一種阿霉素前藥及其釋放度評(píng)價(jià)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種阿霉素前藥，同時(shí)公開了其釋放度的評(píng)價(jià)方法，該前藥為含有不同取代基團(tuán)的香豆素和阿霉素的偶聯(lián)產(chǎn)物；本發(fā)明的阿霉素前藥易于制備，成本低廉。該阿霉素前藥在水溶液釋放后可以同時(shí)發(fā)射兩個(gè)波段的熒光，能夠同時(shí)通過兩個(gè)不同波段的熒光強(qiáng)度的檢測(cè)評(píng)價(jià)該前藥的釋放效果；同時(shí)該前藥可通過綠色和紅色雙重?zé)晒獬上穹绞綄?duì)阿霉素前藥的釋放實(shí)現(xiàn)可視化測(cè)定，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種阿霉素前藥及其釋放度評(píng)價(jià)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種新型阿霉素前藥及其釋放度的評(píng)價(jià)方法，屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 以抗腫瘤藥物為主的化學(xué)療法依然是當(dāng)今治療癌癥的三大手段之一。抗腫瘤藥物 的優(yōu)點(diǎn)是能夠?qū)κ中g(shù)切除后殘余的腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞有殺傷作用。但是由于腫瘤 細(xì)胞和正常細(xì)胞沒有根本性的性狀與代謝差異，往往會(huì)導(dǎo)致抗腫瘤藥物也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞亦 有殺傷作用，帶來較大的副作用。因此，發(fā)展有效的藥物傳遞系統(tǒng)(Drug Delivery System, DDS)能夠用來監(jiān)測(cè)與控制抗腫瘤藥物在細(xì)胞內(nèi)的分布與釋放、提高藥物在腫瘤組織的富 集、增加藥物緩釋作用等提高抗腫瘤藥物的藥效，降低對(duì)正常組織的損傷。
[0003] 近年來，熒光成像技術(shù)因其能夠在不破壞樣品前提下，能夠在活細(xì)胞和活動(dòng)物體 內(nèi)實(shí)時(shí)原位追蹤各種生物分子和藥物分子而被廣泛使用。除此之外，熒光成像技術(shù)還具有 較高的靈敏度、響應(yīng)速度快、能進(jìn)行定量分析等優(yōu)點(diǎn)。這些都為熒光成像技術(shù)應(yīng)用到DDS中 奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0004] 采用熒光染料與抗腫瘤藥物偶聯(lián)構(gòu)成熒光前藥探針，一方面能夠?qū)崟r(shí)追蹤藥物在 細(xì)胞組織的內(nèi)外的分布與釋放;另一方面熒光與藥物是依據(jù)腫瘤微環(huán)境的特點(diǎn)而被激活分 別釋放熒光與藥物分子，能夠起到靶向緩釋作用，降低毒性。盡管目前已經(jīng)報(bào)道了多種有機(jī) 熒光前藥探針，但是還沒有應(yīng)用本身具有熒光性質(zhì)的抗腫瘤藥物阿霉素(Doxorubicine, D0X)與有機(jī)熒光染料構(gòu)成比率型熒光探針。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種阿霉素前藥，其能夠通過生物醫(yī)學(xué)成 像對(duì)阿霉素的釋放進(jìn)行可視化檢測(cè)。
[0006] 本發(fā)明所述的新型阿霉素前藥為香豆素和阿霉素的偶聯(lián)化合物:所述阿霉素前藥 的化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如式(I)所示：
式(I) 其中：R= H，命名為la;或R=C1，命名為2a;或R= CH3,命名為3a;或R= CH2CH3,命名為4a。
[0007] 本發(fā)明所述阿霉素前藥優(yōu)選的實(shí)施方式是:所述阿霉素前藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如式 (I)所示，其中:R= H。
[0008] 式（n) 本發(fā)明所述阿霉素前藥的制備方法為:將式（n)所示的化合物al (1 mmol)、a2 (1 mmol)、三乙胺（2.2 mmol)和二甲基亞砜（5 mL)加入到50 mL單口燒瓶中，室溫避光攪拌48 小時(shí)。使用制備液相將所得反應(yīng)液進(jìn)行純化，得到棕紅色產(chǎn)物即為本發(fā)明所述檢測(cè)阿霉素 前藥。
[0009] 本發(fā)明所述的阿霉素前藥具有優(yōu)良的緩釋效果，并通過組織成像對(duì)其緩釋效果進(jìn) 行可視化檢測(cè)。該阿霉素前藥具有羰基和氨基形成的亞胺結(jié)構(gòu)，可在水中水解，生成能夠發(fā) 射藍(lán)綠熒光的香豆素al和能夠發(fā)射紅色熒光的阿霉素a2。通過熒光分析法，確定這兩種熒 光的強(qiáng)度，即可檢測(cè)阿霉素的釋放度。
[0010] 具體測(cè)定方法為:室溫條件下，配制5 iiM阿霉素前藥的DMS0溶液，加入到具有不同 pH值的B-F緩沖液體系中，測(cè)定溶液熒光強(qiáng)度作為阿霉素釋放的評(píng)價(jià)指標(biāo)。
[0011] 本發(fā)明所述的阿霉素前藥盡管含有香豆素和阿霉素兩個(gè)熒光團(tuán)，但是由于結(jié)構(gòu)中 含有能夠自由旋轉(zhuǎn)的N-N單鍵，本身不具備熒光發(fā)射能力。在弱酸溶液中，阿霉素前藥的亞 胺結(jié)構(gòu)在酸的催化下發(fā)生水解，使得一分子阿霉素前藥釋放為一分子香豆素和一分子阿霉 素。所釋放的香豆素在水中可以發(fā)射強(qiáng)烈的藍(lán)綠色熒光，阿霉素可以發(fā)射強(qiáng)烈的紅色熒光。 阿霉素前藥在水中水解時(shí)，可以同時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)增強(qiáng)的熒光波段。因此，所設(shè)計(jì)的阿霉素前藥 在水中的水解過程可以通過檢測(cè)香豆素和阿霉素的熒光來評(píng)價(jià)。由于阿霉素前藥釋放的香 豆素和阿霉素比值恒定，在整個(gè)前藥釋放過程中，香豆素和阿霉素的熒光比值也恒定不變。 可采用熒光檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)阿霉素釋放的快速靈敏檢測(cè)；檢測(cè)條件為：激發(fā)波長為420 nm，在 430-750 nm之間進(jìn)行熒光發(fā)射光譜的檢測(cè)，其中450-520 nm波段內(nèi)的熒光來自于香豆素， 530-700 nm波段內(nèi)的熒光來自于阿霉素。這樣兩種熒光團(tuán)的相互作用關(guān)系的變化會(huì)直接表 明藥物的釋放，并且能夠依據(jù)彼此去定量分析；同時(shí)兩種熒光團(tuán)的相互作用關(guān)系能夠降低 細(xì)胞組織背景干擾，提高信噪比；最后兩者可斷裂的化學(xué)鍵偶聯(lián)后能夠影響阿霉素作用效 果，降低毒副作用。
[0012] 阿霉素前藥在生物成像應(yīng)用研究主要內(nèi)容有探針對(duì)活細(xì)胞的毒性、活細(xì)胞和活組 織熒光成像。采用MTT比色法，通過分析細(xì)胞在加入阿霉素前藥之后的存活率，討論阿霉素 前藥對(duì)細(xì)胞的毒性。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用本發(fā)明所述的阿霉素前藥對(duì)活細(xì)胞或活組織進(jìn)行檢 測(cè)，能夠?qū)υ摌悠分邪⒚顾蒯尫艑?shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)，達(dá)到阿霉素前藥的藥效評(píng)估目的。
[0013] 本發(fā)明的有益效果為： 本發(fā)明所述的阿霉素前藥可經(jīng)化學(xué)合成獲得，合成工藝簡單易行，原料廉價(jià)易得，制備 成本低，易于推廣。
[0014] 本發(fā)明所述的阿霉素前藥在水溶液釋放后可以發(fā)射兩個(gè)波段的熒光，能夠通過熒 光強(qiáng)度的檢測(cè)評(píng)價(jià)該前藥的釋放效果，同時(shí)可通過熒光成像對(duì)阿霉素前藥實(shí)現(xiàn)可視化測(cè) 定，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0015] 本發(fā)明所述的阿霉素前藥，具有良好的熒光發(fā)射光譜特性(450~750 nm)，通過繪 制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)阿霉素釋放速率，可以對(duì)阿霉素前藥在細(xì)胞或組織內(nèi)的釋 放實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的可視化檢測(cè)。
[0016]
【附圖說明】
[0017]圖1是阿霉素前藥la的1H NMR圖譜。
[0018] 圖2是阿霉素前藥la的13C NMR圖譜。
[0019] 圖3是阿霉素前藥la的HPLC圖譜。
[0020] 圖4是阿霉素前藥la在pH 4.5條件下不同時(shí)間的熒光光譜。
[0021] 圖5是阿霉素前藥la在pH 7.4條件下不同時(shí)間的熒光光譜。
[0022]圖6是阿霉素前藥la組織中釋放lh和3h的熒光成像。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明保護(hù)內(nèi)容不僅限于此。
[0024] 實(shí)施例1:本發(fā)明所述阿霉素前藥la的制備 將式（11)所示的化合物&1(11111]1〇1)、32(11111]1〇1)、三乙胺(2.2 1]11]1〇1)和二甲基亞砜 (5 mL)加入到50 mL單口燒瓶中，室溫避光攪拌48小時(shí)。使用制備液相將所得反應(yīng)液進(jìn)行純 化，得到棕紅色產(chǎn)物即為本發(fā)明所述檢測(cè)阿霉素前藥(32 mg)，產(chǎn)率4%。
[0025] 上述檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)溶酶體pH的熒光探針la的1 H NMR圖譜見圖I，13 C NMR圖譜見圖2， HPLC圖譜見圖3。
[0026] 實(shí)施例2:本發(fā)明所述阿霉素前藥la在pH4.5條件下不同時(shí)間的熒光光譜 預(yù)先準(zhǔn)備5mL的5 yM探針B-F緩沖溶液，含5% DMS0，pH為4.5。然后進(jìn)行熒光檢測(cè)(&= 410 nm);計(jì)算各焚光強(qiáng)度;評(píng)估該前藥在pH4.5條件下的釋放效果(見圖4)。分析溶液在pH 4.5時(shí)，480 nm、560 nm、600 nm處的熒光強(qiáng)度，見圖4,評(píng)價(jià)該前藥在此pH條件下的藥物釋放 性能。
[0027] 實(shí)施例3:本發(fā)明所述阿霉素前藥la在pH 7.4條件下不同時(shí)間的熒光光譜 預(yù)先準(zhǔn)備5mL的5 yM探針B-F緩沖溶液，含5% DMS0，pH為7.4。然后進(jìn)行熒光檢測(cè)(&= 410 nm);計(jì)算各熒光強(qiáng)度;評(píng)估該前藥在pH4.5條件下的釋放效果(見圖5)。分析溶液在pH 7.4時(shí)，480 nm、560 nm、600 nm處的熒光強(qiáng)度，見圖5,評(píng)價(jià)該前藥在此pH條件下的藥物釋放 性能。
[0028] 實(shí)施例4:阿霉素前藥la在活組織中的成像應(yīng)用 取活小鼠新鮮肝組織，PBS清洗3次。用微量進(jìn)樣器吸取本發(fā)明所述阿霉素前藥la (10 虛），與小鼠肝組織培養(yǎng)111、211、311，進(jìn)行成像測(cè)試。測(cè)試條件 :綠色通道，激發(fā)波長為488 11111， 收集波長為500-550 nm;紅色通道，激發(fā)波長為561 nm，收集波長為570-620 nm〇 [0029] 結(jié)果見圖6。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種阿霉素前藥，其特征在于:其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如式(?)所示：其中：R= Η，命名為la;或R=C1，命名為2a;或R= CH3,命名為3a;或R= CH2CH3,命名為4a。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿霉素前藥，其特征在于，由以下方法制備而成： 將1 mmol al、1 mmol a2、2·2謹(jǐn)〇1三乙胺和5 mL二甲基亞諷加入到50 mL單口燒瓶 中，室溫避光攪拌48小時(shí)；液相純化，得到棕紅色產(chǎn)物即為阿霉素前藥;其中al，a2結(jié)構(gòu)如 下：3. -種權(quán)利要求1或2所述的阿霉素前藥的釋放度評(píng)價(jià)方法，其特征在于，具體方法如 下： 室溫條件下，配制5 μΜ阿霉素前藥的DMS0溶液，加入到具有不同pH值的B-F緩沖液體系 中，測(cè)定溶液熒光強(qiáng)度； 檢測(cè)條件為:激發(fā)波長為420 nm，在430-750 nm之間進(jìn)行熒光發(fā)射光譜的檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】A61K31/704GK105854032SQ201610334718
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月19日
【發(fā)明人】林偉英, 孔秀琪, 董寶利, 宋學(xué)真, 王超
【申請(qǐng)人】濟(jì)南大學(xué)