以rgd為活性中心的多肽在制備抗抑郁靶向遞藥系統(tǒng)中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明屬生物藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及以RGD為活性中心的多肽其在制備治療抗抑郁靶向藥物中的用途，特別是所述的RGD為活性中心的多肽可作為靶頭構(gòu)建抗抑郁腦靶向遞藥系統(tǒng)。本發(fā)明所述的RGD肽是由精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸構(gòu)成的三肽序列(Arg-Gly-Asp)，以RGD三肽為活性中心的多肽包括五肽、七肽、環(huán)肽或擬肽化合物。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明以RGD為活性中心的線性肽及環(huán)狀肽修飾納米給藥系統(tǒng)，可顯著提高該系統(tǒng)在腦內(nèi)的藥物蓄積，具有明顯的腦靶向遞藥特征；應(yīng)用該系統(tǒng)包載抗抑郁，可明顯提三葉因子抗抑郁效果。
【專利說明】
以RGD為活性中心的多肽在制備抗抑郁靶向遞藥系統(tǒng)中的 用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬生物藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及以RGD為活性中心的多肽其在制備治療抗抑郁 靶向藥物中的用途，特別是所述的RGD為活性中心的多肽可作為靶頭構(gòu)建抗抑郁腦靶向遞 藥系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 研究顯示，抑郁癥是一種嚴(yán)重危及人類身心健康的情感障礙性精神疾病，其發(fā)病 率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)。抑郁癥狀多變、病因復(fù)雜，這給臨床治療帶來了巨大困難。抑郁癥 嚴(yán)重性的另外一些表現(xiàn)是自殺危險(xiǎn)性增加，以及對(duì)共病抑郁障礙的慢性軀體疾病病人愈 后和轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生消極影響。與其他嚴(yán)重疾病相比，抑郁癥給社會(huì)造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)是驚人的。 有效治療抑郁癥的歷史已有四十余年，現(xiàn)在臨床使用的抗抑郁藥主要有六大類構(gòu)成：?jiǎn)伟?氧化酶抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥、五羥色胺（5-HT)再攝取抑制劑、多巴胺再攝取抑制劑、選 擇性去甲腎上腺素（NA)再攝取抑制劑以及抗氧化劑。然而，由于血腦屏障（BBB)的存在，這 些藥物大多數(shù)難以跨過BBB而到達(dá)中樞發(fā)揮作用，導(dǎo)致藥物在臨床難以獲得理想的療效。 因此，如何為精神疾病治療藥物在臨床的應(yīng)用提供理想的遞藥系統(tǒng)，也是抗精神病藥物突 破瓶頸問題的關(guān)鍵。
[0003] 研究證實(shí)，在抑郁癥發(fā)病過程中，白細(xì)胞（主要為中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞）可在細(xì) 胞因子調(diào)控的趨化性作用下被激活，跨越BBB達(dá)到腦內(nèi)病變部位。在這一病理過程中，血循 環(huán)中的白細(xì)胞是關(guān)鍵：其在細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的趨化性作用下穿越BBB并到達(dá)缺血腦組織，那 么，如果能利用白細(xì)胞，使其攜帶載藥系統(tǒng)跨越BBB并到達(dá)腦內(nèi)缺血組織，則有利于構(gòu)建一 種十分理想的具有多級(jí)腦靶向功能的遞送系統(tǒng)應(yīng)用于抑郁癥的治療。
[0004] RGD肽（Arg-Gly-Asp)是由精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸構(gòu)成的三肽序列，為纖維 連接蛋白與其受體的特異性結(jié)合位點(diǎn)。RGD肽與整合素受體a V03具有高度親和力，而 a vP 3受體在腫瘤血管新生過程中的內(nèi)皮細(xì)胞上具有高度的表達(dá)，因此采用R⑶修飾的載 體或診斷試劑可應(yīng)用于腫瘤的治療及診斷。此外，以RGD三肽為活性中心，有研究合成了一 系列五肽、七肽、環(huán)肽或擬肽化合物，結(jié)果顯示環(huán)化肽在體內(nèi)具有更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和更強(qiáng)的活 性。
[0005] 事實(shí)上除a 3外，R⑶肽與整合素受體家族中a 1同樣具有高度的親和力。 迄今，尚未見有關(guān)RGD修飾的載體通過與a v M的高親和力與白細(xì)胞結(jié)合后，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn) 多級(jí)腦靶向目的報(bào)道。
[0006] 與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有：
[0007] [l]Nestler, E. J. and Carlezon, ff. A. , Jr. The mesolimbic dopamine reward circuit in depression. Biol Psychiatry, 2006 ；59 (12):1151-1159.
[0008] [2] Cascade, E. , Kalal i, A. H. and Kennedy, S. H. Real-fforld Data on SSRI Antidepressant Side Effects. Psychiatry(Edgmont), 2009 ；6(2):16-18.
[0009] [3]Huang R, Ke ff, Han L? et al. Targeted delivery of chlorotoxin-modified DNA-loaded nanoparticles to glioma via intravenous administration. Biomateria Is. 2011，32(9) :2399-2406.
[0010] [4]Bailey, M. T. , Kinsey, S. G. , Padgett, D. A. , Sheridan, J. F. , Leblebicioglu, B. , 2009.Social stress enhances IL-lbeta and TNF-alpha production by Porphyromonas gingival is lipopolysaccharide-stimulated CDllb+cells. Physiol. Behav. 98, 351-358.。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于提供以RGD為活性中心的多肽在制藥中的新用途，具體涉及以 RGD為活性中心的多肽在制備抗抑郁靶向遞藥系統(tǒng)中的用途。
[0012] 本發(fā)明基于a vP 1是在白細(xì)胞表面高度表達(dá)的整合素受體，因此RGD修飾的載體 可通過與a 1的高親和力與白細(xì)胞結(jié)合，然后在炎癥反應(yīng)過程中被白細(xì)胞攜帶通過BBB 并到達(dá)腦內(nèi)受損部位，實(shí)現(xiàn)多級(jí)腦靶向目的，本發(fā)明中，通過實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了以RGD為活性中 心的多肽可用于制備抗抑郁靶向遞藥系統(tǒng)中。
[0013] 本發(fā)明中，公開了以RGD為活性中心的多肽作為靶頭在構(gòu)建抗抑郁靶向遞藥系統(tǒng) 中的用途；
[0014] 其中，所述的多肽其特征為：以精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD)三肽序列為活性 中心的線性多肽、環(huán)肽或擬肽化合物；本發(fā)明的實(shí)施例中，優(yōu)選環(huán)狀RGD多肽；
[0015] 本發(fā)明中，所述的遞藥系統(tǒng)包括但不限定于：脂質(zhì)體、納米粒、磷脂復(fù)合物、微球、 聚合物、納米球、納米乳、自微乳、包合物等任何一種常見于臨床的劑型；
[0016] 本發(fā)明中，所述的RGD肽應(yīng)用于遞藥系統(tǒng)的方式包括但不限定為：與遞藥系統(tǒng)中 的任何一種常見的功能性材料偶聯(lián)；所述的功能性材料其特征為：一端含NHS活潑酯，一端 含巰基等任何一種常見的可與多肽發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)；本發(fā)明的實(shí)施例中，優(yōu)選的功能性材 料包括但不限定為：功能性磷脂、功能性膽固醇、功能性PEG、功能性聚合物、功能性膽固醇 等。
[0017] 本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)顯示，以RGD為活性中心的線性肽及環(huán)狀肽修飾納米給藥系統(tǒng)，可 顯著提高該系統(tǒng)在腦內(nèi)的藥物蓄積，具有明顯的腦靶向遞藥特征；進(jìn)一步采用該系統(tǒng)包載 抗抑郁，可明顯提三葉因子抗抑郁效果。
[0018] 下列結(jié)合附圖和具體的實(shí)施方案僅作為本發(fā)明的解釋，但絕不是對(duì)本發(fā)明的限 制。
【附圖說明】
[0019] 圖 1，DSPE-PEG-NHS (A)和 DSPE-PEG-cRGD (B) modi-toff 圖譜。
[0020] 圖2,裸鼠分別給予RGDL-Dir，cRGDL-Dir或PL-Dir后小動(dòng)物活體成像照片，其中， A:PL-Dir ；B:cRGDL-Dir ；C:RGDL-Dir
[0021] 圖3,四種不同制劑對(duì)大鼠強(qiáng)迫游泳及運(yùn)動(dòng)行為的影響。
[0022] 圖4,四種不同制劑對(duì)大鼠新環(huán)境進(jìn)食抑制的影響。
[0023] 圖5,強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0024] 圖6,大鼠嗅球損毀抑郁實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】 [0025] 實(shí)施例1
[0026] RGD與憐脂的偶聯(lián)：
[0027] 精密稱取適量RGD三肽（RGD，Arg-Gly-Asps)或五環(huán)肽（cR⑶， Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)和 DSPE-PEG-NHS(肽：DSPE-PEG-NHS = 2:1，molar ratio)， 分別溶解于少量無水無氨DMF中，攪拌至全部溶解。將肽溶液緩慢滴加至快速攪拌下 的DSPE-PEG-NHS溶液中，加入少量三乙胺調(diào)節(jié)pH至堿性，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 小時(shí)。葡聚糖凝膠將DSPE-PEG-cRGD與未反應(yīng)的小肽分離。然后將DSPE-PEG-cR⑶和 DSPE-PEG-NHS進(jìn)行modi-toff檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，DSPE-PEG-NHS的平 均分子量為4319，DSPE-PEG-R⑶的平均分子量為4632，DSPE-PEG-cR⑶的質(zhì)子峰向右迀移， 說明cR⑶肽已成功和DSPE-PEG-NHS偶聯(lián)；
[0028] 脂質(zhì)體的制備：
[0029] 稱取大豆磷脂100mg，A膽固醇20mg，依達(dá)拉奉（Edaravone, ER) 8mg， DSPE-PEG-cRGD或DSPE-PEG-RGD 2mol %置于250mL茄形瓶中，加入10mL氯仿溶解，室溫 旋蒸成膜。加入3mL無水乙醚，將磷脂膜復(fù)溶，再加入lmL蒸餾水，水浴超聲5min形成白 色的w/o乳劑。40°C旋蒸，抽去乙醚，形成粘稠透明凝膠后，補(bǔ)加9mL水，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)洗膜， 磁力攪拌lh，探頭超聲，得載藥ER-cRGD-L或ER-RGD-L。處方中不加入DSPE-PEG-RGD或 DSPE-PEG-cRGD，按上述方法制備得到熒光標(biāo)記的普通脂質(zhì)體（plain liposome，ER-PL);
[0030] 處方中加入將碘化1，1' -雙十八烷基3, 3, 3'，3' -四甲基吲三羰花青（Dir，Dir/ Cy5:磷脂 l:100mol/mol)，然后同上制備得 Dir 標(biāo)記的 cRGDL-Dir，RGD-Dir，PL-Dir ;
[0031] 脂質(zhì)體的評(píng)價(jià)：將制備的ER-cRGDL，ER-RGD-L及ER-PL適當(dāng)稀釋，以粒徑儀測(cè)其粒 度分布，透射電鏡觀察其形態(tài)，結(jié)果見表1。三種脂質(zhì)體包封率約為72%，載藥量約為5%， 平均粒徑120nm左右，Zeta電位約為-21mV，偶聯(lián)RGD或cR⑶對(duì)脂質(zhì)體理化性質(zhì)無顯著影 響；
[0032] 表1三種脂質(zhì)體理化性質(zhì)
[0034] 靶向性評(píng)價(jià)：將RGDL-Dir，cRGDL-Dir及PL-Dir給予IL-1 0致炎癥模型裸鼠，給 藥后分別于30, 40, 60, 90min及2, 3, 4, 12h進(jìn)行活體熒光測(cè)定，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明 與普通脂質(zhì)體相比，cRGD及RGD修飾的脂質(zhì)體均具有明顯的腦靶向作用，其中cRGDL-Dir腦 靶向作用明顯優(yōu)于RGDL-Dir ;
[0035] 藥效學(xué)評(píng)價(jià)：
[0036] 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)：正常大鼠12只，隨機(jī)分成四組，分別為對(duì)照組、ER溶液組（ERS)、 ER-PL組和ER-cRGD-L組。將大鼠單個(gè)放入于高65cm，直徑25cm，水深30cm，水溫23-25°C的 圓筒中強(qiáng)迫游泳15min (適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)）。吹干后放回籠內(nèi)，24h后，單次給予四種制劑。30min 后進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，游泳行為（大鼠在"泳池"內(nèi)水平面、四周游動(dòng)）、攀爬行為（大鼠在 "泳池"沿內(nèi)壁使用前爪向上攀爬）和不動(dòng)行為（大鼠除為避免沒入水中而主動(dòng)向上運(yùn)動(dòng)外 無其他行為）。記錄大鼠在5min內(nèi)不動(dòng)行為的時(shí)間，結(jié)果如圖3所示；
[0037] 運(yùn)動(dòng)分析實(shí)驗(yàn)：系統(tǒng)由8個(gè)一樣（40*40*65cm)有燈光和聲音控制的暗盒組成，每 個(gè)暗盒頂部都有一個(gè)攝像頭，所有的攝像頭和電腦連接記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)情況，通過軟件分 析小鼠的運(yùn)動(dòng)距離。共四組大鼠分別給予PBS、藥物溶液、ERLs、cRGD-ERLs，30min后，大鼠 進(jìn)行運(yùn)動(dòng)分析實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)用分析軟件分析，測(cè)定這段時(shí)間的運(yùn)動(dòng)距離，如圖3所示；
[0038] 如圖3a所示，ERS組和對(duì)照組比較，無顯著性差異，不能有效的減少大鼠不動(dòng)時(shí) 間。ER-PL組ER-cRGD-L組與PBS組、ERS組比較，不動(dòng)時(shí)間顯著減少，且ER-cRGD-L組較 ER-PL組效果更顯著，說明ER-PL及ER-cRGD-L均可增強(qiáng)ER治療作用，且靶向制劑效果最 佳，通過運(yùn)動(dòng)分析實(shí)驗(yàn)如圖3b，可知四組均無顯著性差異，說明四種制劑對(duì)大鼠的自主運(yùn)動(dòng) 無影響；
[0039] 新環(huán)境進(jìn)食抑制實(shí)驗(yàn)（Novelty suppressed feeding test, NSF):正常大鼠 12 只，隨機(jī)分成四組，分別為PBS組、ER溶液組（ERS)、ER-PL組和ER-cRGD-L組。試驗(yàn)前動(dòng)物 禁食24h，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，準(zhǔn)備長(zhǎng)、寬75cm、高40cm的試驗(yàn)箱，箱底中央放置糖丸或小塊食物于 10cm*10cm的白紙上。分別給予大鼠PBS、ERS、ER-PL和ER-cRGD-L給藥30min后，從任意 的箱角放大鼠入箱內(nèi)，通過攝像系統(tǒng)觀察l〇min，記錄大鼠的活動(dòng)量，同時(shí)計(jì)算由放入大鼠 到大鼠前肢抱起糖丸進(jìn)食的時(shí)間（latency)。大鼠的活動(dòng)量和進(jìn)食時(shí)間的長(zhǎng)短反應(yīng)了大鼠 的焦慮/抑郁程度，隨后將動(dòng)物放回籠中，同時(shí)記錄放回籠中前5min內(nèi)食物消耗量，以排除 cRGD-ERL對(duì)食欲和進(jìn)食時(shí)間的影響。結(jié)果如圖4所示；
[0040] 如圖4a所示，ERS組和對(duì)照組比較，無顯著性差異，不能有效的縮短latency時(shí)間， ER-PL組ER-cRGD-L組與對(duì)照組、ERS組比較，不動(dòng)時(shí)間顯著減少，且ER-cRGD-L組較ER-PL 組效果更顯著，說明ER-PL及ER-cRGD-L均能緩解大鼠的抑郁程度，且靶向制劑效果最佳。 通過考察大鼠放回籠內(nèi)前5min的進(jìn)食情況，如圖b所示；可以看出四組無顯著性差異，說明 四種制劑對(duì)大鼠的進(jìn)食量無影響，排除了 ER-cRGD-L對(duì)食欲和進(jìn)食時(shí)間的影響。
[0041] 實(shí)施例2
[0042] 按處方比例磷脂：膽固醇：cRGD-PEG-DSPE比為85:10:5(mol/mol/mol)稱取三種 樣品，其中磷脂濃度為5mg/mL，三葉因子（TFF3)脂藥比為20:1 (w/w)，置于50mL茄形瓶中， 加入3mL無水乙醚，室溫減壓旋轉(zhuǎn)蒸干成膜，加入3mL無水乙醚將磷脂膜復(fù)溶，再加入lmL TFF3的PBS(pH7. 40)水溶液，水浴超聲5min形成白色的w/o乳劑。40°C旋蒸，抽去乙醚， 形成粘稠透明凝膠直至凝膠崩塌，補(bǔ)加2mL蒸餾水，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)洗膜，磁力攪拌30min，探頭超 聲分散，得載有TFF3藥物的cRGD脂質(zhì)體（TFF3-CRGD-L)并以超濾法對(duì)其包封率進(jìn)行測(cè)定。 其中如不加入cRGD-PEG-DSPE，則制備普通脂質(zhì)體（TFF3-L)，兩種脂質(zhì)體理化性質(zhì)如表2所 示，包封率約為45%，平均粒徑約為130nm，Zeta電位-36mV左右。偶聯(lián)cRGD不影響脂質(zhì) 體理化性質(zhì)；
[0043] 表2兩種脂質(zhì)體理化性質(zhì)
[0045] 藥效學(xué)評(píng)價(jià)
[0046] 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)：正常大鼠12只，隨機(jī)分成四組，分別為PBS組、TFF3溶液組 (TFF3)、載TFF3普通脂質(zhì)體組（TFF3-L)組和載TFF3的cR⑶脂質(zhì)體組（TFF3-CRGD-L)，進(jìn) 行強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)。結(jié)果見圖5。單次給予TFF3溶液，能有效減少大鼠不動(dòng)時(shí)間，增加游泳和 攀爬時(shí)間，而不影響大鼠的自主運(yùn)動(dòng)。TFF3-L組及TFF3-CRGD-L組與PBS組、TFF3組比較， 不動(dòng)時(shí)間顯著減少，游泳和攀爬時(shí)間顯著增加，且TFF3-CRGD-L組較TFF3-L組效果更顯著， 說明TFF3-PL及TFF3-CRGD-L均可增強(qiáng)對(duì)抑郁癥的治療效果，且TFF3-CRGD-L效果最佳；
[0047] 大鼠嗅球損毀抑郁模型試驗(yàn)：正常大鼠12只，隨機(jī)分成四組，分別為PBS組、 TFF3溶液組（TFF3)、載TFF3普通脂質(zhì)體組（TFF3-L)組和載TFF3的cR⑶脂質(zhì)體組 (TFF3-CRGD-L)，進(jìn)行大鼠嗅球損毀抑郁模型及運(yùn)動(dòng)行為分析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見如圖6所示， 模型組與假手術(shù)組比較，大鼠的運(yùn)動(dòng)量明顯增加，TFF3組與模型組比較，無顯著性差異， TFF3-L組及TFF3-CRGD-L組與模型組比較，能顯著性的減少大鼠的運(yùn)動(dòng)量，且TFF3-CRGD-L 組較TFF3-L組效果更顯著，說明TFF3-L及TFF3-CRGD-L均可增強(qiáng)TFF3的治療作用，且 TFF3-CRGD-L效果最佳。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 以RGD為活性中心的多肽在制備抗抑郁靶向遞藥系統(tǒng)中的用途；所述的以RGD為活 性中心的多肽作為靶頭。2. 按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的多肽為：以精氨酸-甘氨酸-天冬氨 酸（RGD)三肽序列為活性中心的線性多肽、環(huán)肽或擬肽化合物。3. 按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的多肽為環(huán)狀RGD多肽。4. 按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的遞藥系統(tǒng)選自：脂質(zhì)體、納米粒、磷脂 復(fù)合物、微球、聚合物、納米球、納米乳、自微乳或包合物。5. 按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制備抗抑郁靶向遞藥系統(tǒng)中所述的 RGD肽以與遞藥系統(tǒng)中的功能性材料偶聯(lián)的方式用于制備抗抑郁靶向遞藥系統(tǒng)。6. 按權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的功能性材料為：一端含NHS活潑酯， 一端含巰基的可與多肽發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)。7. 按權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的功能性材料為功能性磷脂、功能性膽 固醇、功能性PEG、功能性聚合物或功能性膽固醇。
【文檔編號(hào)】A61K38/06GK105854024SQ201510024559
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2015年1月19日
【發(fā)明人】秦晶, 王建新, 楊旭, 侯佳, 朱維莉
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)