一種治療β-地中海貧血的試劑及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種治療β?地中海貧血的試劑及其應(yīng)用，所述的試劑通過降低miR?144/451基因的表達(dá)水平或miR?144/451量的來治療β?地中海貧血。本發(fā)明構(gòu)建miR?144/451基因敲除β?地貧鼠模型，將β?珠蛋白基因敲除的β?地中海貧血鼠和miR?144/451基因敲除鼠通過遺傳學(xué)培植方法，基因型鑒定得到的miR?144/451基因敲除的β?地貧鼠模型，該類β?地中海貧血小鼠的貧血由重度改為輕度，全血細(xì)胞分析提示紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及血紅蛋白水平明顯增高，脾臟體積減小，小鼠紅細(xì)胞形態(tài)大小均勻，說明小鼠貧血癥狀明顯改善，miR?144/451基因敲除的β?地貧鼠為研究貧血改善的分子機(jī)制提供可靠的體內(nèi)模型。利用降低β?地中海貧血血細(xì)胞中的miR?144/451的方法治療β?地中海貧血具有潛在的巨大經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
【專利說明】
一種治療卜地中海貧血的試劑及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種治療人類地中海貧血的試劑 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類地中海貧血是由0珠蛋白基因突變引起的遺傳性疾病，為人類最常見的單 基因遺傳病，主要分布在地中海地區(qū)、中非洲、亞洲、南太平洋地區(qū)以及中國南方地區(qū)，在我 國，廣東、廣西、海南、澳門及香港五省區(qū)為高發(fā)區(qū)。目前已發(fā)現(xiàn)的地貧的突變達(dá)200多種。 流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球目前有0珠蛋白突變基因攜帶者超過7500萬，2009年廣西壯族自治 區(qū)婦幼衛(wèi)生監(jiān)測到重癥地貧發(fā)生率為2.58%。0_地中海貧血的發(fā)病機(jī)制是由于0珠蛋白 基因突變引起0珠蛋白肽鏈合成減少或完全缺如，造成與其匹配的a鏈相對(duì)過剩，過剩的a鏈 在紅細(xì)胞膜上沉淀形成包涵體，最終導(dǎo)致紅細(xì)胞前體細(xì)胞凋亡增加等引起嚴(yán)重慢性溶血性 貧血。
[0003] 臨床上地貧分輕、中、重三種。輕、中型無癥狀或癥狀較輕。重癥地貧又稱Cooley 貧血，生長發(fā)育遲緩，頭顱變形呈典型性"地中海貧血貌"，肝脾因代償性造血呈進(jìn)行性腫 大，血常規(guī)及紅細(xì)胞形態(tài)異常，基因檢測可鑒定珠蛋白的點(diǎn)突變或缺失。目前，定期輸血 及口服鐵螯合劑作為地中海貧血的常規(guī)治療，臨床應(yīng)用廣泛。但長期輸血及也中海貧血 疾病本身均導(dǎo)致腸道鐵吸收增加形成鐵負(fù)荷過重，心肌、肝、胰、腦等實(shí)質(zhì)性臟器的鐵沉積 以及繼發(fā)感染均可引起相關(guān)臟器的功能障礙及衰竭，最終威脅患者生命。骨髓移植及異體 造血干細(xì)胞移是一種治療地貧的有效方法，可達(dá)到完全治愈效果。但由于對(duì)配子要求高， 成功率低，術(shù)后需長期抗免疫治療，毒副作用大，加上昂貴費(fèi)用，限制了多數(shù)患者尤其是發(fā) 展中國家及貧困地區(qū)患者的移植治療。
[0004] 近年來應(yīng)用慢病毒載體在患者體內(nèi)導(dǎo)入正常的0珠蛋白基因或糾正P珠蛋白突變 基因的治療取得很大進(jìn)展，研究已表明0珠蛋白基因組控制區(qū)域⑴-LCR)調(diào)控異常和該基因 的突變均可引起0珠蛋白合成障礙，特異性影響血紅蛋白的生成。通過導(dǎo)入正常P珠蛋白基 因、啟動(dòng)子或促進(jìn)0-LCR功能均可促進(jìn)0珠蛋白的表達(dá)，起到改善M也中海貧血的作用。 Cavazzana等研究運(yùn)用病毒載體將正常0珠蛋白基因?qū)胫匕Y跖/執(zhí))成年地中海貧血，激活 紅系細(xì)胞中高迀移率族蛋白A2(HMGA2)轉(zhuǎn)錄，提高y珠蛋白表達(dá)，血紅蛋白水平維持在9-10 克/分升，約1/3的血紅蛋白由病毒載體編碼的珠蛋白基因所產(chǎn)生。諸如此類將0珠蛋白基 因通過不同途徑轉(zhuǎn)入造血細(xì)胞祖細(xì)胞后，使得動(dòng)物模型或患者體內(nèi)0珠蛋白表達(dá)升高的報(bào) 道較多，可改善貧血，但由于此類技術(shù)需要病毒載體轉(zhuǎn)入患者基因組中，可能導(dǎo)致患者體 內(nèi)基因突變誘發(fā)腫瘤，且在如何選擇導(dǎo)入備選的造血干細(xì)胞上存在困難，相關(guān)病毒載體的 穩(wěn)定性欠佳，導(dǎo)入0基因的干細(xì)胞在患者體內(nèi)是否能長期存活等原因，限制了該類技術(shù)方法 進(jìn)一步臨床應(yīng)用。
[0005] 人類0樣珠蛋白基因座包含有e、y、5和0珠蛋白基因。e、y珠蛋白基因分別在胚胎 早期造血組織卵黃囊及造血肝組織中呈高表達(dá)。伴隨胎兒的發(fā)育成熟，e、y珠蛋白基因表 達(dá)沉默，0珠蛋白表達(dá)增加，由血紅蛋白A(HbA)逐漸替代胎兒血紅蛋白（HbF)。目前研究已證 實(shí)發(fā)現(xiàn)創(chuàng)也中海貧血嬰兒在出生3至6月內(nèi)無明顯貧血，直至3至6月后y珠蛋白合成減少時(shí) 貧血明顯，并證實(shí)提高HbF的合成可改善0地中海貧血。也有研究提示也中海貧血患者紅細(xì) 胞中HbF水平與患者的貧血程度呈負(fù)相關(guān)，未經(jīng)輸血及HbF誘導(dǎo)治療的中間型0地中海貧血 患者，HbF水平與患者總血紅蛋白水平呈正相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明促進(jìn)HbF表達(dá)可達(dá)到 有效治療0地中海貧血的作用。目前誘導(dǎo)HbF治療主要包括y -珠蛋白的藥物誘導(dǎo)治療、y -珠蛋白基因再激活這兩個(gè)方面，藥物誘導(dǎo)治療存在或多或少的毒副作用，目前對(duì)其安全性 一直存在爭議，例如其中的羥基脲對(duì)生育能力存在影響，且有導(dǎo)致惡性腫瘤形成的可能性。 珠蛋白基因再激活同樣存在誘導(dǎo)基因突變誘發(fā)腫瘤等。因此，此類HbF誘導(dǎo)治療由于治 療效果的不確切性，治療費(fèi)用較高，其臨床應(yīng)用有效數(shù)據(jù)有限，限制了該類藥物的應(yīng)用。
[0006] 近十余年以來，micr〇RNA(miRNA)-直是分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，目前已發(fā)現(xiàn) miRNAs是一類由非蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄物形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體，經(jīng)酶剪切成熟后形成的長度為 18~25個(gè)核苷酸的小RNA分子。miRNAs可以在轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)控真核生物的基因表達(dá)，其 通過不完全的堿基互補(bǔ)，作用于特異性靶基因，形成強(qiáng)大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致靶基因穩(wěn)定性降 低或表達(dá)減少，在各種細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化以及細(xì)胞死亡等過程中起到舉足輕重的作 用。在紅細(xì)胞生成方面充分證據(jù)表明，miRNAs對(duì)紅細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中發(fā) 現(xiàn)miR-144/451在紅細(xì)胞發(fā)育及珠蛋白合成中有重要作用。miR-144和miR-451是一個(gè)雙順 反子miRNA基因位點(diǎn)，兩者相距約100個(gè)堿基，該基因簇共享相同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控啟動(dòng)子，在成熟 紅細(xì)胞表達(dá)最多。RNA測序研究表明，后期紅細(xì)胞總miRNA池中miR-451的表達(dá)占據(jù)約50%。 我們的體內(nèi)模型證實(shí)miR-144/451在紅細(xì)胞發(fā)育成熟中起到重要作用。miR-144/451表達(dá)紊 亂會(huì)引起相應(yīng)的紅細(xì)胞疾病。
[0007] 地中海貧血患者的生存質(zhì)量差，平均壽命短，為家庭、社會(huì)均造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)，如 何早期診斷，探索有效的治療方法，對(duì)整個(gè)人類具有重要價(jià)值。因此研究和開發(fā)相對(duì)安全的 靶向治療藥物成為地中海貧血治療的一個(gè)方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種治療地中海貧血的方法，通過降低miR-144/451 基因的表達(dá)水平或減少有功能的成熟 miR-144/451 的量的方法，改善 e-地中海貧血 的貧血癥狀。
[0009] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明實(shí)施例公開了一種治療地中海貧血的方法，包 括:通過最終降低紅細(xì)胞中miR-144/451基因的表達(dá)水平或/和功能的方法，可以治療地 中海貧血。
[0010] 進(jìn)一步的，所述降低miR-144/451基因的表達(dá)水平的方法包括：降低miR-144和 miR-451成熟序列表達(dá)或/和功能的方法、調(diào)節(jié)前體或原始miR-144和miR-451RNA表達(dá)的方 法、調(diào)節(jié)miR-144/451基因調(diào)控以降低成熟miR-144/451表達(dá)的方法、改變miR-144，miR-451 調(diào)控的分子生物途徑來改變miR-144/451表達(dá)和功能的方法。
[0011] 進(jìn)一步的，所述降低miR-144/451基因的表達(dá)水平的方法包括:小核酸藥物、化學(xué) 藥物、生物遺傳學(xué)方法、基因治療(包括針對(duì)造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和多能誘導(dǎo)干細(xì)胞)和 基因敲除技術(shù)等方法。
[0012] 進(jìn)一步的，所述調(diào)節(jié)miR-144和miR-451前體或原始RNA表達(dá)的方法包括:改變啟動(dòng) 子序列和功能，改變Gata-1、KLF1等轉(zhuǎn)錄因子活性。
[0013] 進(jìn)一步的，所述降低miR-144和miR-451成熟序列表達(dá)或/和功能的方法為shRNA、 siRNA、RNAi、反義序列、LNA技術(shù)（Locked nucleicAcids)和Crispr_Cas9結(jié)合miR-144/451 序列抑制miR-144/451的成熟序列表達(dá)和功能。
[0014] 更進(jìn)一步的，一種根據(jù)本方法治療地中海貧血的實(shí)驗(yàn)方法，包括以下步驟： S1:準(zhǔn)備好相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑； S2:0-globin-/+和miR-144/451-/-基因敲除的雄性小鼠各兩只、C57/BL6雌性小鼠若 干只，通過繁殖得到大量的基因敲除地中海貧血鼠，miR-144/451基因敲除鼠和miR-144/ 451基因敲除的地貧鼠模型； S3:按照SPF(Specefic pathogen Free無特定病原體)級(jí)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)小鼠，濕度控制 在40%-70%，溫度控制在20-25°C，用已滅菌處理的飼料、墊料和飲水一周更換二到三次； S4:合籠方式為1只基因敲除的雄鼠和1-5只基因敲除的雌鼠交配進(jìn)行繁殖，發(fā)現(xiàn)雌鼠 有懷孕表現(xiàn)立即分籠生育，并及時(shí)記錄小鼠父母系來源； S5:小鼠DNA提取:取3周齡的小鼠尾部末端組織，大小約0.5cm，放入1.5ml EP管中，每 管加1 〇〇y 1 /95 °C裂解液，靜置20分鐘，冷卻后加入100y 1中和液混勻，取以上的含鼠DNA的上 清液用于PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))進(jìn)行小鼠基因型鑒定； S6:小鼠DNA的PCR。下列反應(yīng)物構(gòu)成20y 1的PCR反應(yīng)體系：鼠尾DNA2y 1、引物ly 1，DNA聚 合酶混合物l〇yl，雙蒸水7iil?；靹螂x心后置于PCR儀設(shè)定條件循環(huán)擴(kuò)增:預(yù)變性，95°C，5分 鐘;變性，95 °C，40秒;退火，60.5 °C，40秒;延伸，72 °C，1分鐘，循環(huán);72 °C，5分鐘； S7:進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳:取瓊脂糖粉末0.75g加入50ml的TAE電泳緩沖液中，微波爐中 加熱至沸騰，將溶解澄清的瓊脂物室溫冷卻至60°C加入Goldview 5yl或EB 3yr混勻，緩緩 倒入已置好梳子的膠板中，室溫放置30min待凝膠完全凝固后輕輕拔出梳子;將制備好的 1.5 %瓊脂糖凝膠放入電泳槽，加入1 xTAE溶液至高出凝膠表面;取PCR反應(yīng)終產(chǎn)物10y 1加樣 到膠孔中，電壓100V電泳，時(shí)間為30分鐘； S8:凝膠成像:電泳結(jié)束后，取出凝膠置于凝膠成像分析儀下拍照，小鼠電泳基因型片 段為地中海貧血小鼠鑒定是，一條大小為567bp(base pair，堿基）的條帶為野生型正常 鼠，一條大小為l〇〇〇bp的條帶為純合子地中海貧血小鼠；出現(xiàn)以上兩條條帶的為地中 海貧血雜合子;miR-144/451野生型小鼠為290bp;純合子 190bp; heterozygous (-/+) 250bp 和190bp。
[0015] 所述裂解液為0.5M EDTA40yl、10N Na0H5yl和100ml蒸餾水在PH為8時(shí)混合的混合 物;所述中和液為1M Tris-HC14ml和蒸鎦水定容至100ml的混合溶液;所述聚合酶混合物包 括:Taq DNA聚合酶，dNTPs，MgC12和反應(yīng)緩沖液。
[0016]依照本方法在降低miR-144/451基因表達(dá)治療地中海貧血中的應(yīng)用模型在貧血 研究中的應(yīng)用。
[0017]依照本方法在針對(duì)降低miR-144/451表達(dá)水平基因敲除地貧鼠模型治療貧血藥 物篩選中的應(yīng)用。
[0018]依照本方法在構(gòu)建得到所述的miR-144/451基因敲除地貧鼠模型。
[0019]相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為： 通過遺傳學(xué)培植的方法敲除地中海貧血模型小鼠體內(nèi)的miR-144/451后，檢測小鼠 外周血各項(xiàng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)地中海貧血模型小鼠由重度貧血轉(zhuǎn)為輕度貧血，表現(xiàn)為紅細(xì)胞計(jì) 數(shù)及血紅蛋白水平升高。且發(fā)現(xiàn)缺失表達(dá)miR-144/451的地中海貧血小鼠脾臟明顯減小， 由此確定降低miR-144/451的表達(dá)及功能可對(duì)地中海貧血啟動(dòng)治療作用。
【附圖說明】
[0020] 圖1是miR-144和miR-451在小鼠胚胎肝、骨髓及外周血中過表達(dá)； 圖2是不同基因型小鼠外周血紅細(xì)胞形態(tài)； 圖3是不同基因型小鼠脾臟形態(tài)及脾臟重量比較； 圖4是不同基因型小鼠鑒定凝膠電泳圖，左圖為miR-144/451基因型鑒定電泳圖，右圖 為0-het基因型鑒定電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以下實(shí)施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。 [0022]本實(shí)施例涉及的miR-144/451成熟序列、前體序列和原始序列如下： (1) 小鼠和人類的miR-144和miR-451成熟序列(完全保守)如下：
(2) miR-144/451成熟序列的反義核酸序列如下： miR-144-5p 成熟序列的反義序列：5 ' -ACTTACAGTATATGATGATATCC-3 ' miR-144-3p 成熟序列的反義序列：5 ' -AGTACATCATCTATACTGTA-3 ' miR-451a 成熟序列的反義序列：5 ' -AACTCAGTAATGGTAACGGITT-3 ' miR-451b 成熟序列的反義序列：5 '-ACGGTTCTCTTGCTGCTCCCA-3 ' (3) 小鼠miR-144和miR-451前體序列(precursor sequence)及反義序列如下：

(5)小鼠的miR-144和miR-451 的原始序列（primary sequence)如SEQ ID NO.l。 [0023] (6)小鼠的miR-144和miR-451的原始序列反向互補(bǔ)鏈序列SEQ ID NO.2。
[0024] (7)人類的miR-144和miR-451 的原始序列為SEQ ID NO.3。
[0025] (8)人類的miR-144和miR-451的原始序列反向互補(bǔ)鏈序列為SEQ ID NO.4。
[0026] (9)小鼠的miR-144和miR-451的啟動(dòng)子序列為SEQ ID NO.5。
[0027] (10)人類的miR-144和miR-451 的啟動(dòng)子序列為SEQ ID NO.6。
[0028] (11)小鼠的miR-144和miR-451上游序列中g(shù)ata-1綁定位點(diǎn)序列為SEQ ID N0.7。
[0029] -種根據(jù)本方法治療地中海貧血的實(shí)驗(yàn)方法，包括以下步驟： S1:準(zhǔn)備好相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑 (1)本實(shí)施例涉及的實(shí)驗(yàn)試劑如下表所示：

(2)本實(shí)施例涉及的主要自配試劑如下表所示：

⑶本實(shí)施例中應(yīng)用到的PCR引物： (3.1)實(shí)時(shí)熒光定量PCR用引物： miR-144 上游引物5 ' -GGATATCATCATATACTGTAAGT-3 miR-451 上游引物5 ' -AAACCGTTACCATTACTGAGIT-3 ' 下游引物為GeneCopoeia公司All-in-One miRNAqRT-PCRDetection Kit中的通用引 物。
[0030] 3.2)基因型鑒定引物： miR451 上游引物：5 ' -TTCTGCCTGTAACTCTGGATCCCTAAGAGA miR451 下游引物-1:5 '-GGGTACCCAGACTAGTACATCATCTATA miR451 下游引物-2:5 ' -ATCCCCTCGAGGGACCTAATAACTTC (3.3 )0_地中海貧血小鼠鑒定引物序列： Thai 上游-1:5 '-GCTTTCCAGCAGGCACTAAC-3 ' Tha 1 下游-1:5 ' -AGGAGGAGGGGAAGCTGATA-3 ' Thai 上游-2:5 '-GGCAAAGGATGTGATACGTGGAAG-3 ' Thai 下游-2:5 '-CCAGTTTCACTAATGACACAAACATG-3 ' S2:揚(yáng)州大學(xué)非編碼RNA中心由美國賓夕法尼亞大學(xué)附屬費(fèi)城兒童醫(yī)院引進(jìn)0-globin-/+和miR-144/451-/-基因敲除雄性小鼠各兩只，揚(yáng)州大學(xué)比較中心C57/BL6雌性小 鼠若干只，目前已繁殖得到大量的基因敲除地中海貧血鼠，miR-144/451基因敲除鼠和 miR-144/451 基因敲除的地貧鼠模型參見：l，Yu D，dos Santos C 0，Zhao G，et al.miR-451protects against erythroid oxidant stress by repressing 14-3-3^[J].Genes& development,2010,24(15):1620-1633.2,Yang B,Kirby S,Lewis J,et al.l995.A mouse model for beta〇-thalassemia.Proc Natl Acad Sci U S A.1995,92(25):11608-11612. 上述兩篇參考文獻(xiàn)的內(nèi)容全文并入本申請(qǐng)說明書并作為說明書的一部分可以作為后續(xù)程 序的修改依據(jù)，文獻(xiàn)中所使用的試劑也作為本申請(qǐng)所使用的試劑被全文并入。 S3:按照SPF(Specific pathogen Free無特定病原體)級(jí)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)小鼠。濕度控制 在40%-70%，溫度控制在20-25°C，用已滅菌處理的飼料、墊料和飲水一周更換二到三次。 S4:合籠方式為1只基因敲除的雄鼠和1-5只基因敲除的雌鼠交配進(jìn)行繁殖，發(fā)現(xiàn)雌鼠 有懷孕表現(xiàn)如陰栓或腹部呈梨形立即分籠生育并及時(shí)記錄小鼠父母系來源。 S5:小鼠DNA提取:取3周齡的小鼠尾部末端組織，大小約0.5cm，放入1.5ml EP管中，每 管加l〇〇yl裂解液，95°C 20min。冷卻后加入100yl中和液，混勻，取以上的含鼠DNA的上清液 用于PCR進(jìn)行小鼠基因型鑒定。
[0034] S6 :小鼠DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR):引物由上海生工生物工程有限公司提供。 PCR反應(yīng)體系：下列反應(yīng)物構(gòu)成20yl的反應(yīng)體系。鼠尾DNA2yl，引物(20wnol)yl，DNA聚合酶 混合物(Taq DNA聚合酶，dNTPs，MgC12和反應(yīng)緩沖液）10yl，雙蒸水7yl?；靹螂x心后置于PCR 儀設(shè)定條件循環(huán)擴(kuò)增:預(yù)變性，95 °C，5分鐘;變性，95 °C，40秒;退火，60.5 °C，40秒;延伸，72 °C，1分鐘;循環(huán);72°C，5分鐘。
[0035] S7:進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳:取瓊脂糖粉末0.75g加入50ml的TAE電泳緩沖液中，微波 爐中加熱至沸騰，將溶解澄清的瓊脂物室溫冷卻至60°C加入Goldview 5y 1或EB 3yr混勻， 緩緩倒入已置好梳子的膠板中，室溫放置30min待凝膠完全凝固后輕輕拔出梳子。將制備好 的1.5 %瓊脂糖凝膠放入電泳槽，加入1 xTAE溶液至高出凝膠表面。取PCR反應(yīng)終產(chǎn)物10y 1加 樣到膠孔中。電壓100V電泳，時(shí)間為30分鐘。
[0036] S8:凝膠成像：電泳結(jié)束后，取出凝膠置于凝膠成像分析儀下拍照，小鼠電泳基因 型片段為地中海貧血小鼠鑒定是，一條大小為567bp(base pair，堿基)的條帶為野生型 正常鼠，一條大小為l〇〇〇bp的條帶為純合子地中海貧血小鼠；出現(xiàn)以上兩條條帶的為0-地中海貧血雜合子。miR-144/451野生型小鼠為290bp;純合子190bp; heterozygous (-/+) 250bp和190bp。
[0037] 實(shí)施例1 如圖1所示，A:小鼠懷孕期為20天，胚胎肝是哺乳動(dòng)物胚胎期的造血器官。我們在芯片 資料中發(fā)現(xiàn)，14.5天的胚胎肝紅細(xì)胞中，P-het (地中海貧血雜合子。注:地中海貧血純 合子為胚胎致死，無法出生）的miR-451比wt (wi Id type，野生型）鼠表達(dá)高出50 - 80 % (p〈 0.01) ;B:比較0-het小鼠及wt小鼠外周血中miR-144和miR-451的表達(dá)，提示0-het時(shí)外周血 中的miR-144和miR-451表達(dá)均顯著性上調(diào)(p〈0.01); C:比較0-het小鼠骨髓中網(wǎng)織紅細(xì)胞 及有核紅細(xì)胞的miR-144和miR-451表達(dá)，提示f3-het時(shí)骨髓Retie(網(wǎng)織紅細(xì)胞)及NRBC(有 核紅細(xì)胞）中的miR-144/451表達(dá)量均顯著上調(diào)(p〈0.01)。
[0038] 實(shí)施例2 不同基因型小鼠外周血各項(xiàng)指標(biāo)比較如下表所示：
取小鼠外周血后，全血細(xì)胞分析儀檢測外周血各項(xiàng)指標(biāo)，與wt小鼠比較發(fā)現(xiàn)，mko小鼠 外周血中血紅蛋白（Hb)顯著降低，紅細(xì)胞分布寬度(RDW)增加，提示紅細(xì)胞大小不均勻，輕 度貧血。此et小鼠為重度貧血，紅細(xì)胞(RBC)、Hb、紅細(xì)胞壓積(HCT)均顯著下降，RDW升高，提 示紅細(xì)胞大小不均一，通過遺傳學(xué)方法去除Phet小鼠體內(nèi)的miR-144/451后，得到的mko/0 het小鼠的RBC、Hb和HCT各項(xiàng)指標(biāo)顯著升高，提示貧血改善，跟此et比較，RDW下降，提示紅細(xì) 胞大小均一。
[0039] 實(shí)施例3 如圖2所示，取不同基因型小鼠外周血，血涂片后進(jìn)行瑞士吉姆薩染色，中性樹膠封片 后顯微鏡觀察，wt小鼠外周血紅細(xì)胞成雙凹圓盤狀，形態(tài)大小均一;0-het小鼠外周形態(tài)大 小不一，可見靶形紅細(xì)胞，網(wǎng)織紅細(xì)胞增多；而mko/Phet小鼠外周血形態(tài)跟P-het比較發(fā)現(xiàn)， 中心淡染區(qū)明顯減少，無靶形紅細(xì)胞數(shù)減少，紅細(xì)胞形態(tài)大小較均一，提示貧血改善。
[0040] 實(shí)施例4 如圖3所示，成年哺乳動(dòng)物主要由骨髓造血，貧血時(shí)，包括脾臟在內(nèi)的髓外器官可代償 性造血，導(dǎo)致髓外器官體積變大。取成年8周的wt、mko、0-het和mko/0het四組不同基因型小 鼠脾臟，比較脾臟形態(tài)大小(A圖）和重量(B圖）。結(jié)果顯示，和wt相比，miR-144/451敲除鼠 (B)的脾臟平均增大0.5到1倍，提示輕度貧血。但地貧鼠（C)脾臟增大特別明顯，平均增大 6倍，說明重度貧血。但和miR-144/451敲除鼠雜交后，即去除地貧鼠中miR-144/451后，雜 交的地貧鼠(D)脾臟增大只有1.5倍，說明代償性造血明顯下降，貧血明顯減輕。
[0041 ] 實(shí)施例5 如圖4所示小鼠基因型鑒定凝膠電泳圖，左圖是miR-144/451基因敲除小鼠雜交后的基 因型鑒定條帶，0為電泳marker，泳道1、2和10為正常小鼠，大小為290堿基（base pair， bp)，電泳道3、8和9為miR-144/451雜合子小鼠，電泳道4到7,大小為156bp，為miR-144/451 敲除純合子小鼠。右圖為地中海貧血小鼠基因型降低電泳圖，其中〇為marker，電泳道1、 2、3、6和7為地中海貧血野生型，電泳道4和5為雜合子。
[0042]本發(fā)明所述的降低miR-144/451基因表達(dá)在治療地中海貧血中的應(yīng)用模型在貧 血研究中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0043]本發(fā)明所述的針對(duì)降低miR-144/451表達(dá)水平基因敲除地貧鼠模型在治療貧血 藥物篩選中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0044] 通過本發(fā)明方法構(gòu)建得到所述的miR-144/451基因敲除地貧鼠模型也在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0045] 以上示意性的對(duì)本發(fā)明及其實(shí)施方式進(jìn)行了描述，該描述沒有限制性，附圖中所 示的也只是本發(fā)明的實(shí)施方式之一，實(shí)際的結(jié)構(gòu)并不局限于此。所以，如果本領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員受其啟示，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造宗旨的情況下，不經(jīng)創(chuàng)造性的設(shè)計(jì)出與該技術(shù)方案 相似的結(jié)構(gòu)方式及實(shí)施例，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種治療β -地中海貧血的試劑，其特征在于：所述的試劑能夠降低紅細(xì)胞中m i R -144/451基因的表達(dá)水平或/和功能。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療β_地中海貧血的試劑，其特征在于：所述降低紅細(xì)胞中 miR-144/451基因的表達(dá)水平和/或功能的試劑包括:用于降低miR-144和miR-451成熟序列 表達(dá)或/和功能的方法、調(diào)節(jié)前體或原始miR-144和miR-451 RNA表達(dá)的方法、調(diào)節(jié)miR-144/ 451基因調(diào)控以降低成熟miR-144/451表達(dá)的方法、改變miR-144和miR-451調(diào)控的分子生物 途徑來改變miR-144/451表達(dá)和功能的試劑。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的治療β-地中海貧血的試劑，其特征在于:所述降低miR-144/ 451紅細(xì)胞中基因的表達(dá)水平和/或功能的試劑包括:小核酸藥物、化學(xué)藥物、生物遺傳學(xué)方 法、基因治療（包括針對(duì)造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和多能誘導(dǎo)干細(xì)胞）和/或能夠敲除miR-144/451基因的試劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的治療β-地中海貧血的試劑，其特征在于:所述調(diào)節(jié)miR-144和 miR-451基因調(diào)控以降低成熟miR-144/451表達(dá)的試劑包括:能夠改變啟動(dòng)子序列和功能， 改變Gata-1、KLF1等轉(zhuǎn)錄因子活性的試劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療β-地中海貧血的試劑，其特征在于:所述降低miR-144和 miR-451成熟序列表達(dá)或/和功能的試劑為shRNA、siRNA、RNAi、反義序列、LNA技術(shù)(Locked nucleic Acids)和Crispr_Cas9結(jié)合111丨1?-144/451序列抑制111丨1?-144/451的成熟序列表達(dá)和 功能。6. 權(quán)利要求5所述的治療β-地中海貧血的試劑，其特征在于所述的試劑包括:miR-144 上游引物5 ' -GGATATCATCATATACTGTAAGT-3 miR-451 上游引物5 ' -AAACCGTTACCATTACTGAGTT-3 ' 下游引物為GeneCopoeia公司All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit中的通用引 物。7. 權(quán)利要求5所述的試劑在制備治療β-地中海貧血藥物中的應(yīng)用。8. -種降低紅細(xì)胞中miR-144/451基因的表達(dá)水平或/和功能的方法，其特征在于:包 括以下步驟， S1:準(zhǔn)備好相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑； S2:0-globin-/+和miR-144/451-/-基因敲除的雄性小鼠各兩只、C57/BL6雌性小鼠若 干只，通過繁殖得到大量的基因敲除β-地中海貧血鼠，miR-144/451基因敲除鼠和miR-144/ 451基因敲除的β-地貧鼠模型； S3:按照SPF(Specefic pathogen Free無特定病原體)級(jí)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)小鼠，濕度控制 在40%-70%，溫度控制在20-25°C，用已滅菌處理的飼料、墊料和飲水一周更換二到三次； S4:合籠方式為1只基因敲除的雄鼠和1-5只基因敲除的雌鼠交配進(jìn)行繁殖，發(fā)現(xiàn)雌鼠 有懷孕表現(xiàn)立即分籠生育，并及時(shí)記錄小鼠父母系來源； S5:小鼠 DNA提取:取3周齡的小鼠尾部末端組織，大小約0.5cm，放入1.5ml EP管中，每 管加 l〇〇yl/95°C裂解液，靜置20分鐘，冷卻后加入100μΙ中和液混勻，取以上的含鼠 DNA的上 清液用于PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))進(jìn)行小鼠基因型鑒定； S6:小鼠 DNA的PCR:下列反應(yīng)物構(gòu)成20μ 1的PCR反應(yīng)體系：鼠尾DNA 2μ1、引物1 μ 1，DNA聚 合酶混合物1〇μ1，雙蒸水7μ1。9. 混勻離心后置于PCR儀設(shè)定條件循環(huán)擴(kuò)增:預(yù)變性，95°C，5分鐘;變性，95°C，40秒;退 火，60.5 °C，40秒;延伸，72 °C，1分鐘，循環(huán);72 °C，5分鐘； S7:進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳:取瓊脂糖粉末0.75g加入50ml的TAE電泳緩沖液中，微波爐中 加熱至沸騰，將溶解澄清的瓊脂物室溫冷卻至60°C加入Goldview 5μ1或ΕΒ 3μ1混勻，緩緩 倒入已置好梳子的膠板中，室溫放置30min待凝膠完全凝固后輕輕拔出梳子;將制備好的 1.5%瓊脂糖凝膠放入電泳槽，加入ΙχΤΑΕ溶液至高出凝膠表面;取PCR反應(yīng)終產(chǎn)物10μ1加樣 到膠孔中，電壓100V電泳，時(shí)間為30分鐘； S8:凝膠成像：電泳結(jié)束后，取出凝膠置于凝膠成像分析儀下拍照，小鼠電泳基因型片 段為:β-地中海貧血小鼠鑒定是，一條大小為567bp(base pair，堿基）的條帶為野生型正常 鼠，一條大小為l〇〇〇bp的條帶為純合子β-地中海貧血小鼠；出現(xiàn)以上兩條條帶的為β-地中 海貧血雜合子;miR-144/451野生型小鼠為290bp;純合子 190bp;heterozygous (_/+)250bp 和190bp。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的降低紅細(xì)胞中miR-144/451基因的表達(dá)水平或/和功能的方 法，其特征在于:所述裂解液為0.5M EDTA40yl、10N NaOH5yl和100ml蒸餾水在PH為8時(shí)混 合的混合物;所述中和液為1M Tris-HC14ml和蒸鍛水定容至100 ml的混合溶液;所述聚合 酶混合物包括:Taq DNA聚合酶，dNTPs，MgC12和反應(yīng)緩沖液。
【文檔編號(hào)】A61K49/00GK105854017SQ201610115449
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年3月1日
【發(fā)明人】郁多男, 李瑤瑤, 候亞穎, 鄧妮, 張艷青
【申請(qǐng)人】揚(yáng)州大學(xué)