針對prrs和胞內(nèi)勞森氏菌的豬疫苗的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬疫苗，具體地一種包含活的減毒PRRS病毒和滅活的胞內(nèi)勞森氏菌的組合的疫苗，其用于保護豬免于PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌的感染。本發(fā)明還涉及使用該疫苗保護豬免于PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌的感染的方法?！緦＠f明】針對PRRS和胞內(nèi)勞森氏菌的豬疫苗[0001]-般
技術(shù)領(lǐng)域：
[0002]本發(fā)明一般地涉及豬的健康領(lǐng)域。豬易于受到很多病原微生物。通常通過對豬圈和飼料進行管理，使用藥物如抗病毒藥和抗生素進行治療，或者使用疫苗進行預(yù)防性治療，來控制感染。[0003]發(fā)明目的[0004]對于豬的健康管理，持續(xù)需要方便、安全且有效的方法。[0005]發(fā)明概述[0006]為了達到本發(fā)明的目的，設(shè)計了一種使豬針對各種致病微生物感染進行聯(lián)合保護的新疫苗，該疫苗包含活的減毒PRRS(豬繁殖與呼吸綜合征)病毒以及滅活的胞內(nèi)勞森氏菌(Lawsoniaintracellularis)抗原的組合。由于它們對豬健康的負面影響，PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌均造成了巨大的經(jīng)濟損失。盡管針對這兩種類型的微生物的藥物以及疫苗是已知的且可以商購獲得，但是還得不到適合為針對這些病原體的感染或臨床疾病提供聯(lián)合保護的聯(lián)合疫苗，所述疫苗有效、質(zhì)量高(例如穩(wěn)定，沒有抗原干擾)不是同時可安全用于年幼動物。如通常所知，并非所有預(yù)期或建議的抗原組合都可以得到安全有效的聯(lián)合疫苗。事實上，關(guān)于聯(lián)合疫苗的穩(wěn)定性、安全性和有效性，有高水平的不確定性，即使單個(單價)疫苗安全且有效時。[0007]要指出的是，術(shù)語"聯(lián)合"并不排除抗原僅在施用于受試動物(例如通過在一個注射部位注射兩個單獨的疫苗)之后，以活的PRRS病毒和死的全細胞胞內(nèi)勞森氏菌的組合形式被提供。[0008]歐洲藥品評價局（EuropeanAgencyfortheEvaluationofMedicinalProducts)(EMEA)的獸藥產(chǎn)品委員會在其出版物"Noteforguidance:requirementsforcombinedveterinaryproducts"（EMEA，2000，CVMP/IWP/52/97_終版）中陳述（第2頁/6頁），"聯(lián)合疫苗的開發(fā)不是簡單直接的。每種組合都應(yīng)當分別在質(zhì)量、安全性和功效方面被開發(fā)和研究"。該委員會進一步指出尋找好的聯(lián)合疫苗通常包括聯(lián)合疫苗中單獨組分之間的穩(wěn)定性和相容性，包括例如防腐劑、賦形劑和穩(wěn)定劑、滅活劑以及佐劑。在第3頁的第一段中，其陳述，"在聯(lián)合疫苗中，多于一種組分的存在經(jīng)常引起相互作用，導(dǎo)致與一個或多個特定組分單獨施用相比，對單個組分的應(yīng)答的減弱或增強......本質(zhì)上此類相互作用通常是免疫學(xué)的，但也可能是由其它對免疫系統(tǒng)直接影響較小的因素所引起的"，并且"當使用佐劑來增加對聯(lián)合疫苗的免疫反應(yīng)時，可能出現(xiàn)特殊問題。"[0009]美國衛(wèi)生和公眾服務(wù)部（U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)、食品藥品監(jiān)督管理局（FoodandDrugAdministration)，生物制品審評和研究中心（CenterforBiologiesEvaluationandResearch)，于1997年4月公布的"GuidanceforIndustry,fortheevaluationofcombinationvaccinesforpreventablediseases：Production，TestingandClinicalStudies"，該指南陳述（第3頁，在"組分的相容性"下），"經(jīng)驗已經(jīng)表明，聯(lián)合單價疫苗所產(chǎn)生的新聯(lián)合可能不如理想中安全或有效。有時，滅活疫苗的組分可以對一種或多種活性組分起到不利的作用"，這表明尤其是滅活的疫苗可能對活疫苗的功效產(chǎn)生負面的影響，如例如將活百日咳疫苗和滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗進行組合時發(fā)生的，其導(dǎo)致疫苗的百日咳效價降低。這表示疫苗中任何附加組分都可能會使最終產(chǎn)品的安全和效價與單獨的疫苗相比更復(fù)雜。[0010]世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization)(WHO)已經(jīng)公布了稱為"疫苗安全性基礎(chǔ)(VaccineSafetyBasics)"的電子學(xué)習(xí)教程，其在模塊2(M0DULE2)中關(guān)注聯(lián)合疫苗。該模塊開頭說"獲得許可的聯(lián)合疫苗在國家當局批準之前要進行廣泛的測試，以確保產(chǎn)品安全、有效以及擁有可接受的質(zhì)量。"該文還陳述到，"對于所有的組合，生產(chǎn)商因而必須評估每種抗原組分的效價，當組合以誘導(dǎo)免疫時疫苗組分的有效性，可能恢復(fù)毒性的風(fēng)險，以及與其他疫苗組分的反應(yīng)。"[0011]本發(fā)明，在疫苗本身之后，還涉及用于保護豬免于感染PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌的方法，其包括施用所述疫苗。[0012]定義[0013]疫苗是防止接種疫苗后感染病原微生物的組成物，即預(yù)防或減少微生物感染，或預(yù)防或減少感染導(dǎo)致的臨床疾病的組成物，通常是通過干擾微生物本身，例如通過抗體，在接種疫苗的宿主中。因此接種疫苗可以預(yù)防，或至少減少，感染的水平和/或預(yù)防，或至少減少，感染所導(dǎo)致的臨床疾病的水平。[0014]野生型細菌的滅活抗原為除活細菌本身外的任意物質(zhì)或化合物，針對其的免疫應(yīng)答會被激發(fā)，作為該免疫應(yīng)答的結(jié)果，使得相應(yīng)的毒性細菌或一種或多種其毒性因子將會被宿主的免疫系統(tǒng)識別，并且最終至少被部分中和。野生型細菌的滅活抗原的通常例子是死的全細菌(術(shù)語"全"不排除在殺死的過程中細菌細胞至少部分的破裂，或者在"死的全細胞細菌"疫苗中實際上提供死的全細胞細菌的提取物或勻漿作為抗原），細菌的亞單位如表面表達蛋白，以及毒素。后兩者可以或者可以不被重組表達。對于胞內(nèi)勞森氏菌，幾種類型的滅活抗原在本領(lǐng)域是已知的，且例如從W02009/144088(死的全細胞細菌，實施例1和2)、W02005/070958(亞單位）和W097/20050(死的全細胞）已知。[0015]活的減毒病毒是能夠自我復(fù)制，但不能引起通常與其毒性(通常是野生型)病原對應(yīng)物相關(guān)的疾病的全套癥狀的病毒。通常，活病毒不在目標宿主內(nèi)進行復(fù)制，或復(fù)制速度不會對宿主細胞顯著有害，或不引起有害的宿主應(yīng)答。對于PRRS病毒，幾種疫苗在本領(lǐng)域是已知的，其包含衍生自野生型病毒的減毒活病毒，其毒性經(jīng)過在體外培養(yǎng)的宿主細胞系中多次傳代被減弱，如例如P〇rcilis?PRRS(MSDAnimalHealth)、IngelvaC?PRRSMLV(BoehringerIngelheim)、Amervac_PRRS(HipraLaboratories)、Pyrsvac-183?(HipraLaboratories)以及F〇stem?PRRS(Zoetis)。在本領(lǐng)域中其它活的減毒PRRS病毒已例如在VeterinaryMicrobiology，volume138，issues1_2,2July2009，，第34-40頁；VeterinaryImmunologyandImmunopathology,volume106,issues3_4，15July2005，第309-319頁以及Vaccine，volume26，issues29-30,4July2008,第3594-3600頁中描述。[0016]本發(fā)明的實施方案[0017]在一個實施方案中疫苗用于在單次施用后保護豬免于PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌的感染。有利的發(fā)現(xiàn)，該疫苗甚至僅在單次施用后即可保護豬免受兩種病原體的感染。該實施方案不排除給予后續(xù)疫苗接種，例如第一次接種疫苗后6到12個月以延續(xù)保護的水平。該后續(xù)疫苗接種不同于初免-加強接種方案中的加強接種，后者僅在加強接種后才能獲得保護。在初免-加強方案中，兩次疫苗接種通常間隔2-3周。[0018]在一個實施方案中疫苗包含佐劑。發(fā)現(xiàn)通常用于改善滅活抗原的免疫應(yīng)答的佐劑不會負面干擾活的減毒PRRS病毒，也不會過分增加對其它抗原的反應(yīng)性，盡管WHO在其疫苗安全性基礎(chǔ)課程(參見上文)的第1頁最后兩行（"聯(lián)合疫苗"章節(jié)）中明確警告了這類干擾和反應(yīng)性。在一個進一步的實施方案中佐劑包括礦物油，例如飽和烴油，其可從ExxonMobil?購得(Marcol?52)。[0019]在還另一個實施方案中，滅活的胞內(nèi)勞森氏菌抗原包括死的全細胞胞內(nèi)勞森氏菌，優(yōu)選負載量使得每劑量該疫苗包含相當于lxio7胞內(nèi)勞森氏菌的胞內(nèi)勞森氏菌抗原。此實施方案不排除更高的抗原負載，其可正向影響保護的水平和免疫力的持續(xù)時間。[0020]關(guān)于疫苗的PRRSv負載，在一個實施方案中每劑量疫苗包含4.01ogl0(4單位的101〇g)TCID5Q的減毒PRRS病毒。此實施方案不排除更高的抗原負載，其可正向影響保護的水平和免疫力的持續(xù)時間。[0021]將使用以下實施例和附圖進一步解釋本發(fā)明。[0022]實施例1描述了對PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌聯(lián)合疫苗的一項研究[0023]圖1顯示激發(fā)后體溫[0024]圖2顯示激發(fā)后平均日增重(ADWG)[0025]圖3顯示激發(fā)后PPRS病毒血清學(xué)[0026]圖4顯示激發(fā)后胞內(nèi)勞森氏菌血清學(xué)[0027]圖5顯示激發(fā)后PRRS病毒病毒血癥[0028]實施例2描述了對PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌聯(lián)合疫苗的另一項研究[0029]實施例1[0030]研究設(shè)計[0031]五只母豬的后代（23只仔豬）用于該試驗。當仔豬約兩周齡時對它們接種疫苗如下：[0032]-第一組（組I，8只動物）接種（頂)使用DiluvacF〇rte?(MSDAnimalHealth)溶解的冷凍干燥的P〇rcilis?PRRS疫苗（購自MSDAnimalHealth，Boxmeer，TheNetherlands)。單劑量為2ml(注射劑量）中包含計算量為41og10TCID5Q的病毒，頸部右側(cè)給藥。[0033]-第二組（組2,9只動物）接種溶解于即用型胞內(nèi)勞森氏菌疫苗[參見W02009/127684，抗原的實施例2:死的全細胞，在本實驗中配制成水包油乳液，包含12.5%v/v(=油的體積比上疫苗的總體積）的礦物油Marco〗?52(ExxonMobi1)，0.75%w/v的維生素E醋酸酯和0.80%的聚山梨酯80(吐溫80;SigmaAldrich)以及注射用水]的相同的PRRS疫苗。該疫苗在室溫下混合，施用前放置長達30分鐘。單劑量為2ml(注射劑量）中包含計算量為41〇g1QTCID5Q的病毒和2xl07細菌細胞，頸部右側(cè)給藥。[0034]_第三組(組3,6只動物）中的仔豬未接受疫苗接種而是作為未接種的激發(fā)對照。激發(fā)感染在疫苗接種后4周使用毒性PRRS激發(fā)病毒通過鼻內(nèi)途徑完成。[0035]接種和激發(fā)后，每天觀察所有仔豬的臨床體征。在感染前一天和當天以及之后10天的每天測量體溫。在激發(fā)前一天，激發(fā)后10天以及實驗結(jié)束前一天(激發(fā)后27天)確定體重。激發(fā)時及3、5、7、10、14、21和28天后收集血樣。[0036]實驗程序[0037]獸醫(yī)檢查[0038]在接種疫苗的前一天，對仔豬進行一般健康檢查。[0039]觀察臨床體征[0040]所有豬在到達當天即開始每天觀察臨床體征。激發(fā)當天開始記錄個體的可能的全身性反應(yīng)例如食欲不振、不愿移動、傾向于躺下、倦怠或瞌睡、發(fā)抖、毛發(fā)豎立以及可能的水月中(尤其在眼部周圍）、嘔吐和腹瀉或呼吸急促和腹式呼吸。[0041]測量體溫[0042]在激發(fā)前一天和當天以及之后10天的每天(每天的相同時刻），記錄所有動物的體溫。[0043]測量體重[0044]激發(fā)前一天，激發(fā)后10和27天，測量仔豬的體重。[0045]血液采樣[0046]在疫苗接種前一天采集所有母豬的血液樣品以確認陰性狀態(tài)。激發(fā)時及激發(fā)后3、5、7、10、14、21和28天采集仔豬血樣。血清樣品被用于檢測?1?1?病毒的可能存在以及?1?1?￥特異性抗體和胞內(nèi)勞森氏菌特異性抗體的可能存在。[0047]結(jié)果[0048]臨床體征[0049]在實驗過程中，疫苗接種或激發(fā)后未觀察到臨床反應(yīng)。除了礦物油是非常刺激的佐劑，尤其是對于豬，其可能導(dǎo)致嚴重的局部反應(yīng)，看起來將該佐劑用于新的聯(lián)合疫苗是安全的。因此對于任何更溫和的佐劑，安全性可理解為完全沒有問題。[0050]體溫[0051]計算每組激發(fā)前一天和當天所測量的平均激發(fā)前體溫。圖1顯示與激發(fā)前平均體溫相比直到10天平均體溫的升高。未接種疫苗的對照仔豬組中只有激發(fā)后第2天平均體溫升高了rc。其它所有激發(fā)后時間點在接種疫苗組和對照組仔豬中均未檢測到升高。[0052]體重和體重增加[0053]實驗開始時將仔豬隨機分組，不考慮起始體重和性別。如圖2所示，趨勢是組2的聯(lián)合疫苗提供的ADWG(平均日增重)與單獨的PRRSV疫苗相同，高于對照組。[0054]PRRSV血清學(xué)[0055]只有接受PRRS疫苗的豬受到激發(fā)時為陽性。如圖3所示(結(jié)果表示為"樣品比陽性或S/P"比例，使用IDEXXPRRSX3ELISA)，抗PRRS抗體效價似乎未受到勞森氏菌抗原的負面影響。相反，對PRRS抗體效價似乎還有意料之外的正面影響，因為在每個時間點接受了聯(lián)合疫苗的動物的PRRS效價都更高。這暗示由于某些還未理解的原因，勞森氏菌抗原增強了對活PRRS病毒的免疫反應(yīng)。[0056]胞內(nèi)勞森氏菌血清學(xué)[0057]圖4給出了勞森氏菌血清學(xué)的結(jié)果。如圖所示，組1中的動物在整個實驗過程中均保持陰性。組2中動物的80-90%得到了良好的血清抗體陽轉(zhuǎn)率，與動物被保護免于毒性勞森氏菌激發(fā)的陽轉(zhuǎn)率相當。[0058]激發(fā)后PRRSV病毒血癥[0059]如通常所知，病毒血癥是保護免于PRRS病毒感染及其導(dǎo)致的臨床疾病的主要讀出方式。結(jié)果在圖5中給出。組1和2在病毒血癥方面均有非常高且相當?shù)臏p少。[0060]實施例2[0061]研究設(shè)計[0062]設(shè)計該研究以確定該聯(lián)合疫苗不依賴于佐劑的類型和活PRRS毒株的類型。為此，使用了替代佐劑DiluvacForte(可購自MDSMDSAnimalHealth，Boxmeer，TheNetherlands)以及卡波普(可以是卡波普974P，購自Lubrizol，Cleveland，Ohio，USA)。替代PRRSv毒株為2型毒株（而不是在實施例1中使用的1型毒株），存在于市售疫苗PrimePacPRRS(可購自MerckAnimalHealth，Millsboro，Delaware，USA)2*。[0063]幾只母豬的后代被用于分配15只仔豬于3個5只仔豬的治療組。在大約1周齡時，組1和2的仔豬被接種重構(gòu)于DiluvacForte(DF)或卡波普(0.8%w/v)中的凍干滅活勞森氏菌疫苗(與實施例1中使用的抗原相同，但現(xiàn)在是凍干的因而與凍干穩(wěn)定劑結(jié)合），如下文表1中所列。疫苗于頸部左側(cè)肌肉內(nèi)（IM)施用。在約5周齡時，仔豬被(再次)接種兩種不同的活PRRSV毒株和勞森氏菌抗原，通過重構(gòu)抗原于DF或卡波普（0.8%w/v)組合成一個疫苗。PRRSV2型疫苗PrimePacPRRS被溶解為2ml中含有104'5TCID5Q的病毒而PRRSV1型疫苗PorcilisPRRS被溶解為2ml中含有IO^TCIDm的病毒。對于第二次疫苗接種，疫苗于頸部右側(cè)肌肉內(nèi)（頂)施用。組3的仔豬不接種疫苗且作為未接種對照。[0064]表1疫苗接種方案[0066]初次疫苗接種后每天觀察仔豬的臨床體征。初次疫苗接種之前，二次疫苗接種之前，以及二次疫苗接種之后的二、四和六周采集所有仔豬的血液樣品。檢測血清樣品中針對PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌的抗體。[0067]結(jié)果[0068]在實驗過程中未觀察到臨床反應(yīng)。二次疫苗接種當天所有動物的胞內(nèi)勞森氏菌和PRRS抗體均為陰性。二次疫苗接種后六周，除了對照，所有動物的勞森氏菌和PRRSv特異性抗體均為陽性。這證明該聯(lián)合疫苗是安全的并引起了針對胞內(nèi)勞森氏菌和PRRS病毒的主動免疫?！局鳈?quán)項】1.一種疫苗，其包含活的減毒PRRS病毒和滅活的胞內(nèi)勞森氏菌抗原的組合。2.-種疫苗，其包含活的減毒PRRS病毒和滅活的胞內(nèi)勞森氏菌抗原的疫苗的組合，用于保護豬免于PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌的感染。3.-種疫苗，其包含活的減毒PRRS病毒和滅活的胞內(nèi)勞森氏菌抗原的疫苗的組合，用于保護豬免于PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌的感染所導(dǎo)致的臨床疾病。4.上述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其特征在于所述疫苗用于在單次施用后保護豬免于PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌的感染。5.上述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其特征在于所述疫苗包含佐劑。6.權(quán)利要求5所述的疫苗，其特征在于所述佐劑包含礦物油。7.上述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其特征在于所述滅活的胞內(nèi)勞森氏菌抗原包括死的全細胞胞內(nèi)勞森氏菌。8.權(quán)利要求7的疫苗，其特征在于所述疫苗每劑量包含相當于IX107胞內(nèi)勞森氏菌的胞內(nèi)5?森氏囷抗原。9.上述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其特征在于所述疫苗每劑量包含4.Olog10TCID50的減毒PRRS病毒。10.保護豬免于PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌感染的方法，其包括給動物施用包含活的減毒PRRS病毒和滅活的胞內(nèi)勞森氏菌抗原的組合的疫苗。11.保護豬免于PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌感染的方法，其包括給動物施用包含活的減毒PRRS病毒和滅活的胞內(nèi)勞森氏菌抗原的組合的疫苗。12.權(quán)利要求10或11的方法，其特征在于所述方法在單次疫苗注射后帶來保護。【文檔編號】A61K39/02GK105873604SQ201480066510【公開日】2016年8月17日【申請日】2014年12月2日【發(fā)明人】C·德雷克斯勒,A·A·C·賈科布斯【申請人】英特維特國際股份有限公司