），十四烷醇（鯨蠟醇），十八烷醇（硬脂醇），二十烷醇（花生醇），二十二醇中的一種或 幾種的混合物；更優(yōu)選所述助乳化劑為硬脂酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、月桂醇、鯨蠟醇、十八烷 醇，以及最優(yōu)選為聚乙二醇400、三聚甘油、硬脂酸中的一種或幾種。此類助乳化劑可起到潤 濕，分散的作用。
[0025] 本發(fā)明采用聚甘油脂肪酸酯乳化劑復(fù)配可與山梨醇，麥芽糖醇，蔗糖，木糖醇等多 元糖的脂肪酸酯結(jié)合使用，可獲得穩(wěn)定高效的油佐劑，所采用的乳化劑不含聚氧乙烯基團， 具有良好的安全性、耐酸性、耐水解性和藥理物質(zhì)的相容性等特點，佐劑中的油是被聚甘油 脂肪酸酯乳化劑所包裹。由于所采用的乳化劑種類是由天然植物提取物合成，在動物的代 謝過程中可被分解參與代謝被動物利用，具有高度的安全性。由于其具有良好的生物相容 性，注射后可以避免組織炎性反應(yīng)，有效避免動物的副反應(yīng)，因而具有很高的安全性。
[0026] 乳劑疫苗經(jīng)肌內(nèi)或皮下注射后，易濃集于淋巴系統(tǒng)，具有淋巴定向性的特點，在體 內(nèi)呈現(xiàn)出靶向性分布的特點，而影響其靶向性的因素有佐劑配方組成，乳滴的大小、表面電 荷，油相、乳化劑種類和用量，給藥途徑等因素有關(guān)?，F(xiàn)有佐劑往往存在局部不良反應(yīng)，存在 全身不良反應(yīng)，有過敏、發(fā)熱、免疫抑制，甚至有致畸、致癌、致突變等危險。本發(fā)明所提供 的新型乳化劑構(gòu)建的疫苗體系由于采用高性能的乳化劑，能與疫苗中的其他組分更好的配 伍，形成獨特的乳液結(jié)構(gòu)，整個乳液體系由均勻微小的油滴組成，將油滴變小后，佐劑就具 有更大的表面積來吸附抗原，與現(xiàn)有油佐劑相比，可有效的增加吸附面積，因此在不增加佐 劑濃度的情況下，具有更大的抗原結(jié)合面積。這些細小油滴能夠通過淋巴系統(tǒng)被更有效的 分散，能有效減少注射部位的組織反應(yīng)。同時這些細小油滴比現(xiàn)有佐劑能夠讓更多的全細 胞抗原被吸附，有更多的抗原被逞遞到免疫系統(tǒng)，具有良好的靶向性和可控性，所以免疫后 動物能產(chǎn)生更強的免疫應(yīng)答，同時均勻微小的油滴可提供疫苗體系出色的穩(wěn)定性。相對而 言由于形成了微小油滴的懸浮液，與常規(guī)連續(xù)油相不同，這樣微小的油滴可減少疫苗對注 射部位的刺激性，獨特的佐劑組成還使疫苗具有良好的通針性和易使用性。
[0027] 本發(fā)明同時提供上述不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑的制備方法之一（優(yōu)選 方法，但并不局限于此），具體而言，所述制備方法為：按比例稱取定量的乳化劑和助劑，加 入到稱量好的礦物油中，控制攪拌速度，進行物理混合，混合過程中可采取加熱助溶的方 式，溫度控制在l〇〇°C以下，混合均勻成液體即得不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑。所述 的攪拌速度優(yōu)選為500轉(zhuǎn)以下。
[0028] 上述制備方法簡單可控，有利于工業(yè)化生產(chǎn)和產(chǎn)品工藝質(zhì)量控制。
[0029] 本發(fā)明的第二目的在于保護包含上述不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑的動物 疫苗。
[0030] 上述動物疫苗包括且不限于禽流感，新城疫，口蹄疫（病毒苗和合成肽苗），豬圓 環(huán)病毒疫苗，豬偽狂犬病毒疫苗，豬繁殖與呼吸綜合癥疫苗，豬偽狂犬疫苗及牛流行熱滅活 疫苗等動物疫苗產(chǎn)品。基于本發(fā)明所述的特殊不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑，所制備 的疫苗不易引起組織炎性反應(yīng)，副反應(yīng)小，安全有效的優(yōu)點。
[0031] 本發(fā)明同時提供了上述動物疫苗的制備方法，所述方法優(yōu)選包括如下步驟：（本 發(fā)明對動物疫苗的制備方法不局限于此）
[0032] (1)將所述不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑經(jīng)121°C滅菌30分鐘冷卻至35°C ;
[0033] (2)將滅菌冷卻的所述不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑加入到乳化罐中，攪拌 混合均勾，控制攪拌速度至3000轉(zhuǎn)/分以下；
[0034] (3)將動物疫苗水相抗原緩慢加入到不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑中，加入 量為不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑質(zhì)量的10~120% ;
[0035] (4)加入完成后，進行預(yù)剪切乳化，控制剪切速度在5000轉(zhuǎn)/分以下，預(yù)剪切乳化 的過程控制在10分鐘以內(nèi)；
[0036] (5)預(yù)剪切完成后，控制轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分以下，進行剪切乳化，此過程控制在10 分以內(nèi)；
[0037] (6)乳化完成后，進行標(biāo)記分裝，即得。
[0038] 采用上述制備方法，有利于制備得到顆粒度為1微米左右，粒度分布均勻，安全有 效的動物疫苗。
【具體實施方式】
[0039] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0040] 本發(fā)明所涉及的尚效佐劑疫苗指標(biāo)檢測的相關(guān)說明如下：
[0041] 1 ?離心檢測
[0042] 采用臺式離心機，疫苗樣品經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，不出油出水、分層、破乳 等現(xiàn)象。
[0043] 2?粒度測定
[0044] 疫苗經(jīng)粒度儀測定，乳液粒子大小分布均勻，粒度特征參數(shù)D90為1微米作用。
[0045] 3.粘度檢測
[0046] 粘度測定采用1毫升吸管（吸管出口內(nèi)徑1. 2mm)，吸取25°C疫苗樣品1毫升，吸 管垂直，經(jīng)自然流出，流出0. 4毫升時用秒表記錄時間，連續(xù)測試三次，取平均值。數(shù)值符合 獸藥典規(guī)程要求。
[0047] 4?穩(wěn)定性測試
[0048] 制備的疫苗在4~8°C條件下放置2年穩(wěn)定有效；常溫25°C條件下放置一年穩(wěn)定， 未破乳分層；在37°C條件下中放置30天疫苗穩(wěn)定，未破乳分層。
[0049] 5.無菌檢測
[0050] 酪胨10g肉浸液1000ml氯化鈉5g，15~20g瓊脂，取酪胨和氯化鈉，瓊脂加入肉 浸液內(nèi)，微溫溶解后，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7. 2±0. 2,分裝， 滅菌。接種疫苗與培養(yǎng)基后經(jīng)30~35°C培養(yǎng)48小時，觀察結(jié)果無菌。
[0051] 本發(fā)明所述高效佐劑動物疫苗的安全性和免疫效果評價內(nèi)容如下：
[0052] 將制備的納米佐劑疫苗免疫評價動物，動物接種疫苗后無異常反應(yīng)，在規(guī)定的時 間采血分離血清，檢測血清HI效價，根據(jù)需要進行攻毒保護率試驗。
[0053] a?動物安全性試驗
[0054] 1.用體重350- 450g的豚鼠2只，每只皮下注射疫苗2ml :用體重18 - 22g的小 白鼠5只，每只皮下注射疫苗0. 5ml。連續(xù)觀察7日，觀察臨床反應(yīng)。
[0055] 2.用至少6月齡的健康易感牛3頭，每頭舌背面皮內(nèi)注射20個點，每點0. 1ml疫 苗，逐日觀察4日。之后，每頭牛按推薦的接種途徑接種3頭份疫苗，繼續(xù)逐日觀察6日，觀 察臨床反應(yīng)。
[0056] 實驗結(jié)果：動物存活100% (2/2, 5/5, 3/3)，未見發(fā)熱等副反應(yīng)，未出現(xiàn)異常癥 狀。
[0057] 3?效力試驗
[0058] 將制備的高效佐劑疫苗免疫評價動物，動物接種疫苗后無異常反應(yīng)，根據(jù)需要進 行攻毒保護率試驗。
[0059] 實施例1
[0060] 本實施例所述不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑按重量百分比計，組成如下：
[0061] 注射用礦物油 MARC0L 52 30%，S0NNEB0RN 40oil 30%
[0062] 山梨醇單油酸酯 8.5%
[0063] 三聚甘油單硬脂酸酯 30%
[0064] 硬脂酸 1.5%。
[0065] 實施例2
[0066] 本實施例所述不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑按重量百分比計，組成如下：
[0067] 注射用礦物油MARC0L 52 85%
[0068] 山梨醇單月桂酸酯 10%
[0069] 六聚甘油單月桂酸酯 5%
[0070] 實施例3
[0071] 本實施例所述不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑按重量百分比計，組成如下：
[0072] 注射用礦物油MARCOL 52 95 % 山梨醇單硬脂酸織 I%， 十聚甘油單異硬脂酸酯 3 % 油酸 1%。
[0073] 實施例4
[0074] 本實施例所述不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑按重量百分比計，組成如下：
[0075] 注射用礦物油杭州石化注射級白油 77 % 麥芽糖醇油酸酯 2% 四聚甘油單油酸酯 2〇0/a 十六醇 rx
[0076] 實施例5
[0077] 本實施例所述不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑按重量百分比計，組成如下：
[0078] 注射用 MARCOL52 91 % 蔗糖油酸酯 0.1% 三聚甘油三油酸酯 7.9% PEG600 1%。
[0079] 實施例6
[0080] 本實施例所述不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑按重量百分比計，組成如下：
[0081] 注射用 MARCOL 52 74.9 % 麥芽糖醇月桂酸酯 20% 二聚甘油單油酸酯 0.1% 肉豆蔻酸 5%:。.
[0082] 實施例7
[0083] 本實施例提供了實施例1-5任一所述不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑的制備 方法：具體如下：
[0084] 按比例稱取定量的乳化劑和助劑，加入到稱量好的礦物油中，控制攪拌速度，進行 物理混合，混合過程中可采取加熱助溶的方式，溫度控制在100°C以下，混合均勻成液體即 得不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑。
[0085] 實施例8
[0086] 本實施例提供了含有實施例1-6任一所述不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑的 動物疫苗。
[0087] 本實施所述動物疫苗為口蹄疫疫苗，制備方法具體如下：
[0088] 根據(jù)上述實施例1-6的配方（優(yōu)選實施例5)，按實施例7所述方法制備成不含聚 氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑佐劑，經(jīng)121°C滅菌30分鐘冷卻至35°C，取1000ml加入到剪切 機乳化罐中，剪切速率1000轉(zhuǎn)/分鐘條件下將生產(chǎn)用符合標(biāo)準(zhǔn)口蹄疫抗原l〇〇〇ml緩慢加 入乳化罐內(nèi)，剪切乳化3分鐘，再在8000轉(zhuǎn)/分鐘條件下剪切乳化5分鐘，制備成5種口蹄 疫疫苗，分裝標(biāo)記后待檢測。放置24小時后進行物理指標(biāo)檢測和動物實驗。
[0089] 本實施例所制備的口蹄疫疫苗在2~8°C中放置一年穩(wěn)定，在37°C中放置30天未 見破乳，經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘未見出油出水，疫苗粒度為0. 9微米左右。
[0090] 對照組
[0091] 按照實施例8所述制備方法，分兩批對市售含甘露醇酯的佐劑采用同樣抗原進行 乳化，制備疫苗，分裝后待檢驗，得實驗編號為201301057A和201301133B的口蹄疫疫苗。
[0092] 市售佐劑所制備的口蹄疫疫苗在2~8°C中放置一年穩(wěn)定，在37°C中放置7天未 見破乳，但在14天后已破乳，經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘未見出油出水，疫苗粒度為1. 5微 米左右。
[0093] 與現(xiàn)有市售佐劑相比，在同樣乳化工藝條件下，本發(fā)明提供的佐劑制備疫苗具有 較小的粒度，可有效的增加吸附面積，因此在不增加佐劑濃度的情況下，具有更大的抗原結(jié) 合面積，這些細小油滴能夠通過淋巴系統(tǒng)被更有效的分散，能有效減少注射部位的組織反 應(yīng)。同時這些細小油滴比現(xiàn)有佐劑能夠讓更多的全細胞抗原被吸附，有更多的抗原被逞遞 到免疫系統(tǒng)，具有良好的靶向性和可控性，所以免疫后動物能產(chǎn)生更強的免疫應(yīng)答，同時均 勻微小的油滴可提供疫苗體系出色的穩(wěn)定性。相對而言由于形成了微小油滴的懸浮液，與 常規(guī)連續(xù)油相不同，這樣微小的油滴可減少疫苗對注射部位的刺激性。
[0094] 由于本發(fā)明所采用的乳化劑種類是由天然植物提取物合成，在動物的代謝過程中 可被分解參與代謝被動物利用，具有高度的安全性。由于其具有良好的生物相容性，注射后 可以避免組織炎性反應(yīng)，有效避免動物的副反應(yīng)。如下動物試驗也證實了本發(fā)明這些的優(yōu) 點。
[0095] 試驗例1動物安全性檢驗
[0096] 實驗對象：
[0097] 實驗組1 :按本發(fā)明實施例5配方，以實施例7給出的制備方法制備佐劑，以該佐 劑按實施例8所述方法制備的口蹄疫疫苗；
[0098] 實驗組2 :按本發(fā)明實施例2配方，以實施例7給出的制備方法制備佐劑，以該佐 劑按實施例8所述方法制備的口蹄疫疫苗；
[0099] 對照組1 :實驗編號為201301057A的口蹄疫疫苗；
[0100] 對照組2 :實驗編號為201301133B的口蹄疫疫苗。
[0101] 實驗方法：
[0102] 采用30-40日齡仔豬，經(jīng)乳鼠中和試驗測定無口蹄疫中和抗體，分本發(fā)明所提供 佐劑和市售佐劑兩組共四頭，各兩側(cè)耳根后肌肉注射兩倍劑量疫苗，逐日觀察2日，未觀察 到異常臨床反應(yīng)，飲食飲水正常。當(dāng)日每隔兩小時記錄體溫變化，當(dāng)日記錄六次，第二日早 晚各記錄一次體溫。結(jié)果如表1(單位為攝氏度）：
[0103] 表 1
[0104]

[0105] 表1的結(jié)果表明，在記錄期內(nèi)市售佐劑的點體溫變化超過基礎(chǔ)體溫0. 5°C的點要 多于本發(fā)明所提供的佐劑，證明本發(fā)明所提供的佐劑較現(xiàn)有佐劑對動物的應(yīng)急反應(yīng)較小。
[0106] 試驗例2動物免疫效力檢驗
[0107] 按照規(guī)程要求進行動物免疫：
[0108] 實驗對象：
[0109] 實驗組：按本發(fā)明實施例5配方，以實施例7給出的制備方法制備佐劑，以該佐劑 制備的口蹄疫疫苗；
[0110] 對照組：實驗編號為201301057A的口蹄疫疫苗（市售佐劑疫苗組）；
[0111] 空白對照組：不注射任何疫苗。
[0112] 實驗方法：
[0113] 體重40kg左右架子豬，經(jīng)乳鼠中和試驗測定無口蹄疫中和抗體，共三組13頭，分 別注射待檢新型疫苗（實驗組）1頭份/頭，共5頭；市售佐劑疫苗組（對照組）5頭，分別 注射1頭份/頭；設(shè)空白對照組3頭。接種28日后攻毒，本發(fā)明所提供佐劑疫苗組，市售 佐劑疫苗組和空白對照組均進行攻毒，每頭豬耳根后肌肉注射豬口蹄疫Ozk/93病毒強毒 1000ID50。記錄各組豬只臨床癥狀，連續(xù)觀察14日，觀察疫苗保護率。數(shù)據(jù)如下：
[0114] 實驗結(jié)果：實驗組及對照組動物實驗均為5/5保護，保護率100%，空白對照組3/3 發(fā)病。
[0115] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑，其特征在于：按重量份計，包括如下組分： 注射用油 60 ~ 95份 乳化劑A 0.1 ~2：0# 乳化劑B 0.1 ~ 3.0份 助乳化刻 Θ~5份； 所述乳化劑Α為一種或多種多元糖的脂肪酸酯； 所述乳化劑B為一種或多種聚甘油酯脂肪酸酯； 所述助乳化劑為直鏈或有支鏈的脂肪酸或脂肪醇。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑，其特征在于，按重量份 計，包括如下組分： 注射用油 77-91# 乳化劑A 1 ~ 12份 乳化劑B 3~20份 助乳化劑 Γ~1.5#β3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑，其特征在于，按重量份 計，包括如下組分： 注射用油 77 ~ 85份 乳化劑A 2 - 10# 乳化劑B 4~8份 助乳化劑 份。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑，其特征在于， 所述注射用油選自一種或多種礦物油，優(yōu)選白油、MARC0L 52及S0NNEB0RN 40oil的一種或 兩種。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑，其特征在于， 所述乳化劑A為山梨醇單油酸酯，山梨醇雙油酸酯，山梨醇三油酸酯，山梨醇單月桂酸酯， 山梨醇雙月桂酸酯，山梨醇三月桂酸酯，山梨醇單硬脂酸酯，山梨醇單硬脂酸酯，麥芽糖醇 油酸酯，蔗糖油酸酯等中一種或多種的混合物，優(yōu)選山梨醇單油酸酯、山梨醇單月桂酸酯、 山梨醇單硬脂酸酯及蔗糖油酸酯。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑，其特征在于， 所述乳化劑B中，聚甘油酯中聚甘油選自二聚甘油，三聚甘油，四聚甘油，五聚甘油，六聚甘 油，七聚甘油，八聚甘油，九聚甘油，十聚甘油，十一聚甘油，十二聚甘油中的一種或多種的 混合物；所述脂肪酸酯中脂肪酸選自硬脂酸、異硬脂酸、軟脂酸、油酸、亞油酸、月桂酸、蓖麻 醇酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、乙酸，酒石酸。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑，其特征在于，所述乳化 劑B選自二聚甘油硬脂酸酯，三聚甘油單硬脂酸酯，三聚甘油二硬脂酸酯，三聚甘油單異硬 脂酸酯，三聚甘油二異硬脂酸酯，三聚甘油單軟脂酸酯，三聚甘油三油酸酯，四聚甘油三硬 脂酸酯，四聚甘油五硬脂酸酯，四聚甘油異硬脂酸酯，五聚甘油單硬脂酸酯，六聚甘油單月 桂酸酯，六聚甘油單油酸酯，十聚甘油雙棕櫚酸酯，十聚甘油十油酸酯，十聚甘油單異硬脂 酸酯，十聚甘油二異硬脂酸酯，聚甘油辛癸酸酯，二乙酰酒石酸雙甘油酯，聚甘油乙酸酯中 的一種或多種，優(yōu)選三聚甘油單硬脂酸酯、六聚甘油單月桂酸酯、十聚甘油單異硬脂酸酯、 六聚甘油單油酸酯和三聚甘油三油酸酯。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑，其特征在于， 所述助乳化劑為直鏈或有支鏈的脂肪酸或脂肪醇，碳鏈長度為5-22 ;優(yōu)選所述脂肪酸選自 硬脂酸、異硬脂酸、軟脂酸、油酸、亞油酸、月桂酸、蓖麻醇酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、琥珀酸中 的一種或多種；優(yōu)選所述脂肪醇選自 PEG100, PEG200, PEG400, PEG600，PEG800, PEG1000， PEG2000,正辛醇，正壬醇，正癸醇，十一烷醇，十二烷醇，十四烷醇，十八烷醇，二十烷醇， 二十二醇中的一種或幾種的混合物；更優(yōu)選所述助乳化劑為硬脂酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、月 桂醇、鯨蠟醇、十八烷醇中的一種或幾種。9. 包含權(quán)利要求1-8任一項所述的不含聚氧乙烯基乳化劑的疫苗佐劑的動物疫苗。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的動物疫苗，其特征在于：所述動物疫苗為禽流感、新城疫、口 蹄疫、豬圓環(huán)病毒疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征疫苗，豬偽狂犬疫苗及牛流行熱滅活疫苗。
【文檔編號】A61P37/02GK105854014SQ201510033634
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月22日
【發(fā)明人】潘京學(xué), 潘春剛, 王賀民, 黃文強, 馬愛榮, 彭正啟
【申請人】中牧實業(yè)股份有限公司