用于核酸和藥物遞送的新型plga-修飾的聚乙烯亞胺自組裝納米技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的實(shí)施方式涉及共聚物和納米顆粒，其用于作為一種或多種試劑的遞送試劑，用于治療人和動(dòng)物的醫(yī)學(xué)狀況。本發(fā)明的一些實(shí)施方式提供用于在例如細(xì)胞培養(yǎng)物、動(dòng)物模型和植物中進(jìn)行生物醫(yī)藥研究的新試劑。所述共聚物包含PLGA和PEI，并且，在一些實(shí)施方式中，還包含1?(3?氨基丙基)?4?甲基哌嗪(APMP)、Fc結(jié)合肽和/或抗體。在某些實(shí)施方式中，將包含一種或多種治療劑的APMP?PLGA?PEI、Fc結(jié)合肽/抗體?PLGA?PEI或Fc結(jié)合肽/抗體?APMP?PLGA?PEI納米顆粒遞送至需要其的個(gè)體，或用于細(xì)胞培養(yǎng)物、動(dòng)物模型和植物中的生物醫(yī)學(xué)研究。
【專利說明】用于核酸和藥物遞送的新型PLGA-修飾的聚乙烯亞胺自組裝 納米技術(shù)
[0001 ]本發(fā)明要求2013年8月13日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)系列第61/865，189號(hào)的優(yōu)先 權(quán)，其通過引用全文納入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明至少涉及醫(yī)藥、納米技術(shù)、生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和/或分子生物學(xué)領(lǐng)域。
[0003] 背景
[0004] 基因和藥物遞送系統(tǒng)是非?；钴S的科研與發(fā)明領(lǐng)域，這是因?yàn)閷?duì)于診斷治療和體 外與體內(nèi)科研的大量需求，以及其目前現(xiàn)有技術(shù)的限制。例如，聚（交酯_共聚-乙交酯） (PLGA)型的納米顆粒已被開發(fā)用于藥物遞送;然而，其對(duì)于核酸(例如DNA和RNA)的荷載和 遞送效率極低，這歸因于其化學(xué)性質(zhì)。脂質(zhì)體和聚乙烯亞胺(PEI)已被開發(fā)用于體外和體內(nèi) 核酸(例如DNA和RNA)遞送。然而，這些遞送系統(tǒng)的效率是受限的；并且仍具有高毒性;且制 備過程復(fù)雜。目前，在臨床應(yīng)用領(lǐng)域中，尚未出現(xiàn)同時(shí)具備高效率和低毒性的遞送系統(tǒng)。本 發(fā)明滿足了本領(lǐng)域?qū)τ谶f送至少一種試劑至個(gè)體的高效、低毒性系統(tǒng)的長期需求。
[0005] 概述
[0006] 本發(fā)明的實(shí)施方式涉及用于向個(gè)體遞送至少一種任何類型的試劑（包括至少核 酸、蛋白質(zhì)、小分子和/或任何種類的藥物）的有用的遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一些實(shí)施方式涉及 采用PLGA-修飾的聚乙烯亞胺納米技術(shù)的組合物和方法。在某些方面，本發(fā)明涉及PLGA-PEI 偶聯(lián)物及其使用與制備方法。實(shí)施方式涵蓋PEI和PLGA的化學(xué)偶聯(lián)，在至少一些情況中，以 特定的PLGA/PEI比率偶聯(lián)。所述實(shí)施方式能夠使形成的該自組裝納米顆粒具有一種或多種 試劑。在特定實(shí)施方式中，試劑是DNA和/或RNA，并且上述復(fù)合物具有高DNA和/或RNA荷載 率、高DNA和/或RNA轉(zhuǎn)染效率和低細(xì)胞毒性。
[0007] 某些實(shí)施方式涉及PLGA和PEI之間的化學(xué)反應(yīng)，和由此所得的組合物。本文提供多 種條件的示例，包括例如，載有DNA的PLGA-修飾的PEI自組裝納米顆粒制劑的示例性的條 件。本發(fā)明的實(shí)施方式提供高效DNA遞送而不具體外和體內(nèi)毒性。
[0008] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所述組合物包含APMP(APMP:l-(3-氨基丙基)-4_甲 基哌嗪)-PLGA-PEI作為新材料，該新材料具有新的應(yīng)用。一些實(shí)施方式包括其中具有定量 伯胺的PLGA-PEI納米顆粒，允許用于針對(duì)具體DNA(作為示例)荷載和顆粒尺寸設(shè)計(jì)控制連 接至PE I的PLGA片段尺寸和含量的新方法。
[0009] 本發(fā)明的實(shí)施方式包括PLGA-PEI/核酸納米顆粒的制劑:采用某些制備步驟的、不 含有機(jī)溶劑或特殊介質(zhì)的，由PLGA-PEI和核酸(DNA)進(jìn)行的納米顆粒制劑的自組裝更為有 效，和/或毒性更低。
[0010] 本發(fā)明的實(shí)施方式提供具有不同反應(yīng)時(shí)間與條件、新結(jié)構(gòu)、新組成、新性質(zhì)和/或 新功能/應(yīng)用的新PLGA-PEI材料。
[0011] 本發(fā)明的實(shí)施方式提供PLGA-PEI/DNA納米顆粒制劑的新機(jī)理，包括化學(xué)組合物、 DNA相互作用、顆粒形成和納米顆粒成像等方面。PLGA-PEI或APMP-PLGA-PEI能夠荷載寬范 圍的DNA含量用于細(xì)胞遞送，并以低于其它遞送試劑(包括，例如，Lipofectamine 2000和 PEI)的毒性更高效地轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0012] 本發(fā)明的實(shí)施方式提供基因治療和化療的有用聯(lián)合。PLGA-PEI或APMP-PLGA-PEI 有利于，例如，一起遞送治療基因和化療藥物。在一些情況中，可將一種或多種特異性抗體 連接至PEG-PLGA-PEI或APMP-PLGA-PEI，用于靶向特定細(xì)胞類型。該技術(shù)特別有用于對(duì)于癌 癥或其它疾病的靶向治療。例如，可通過偶聯(lián)將抗體連接至本發(fā)明的復(fù)合物。
[0013]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的納米顆粒和與所述納米顆粒分開的另一種治療化合 物使用，以治療所述個(gè)體中的相同適應(yīng)癥。在具體情況中，所述納米顆粒和所述治療化合物 分開或一起遞送。一起遞送時(shí)，它們可以或可以不處于相同制劑中，并且它們可以或可以不 通過相同途徑遞送。
[0014]在實(shí)施方式，共聚物組合物包含聚（乳酸-共聚-乙醇酸）（PLGA)和聚乙烯亞胺 (卩￡1)，其中卩11^與?￡1的￥/^比是0.5:1、1:1、2:1或5:1。
[0015] 在實(shí)施方式，共聚物組合物包含PLGA和PEI，其中PLGA與PEI的w/w比是0.5:1，并且 其中，PLGA的約70-130個(gè)交酯-共聚-乙交酯單元通過酰胺鍵偶聯(lián)至PEI分子。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方式中，共聚物組合物包含PLGA和TOI，其中伯胺濃度是約40 % -約 55%。伯胺濃度可以是約45%-約55%、約45%-約52%，或約46%-約52%。伯胺濃度可以是 45%-55%、45%-52%，或46%-52%。
[0017]在某個(gè)實(shí)施方式中，共聚物組合物包含PLGA、PEI和選自下組的另一化合物：1_(3_ 氨基丙基)-4_甲基哌嗪(APMP)、2_(3_氨基丙基氨基）乙醇、2-甲基_1，5-二氨基戊燒、1_(3_ 氨基丙基)吡咯烷、4-氨基苯基二硫化物和胱胺。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施方式中，共聚物組合物包含PLGA、PEI、APMP和接頭，例如聚乙二醇 (PEG)接頭，例如包括馬來酰亞胺-PEG-NHS。在一些情況中，所述接頭是化學(xué)偶聯(lián)至PLGA-PEI 或APMP-PLGA-PEI 聚合物的PEG生物接頭(Ma 1-PEG-NHS)，以分別產(chǎn)生Ma 1 -PEG-PLGA-PEI 或 Ma 1 -PEG-APMP-PLGA-PEI。在一些情況中，Ma 1 -PEG-PLGA-PEI 或 Ma 1 -PEG-APMP-PLGA-PEI 化學(xué)偶聯(lián)至Fc結(jié)合肽或抗體，用于特異性遞送。
[0019] 在一些實(shí)施方式中，某些組合物還包含至少一種治療和/或診斷劑，并且所述共聚 物包含納米顆粒中的試劑。在特定實(shí)施方式中，配制治療和/或診斷劑以使其適用于動(dòng)物疾 病、作為研究試劑，或同時(shí)滿足這兩種需求。所述治療劑可穩(wěn)定配制用于人類癌癥、AIDS、心 臟病、中風(fēng)、糖尿病、呼吸道疾病、腎病、細(xì)菌感染，和/或病毒感染。在特定實(shí)施方式中，所述 試劑是核酸、蛋白質(zhì)、肽、小分子、抗原、疫苗或其混合物。在其中所述核酸是DNA的情況中， 所述DNA可以是雙鏈、單鏈或其混合物;所述DNA可以是寡核苷酸。在其中所述核酸是RNA的 情況中，所述RNA可以是雙鏈、單鏈或其混合物。所述RNA可以是siRNA、shRNA、miRNA或其混 合物。在特定情況中，所述診斷劑是帶標(biāo)記的，包括有色和/或熒光標(biāo)記。在特定實(shí)施方式 中，當(dāng)PLGA與PEI的比率是0.5: lw/w時(shí)，所述納米顆粒處于100和130nm之間。
[0020] 在一些實(shí)施方式中，制備本發(fā)明的組合物的方法包括如下步驟:將APMP-共聚-1， 4-丁二醇二丙烯酸酯與PEr混合以產(chǎn)生APMP-PEI聚合物;并將該APMP-PEI聚合物與PLGA混 合以形成APMP-PLGA-PEI共聚物組合物。1,4-丁二醇二丙烯酸酯-共聚-1-(3-氨基丙基)-4_ 甲基哌嗪。在特定情況中，APMP-共聚-1,4-丁二醇二丙烯酸酯和PEr混合至少24小時(shí)。APMP-PEI聚合物和PLGA可混合至少12、18或24小時(shí)。在特定實(shí)施方式中，所述方法還包括如下步 驟:將該共聚物組合物與至少一種治療和/或診斷劑混合。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方式中，用于治療個(gè)體的醫(yī)學(xué)狀況的方法包括如下步驟：向所述個(gè)體 遞送治療有效量的本發(fā)明的組合物。在特定實(shí)施方式中，所述組合物被遞送多于一次。所述 組合物可通過注射遞送。所述組合物可通過腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑被遞送。在一些情況中，所 述方法還包括，向所述個(gè)體遞送治療有效量的另一種化合物用于治療所述醫(yī)學(xué)狀況。在某 些方面，方法還包括如下步驟:鑒定所述個(gè)體是否需要對(duì)其醫(yī)學(xué)狀況進(jìn)行治療。所述醫(yī)學(xué)狀 況可以是癌。
[0022] 在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述方法和/或組合物以體外、離體或體內(nèi)方式使用。在 特定實(shí)施方式中，體外設(shè)定使用所述方法和/或組合物以向特定位置遞送具體組合物。例 如，所述組合物可用于清除組合物以影響特定位置(例如醫(yī)院、學(xué)校等的一個(gè)或多個(gè)表面 上)的細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物等的存在。
【附圖說明】
[0023]為了更完整地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖提供以下說明。
[0024]圖 1說明PLGA-PEI (示例0 ? 5 : lw/w)(圖 1A)、APMP-PLGA-PEI (圖 1B)和Fc結(jié)合肽-PEG-PLGA-PEI或Fc結(jié)合肽-PEG-APMP-PLGA-PEI (圖1C)的形成機(jī)理的實(shí)施方式。
[0025] 圖2顯示采用25yg PLGA-PEI/10yg質(zhì)粒DNA(雙鏈)的多峰尺寸分布結(jié)果。
[0026]圖3A顯示PLGA/PEI/DNA引物（10yg，23個(gè)核苷酸，單鏈）的尺寸分布。圖3B顯示采用 25yg PLGA-PEI和15yg引物(23個(gè)核苷酸，單鏈)制備的納米顆粒的粒徑分布。
[0027] 圖4A顯示PLGA-PEI的DNA荷載率，且圖4B說明該納米顆粒的DNA余留。圖4C通過DNA 余留試驗(yàn)顯示APMP-PLGA-PEI納米顆粒的DNA荷載率。
[0028] 圖5說明示例性的納米顆粒尺寸。圖5A顯示，當(dāng)DNA與氮/磷比率(N/P)7.4的PLGA-PEI凝縮時(shí)，產(chǎn)生約150-230nm的顆粒。圖5B顯示采用更多PLGA-PEI的納米顆粒尺寸，并且隨 著N/P提高至12.2，所得尺寸是100-150腹。圖5(：顯示當(dāng)1^^提高至17.2時(shí)，尺寸減小至約 50nm。PLGA-PEI是與DNA有效凝縮并且控制了顆粒尺寸的聚合物。
[0029] 圖6顯示相較于等同PEI量的PEI，PLGA-PEI/DNA納米顆粒的細(xì)胞毒性。因此，PLGA-PEI /DNA納米顆粒的毒性低于PE I /DNA遞送系統(tǒng)。
[0030] 圖7A顯示相較于PEI和Lipofectamine 2000遞送系統(tǒng)，評(píng)價(jià)PLGA-PEI/綠色熒光蛋 白（GFP)DNA復(fù)合物在PANC-1細(xì)胞（胰腺癌細(xì)胞系）中的轉(zhuǎn)染效率。圖7B顯示相較于PLGA-PEI、PEI和Lipofectamine 2000遞送系統(tǒng)，測試APMP-PLGA-PEI/GFP DNA納米顆粒在PANC-1 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。在相同條件下，APMP-PLGA-PEI的遞送效率優(yōu)于PLGA-PEI、PEI和 Lipofectamine 2000遞送系統(tǒng)。圖7C顯示在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEV)中，PLGA-PEI納米顆 粒的轉(zhuǎn)染率比Lipofectamine 2000高得多。不同類型的細(xì)胞響應(yīng)不同轉(zhuǎn)染試劑具有不同轉(zhuǎn) 染率。HUVEC被視作難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。因此，PLGA-PEI遞送系統(tǒng)顯著優(yōu)于其它遞送系統(tǒng)，例如 Lipofectamine 2000〇
[0031] 圖8顯示PLGA-PEI /紅色熒光蛋白（RFP) DNA-處理的小鼠和用PE I /DNA對(duì)照處理的 那些，尤其對(duì)于肝、脾和胰腺。PLGA-PEI納米顆粒遞送系統(tǒng)的體內(nèi)效率高于基于PEI的遞送 系統(tǒng)。
[0032] 圖9顯示PLGA-PEI遞送10yg RFP DNA，并分析3天后的腫瘤。在該小鼠模型中， PLGA-PEI納米顆粒有效于遞送DNA進(jìn)入腫瘤。
[0033]圖10顯示靜脈內(nèi)給予PLGA-PEI/miR-198納米顆粒用于治療小鼠模型中胰腺癌的 治療應(yīng)用。通過熒光成像分析（圖10A)和直接測量切除的腫瘤（圖10B)可見，靜脈內(nèi)（IV)遞 送載有miR-198的PLGA-PEI納米顆粒降低了小鼠模型中的腫瘤荷載和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。
[0034]圖11顯示腹膜內(nèi)（IP)給予PLGA-PEI/miR-198納米顆粒聯(lián)合化療劑吉西他濱用于 治療小鼠模型中胰腺癌的治療應(yīng)用。圖11A顯示在用PLGA-PEI /mi R-198和吉西他濱處理的 小鼠中，原發(fā)和轉(zhuǎn)移的腫瘤的減小(通過熒光成像分析）。圖11B顯示對(duì)于用PLGA-PEI/miR-198和吉西他濱處理的小鼠中的腫瘤尺寸的減小的確認(rèn)(通過直接測量切除的腫瘤）。
[0035] 圖12.對(duì)PLGA-PEI共聚物和質(zhì)粒DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)建模和納米顆粒形成。A. PLGA-PEI 共聚物。各支化的PEI分子(25kDa)具有約214個(gè)伯胺、159個(gè)仲胺和212個(gè)叔胺。而各PLGA分 子（12~16kDa)平均具有215(184-246)個(gè)酯鍵。當(dāng)PLGA和PEI以1:1的摩爾比率(w/w為0.5: 1)在有機(jī)溶劑THF中反應(yīng)時(shí)；形成新產(chǎn)物PLGA-PEI共聚物。PLGA-PEI共聚物中所得的PEI重 量含量是64%;并且PEI的51 %的伯胺在該P(yáng)LGA-PEI共聚物中被利用，指示PEI的伯胺與 PLGA的酯鍵發(fā)生了反應(yīng)。PEI保持完整，因?yàn)镻LGA對(duì)PEI的鏈沒有破壞力。估計(jì)各PEI分子中 利用了約109個(gè)伯胺?；邗ユI、PEI含量和伯胺百分?jǐn)?shù)，經(jīng)總結(jié)，PLGA分子被PEI片段化成交 酯 -共聚-乙交酯(LGA)單一單元；因此形成多個(gè)LGA單元。因此，1個(gè)PEI分子與109個(gè)LGA單一 單元偶聯(lián)。B.PLGA-PEI/DNA小顆粒。PLGA-PEI共聚物的分子量約為37kDa;而5kbp質(zhì)粒DNA是 約3300kDa。對(duì)于35yg PLGA-PEI/10yg DNA NP，10yg DNA具有 1.82X1012個(gè)DNA分子；而35yg PLGA-PEI具有5.69 X1014個(gè)分子。因此，PLGA-PEI與DNA的分子比是313。如果1個(gè)DNA分子和 313個(gè)PLGA-PEI分子形成NP，其重量是2.468X10- 17g。假設(shè)NP的密度是lg/cm3,其體積則是 2.468 X l(T17cm3(或24680nm3)，對(duì)應(yīng)于36nm的顆粒直徑。因此，對(duì)于尺寸為約36nm的NP，其可 包含 1 個(gè)質(zhì)粒DNA分子。C.PLGA-PEI/DNA的大顆粒。對(duì)于25yg PLGA-PEI/10yg DNA NP，PLGA-PEI共聚物與DNA的分子比是223。通過相同方法，估計(jì)1個(gè)DNA分子和223個(gè)PLGA-PEI共聚物 的體積是1.918父10- 17〇113(或19180111113)。這些即的尺寸是約10011111，對(duì)應(yīng)于29452411111 3的體 積。該顆?？砂s15個(gè)DNA分子和3345個(gè)PLGA-PEI共聚物。
[0036]圖13顯示XIST在女性胰腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，基于實(shí)時(shí)PCR分析。A.XIST在 來自8名女性患者的手術(shù)胰腺癌組織及其周圍非癌組織中的表達(dá)。B. XIST在5名女性的胰腺 癌細(xì)胞系以5?(：-1、81?(：-3、？311(3〇3.27、即4(：和31]86.86)和3名女性的對(duì)照細(xì)胞(包括即0￡永 生人胰腺管上皮細(xì)胞）、HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)和AoSMC(人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞）中的表 達(dá)。
[0037]圖14顯示XIST(2.6kb)的強(qiáng)行表達(dá)對(duì)ASPC-1細(xì)胞的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和腫瘤生 長的影響。A .XIST通過充足腺病毒基因遞送在ASPC-1細(xì)胞中的強(qiáng)行表達(dá)(實(shí)時(shí)PCR) 3.細(xì)胞 增殖的MTS試驗(yàn)。C.細(xì)胞周期分析(流式細(xì)胞術(shù)）』.裸小鼠中的皮下腫瘤異種移植。
[0038]圖15顯示系列XIST截短突變克隆和功能分析（MTT)。原始XIST同種型克隆 (AK054860，2.659kb，克隆1)被亞克隆進(jìn)入臨床批準(zhǔn)的質(zhì)粒載體pUVMC3中的三個(gè)截短的區(qū) 段（克隆2、3和4)。采用PLGA-PEI納米顆粒，各克隆被轉(zhuǎn)染進(jìn)入ASPC-1 (女性）（圖15A)和 PANC-1 (男性）（圖15B)細(xì)胞系。在0、1、2、3和4天檢測MTLXIST克隆3(XIST486)是最短的功 能結(jié)構(gòu)域。
[0039]前述內(nèi)容相當(dāng)寬泛地描述了本
【發(fā)明內(nèi)容】
的特征和技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，使得能夠更好地理解 以下的詳細(xì)說明。以下描述的本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)構(gòu)成本發(fā)明要求保護(hù)的主題。本領(lǐng) 域的技術(shù)人員應(yīng)理解，所揭示的觀念和【具體實(shí)施方式】可以方便地被用作改進(jìn)或設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)本 發(fā)明的同樣目的的其他結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)認(rèn)識(shí)到這種等價(jià)結(jié)構(gòu)沒有偏離 所附權(quán)利要求書中提出的本發(fā)明的精神和范圍。被認(rèn)為是本發(fā)明的特征的新特征，對(duì)于其 構(gòu)建和方法的操作，還有其他對(duì)象和優(yōu)點(diǎn)等，可以結(jié)合以下詳細(xì)的說明和附圖一起，得到更 好的理解。但應(yīng)理解，各附圖僅僅是為了示意和說明，并不旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定。
[0040] 發(fā)明詳述
[0041]本文說明書中所用的"一個(gè)"或"一種"可指一個(gè)/種或多個(gè)/種。如本文中權(quán)利要求 中所用，當(dāng)于詞語"包含"聯(lián)用時(shí)，該詞"一種"或"一個(gè)"可指一種/個(gè)或多于一種/個(gè)。本文中 所用的"另一種/個(gè)"可指至少第二種/個(gè)或更多種/個(gè)。在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的方面可 "基本由"或"由"例如本發(fā)明的一種或多種要素或步驟"組成"。本發(fā)明的一些實(shí)施方式可能 由一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的要素、方法步驟和/或方法組成或基本由其組成?？紤]到本文所述的 任意方法或組合物可相對(duì)于本文所述的任意其他方法或組合物實(shí)施。
[0042] 一般實(shí)施方式
[0043]本發(fā)明對(duì)至少醫(yī)療領(lǐng)域中的技術(shù)提供改善，所述領(lǐng)域包括一種或多種治療和/或 診斷組合物的遞送。在特定實(shí)施方式中，該系統(tǒng)利用聚(交酯_共聚-乙交酯）(PLGA)、聚乙烯 亞胺(PEI)、APMP(l-(3_氨基丙基)_4_甲基哌嗪），并且，可包括另一種組分。該其它組分，并 且，在至少一些情況中，該組分是抗體。在【具體實(shí)施方式】中，該組分是是Fc-結(jié)合肽。
[0044]本領(lǐng)域中，基于聚(交酯_共聚-乙交酯）（PLGA)的納米顆粒荷載和遞送核酸(例如 DNA和RNA)的效率極低，這是因?yàn)镻LGA的化學(xué)性質(zhì)。脂質(zhì)體和聚乙烯亞胺(PEI)可用于體外 和體內(nèi)遞送核酸(例如DNA和RNA)。然而，該遞送系統(tǒng)的效率有限，毒性高;且制備過程復(fù)雜。 本發(fā)明的實(shí)施方式采用至少PLGA和PE I來實(shí)現(xiàn)有效和有用的系統(tǒng)。PLGA修飾的PE I包括如下 具體優(yōu)勢(shì)：1)體外和體內(nèi)高效率荷載和遞送核酸;2)寬范圍的荷載和遞送試劑;3)低毒性； 4)自組裝和容易的制備過程;5)結(jié)合至特異性抗體用于特異性遞送;和6)廣泛體外和體內(nèi) 應(yīng)用(動(dòng)物和人應(yīng)用）。
[0045]用于公開的納米技術(shù)的方法經(jīng)優(yōu)化和表征，包括PLGA和PEI之間的化學(xué)反應(yīng)和機(jī) 理，質(zhì)粒DNA和修飾的PLGA-PEI之間的相互作用，以及納米顆粒的尺寸和形貌。該納米技術(shù) 的DNA荷載、轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性經(jīng)表征并與現(xiàn)有技術(shù)(包括lipofectamine 2000和PEI)在 細(xì)胞培養(yǎng)物中做了仔細(xì)比較。該納米技術(shù)作為DNA遞送系統(tǒng)在所有這些關(guān)鍵檢測中均顯示 較好結(jié)果。此外，在小鼠模型中研究了該技術(shù)的DNA遞送和毒性，并與PEI遞送系統(tǒng)做比較。 相較于PEI遞送系統(tǒng)，本文公開的納米技術(shù)顯示在主要器官包括至少肝、脾和胰腺中的較高 的遞送效率，并且其在小鼠中具有低得多的毒性。更重要地，發(fā)明人已總結(jié)了采用該技術(shù)在 人胰腺癌的裸小鼠模型遞送示例性的治療miRNA構(gòu)建體的研究。該納米技術(shù)與治療性miR-198的腹膜內(nèi)和尾靜脈遞送途徑均顯著地抑制小鼠中腫瘤生長。
[0046]在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的主題提供PLGA-PEI聚合物的一步法制備，例如，包括 易于工業(yè)生產(chǎn)的那些。在具體情況中，示例性的PLGA-PEI聚合物來自例如，w/w比為0.5:1、 1:1、2:1和5:1的PLGA和PEI。在【具體實(shí)施方式】中，PLGA含量越高，毒性越低，但DNA轉(zhuǎn)染越低 (盡管這樣可能適于遞送除DNA外的其它試劑）。特定比率允許高DNA轉(zhuǎn)染和材料低毒性之間 的合適平衡。
[0047]在某些實(shí)施方式中，存在低PLGA濃度，從而PLGA-PEI (0.5:1的w/w)是水溶性材料， 而這顯著降低了 PEI的細(xì)胞毒性。然而，在一些情況中低PLGA濃度可能是合適的。
[0048] 在具體情況中，提供PLGA-PEI的PEI和伯胺濃度，從而提供對(duì)于具體的PLGA-PEI聚 合物的結(jié)構(gòu)的計(jì)算。
[0049] 本發(fā)明的實(shí)施方式允許容易地一步法制備PLGA-PEI/DNA納米顆粒，自組裝，不采 用有機(jī)溶劑或特殊介質(zhì)，和/或不采用除了水或介質(zhì)中的PLGA-PEI和DNA以外的其它添加 劑。所述制備允許簡易的大規(guī)模生產(chǎn)。
[0050] 本發(fā)明的納米顆粒在水或介質(zhì)中穩(wěn)定，從而在至少具體的實(shí)施方式中，許多天仍 無聚集物。所述DNA分子(作為試劑的示例)在所述納米顆粒中是穩(wěn)定的。在一些情況中，該 試劑完全包被在納米顆粒中，而在其它情況中，該試劑不完全包被在納米顆粒中。該試劑可 部分包被在所述納米顆粒中。在特定實(shí)施方式中，納米顆粒允許緩慢釋放長達(dá)2周供于細(xì)胞 轉(zhuǎn)染。在本發(fā)明的方面中，PLGA-PEI/DNA是在體外和體內(nèi)具有低毒性和高轉(zhuǎn)染的高效系統(tǒng)。 [00511本發(fā)明的PLGA-PEI實(shí)施方式優(yōu)于PEI且具有較低毒性和較好轉(zhuǎn)染。本發(fā)明的示例 性實(shí)施方式采用PLGA-PEI以向小鼠遞送GFP質(zhì)粒(僅舉例而言），導(dǎo)致GFP在肝、脾和胰腺中 的表達(dá)。相較于標(biāo)準(zhǔn)PEI/DNA遞送系統(tǒng)，PLGA-PEI系統(tǒng)得到改善。其它示例性的實(shí)施方式證 明，向腫瘤遞送RFP DNA，導(dǎo)致腫瘤中的RFP表達(dá)。在其它示例性的實(shí)施方式中，發(fā)明人遞送 了示例性的治療基因至胰腺癌，其抑制了腫瘤生長，甚至縮小了已生長腫瘤的尺寸。
[0052]本文所述的納米技術(shù)具有許多創(chuàng)新方面，包括與PLGA和PEI之間的化學(xué)反應(yīng)相關(guān) 的方法和組合物;對(duì)于帶有DNA荷載的PLGA修飾的PEI自組裝納米顆粒形成的有用的條件和 確認(rèn)；以及體外和體內(nèi)DNA遞送效率和低毒性。本發(fā)明納米技術(shù)可用于科學(xué)研究和臨床實(shí)踐 應(yīng)用，作為高效且安全的遞送系統(tǒng)，供于一種或多種基因或藥物或其它治療劑。
[0053] 本文所述的納米技術(shù)包括1-(3_氨基丙基)-4_甲基哌嗪(APMP)修飾的PLGA-PEI， APMP-PLGA-PEI的合成。APMP是已被用于共價(jià)修飾其它聚合物材料用于增強(qiáng)聚合物材料的 生物相容性和生物降解性質(zhì)的小分子。在具體的方面中，APMP與PLGA-PEI共聚物的偶聯(lián)增 強(qiáng)了其轉(zhuǎn)染效率。
[0054]抗體偶聯(lián)物的PLGA-PEI或APMP-PLGA-PEI的合成也涵蓋在本發(fā)明中，包括所得的 偶聯(lián)物組合物?？贵w可直接偶聯(lián)至PLGA-PEI或APMP-PLGA-PEI，例如通過雙功能聚乙二醇 (馬來酰亞胺-PEG-N-羥基琥珀酰亞胺），Mal-PEG-NHS?？贵w-PLGA-PEI或抗體-APMP-PLGA-PEI可用于特異性遞送。另一方面，源自蛋白G或蛋白A的Fc結(jié)合肽可首先通過Mal-PEG-NHS 偶聯(lián)至PLGA-PEI或APMP-PLGA-PEI，以制備通用抗體銜接子。Fc結(jié)合肽-PLGA-PEI或Fc結(jié)合 肽-APMP-PLGA-PEI可結(jié)合至任何特異性抗體，供于特異性遞送?？刹捎肏S-PEG-NHS，將抗體 通過S-S鍵偶聯(lián)至分子。
[0055] 表1 .FDA批準(zhǔn)的基于抗體的治療**


[0059] *被贊助商撤回
[0060] **http://www?免疫 logylink.com/FDA-APP_Abs.html(訪問日期2013年8月9 日； 參見免疫學(xué)鏈接網(wǎng)站）
[0061 ] 表2 ?嵌合單克隆抗體(〃-xi_〃)**


[0065] **http://www?免疫 logylink.com/FDA-APP_Abs.html(訪問日期2013年8月9 日； 參見免疫學(xué)連接網(wǎng)站）
[0066]治療劑或其它試劑
[0067]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述納米技術(shù)遞送系統(tǒng)允許遞送一種或多種治療劑或其 它試劑(包括，例如，診斷劑)至對(duì)該試劑有需要的個(gè)體。在具體情況中，所述系統(tǒng)允許遞送 多于一種試劑，并且所述多種試劑可以是或不是相同類型的試劑（例如，核酸或藥物）。因 此，在許多納米顆粒中，可以存在帶有多于一種試劑的納米顆粒的混合物，但其中各分開的 納米顆粒僅具有一種試劑;可向所述個(gè)體給予治療有效量的該試劑。在一些實(shí)施方式中，存 在帶有多于一種試劑的納米顆粒的混合物，但其中特定納米顆粒具有多于一種試劑。在任 何情況中，可向所述個(gè)體提供治療有效量的該試劑。
[0068] 該試劑可以是任何種類，只要PLGA-PEI納米顆粒能穩(wěn)定包含該試劑即可。在特定 實(shí)施方式中，該試劑可與DNA相互作用。在特定情況中，該試劑是核酸、小分子、蛋白質(zhì)、肽或 其混合物中的一種或多種。該試劑可以是藥物。具體的核酸示例包括寡核苷酸、miRNA、 8111?祖、811?祖、0嫩、1?嫩、1111?祖、〇0嫩、雙鏈核酸、單鏈核酸等。核酸的尺寸可以如大質(zhì)粒一般 大，或如小寡核苷酸一般小，此處僅作示例。在一些情況中，所述DNA是包含表達(dá)構(gòu)建體的載 體，所述表達(dá)構(gòu)建體用于表達(dá)一種或多種治療性多核苷酸或編碼治療基因產(chǎn)物的一種或多 種多核苷酸。
[0069] 在一些實(shí)施方式中，所述治療基因產(chǎn)物是實(shí)體，其降低至少部分(若非全部)癌基 因的表達(dá)。癌基因的示例包括Trop2、ZIP4、間皮素、親環(huán)素六、11111?-1963、11111?-363，并且該試 劑可部分或全部地降低這些基因中一種或多種的表達(dá)。該試劑的示例可以是反義RNA、 miRNA寡聚物或shRNA，用于沉默基因。在其它情況中，該試劑靶向腫瘤抑制基因，并且該試 劑增加腫瘤抑制基因的表達(dá)。腫瘤抑制劑的示例包括XIST、Jade-2或miR-198。
[0070] 具體的小分子可包括用作醫(yī)學(xué)病癥的藥物的那些。關(guān)于小分子藥物遞送，可采用 PLGA-PEI/DNA納米顆粒來遞送用于小分子(例如藥物）的載劑，用于化療和其它目的?？刹?用親水性藥物和/或疏水性小分子藥物，并且所述小分子藥物可與納米顆粒的DNA和/或PEI 部分直接相互作用，用于藥物遞送。結(jié)構(gòu)中包含氨基基團(tuán)的藥物通常是帶正電的，其可與帶 負(fù)電的DNA分子相互作用。其結(jié)構(gòu)中包含-C00H、-POf或其它酸性基團(tuán)的藥物可與所述納米 顆粒的PEI部分中的氨基基團(tuán)相互作用。核苷類似物藥物也可用PLGA-PEI/DNA納米顆粒荷 載。基于化學(xué)結(jié)構(gòu)，PLGA-PEI/DNA納米顆粒對(duì)于許多藥物而言是高效的遞送系統(tǒng)，至少包括 吉西他濱、AraC、PALA、長春新堿、甲氨蝶呤、長春花堿、紫杉醇、長春瑞濱、拓?fù)涮婵?、順鉑、 阿霉素、正定霉素等。
[0071] 最重要地，可采用PLGA-PEI、APMP-PLGA-PEI或抗體-PEG-PLGA-PEI (作為示例）以 遞送基因和化療藥物，用于基因治療和化療的聯(lián)合。PLGA-PEI易于與DNA形成納米顆粒，并 且許多小分子藥物可與PLGA-PEI/DNA納米顆粒的DNA或PEI部分相互作用，以形成復(fù)合物。 因此，DNA和藥物可同時(shí)被遞送至同一位置，供于聯(lián)合治療。簡言之，可將PLGA-PEI、小分子 藥物和待遞送的基因以所需比率混合在一起，以制備納米顆粒。
[0072]在某些實(shí)施方式中，所述試劑是蛋白質(zhì)或肽。所述蛋白質(zhì)或肽可以是治療和/或診 斷性的。在一些情況中，蛋白質(zhì)是對(duì)于該蛋白質(zhì)的遞送目標(biāo)個(gè)體而言天然內(nèi)源性的蛋白質(zhì)， 但內(nèi)源性水平是缺乏的或天然不足的，或其高于天然水平的存在或豐度是有益的。蛋白質(zhì) 或肽可通過銜接子肽-PEG-PLGA-PEI遞送（圖1C)。銜接子肽的序列可以是 CGGG⑶CAWHLGELVWCTGGGGC(SEQ ID NO: 1)，兩側(cè)均以胱氨酸結(jié)束。一側(cè)偶聯(lián)至PEG-PLGA-PEI，而另一側(cè)用于與遞送蛋白或肽中的胱氨酸通過S-S鍵偶聯(lián)，該S-S鍵由胱氨酸的硫氫基 (-SH)基團(tuán)的氧化形成。氧化劑，例如過氧化氫、碘，在堿或若干金屬（包括銅（II)和鐵 (III))復(fù)合物的存在下，可用于制備。一旦所述蛋白質(zhì)或肽通過二硫鍵偶聯(lián)至PLGA-PEI，所 述納米顆?？杀恢苽湟詭в泄δ苄曰蚍枪δ苄訢NA。當(dāng)所述納米顆粒通過內(nèi)吞被遞送進(jìn)入 細(xì)胞時(shí)，溶酶體酶能切斷二硫鍵從而釋放所述蛋白質(zhì)或肽至胞液或核，供于其功能 ((]〇11;[118等，1991;厶1'1111&。11&1&1]1等，2000)。
[0073] 在其它實(shí)施方式中，任何氨基酸可通過酰胺鍵偶聯(lián)至分子一PLGA-PEI，盡管該反 應(yīng)將需要活化。例如，在特定情況中，如果所述肽的C-末端被酯化，那么所述肽能夠通過酰 胺鍵直接偶聯(lián)至PEI (帶有游離-NH2)。
[0074] 所述納米顆粒中所用的該試劑可能有利于任何種類的醫(yī)學(xué)病癥。在特定實(shí)施方式 中，該醫(yī)學(xué)病癥是癌，例如腦、肺、乳腺、前列腺、胰腺、腎、結(jié)腸直腸、血液、骨、胃、脾、膽囊、 睪丸、卵巢、宮頸、垂體、甲狀腺、皮膚等的癌。在一些實(shí)施方式中，待治療的醫(yī)學(xué)病癥是由病 原體(包括細(xì)菌、病毒、真菌等)所致的感染。所述醫(yī)學(xué)病癥可以是損傷或創(chuàng)傷。其它治療劑， 包括鎮(zhèn)痛劑、利尿劑、糖尿病藥物、酸回流藥物、高血壓藥物、甲狀腺素、高膽固醇藥物等。所 述醫(yī)學(xué)病癥可以是心臟病、腎病、中風(fēng)、呼吸道疾病、敗血癥等。
[0075] 也可采用非治療性的其它試劑。在一些情況中，可采用所述納米技術(shù)來遞送一種 或多種診斷劑。所述試劑可帶有標(biāo)記物，例如，允許其在個(gè)體身體中被追蹤到的標(biāo)記物。在 特定實(shí)施方式中，可用熒光微球和納米顆粒來成像。示例性的標(biāo)記物和顏色包括藍(lán)色、綠 色、橙色、紅色和近紅外。
[0076] 在一些實(shí)施方式中，貫穿全身系統(tǒng)性地使用所述試劑，盡管在特定情況中，所述試 劑待施于身體的局部。
[0077] 除人疾病以外，所述納米顆粒遞送系統(tǒng)也可用于，例如，治療動(dòng)物疾病，和微生物 研究、細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型。
[0078] PLGA-PEI復(fù)合物的遞送
[0079]本發(fā)明的納米技術(shù)PLGA-PEI復(fù)合物的實(shí)施方式可以多種合適的方式遞送至需要 其的個(gè)體。在特定實(shí)施方式中，所述復(fù)合物可通過如下方式遞送:靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、透皮、鞘內(nèi)、 動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、肌內(nèi)、皮下、粘膜、經(jīng)口、局部(topically)、局 部性（local ly )、吸入(例如，氣溶膠吸入）、注射、輸注、連續(xù)輸注、局部灌注直接沖洗靶細(xì) 胞，通過導(dǎo)管，通過灌洗，以乳膏、以脂質(zhì)組合物形式(例如，脂質(zhì)體)或通過本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員已知的其它方法或前述方式的任何組合。
[0080]在至少具體的情況中，包括微生物和特異性抗原的疫苗可通過所述PLGA-PEI納米 技術(shù)遞送。疫苗的示例包括用于癌或感染(例如微生物感染）的那些。疫苗的示例包括活疫 苗、減毒疫苗;失活疫苗;亞基疫苗;類毒素疫苗;偶聯(lián)疫苗;DNA疫苗;和重組載體疫苗。疫苗 的示例包括針對(duì)任何種類的肝炎、輪狀病毒、DTaP、HIB、脊髓灰質(zhì)炎、MMR等的疫苗。
[0081]給予動(dòng)物或患者的本發(fā)明的組合物的實(shí)際劑量可根據(jù)物理和生理因素確定，例如 體重、病癥嚴(yán)重程度、待治療的疾病類型、先前或同期治療干預(yù)、患者的特發(fā)病和給予途徑。 取決于劑量和給予途徑，優(yōu)選劑量和/或有效量的給予次數(shù)可根據(jù)對(duì)象的響應(yīng)而不同。在任 何事件中，負(fù)責(zé)給予的醫(yī)師將確定組合物中活性成分的濃度，以及對(duì)于個(gè)體對(duì)象合適的劑 量。
[0082] 組合治療
[0083] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，除了其本身包含治療試劑的PLGA-PEI納米顆粒以 外，還可向個(gè)體提供一種或多種醫(yī)藥治療。所述一種或多種其它醫(yī)藥治療可適于癌癥治療、 細(xì)菌或病毒感染、遺傳疾病或任何其它種類的醫(yī)學(xué)狀況。
[0084] 在特定實(shí)施方式中，該聯(lián)合治療包含一種或多種抗癌試劑。"抗癌"試劑能對(duì)對(duì)象 的癌癥產(chǎn)生不利影響，例如通過殺死癌細(xì)胞、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、降低癌細(xì)胞生長速率、降低 轉(zhuǎn)移的發(fā)生率或數(shù)量、降低腫瘤尺寸、抑制腫瘤生長、減少對(duì)腫瘤或癌細(xì)胞的血液供給、促 進(jìn)對(duì)癌細(xì)胞或腫瘤的免疫應(yīng)答、阻止或抑制癌癥發(fā)展、或延長患癌對(duì)象的壽命。更一般地， 這些其他組合物會(huì)以有效殺死或抑制細(xì)胞增殖的組合量提供。該方法可涉及使所述細(xì)胞與 所述納米顆粒和所述試劑或多種因子同時(shí)接觸。這可通過使所述細(xì)胞與包括兩種試劑的單 一組合物或藥物制劑接觸，或通過使所述細(xì)胞與兩種不同的組合物或制劑同時(shí)接觸來實(shí) 現(xiàn)，其中一種組合物包含所述納米顆粒且另一種包含第二試劑。
[0085] 在本
【發(fā)明內(nèi)容】
中，設(shè)想所述納米顆粒治療可類似地與，例如，化療、放療或免疫治 療介入聯(lián)用?；蛘?，所述納米顆粒治療可以數(shù)分鐘至數(shù)周的間隔先于或晚于其它試劑使用。 在其中其它試劑與納米顆粒分開施予細(xì)胞的實(shí)施方式中，一般會(huì)確保在每次遞送的期間不 會(huì)顯著超時(shí)，從而所述試劑和表達(dá)構(gòu)建體仍能夠有利地對(duì)細(xì)胞發(fā)揮聯(lián)合作用。在這類情況 中，考慮可將細(xì)胞與兩種方式接觸，互相間隔在約12-24小時(shí)內(nèi)，并且更優(yōu)選互相間隔在約 6-12小時(shí)內(nèi)。然而在一些情況中，可能需要顯著延長治療時(shí)間，其中各給藥之間間隔數(shù)天 (2、3、4、5、6或 7)到數(shù)周（1、2、3、4、5、6、7或 8)。
[0086] 可采用多種聯(lián)合方式，例如其中納米顆粒治療是"A"且第二試劑，例如放療或化療 劑，是"B"：
[0087] A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
[0088] 在一些情況中，本發(fā)明的治療性納米顆粒對(duì)患者的給予將在給予化療劑的一般方 案之后進(jìn)行。預(yù)期所述治療循環(huán)在需要時(shí)重復(fù)。還預(yù)期各種標(biāo)準(zhǔn)治療法以及外科手術(shù)介入 可與所述的過度增殖性納米顆粒療法聯(lián)用。本發(fā)明具有對(duì)于動(dòng)物疾病的類似臨床應(yīng)用。
[0089] 化療
[0090] 癌癥療法可包括多種同時(shí)有基于化學(xué)物和放射的治療的組合療法。組合化療包括 例如，順鉑(CDDP)、卡鉑、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮 芥、白消安、亞硝基脲(nitrosurea)、更生霉素、柔紅霉素、阿霉素、博來霉素、普卡霉素、絲 裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受體結(jié)合試劑、紫杉醇、吉西他濱、諾 維本、法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、反鉬（transplatinum)、5-氟尿啼啶、長春新堿、長春堿和 甲氨蝶呤、或上述任何類似物或衍生變體。
[0091] 放療
[0092]造成DNA損傷并已廣泛使用的其他因素包括通常稱為y射線、X射線和/或?qū)⒎派?性同位素直接遞送給腫瘤細(xì)胞。也考慮其它形式的DNA破壞因素，如微波和紫外輻射。所有 這些因素很有可能會(huì)對(duì)DNA、DNA前體、DNA復(fù)制和修復(fù)、染色體裝配和維持造成較寬范圍的 損傷。X-射線的劑量范圍從延長期間（3至4周）50至200倫琴的每天劑量到2000至6000倫琴 的單次劑量。放射性同位素的劑量范圍差異很大，取決于所述同位素的半衰期、發(fā)射輻射的 強(qiáng)度和類型、以及腫瘤細(xì)胞的攝入。
[0093]本文所用術(shù)語"接觸"和"暴露"用于細(xì)胞時(shí)，描述治療構(gòu)建體和化療或放療試劑遞 送給靶細(xì)胞或放置成與所述靶細(xì)胞直接并置所用的方法。為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞殺死或靜止，以有 效殺死所述細(xì)胞或阻止其分裂的結(jié)合量將兩種試劑遞送給細(xì)胞。
[0094] 免疫治療
[0095] -般免疫治療法依賴于使用免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子靶向并破壞癌細(xì)胞。免疫效應(yīng)物 可為例如對(duì)腫瘤細(xì)胞表面的一些標(biāo)記特異的抗體?？贵w本身可用作治療效應(yīng)物或其可招募 其他細(xì)胞以實(shí)際影響細(xì)胞殺死?？贵w也可與藥物或毒素(化療劑、放射性核素、蓖麻毒素A 鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)偶聯(lián)并且僅用作靶向劑。替代地，所述效應(yīng)物可為攜帶表面分 子的淋巴細(xì)胞，所述分子直接或間接與腫瘤細(xì)胞靶標(biāo)相互作用。各種效應(yīng)細(xì)胞包括細(xì)胞毒 性T細(xì)胞和NK細(xì)胞。
[0096]因此，免疫治療可用作組合治療的部分，與Ad_mda7基因治療聯(lián)用。組合療法的一 般方法如下所述。一般而言，腫瘤細(xì)胞必須攜帶一些易于靶向的標(biāo)記物，即，不存在于大多 數(shù)其它細(xì)胞上。存在許多腫瘤標(biāo)記物并且這些標(biāo)記物中的任一種適用于在本發(fā)明的內(nèi)容中 靶向。常見的腫瘤標(biāo)記物包括癌胚抗原、前列腺特異抗原、泌尿腫瘤相關(guān)抗原、胎兒抗原、酪 氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化Lewi s抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受體、層粘 連蛋白受體、048和口155。
[0097] 基因療法
[0098] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，第二治療是第二基因治療，其中第二治療性多核苷酸在編 碼治療性多肽的部分或全部的第一治療性多核苷酸給予之前、之后或同時(shí)給予，或其中所 述多核苷酸本身具有治療性(例如1^1?嫩、811?嫩、8111?^)。編碼全長或截短的治療性多肽或 治療性多核苷酸的載體與本發(fā)明納米顆粒的遞送將對(duì)目標(biāo)組織具有聯(lián)合的抗過度增殖作 用。
[0099] 外科手術(shù)
[0100] 約60%的癌癥患者會(huì)經(jīng)歷一些類型的外科手術(shù)，包括預(yù)防性、診斷性或分期、治愈 性和緩解性外科手術(shù)。治愈性外科手術(shù)是可與其他治療法聯(lián)用的癌癥治療，所述治療法如 本發(fā)明的治療、化療、放療、激素治療、基因治療、免疫治療和/或其他治療。
[0101] 治愈性外科手術(shù)包括切除術(shù)，其中所有或部分癌組織被物理移除、切割和/或破 壞。腫瘤切除是指物理去除至少部分腫瘤。除了腫瘤切除術(shù)，外科手術(shù)治療包括激光手術(shù)、 冷凍手術(shù)、電外科手術(shù)和顯微鏡控制手術(shù)(莫氏(Mohs)手術(shù)）。還預(yù)期本發(fā)明可與淺表性癌、 初癌或附帶量的正常組織移除聯(lián)用。
[0102] 所有癌細(xì)胞、組織或腫瘤的部分切割后，可在體內(nèi)形成空腔。治療可通過灌注、直 接注射或局部區(qū)域應(yīng)用其他抗癌治療來實(shí)現(xiàn)。該治療可例如每1、2、3、4、5、6或7天或每1、2、 3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)月重復(fù)。這些治療也可用不同的劑量。 [0103]其他試劑
[0104]設(shè)想其它試劑可與本發(fā)明聯(lián)用以提高治療的治療效率。這些其他試劑包括免疫調(diào) 節(jié)劑、影響細(xì)胞表面受體和GAP連接上調(diào)的試劑、細(xì)胞抑制和分化試劑、細(xì)胞粘附抑制劑、或 增加所述過度增殖性細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)物的敏感性的試劑。免疫調(diào)節(jié)劑包括腫瘤壞死因子； 干擾素a、f3和y ;IL-2和其他細(xì)胞因子;F42K和其他細(xì)胞因子類似物;或MIP-l、MIP-lf3、MCP-l 、 RANTES 和其他趨化因子 。還考慮細(xì)胞表面受體或其配體如 Fas/Fas 配體、 DR4 或 DR5/TRAIL 的上調(diào)將通過對(duì)過度增殖細(xì)胞建立自分泌或旁分泌作用來增強(qiáng)本發(fā)明的凋亡誘導(dǎo)能力。通 過提高GAP接頭的數(shù)量將提高對(duì)相鄰過度增殖細(xì)胞群的抗-過度增殖作用。在其他實(shí)施方式 中，細(xì)胞抑制或分化試劑可與本發(fā)明聯(lián)用以改進(jìn)所述治療的抗過度增殖效力?？紤]細(xì)胞粘 附抑制劑來改善本發(fā)明的效力。細(xì)胞粘附抑制劑的例子為粘著斑激酶(FAK)抑制劑和洛伐 他汀。還可考慮增加過度增殖細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性的其它藥劑(如抗體c225)與本發(fā)明聯(lián)用 以提尚治療效力。
[0105] 激素治療也可與本發(fā)明聯(lián)用，或與先前所述的任何其癌癥治療聯(lián)用。所述激素的 應(yīng)用可在某些癌癥如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或?qū)m頸癌的治療中采用以降低某些激素如 睪丸激素或雌激素的水平或阻礙其效應(yīng)。該治療通常與至少一種其它癌治療聯(lián)用作為治療 選項(xiàng)或用于降低轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。
[0106] 本發(fā)明的試劑盒
[0107] 本文所述的任意組合物可包含于試劑盒中。在一個(gè)非限制性示例中，試劑盒中可 包含?1^^、？￡1^?10\?(：結(jié)合肽和/或一種或多種治療劑或其它試劑。也可包括用于將該納 米顆粒偶聯(lián)至另一種化合物的任何接頭。所述試劑盒將在合適的容器器具中包含其組分。 所述組分可被合適地分裝。所述試劑盒的組分可在水性介質(zhì)中或以凍干形式包裝。這些試 劑盒的容器用具通常包括至少一種小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其它容器用具，其中該組 分可放置，并優(yōu)選適當(dāng)分裝于其中。在試劑盒中存在超過一種組分的情況中，該試劑盒通常 還含有第二、第三或其他容器，其中可分開放置其他組分。然而，可在容器中包含組分的各 種組合。本發(fā)明的試劑盒通常還包含用于市售的封閉約束形式含有該組分容器的器具。此 類容器可包括注塑或吹塑的塑料容器，其中保留所需小瓶。
[0108] 當(dāng)在一種和/或多種液體溶液中提供試劑盒的組分時(shí)，液體溶液可以是水性溶液， 無菌水性溶液是特別優(yōu)選的?？蓪⑺鼋M合物配制成可注射的組合物。在該情況中，容器用 具本身可以是注射器、移液器和/或其他這類設(shè)備，從中可將制劑施用于身體的受感染區(qū) 域、注射到動(dòng)物中和/或甚至用于和/或與試劑盒的其他組分混合。
[0109] 然而，試劑盒的組分可以干粉形式提供。當(dāng)以干粉提供試劑和/或組分時(shí)，可通過 加入合適的溶劑來重建粉末。設(shè)想也可用另一種容器用具提供溶劑。
[0110] 不論容器的數(shù)量和/或類型，本發(fā)明的試劑盒還可包含，和/或包裝有，用于協(xié)助注 射/給予和/或?qū)⒆罱K組合物置于動(dòng)物身體中的器具。所述器具可以是注射器、移液管、鉗 子，和/或任何此類醫(yī)療上批準(zhǔn)的遞送載體。
[0111] 藥物制劑
[0112] 本發(fā)明的藥物組合物包含有效量的一種或多種組合物，其在一些實(shí)施方式中被溶 解或分散于藥學(xué)上可接受的載體中。本發(fā)明的實(shí)施方式包括將藥物(或任何治療和/或診斷 劑）封裝進(jìn)入微球和納米顆粒、微乳液（例如，以遞送不溶性活性藥物成分(API)或油性 API)、納米顆粒(表面修飾，例如，被覆和偶聯(lián)），及其給予(例如，經(jīng)口、舌下、可注射、皮下、 吸入和/或局部）。在特定實(shí)施方式中，藥物制劑包括藥物(或任何治療和/或診斷劑)的控釋 和緩釋。
[0113] 詞組"藥學(xué)或藥理學(xué)上可接受的"指分子實(shí)體和組合物在恰當(dāng)?shù)亟o予動(dòng)物，例如人 時(shí)不產(chǎn)生不利、過敏性或其它不良反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，含有至少一種組合物或其他活性成分 的藥物組合物的制備為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(《雷明頓藥物科學(xué)與實(shí)踐》），第21版，LWW出版社(Lippincott Williams and Wilkins)，2005所例示，其通過引用納入本文。另外，就動(dòng)物(如人)給藥而言，理解制備應(yīng)該 滿足由FDA官方生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)要求的無菌性、致熱原性、常規(guī)安全和純度標(biāo)準(zhǔn)。
[0114] 本文使用的"藥學(xué)上可接受載體"包含任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、表面活性 劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗菌劑、抗真菌劑）、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物 穩(wěn)定劑、凝膠、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、染料、諸如此類的物質(zhì)和其 組合，此應(yīng)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知（參見，例如，Remington ' s Pharmaceutical Sciences(《雷明頓藥物科學(xué)》），馬克出版公司（Mack Printing Company)，1990,第1289-1329頁，通過引用納入本文）。除非任何常規(guī)載體都與活性成分不相容，否則應(yīng)考慮在藥物 組合物中使用這些載體。
[0115] 所述組合物可以包含不同類型載體，這取決于其是否以固體、液體或氣溶膠形式 給藥和是否需要無菌用于所述給藥途徑如注射。本發(fā)明可通過如下方式遞送:靜脈內(nèi)、皮 內(nèi)、透皮、鞘內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、肌內(nèi)、皮下、粘膜、經(jīng)□、局部 (topica 11 y)、局部性(1 oca 11 y)、吸入(例如，氣溶膠吸入）、注射、輸注、連續(xù)輸注、局部灌注 直接沖洗靶細(xì)胞，通過導(dǎo)管，通過灌洗，以乳膏、以脂質(zhì)組合物形式(例如，脂質(zhì)體)或通過本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它方法或前述方式的任何組合(參見，例如，《雷明頓藥物科學(xué)》 (Remington's Pharmaceutical Sciences)，第18版?馬克出版公司，1990,其通過引用納入 本文）。
[0116] 所述組合物可以配制在游離堿、中性或鹽形式的組合物中。藥學(xué)上可接受的鹽包 括例如酸加成鹽（用蛋白質(zhì)組合物的游離氨基基團(tuán)形成的那些），或其用無機(jī)酸(例如鹽酸 或磷酸)或有機(jī)酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸)形成。用游離羧基形成的鹽還可源自無 機(jī)堿例如鈉、鉀、銨、鈣、或鐵的氫氧化物;或有機(jī)堿例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因。 配置后，溶液可以能夠與劑量配方相容的方式和有效的量給予。所述制劑易于在多種劑型 中給予，例如配制用于胃腸外給予，例如可注射溶液或用于遞送至肺的氣溶膠，或配制用于 經(jīng)消化道給予，例如藥物釋放膠囊等。
[0117] 進(jìn)一步根據(jù)本發(fā)明，適于給予的本發(fā)明組合物在藥學(xué)上可接受的載體中提供，采 用或不采用惰性稀釋劑。所述載體應(yīng)可被同化，并且包括液體、半固體，即糊狀或固體載體。 除非任何傳統(tǒng)介質(zhì)、試劑、稀釋劑或載體均對(duì)受者或?qū)ζ渲邪慕M合物的治療效果有害， 否則其適用于可給予的組合物中供于本發(fā)明方法的實(shí)踐。載體或稀釋劑的示例包括脂肪、 油、水、鹽水溶液、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、樹脂、粘合劑、填料等或其組合。所述組合物還可包含多種 抗氧化劑以延遲一種或多種組分的氧化。此外，可采用防腐劑來防止微生物作用，所述防腐 劑例如多種抗細(xì)菌和抗真菌試劑，包括但不限于對(duì)羥基苯甲酸酯類(例如，對(duì)羥基苯甲酸甲 酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯）、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其組合。
[0118] 根據(jù)本發(fā)明，所述組合物以任何方便且實(shí)用的方式與載體聯(lián)用，即，通過溶液、懸 液、乳化、摻混物、包封、吸收等。此類方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是常規(guī)的。
[0119] 在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，所述組合物與半固體或固體載體完全合并或混合。 所述混合可以任何方便的方式(例如研磨）進(jìn)行。還可向混合過程添加穩(wěn)定劑，以保護(hù)所述 組合物不在胃中損失治療活性，即，變性。用于所述組合物的穩(wěn)定劑的示例包括:緩沖劑、氨 基酸例如甘氨酸和賴氨酸、碳水化合物例如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽 糖、山梨醇、甘露醇等。
[0120] 在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明可涉及采用包含所述組合物、一種或多種脂質(zhì)以及水 性溶劑的藥物脂質(zhì)載體組合物。本文中所用的術(shù)語"脂質(zhì)"定義為包括特點(diǎn)為水不溶性和可 由有機(jī)溶劑萃取的任何寬范圍的物質(zhì)。該寬范圍的化合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且 本文中所用的術(shù)語"脂質(zhì)"不限于任何具體結(jié)構(gòu)。示例包括含有長鏈脂族烴的化合物及其衍 生物。脂質(zhì)可天然產(chǎn)生或是合成的（即，經(jīng)人工設(shè)計(jì)或生成）。然而，脂質(zhì)通常是生物物質(zhì)。生 物脂質(zhì)是本領(lǐng)域熟知的，并且包括例如，中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、固醇、萜、溶血脂質(zhì)、 鞘糖脂、糖脂、硫酯、具有醚和酯連接的脂肪酸的脂質(zhì)和可聚合的脂質(zhì)，及其組合。當(dāng)然，除 了本文具體描述的那些以外的，被本領(lǐng)域技術(shù)人員視作脂質(zhì)的化合物也涵蓋在本發(fā)明的組 合物和方法中。
[0121] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉可用于將組合物分散于脂質(zhì)載體中的技術(shù)范圍。例如， 所述組合物可分散于包含脂質(zhì)的溶液中，用脂質(zhì)溶解，用脂質(zhì)乳化，與脂質(zhì)混合，與脂質(zhì)合 并，共價(jià)結(jié)合至脂質(zhì)，以懸液形式包含在脂質(zhì)中，與膠束或脂質(zhì)體包含或復(fù)合，或在其它情 況下通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方式與脂質(zhì)或脂質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)。所述分散體可導(dǎo) 致或可不導(dǎo)致脂質(zhì)體的形成。
[0122] 給予動(dòng)物患者的本發(fā)明的組合物的實(shí)際劑量可根據(jù)物理和生理因素確定，例如體 重、病癥嚴(yán)重程度、待治療的疾病類型、先前或同期治療干預(yù)、患者的特發(fā)病和給予途徑。取 決于劑量和給予途徑，優(yōu)選劑量和/或有效量的給予次數(shù)可根據(jù)對(duì)象的響應(yīng)而不同。在任何 事件中，負(fù)責(zé)給予的醫(yī)師將確定組合物中活性成分的濃度，以及對(duì)于個(gè)體對(duì)象合適的劑量。
[0123] 在某些實(shí)施方式中，藥物組合物可包含，例如，至少約0.1 %的活性化合物。在其它 實(shí)施方式中，所述活性化合物可包含約2 % -約75 %的單元重量或例如，約25 % -約60 %，以 及從中衍生的任何范圍。自然地，各治療上有用的組合物中活性化合物的量可以這樣的方 式制備:在任何給定單位劑量的化合物中將獲得合適的劑量。多種因素，例如溶解性、生物 利用度、生物半衰期、給藥途徑、產(chǎn)品保質(zhì)期，以及其它藥學(xué)上的考量將油制備所述藥物制 劑的本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮，并且由此，優(yōu)選有多種劑量和治療方案。
[0124] 在其它非限制性示例中，每次給予的劑量還可包含約1微克/kg/體重，約5微克/ kg/體重，約10微克/kg/體重，約50微克/kg/體重，約100微克/kg/體重，約200微克/kg/體 重，約350微克/kg/體重，約500微克/kg/體重，約1毫克/kg/體重，約5毫克/kg/體重，約10毫 克/kg/體重，約50毫克/kg/體重，約100毫克/kg/體重，約200毫克/kg/體重，約350毫克/kg/ 體重，約500毫克/kg/體重，至約1000毫克/kg/體重或更多，以及從中衍生的任何范圍。在從 本文所列的數(shù)值衍生的范圍的非限制示例中，基于上文所述的數(shù)字，可給予約5mg/kg/體 重-約100mg/kg/體重，約5微克/kg/體重-約500微克/kg/體重等。
[0125] A.營養(yǎng)組合物和制劑
[0126] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，配制所述組合物以通過消化道途徑給予。營養(yǎng)途徑 包括其中所述組合物直接接觸消化道的所有可能的給予途徑。具體地，本文公開的藥物組 合物可經(jīng)口、口腔、直腸或舌下給藥。由此，這些組合物可與惰性稀釋劑或可同化的食用型 載體配制，或其可包封在硬殼或軟殼明膠膠囊中，或其可被壓制成片劑，或其可與食物直接 納入飲食。
[0127] 在某些實(shí)施方式中，所述活性化合物可納入賦形劑，并以可消化的片劑、含片、藥 片、膠囊、酏劑、懸液、糖衆(zhòng)、晶片等形式使用(Mathiowitz等，1997; Hwang等，1998;美國專利 號(hào)5,641，515;5,580,579和5,792,451，各自具體通過引用其全文納入本文）。所述片劑、藥 片、丸劑、膠囊等可包含如下組分:粘合劑，例如黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠或其組 合;賦形劑，例如磷酸二鈣、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂或其組 合;崩解劑，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸或其組合;潤滑劑，例如硬脂酸鎂;甜味劑， 例如蔗糖、乳糖、糖精或其組合;調(diào)味劑，例如薄荷、冬青油、櫻桃調(diào)味劑、橙調(diào)味劑等。當(dāng)所 述劑量單位形式是膠囊時(shí)，除了上述類型的材料以外，它可以包含液體載體?？梢源嬖诟鞣N 各樣的其它材料作為包衣或者來改變所述劑型的外形。例如，片劑，丸劑或膠囊可用紫膠、 糖或兩者同時(shí)被覆。當(dāng)所述劑型是膠囊時(shí)，除了上述類型的材料以外，它可以包含載體如液 體載體。明膠膠囊、片劑或丸劑可以經(jīng)腸溶型被覆。腸溶性包衣防止組合物在pH為酸性的胃 或上腸道處變性。參見例如，美國專利號(hào)5，629，001。在到達(dá)小腸后，其中的堿性pH將包衣溶 解，并允許所述組合物被釋放，并由特化細(xì)胞(例如，腸上皮細(xì)胞和派氏結(jié)(Peyer ' s patch) M細(xì)胞)吸收。酏劑糖漿可包含活性化合物蔗糖作為甜味劑，甲基和對(duì)羥基苯甲酸丙酯作為 防腐劑，染料和調(diào)味劑，例如櫻桃或橘子風(fēng)味。當(dāng)然，用于制備任何單位劑型的任何材料應(yīng) 是藥學(xué)上純的，且基于所用的量基本無毒性。此外，可將活性化合物納入緩釋制備物和制 劑。
[0128] 對(duì)于口服給予，本發(fā)明的組合物可替代性地納入一種或多種賦形劑，其可具有漱 口液、牙膏、含片、□服糖漿或舌下□服給予的制劑的形式。例如，可制備漱□液以將所需量 的活性成分納入合適的溶劑，例如硼酸鈉溶液(朵貝爾氏溶液）。或者，可將活性成分納入口 服溶液，例如包含硼酸鈉、甘油和碳酸氫鉀的口服溶液，或分散于牙膏，或以治療有效量添 加至可包含水、粘合劑、研磨劑、調(diào)味劑、發(fā)泡劑和致濕劑的組合物?；蛘撸鼋M合物可制 成置于舌下或在其它情況中溶解于口中的片劑或溶液形式。
[0129] 適于其它模式的消化道給予的其它制劑包括栓劑。栓劑是具有多種重量和外形的 固體劑型，通常為插入直腸用藥。插入后，栓劑在腔液中變軟、熔化或溶解。一般而言，對(duì)于 栓劑，傳統(tǒng)載體可包括，例如，聚二醇、甘油三酯或其組合。在某些實(shí)施方式中，栓劑可以從 混合物形成，包含例如活性成分范圍約0.5 % -約10 %，且優(yōu)選約1 % -約2 %的。
[0130] 胃腸外組合物和制劑
[0131] 在其它實(shí)施方式中，所述組合物可通過胃腸外途徑給予。本文中所用的術(shù)語"胃腸 外"包括繞過消化道的途徑。具體地，本文公開的藥物組合物可如下給予，例如但不限于，靜 脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)，美國專利號(hào)6,613,308,5,466,468,5,543， 158; 5，641，515;和5，399，363(其各自具體通過引用其全文納入本文）。
[0132] 活性化合物作為游離堿或藥學(xué)上可接受的鹽的溶液可在適于與表面活性劑(例如 羥丙基纖維素)混合的水中制備。分散體也可用甘油、液體聚乙二醇和它們?cè)谟椭械幕旌衔?制備。在常見的儲(chǔ)存和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物生長。適于注射用途 的藥品形式包括無菌水性溶液或者分散劑和用于臨時(shí)制備無菌可注射溶液或分散液的無 菌粉末(美國專利5,466,468，具體通過引用其全文納入本文）。在所有情況下，劑型都必須 無菌，并應(yīng)必須是易被注射的流體。它必須在制造和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定，并且必須在保存過程 中能夠抵抗微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是包含水、乙醇、多元醇（即甘油、丙 二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物以及植物油的溶劑和/或分散介質(zhì)。例如可通過 使用涂層如卵磷脂、保持所需粒度(在分散液的情況中）以及使用表面活性劑，來維持合適 的流動(dòng)性?？梢酝ㄟ^各種抗菌劑和抗真菌劑，例如，對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨 酸、硫柳汞等帶來對(duì)微生物作用的阻礙。在很多情況中，優(yōu)選包括等張劑，例如糖類或氯化 鈉。可通過將延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠用于組合物中來延長可注射組合物的 吸收。
[0133] 例如為了在溶液中胃腸外給藥，若需要?jiǎng)t所述溶液應(yīng)經(jīng)適當(dāng)緩沖，并且用充分的 鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這些具體水溶液特別適于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi) 給藥。就此而言，可用的無菌水性介質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開內(nèi)容已知的。例如，一 個(gè)劑量可溶于等滲溶液中，并加入皮下灌輸液體中，或在輸注的計(jì)劃位置注射(參見例如 《雷明頓藥物科學(xué)》第15版1035-1038和1570-1580頁）?；谥委熁颊叩牟“Y會(huì)需要對(duì)劑量 進(jìn)行變化。負(fù)責(zé)給藥的人在任何情況中均可確定個(gè)體對(duì)象的合適藥量。此外，就人的給藥而 言，制品應(yīng)當(dāng)滿足FDA生物制品標(biāo)準(zhǔn)部(Office of Biologies standards)要求的無菌性、 致熱原性、常規(guī)安全和純度標(biāo)準(zhǔn)。
[0134] 通過將合適溶劑中所需量的活性化合物摻入不同的其它上述組分后過濾滅菌制 得無菌注射液。通常，將不同的無菌活性成分納入含有堿性分散介質(zhì)和上述其它所需成分 的無菌載體中制備分散液。當(dāng)制備無菌注射液制備所需的無菌粉末時(shí)，優(yōu)選的制備方法是 真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，由之前無菌過濾的溶液得到活性組分和任何其它所需組分的粉 末。將粉末狀的組合物與液體載體(例如，水或鹽水溶液)合并，采用或不采用穩(wěn)定劑。
[0135] 其它各種藥物組合物和制劑
[0136] 在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，所述活性化合物可經(jīng)配制用于通過多種其它途徑給 予，例如，局部(即，透皮)給予、粘膜給予(鼻內(nèi)、陰道內(nèi)等)和/或吸入。
[0137] 用于局部給予的藥物組合物可包括配制用于加藥施用方式(例如，藥膏、糊乳膏或 粉末)的活性化合物。藥膏包括所有基于油質(zhì)的、吸附、乳液和水溶性的組合物，用于局部應(yīng) 用，而乳膏和洗液是僅包含乳液基的那些組合物。局部給予的藥物可包含穿透增強(qiáng)劑，以促 進(jìn)活性成分通過皮膚的吸附。合適的穿透增強(qiáng)劑包括甘油、醇、烷基甲基亞砜、啦咯烷酮和 月桂氮酮（luarocapram)。對(duì)于局部應(yīng)用的組合物而言，可能的基底包括聚乙二醇、羊毛脂、 冷膏和礦脂，以及任何其它合適的吸收物、乳液或水溶性軟膏基底。局部制劑還可包括保護(hù) 活性成分并提供均質(zhì)混合物所必需的乳化劑、凝膠劑，和抗微生物防腐劑。本發(fā)明的透皮給 予還可包括"貼片"的應(yīng)用。例如，所述貼片可在一段固定長度的時(shí)間內(nèi)以連續(xù)方式和預(yù)定 速率給予一種或多種活性物質(zhì)。
[0138] 在某些實(shí)施方式中，所述藥物組合物可通過滴眼液、鼻內(nèi)噴霧、吸入物，和/或其它 氣溶膠遞送載劑被遞送。用于將組合物通過鼻部氣溶膠噴霧直接遞送至肺的方法已描述 于，例如，美國專利號(hào)5,756,353和5,804,212(其各自具體通過引用其全文納入本文）。同樣 地，使用鼻內(nèi)微顆粒樹脂(Takenaga等，1998)和溶血磷脂酰膽堿-甘油化合物(美國專利號(hào) 5,725,871，具體通過引用其全文納入本文)的藥物遞送也是藥學(xué)領(lǐng)域中熟知的。同樣地，聚 四氟乙烯支持基質(zhì)形式的經(jīng)粘膜藥物遞送見述于美國專利號(hào)5,780,045(具體通過引用其 全文納入本文）。
[0139] 術(shù)語氣溶膠指的是，分散在液化或壓氣推進(jìn)劑中的細(xì)分的液體顆粒的固體的膠體 系統(tǒng)。本發(fā)明的用于吸入的典型氣溶膠將由活性成分在液體推進(jìn)劑或液體推進(jìn)劑和合適的 溶劑的混合物中的懸液組成。合適的推進(jìn)劑包括烴類和烴醚。合適的容器將視推進(jìn)劑的壓 強(qiáng)需要而變化。氣溶膠的給予將視患者年齡、體重和癥狀的嚴(yán)重程度和響應(yīng)而變化。 實(shí)施例
[0140] 納入下列實(shí)施例以顯示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)理解， 根據(jù)代表本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)技術(shù)的實(shí)施例中公開的技術(shù)能很好地實(shí)施本發(fā)明，從而可將其視 為實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選模式。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開應(yīng)理解，在不偏離本發(fā)明精神 和范圍的前提下，可對(duì)所公開的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行許多變化，同時(shí)仍能獲得相同或類似的 結(jié)果。
[0141] 實(shí)施例1
[0142] PLGA-PEI共聚物的制備
[0143] 聚（乳酸-共聚-乙醇酸）（PLGA)是食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的材料，其用于治 療裝置和遞送系統(tǒng)，因?yàn)槠渚哂猩锟山到庑?、生物相容性、低毒性和?yōu)越的藥代動(dòng)力學(xué)參 數(shù)。例如，PLGA作為藥物遞送納米顆?？杀苊獗痪W(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)消除，并在循環(huán)中長時(shí)間停 留。然而，PLGA荷載核酸的效率較低，歸因于其化學(xué)性質(zhì)。聚乙烯亞胺(PEI)可帶負(fù)電的核酸 磷酸酯基團(tuán)和帶正電的PEI胺基團(tuán)之間的靜電相互作用有效地結(jié)合并凝縮核酸，并通過形 成納米顆粒。PEI可通過胞吞將DNA遞送進(jìn)入細(xì)胞，并以pH依賴性的方式釋放DNA(Utsuno和 1]111(^，2010;31111等，2011 ;31111等，2012)。支化的？￡1(251(0&)是最常用的轉(zhuǎn)染試劑之一。然 而，PEI缺乏生物可降解部分，并且可造成高細(xì)胞毒性(Akinc等，2005;Moghimi等，2005)。 PEI的轉(zhuǎn)染率也在不同類型的細(xì)胞中有所不同。PE I作為體內(nèi)核酸遞送系統(tǒng)的藥代動(dòng)力學(xué)參 數(shù)并不喜人。
[0144] 因此，將PLGA與PEI相結(jié)合能夠產(chǎn)生新共聚物，其具有更好的利于核酸遞送的性 質(zhì)，包括高DNA荷載容量、有效DNA遞送和釋放至廣泛的細(xì)胞類型、改善的藥代動(dòng)力學(xué)和低毒 性。相較于非可降解形式，PEI可降解形式具有顯著改善轉(zhuǎn)染效率和更低的細(xì)胞毒性(Green 等，2007;Forrest等，2003)。出于該目的，本文中描述一種用于產(chǎn)生新PLGA-PEI共聚物的新 方法，所述新PLGA-PEI共聚物具有用于遞送試劑(例如核酸)的獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。
[0145] PLGA-PEI共聚物通過在如下示例性條件下，將PLGA和PEr混合于有機(jī)溶劑而直接 制備。PLGA(12-16kDa，交酯：乙交酯50:50m 〇l/m〇l，固有粘度0.50-0.65)獲自皮力賽斯公司 (Polysciences，Inc.)(賓夕法尼亞州沃靈頓）JEI，支化的，平均MW為約25kDa，和四氫咲喃 (THF)獲自西格瑪奧德里奇公司（Sigma-Aldrich)(密蘇里州圣路易斯）。通常地，將分別溶 解于10ml THF的250mg PEI和120mg PLGA在室溫（23°C)溫和攪拌下混合48小時(shí)。從THF溶液 分離軟沉淀物并用THF溶劑清洗兩次。然后，該固體在真空下室溫干燥過夜。這制成共聚物 PLGA-PEI (w/w 0 ? 5/1)。分別以PLGA/PEI重量比0 ? 5:1、1:1、2 ? 5:1和5:1，對(duì)應(yīng)摩爾比 1:1、2: 1、5:1和10:1，制備四種類型的PLGA-PEI共聚物。所述比率越高，共聚物在THF中的溶解性越 好，而在水中的溶解性越差。以重量比0.5:1采用PLGA和PEI的方案產(chǎn)生了含有平均約1個(gè) PLGA分子/PEI分子的共聚物偶聯(lián)物。對(duì)于共聚物PLGA-PEI( W/W 0.5/l)，PLGA-PEI共聚物偶 聯(lián)物中的PEI濃度測定為64.7± 1.6% (通過硫酸銅試驗(yàn)(von Harpe等，2000)測定），且伯胺 濃度檢測為49 ± 3 % (通過TNBS試驗(yàn)（Bui lock等，1997)檢測）。對(duì)于PLGA-PEI (w/w 1:1)， PLGA-PEI共聚物偶聯(lián)物中的PEI濃度測定為48.0±0.8%，而伯胺濃度檢測為9.5 ± 2.1 %。 對(duì)于PLGA-PEI (w/w 2:1)和PLGA-PEI (w/w 5:1)，伯胺濃度分別測定為 11 ? 3 % 和8 ? 2 % (表 3)〇
[0147] 表3.不同PLGA-PEI制劑中的PEI濃度和伯胺百分?jǐn)?shù)。PLGA和PEI的重量比為0.5:1 的方案產(chǎn)生含有平均約1個(gè)PLGA/PEI分子的偶聯(lián)物。PLGA-PEI偶聯(lián)物中的PE I濃度測定為 64.7±1.6% (采用硫酸銅試驗(yàn)），而伯胺濃度檢測為49±3% (通過TNBS試驗(yàn)）。
[0148] 基于對(duì)PLGA-PEI新共聚物的重量比和伯胺的分析，能夠確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。各支化 的PEI分子(25kDa)具有約214個(gè)伯胺、159個(gè)仲胺和212個(gè)叔胺。而各PLGA分子（12~16kDa) 平均具有215(184-246)個(gè)酯鍵。基于PLGA和PEI的分子量和PLGA-PEI(0.5: lw/w)中的PEI濃 度(64.7±1.6%)，該?11^^^1(0.5:1￥/￥)聚合物中？￡1分子包含約1個(gè)起始?11^。其伯胺濃 度經(jīng)檢測為49±3%，表明一半的伯胺與PLGA通過進(jìn)攻其酯鍵而發(fā)生反應(yīng)，并導(dǎo)致酰胺的形 成（圖1A)。起始PLGA分子通過PEI被片段化成為交酯-共聚-乙交酯單一單元，而PEI是完整 的；因此，約109個(gè)交酯-共聚-乙交酯單一單元通過酰胺鍵偶聯(lián)至一個(gè)PEI分子。PLGA-PEI共 聚物的這一化學(xué)結(jié)構(gòu)是先前未被確定的新材料。
[0149] 實(shí)施例2
[0150] APMP修飾的PLGA-PE I共聚物的制備
[0151] 1_(3_氨基丙基)_4_甲基哌嗪(APMP，阿法埃莎公司(Alfa Aesar)，馬薩諸塞州沃 德希爾市)是小分子，其已被用于共價(jià)修飾其它聚合物材料用于增強(qiáng)聚合物材料的生物相 容性和生物降解性質(zhì)（Bhise等，2010; Sunshine等，2012; Sunshine等，2012 ;Eltoukhy等， 2012; Sunshine等，2009;Lee等，2009)。然而，其尚未用于修飾PLGA或PEI以用于提高遞送效 率。在本發(fā)明的方面中，APMP與PLGA-PEI共聚物的偶聯(lián)增強(qiáng)了其轉(zhuǎn)染效率。
[0152] APMP能通過接頭直接偶聯(lián)至PEI，并通過修飾其生物利用度、生物降解且降低其毒 性來增強(qiáng)PEI的轉(zhuǎn)染。為了將APMP偶聯(lián)至PEI，APMP首先與1，4-丁二醇二丙烯酸酯在DMS0中 反應(yīng)2小時(shí)以制備1，4_丁二醇二丙烯酸酯-共聚-1-(3-氨基丙基)-4_甲基哌嗪，（Sunshine 等，2012)，其具有供于與PEI的伯胺在THF中反應(yīng)24小時(shí)的酯鍵。因此，APMP通過短接頭偶聯(lián) 至PEI，形成新共聚物材料APMP-CH2CH2-共聚-PEKAPMP的含量基于最終偶聯(lián)物中的所需的 摩爾比。在該材料中，APMP-CH2CH2-共聚-占據(jù)了小量的PE I的伯胺，因此，APMP - CH2 CH2-共 聚-PEI能夠進(jìn)一步以所需比率與PLGA在THF中反應(yīng)48小時(shí)，以制備APMP-PLGA-PEI (圖1B)。 從THF溶液分離軟沉淀物并用THF溶劑清洗兩次。然后，該固體在真空下室溫干燥過夜。基于 Cu(II)法分析(von Harpe等，2000)測定PEI濃度，并且，通過TNBS試驗(yàn)(Bullock等，1997)檢 測該修飾的PLGA-PEI中的伯胺。功能上，APMP-PLGA-PEI能夠有效地荷載DNA并在水性溶液 中形成納米顆粒。更重要地，APMP-PLGA-PEI更加有效地遞送DNA進(jìn)入細(xì)胞?；谠撛?，可 采用若干其它化合物來修飾PLGA-PEI，包括2-(3-氨基丙基氨基）乙醇、2-甲基-1，5-二氨基 戊烷、1_(3_氨基丙基）吡咯烷、4-氨基苯基二硫化物和胱胺(Bhise等，2010; Sunshine等， 2012)。
[0153] 或者，還以如下順序制備APMP修飾的PLGA-PEI共聚物(APMP-PLGA-PEI):先使APMP 和PLGA混合一天，然后與PEI在THF溶液中混合另兩天。APMP具有伯胺，其可使PLGA氨基化 (aminolyze)，因此偶聯(lián)至PLGA。當(dāng)該APMP修飾的PLGA(聚酯）與PEI混合時(shí)，PEI中的伯胺將 進(jìn)攻PLGA的酯鍵，因此，形成APMP修飾的PLGA-PEI。通常地，將分別溶解于5ml THF的20mg APMP和120mg PLGA在室溫下以溫和速率攪拌混合20小時(shí)。將該混合物添加至5ml THF中的 250mg支化的PEI，并室溫?cái)嚢?8小時(shí)。從THF溶液分離軟沉淀物并用THF溶劑清洗兩次。然 后，該固體在真空下室溫干燥過夜?；贑u(II)法分析(von Harpe等，2000)測定PEI濃度為 約60%，并且，檢測該修飾的PLGA-PEI中的伯胺是51.5±0.8% (Bullock等，1997)。因此，基 于該數(shù)據(jù)，約4%的4?]\^納入?11^^^1。
[0154] 實(shí)施例3
[0155] 抗體-結(jié)合的PLGA-PEI共聚物的制備
[0156] 歸因于其對(duì)靶標(biāo)的高選擇性、親和性和變異性，抗體完全利用靶向部分用于特異 性藥物遞送(Arruebo等，2009 ;Bae等，2012;Kang等，2012)?？贵w通常直接偶聯(lián)至遞送平臺(tái) 的表面。然而，化學(xué)偶聯(lián)通常會(huì)影響抗體的結(jié)合能力，這歸因于其抗原結(jié)合位點(diǎn)的變化，變 性或抗體的隨機(jī)取向。因此，開發(fā)了更有效方法以使抗體偶聯(lián)至遞送平臺(tái)，且不改變抗體性 質(zhì)。蛋白A/G廣泛用于抗體純化，通過特異性結(jié)合至抗體的片段可結(jié)晶區(qū)(Fc)來非共價(jià)捕獲 抗體，因此抗體的結(jié)構(gòu)和功能保持完全完整(Bae等，2012 ;Kang等，2012)。蛋白G或蛋白A的 小結(jié)合肽擬Fc結(jié)合肽可用于設(shè)計(jì)該遞送系統(tǒng)，其可提供用于結(jié)合任何抗體的銜接子，供于 特異性遞送。
[0157] 示例性的小結(jié)合肽，源自蛋白6的00六1見1^1^1(：1'(5￡〇10勵(lì):2)，對(duì)抗體具有高親 和性，并且已被插入蛋白質(zhì)籠狀物以結(jié)合抗體(Kang等，2012)。向結(jié)合肽的兩側(cè)添加其它甘 氨酸殘基，以增強(qiáng)其構(gòu)象柔性并提供完全可及性以接近抗體?？梢?或多于1個(gè)拷貝合成該 Fc結(jié)合肽，以增強(qiáng)結(jié)合力。可在所述結(jié)合肽的兩側(cè)添加額外的甘氨酸殘基并以胱氨酸結(jié)束， 例如，1 個(gè)拷貝：CGGGGDCAWHLGELVWCTGGGGC ( SEQ ID N0:l);2 個(gè)拷貝： 過雙功能PEG，Ma 1-PEG-NHS偶聯(lián)至PLGA-PEI (圖 1C)。
[0158] 可采用雙功能PEG(Mal-PEG-NHS)來將抗體或Fc結(jié)合肽片段連接至PLGA-PEI，以制 備特異性遞送試劑。在特定實(shí)施方式中，Mal-PEG-NHS與PLGA-PEI以所需的摩爾比在0.1M磷 酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，于室溫下，在氮?dú)庀路磻?yīng)3小時(shí)。Mal-PEG-PEI-PLGA可通過，例如， 凝膠滲透色譜純化。所述抗體或Fc結(jié)合肽片段可以所需的摩爾比添加至Mal-TOG-TOI-PLGA，并在氬氣下室溫反應(yīng)過夜。所述抗體-PEG-PEI-PLGA還可通過對(duì)0.1M NaCl透析來純 化。
[0159] 實(shí)施例4
[0160] PLGA-PEI/DNA納米顆粒的制備
[0161] 使PLGA-PEI (w/w至多 1:1)和APMP 修飾的 PLGA-PEI (w/w = 0.5:1)完全溶解于水中。 這些帶大量正電的聚合物適于基因遞送。PLGA-PEI/DNA納米顆粒以聚合物和DNA的不同比 率制備(通常是1.5:1-25:1)，通過將質(zhì)粒DNA溶液添加至PLGA-PEI聚合物的水溶液，然后渦 旋5秒。通常，將50yl水中的10yg質(zhì)粒DNA添加至50yl水中的25yg的PLGA-PEI，并渦旋5秒。使 用前，這些納米顆粒分散體在室溫下放置30分鐘。這些納米顆粒分散體無需進(jìn)一步處理即 可使用。同樣地制備APMP-PLGA-PEI/DNA納米顆粒。類似地，對(duì)于基因治療和化療聯(lián)合，待遞 送的DNA與PLGA-PEI、APMP-PLGA-PEI或抗體-PEG-PLGA-PEI，以及化療藥物混合在一起以制 備納米顆粒。PLGA-PEI或APMP-PLGA-PEI可荷載寬范圍的DNA，例如，25ug PLGA-PEI能夠遞 送l_15ug DNA至6孔板的1個(gè)孔中的細(xì)胞，并以相較于lipofectamine 2000和PEI的低毒性 高效轉(zhuǎn)染。
[0162] 對(duì)于用PLGA-PEI (0.5 : lw/w)和DNA形成的納米顆粒，納米顆粒的有效直徑范圍是 100nm-l 30nm，取決于PLGA-PEI和DNA的比率（表4)。
[0164] 表4. PLGA-PEI/DNA納米顆粒的表征。PLGA-PEI/DNA納米顆粒的尺寸通過動(dòng)態(tài)光散 射，采用ZetaPlus粒徑測量(布魯克海文儀器公司（Brookhaven Instruments Corp ?))測 定。
[0165] 25yg PLGA-PEI/10yg DNA的代表性尺寸分布示于圖2。多分散性介于0.1和0.3。 PEI的G電位僅為多至90mV，但如果與DNA復(fù)合，則降至60mV。相較于PEI/DNA，PLGA-PEI/DNA 具有低得多的G電位（約20mV)，指示PEI的正電荷被PLGA有效遮蔽。APMP修飾的PLGA-PEI/ DNA的粒徑分布和（電位列于表5。
[0166]
[0167] 表5.APMP-PLGA-PEI/DNA納米顆粒的粒徑和G電位。PLGA-PEI/DNA納米顆粒的尺寸 通過動(dòng)態(tài)光散射，采用ZetaPlus粒徑測量(布魯克海文儀器公司（Brookhaven Instruments Corp.))測定。
[0168] 對(duì)于重量比為0.5:1的PLGA與PEI或APMP-PEI的反應(yīng)時(shí)間，發(fā)明人觀察到，反應(yīng)在 室溫下THF中的混合后立即開始，因?yàn)樵撊芤鹤兊貌磺宄海?，產(chǎn)物不溶于THF。所有產(chǎn)物在 4 8小時(shí)沉淀。可如果在短時(shí)間（例如1小時(shí)、5小時(shí)或2 4小時(shí)）停止該反應(yīng)，則可測試產(chǎn)物性 質(zhì)。在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，反應(yīng)時(shí)間是重要的。因?yàn)镻EI將大PLGA斷裂成偶聯(lián)至PEI的 小交酯-共聚-乙交酯單一單元，來自該反應(yīng)物(PLGA和PEI)的終產(chǎn)物在THF中具有不同溶解 性。如果該反應(yīng)在1小時(shí)、5小時(shí)或24小時(shí)中停止，該反應(yīng)尚未結(jié)束，在某些實(shí)施方式中，從而 產(chǎn)物可與本文中提供的那些具有不同結(jié)構(gòu)。在大多數(shù)文獻(xiàn)中，PLGA和PEI在有機(jī)溶劑中混合 小于1小時(shí)，然后傾倒進(jìn)入表面活性劑溶液(Bivas-Benita等，2004 ;Nam等，2003; Shau等， 2012; Gargouri等，2011; Bivas-Benita等，2009)。在文獻(xiàn)中，沒有論文報(bào)道PLGA和PEI混合 物的最終結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，不同反應(yīng)時(shí)間可能會(huì)獲得不同產(chǎn)物。在本技術(shù)中， PLGA和PEI反應(yīng)48小時(shí)且反應(yīng)完全，因此，形成均一的產(chǎn)物。
[0169] 對(duì)于反應(yīng)溫度，可以較低或較高溫度測試反應(yīng)。對(duì)于起始材料PLGA，采用PLGA(50: 50)(12-16kDa，交酯：乙交酯50:50mol/mol，靜脈內(nèi)（i .v. )0.50-0.65)和PLGA(50:50， llOkDa)。生成均一產(chǎn)物。在特定實(shí)施方式中，具有不同分子量和交酯：乙交酯比率的其它 PLGA制備類似材料但一些性質(zhì)可能稍有不同?？刹捎貌煌琍LGA聚合物合成PLGA-PEI。對(duì)于 PEI，在具體的實(shí)施方式中，其為具有多個(gè)伯胺的支化形式。然而，市售來源的支化的PEI也 具有不同分子量，包括(不限于)800，1200，1800，2500，5000，25000 和60000kDa。
[0170] PLGA與PEI的比率是影響產(chǎn)物性質(zhì)的另一項(xiàng)因素。支化的PEI是良好的DNA遞送載 體，但其毒性過高。PLGA曾被用于修飾PEI，通過將PLGA單一單元偶聯(lián)至PEI以降低其毒性并 改善遞送性質(zhì)/或過程。如果PLGA與PEI的比率過高，PEI的大多數(shù)伯胺將被PLGA片段占據(jù)， 由此會(huì)降低DNA荷載容量和轉(zhuǎn)染效率。然而，若其過低，PEI無法被PLGA片段良好遮蔽，該共 聚物仍對(duì)細(xì)胞具有高毒性。PLGA與PEI的比率的具體條件可能是有用的。此外，文獻(xiàn)方法采 用少于 15 % 的PEI 以制備PLGA-PEI (Bivas-Benita等，2004; Nam等，2003 ; Shau等，2012 ; Gargouri等，2011;Bivas-Benita等，2009)。用較少PEI含量制備的PLGA-PEI的結(jié)構(gòu)完全不 同于用高PEI含量制備的那些。例如，在現(xiàn)有材料PLGA-PEI (0.5/1 w/w)中，約50 %的PEI的伯 胺通過酰胺鍵與PLGA交酯-共聚-乙交酯單一單元偶聯(lián);其它50%的PEI的伯胺仍然游離。如 果PLGA與PEI的比率增加至1:1或更高(w/w)，90%的PEI的伯胺將被PLGA片段占據(jù)。此外，如 果采用更多PLGA含量或更少PEI含量，PLGA片段可變得更大，導(dǎo)致不同結(jié)構(gòu)。
[0171] 合成的APMP修飾的PLGA-PEI的遞送性質(zhì)優(yōu)于PLGA-PEI和缺乏APMP的那些。APMP已 被偶聯(lián)至其它聚合物以增加細(xì)胞攝取(Sunshine等，2012)。與APMP具有類似性質(zhì)的其它化 學(xué)品也可偶聯(lián)至PLGA-PEI以遞送核酸和其它分子至細(xì)胞或動(dòng)物?？捎?-(3_氨基丙基氨基） 乙醇、2-甲基-1，5-二氨基戊烷、3-氨基-1-丙醇、4-氨基-1-丁醇、5-氨基-1-戊醇、1-( 3-氨 基丙基)吡咯烷、4-氨基苯基二硫化物和胱胺來合成修飾的PLGA-PEI(Sunshine等，2012)。
[0172] 實(shí)施例5
[0173] PLGA-PEI/DNA納米顆粒的合成和尺寸分布
[0174] 提供PLGA-PEI/DNA的制備。PLGA-PEI(w/w至多1:1)是水溶性的。PLGA-PEI與質(zhì)粒 DNA在普通（plain)培養(yǎng)基或水中的混合導(dǎo)致形成納米顆?；驈?fù)合物。對(duì)于用PLGA-PEI (0 ? 5:1 w/w)和DNA形成的納米顆粒，納米顆粒的有效直徑范圍是100nm-l 30nm，取決于PLGA-PEI和DNA的比率(表4)。25yg PLGA-PEI/1 Oyg DNA的代表性尺寸分布示于圖2。多分散性介 于0.1和0.3JEI的G電位僅為多至90mV，但如果與DNA復(fù)合，則降至60mV。尖峰指示顆粒具有 約llOnm的均一尺寸。
[0175] 除了質(zhì)粒DNA的遞送之外，該P(yáng)LGA-PEI遞送系統(tǒng)還用于遞送寡核苷酸DNA或RNA(單 鏈或雙鏈），用于治療目的。為表征該用途，形成具有不同量的單鏈寡聚DNA引物(23個(gè)堿基） 和測試的尺寸分布的PLGA-PEI 1LGA-PEI (25yg)和5yg寡聚DNA沒有形成納米顆粒;而PLGA-PEI (25yg)和10yg寡聚DNA形成較大的顆粒（大于250nm，小于900nm)(圖3A);且PLGA-PEI (25 yg)和15yg寡聚DNA形成較小顆粒（大于1 OOnm，小于250nm)(圖3B)。另一方面，PLGA-PEI (25y g)和20~35yg雙鏈寡聚DNA形成納米顆粒(約500nm)。
[0176] 1-(3_氨基丙基）-4_甲基哌嗪修飾的PLGA-PEI共聚物(APMP-PLGA-PEI)通過將 APMP經(jīng)接頭直接偶聯(lián)至PEI然后與PLGA反應(yīng)來制備。APMP修飾的PLGA-PEI/DNA的粒徑分布 和G電位列于表5。例如，荷載10yg質(zhì)粒DNA的15、20、25、30或35邱六?]\〇 3-?1^^-?￡1可形成粒 徑介于118和140nm之間的納米顆粒。
[0177] 實(shí)施例6
[0178] 通過光學(xué)檢測的PLGA-PEI的DNA荷載率和PLGA-PEI的DNA保留
[0179] 納米顆粒的DNA荷載率通過分光光度法和凝膠電泳檢測。納米顆粒采用50yl水中 的l〇yg質(zhì)粒DNA和50yl水中的0-30yg的PLGA-PEI制備，并制成總計(jì)lOOyl溶液。這些納米顆 粒分散體在使用前于室溫下保持30分鐘。50iU的各分散體經(jīng)等分并以15krpm離心 (Eppendorf，離心機(jī)5424)10分鐘。采用安捷倫8453分光光度計(jì)，在26〇11111檢測上清液的吸光 度。凝膠電泳在包含25nM溴化乙錠的0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行。各泳道上樣與5iU帶負(fù)電的 染料混合的l〇yl的上述顆粒溶液。凝膠在80mV跑動(dòng)45分鐘，并在VersaDoc成像系統(tǒng)上采用 軟件"Quantity 0ne4.6.7"，美國伯樂公司（Bio-RAD)成像。
[0180]光學(xué)檢測能夠測定溶液中懸浮的游離DNA或聚合物/DNA納米顆粒（圖4A)。顯示對(duì) 于10yg DNA與0-30yg PLGA-PEI而言，隨著聚合物增加至15yg，溶液中的DNA從100減少至 零，然后當(dāng)聚合物濃度增加時(shí)增加。這指示帶負(fù)電的DNA分子被帶正電的聚合物中，然后顆 粒形成并離心，然而，采用約多的聚合物，該復(fù)合物具有額外電荷，這使顆粒在水性溶液中 可溶。這并不意味指DNA在溶液中是游離的。由于能夠從凝膠電泳觀察到，在0.5: l(w/w)比 率下，PLGA能夠保留大多數(shù)DNA，但其在低l:l(w/w)比率下能夠保留全部DNA，圖4B。因此，在 該比率下，DNA荷載是100%。采用越多的PLGA-PEI，帶有越多正電的聚合物將結(jié)合DNA并使 其凝縮。因此，采用DNA 10yg+15yg PLGA-PEI或如上所述，所有材料有效地形成具有可變尺 寸和水溶性的納米顆粒。
[0181] 實(shí)施例7
[0182] PLGA-PEI/DNA納米顆粒的直接觀察
[0183] 顆粒圖像用掃描電子顯微鏡(SEM)檢測。采用PLGA-PEI(64%PEI)和綠色熒光蛋白 質(zhì)粒DNA(4.7kbp)在氮/磷(N/P)比率為7.4、12.3和17.2下制備樣品。當(dāng)0嫩用？11^^^1以~/ P為7.4凝縮時(shí)，清楚顯示盡管DNA仍成型但DNA被聚合物包裹，獲得約150-230nm的顆粒尺寸 (圖5A)。然而，采用越多的PLGA-TOI，顆粒看上去越呈固體且剛性，并且隨著N/P增加至 12.2，尺寸下降至100~150nm(圖5B)。當(dāng)N/P增加至17.2時(shí)，顆粒變成球形，且尺寸減小至約 50nm(圖5C)。因此，PLGA-PEI是與DNA有效凝縮并且控制了顆粒尺寸的聚合物。越多的聚合 物產(chǎn)生越小尺寸的納米顆粒。顆粒尺寸是遞送系統(tǒng)的一項(xiàng)重要參數(shù)。不同應(yīng)用需要特定的 納米顆粒尺寸用于遞送。本發(fā)明能夠容易地控制PLGA-PEI納米顆粒的尺寸。
[0184] 實(shí)施例8
[0185] PLGA-PEI/DNA納米顆粒的體外細(xì)胞毒性
[0186] 在人胰腺癌細(xì)胞系(PANC-1細(xì)胞）中研究PLGA-PEI/DNA納米顆粒和PEI/DNA復(fù)合物 的細(xì)胞毒性。細(xì)胞用納米顆粒在10%FBS DMEM培養(yǎng)基中處理過夜，然后移除培養(yǎng)基并用MTT (2 % FBS培養(yǎng)基中的lmg/ml)處理細(xì)胞兩小時(shí)，然后添加100y 1 SDS/DMF。板在37C孵育過夜， 并在570nm處通過光學(xué)密度測定濃度。MTT試驗(yàn)是比色試驗(yàn)，用于檢測細(xì)胞酶將四唑染料 (MTT)還原成其不溶性甲臘(formazan)并呈現(xiàn)紫色的能力。該試驗(yàn)檢測存在的活細(xì)胞的數(shù) 量。
[0187] 質(zhì)粒DNA量固定在lyg/孔，并且不同聚合物和DNA采用相同的PEI與DNA比率（即，相 同的N/P比率），與PLGA-PEI做比較（圖6)。研究1:1 -4:1的PE I與DNA的比率。MTT測試結(jié)果指 示，相較于未處理的細(xì)胞，PEI與DNA比率多至3:1的PLGA-PEI/DNA復(fù)合物不具有毒性或具有 較小毒性。然而，采用PEI/DNA復(fù)合物，PEI與DNA比率為2:1時(shí)，失去了大約一半的細(xì)胞活力。 因此，PLGA-PEI/DNA納米顆粒的PLGA組分對(duì)于PEI-誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性而言具有保護(hù)作用。因 此，在相同的PEI和DNA含量和條件下，PLGA-PEI/DNA遞送系統(tǒng)的毒性低于PEI/DNA遞送系 統(tǒng)。
[0188] 實(shí)施例9
[0189] PLGA-PEI/DNA(EGFP)納米顆粒的體外轉(zhuǎn)染效率
[0190] 胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞在10%的血清的存在下培養(yǎng)。所述細(xì)胞用10%FBS DMEM 培養(yǎng)基中的納米顆粒處理過夜，然后培養(yǎng)基用新鮮培養(yǎng)基替代，并且再孵育一天。評(píng)價(jià)與編 碼綠色熒光蛋白（GFP)的質(zhì)粒DNA復(fù)合的PLGA-PEI納米顆粒在PANC-1細(xì)胞中于10%的FBS存 在下的轉(zhuǎn)染效率，并將其與Lipofectamine/DNA和PEI/DNA遞送系統(tǒng)做比較（圖7A)。在PANC-1細(xì)胞中，PLGA-PEI/DNA納米顆粒的轉(zhuǎn)染活性優(yōu)于PEI/DNA復(fù)合物，并類似于 Lipofectamine/DNA。此外，細(xì)胞中采用PLGA-PEI/DNA的GFP表達(dá)較在那些細(xì)胞中采用PEI/ DNA 或 1 ipof ectamine/DNA 而言更長久。
[0191] APMP(l-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪）用于共價(jià)連接至PLGA并配制APMP-PLGA-PEI。 該新材料有效荷載DNA并形成納米顆粒(表5,圖4B)。測試該新材料的納米顆粒形成和向胰 腺癌細(xì)胞（PANC-1)的GFP質(zhì)粒遞送（圖7B)，并且與相同條件（5yg質(zhì)粒-GFP DNA)下 Lipofectamine 2000、？￡1、？11^^^1做比較。明顯地4?]\03-?11^^^1/6??質(zhì)粒0嫩的效率高 于PLGA-PEI、PEI和Lipofectamine 2000遞送系統(tǒng)。
[0192] 不同類型的細(xì)胞響應(yīng)不同轉(zhuǎn)染試劑具有不同轉(zhuǎn)染率。熟知的是，在向人臍靜脈內(nèi) 皮細(xì)胞(HUVEC)遞送基因方面，Lipofectamine 2000并不有效(約2%)。研究了PLGA-PEI/質(zhì) 粒DNA納米顆粒在HUVEC細(xì)胞中的基因遞送效率，并與相同條件下的Lipof ectamine 2000做 比較。HUVEV培養(yǎng)于10%FBS內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(EBM-2加有補(bǔ)充物，Lonza)中。細(xì)胞用PLGA-PEI/質(zhì)粒 DNA(25yg PLGA-PEI/包含 GFP 基因的 10yg 質(zhì)粒 DNA)或 Lipof ectamine 2000/10yg DNA處理過夜;然后細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基再培養(yǎng)一天。拍攝熒光圖像以指示GFP蛋白的轉(zhuǎn)染率 和表達(dá)。HUVEC中，PLGA-PEI納米顆粒的轉(zhuǎn)染率比Lipofectamine 2000高得多（圖7C)。作為 新藥物遞送系統(tǒng)，PLGA-PEI納米顆粒有效于遞送基因或藥物至通過其它遞送系統(tǒng)難以轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞，例如HUVEC。因此，PLGA-PEI遞送系統(tǒng)顯著優(yōu)于其它遞送系統(tǒng)，例如Lipof ectamine 2000 〇
[0193] 實(shí)施例10
[0194] PLGA-PEI/DNA納米顆粒:小鼠中的毒性研究
[0195] 不推薦Lipofectamine 2000用于體內(nèi)，因?yàn)槠鋵?duì)血紅細(xì)胞和其它細(xì)胞有毒性。僅 一些脂質(zhì)體制劑和PEI可用于體內(nèi)；但其毒性是眾所周知的。將PLGA-PEI/DNA的體內(nèi)毒性與 PE I /DNA做比較。對(duì)于PE I /DNA遞送系統(tǒng)，所有小鼠（n = 3)在尾靜脈注射以1.5:1的w/w比與 PEI(75yg)復(fù)合的50yg DNA之后死亡；而所有小鼠（n = 3)在尾靜脈注射與PLAE-PEI(125yg) 復(fù)合的50yg DNA之后存活。此外，接受了與PLGA-PEI(250yg)復(fù)合的100yg DNA的所有小鼠 (n = 8)存活。接受了與PLGA-PEI(500yg)復(fù)合的200yg DNA的小鼠（n = 4)有50%存活。因此， PLGA-PEI /DNA顯示的體內(nèi)毒性遠(yuǎn)小于PE I /DNA。PLGA顯著地降低了 PE I相關(guān)的體內(nèi)毒性。這 是本發(fā)明用于體外和體內(nèi)基因或藥物遞送應(yīng)用的一項(xiàng)主要優(yōu)勢(shì)。
[0196] 實(shí)施例11
[0197] PLGA-PEI/紅色熒光蛋白（RFP)DNA納米顆粒在小鼠模型中的遞送效率
[0198] 采用PLGA-PEI作為遞送系統(tǒng)，通過尾靜脈注射向小白鼠遞送紅色熒光蛋白（RFP) 質(zhì)粒DNA，以研究小鼠器官中的DNA轉(zhuǎn)染，并與PEI/DNA遞送做比較。在5天內(nèi)向小鼠注射三個(gè) 劑量的與PLGA-PEI或PEI聯(lián)合的30yg DNA，然后，在第7天處死小鼠，并通過紅色熒光檢測器 官組織的DNA轉(zhuǎn)染。對(duì)于PLGA-PEI/DNA處理的小鼠，器官例如肝、脾和胰腺顯示強(qiáng)紅色熒光； PE I /DNA處理的小鼠僅顯示肝、脾和胰腺中的弱紅色熒光（圖8)。因此，在體內(nèi)，PLGA-PE I遞 送系統(tǒng)遠(yuǎn)比基于PEI的遞送系統(tǒng)高效。
[0199] 此外，在裸小鼠模型中的胰腺腫瘤(作為示例）中測試PLGA-PEI/DNA系統(tǒng)。裸小鼠 用另一種人胰腺癌細(xì)胞系(AsPC-1細(xì)胞)皮下注射，兩周內(nèi)腫瘤生長出來。通過向腫瘤直接 注射，采用25yg PLGA-PEI并遞送10yg RFP NDAJ天后，取出腫瘤，并在腫瘤中發(fā)現(xiàn)強(qiáng)紅色 熒光，指示腫瘤組織內(nèi)部的高DNA轉(zhuǎn)染效率(圖9)。
[0200] 實(shí)施例12
[0201] 載有miR-198的PLGA-PEI納米顆粒的靜脈內(nèi)（IV)遞送降低了原位胰腺癌模型中的 腫瘤荷載和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散
[0202] 先前的研究顯示間皮素(MSLN)過表達(dá)和miR-198下調(diào)導(dǎo)致胰腺癌(PC)細(xì)胞的體外 侵入和轉(zhuǎn)移增加和體內(nèi)腫瘤擴(kuò)散的增加;并且miR-198重建能夠減少轉(zhuǎn)移擴(kuò)散和腫瘤體積。 考慮通過PLGA-PEI納米顆粒治療性遞送miR-198能否減少M(fèi)SLN-過表達(dá)PC細(xì)胞在原位PC腫 瘤模型中的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。裸小鼠用胰腺癌細(xì)胞(Mia-MSLN)植入兩周，并分成兩組。對(duì)照小鼠通 過尾靜脈注射3次/周，持續(xù)3周，接受PLGA-PEI/空載體質(zhì)粒(50邱）；處理的小鼠通過尾靜脈 注射3次/周，持續(xù)3周，接受PLGA-PEI/miR-198質(zhì)粒(50yg)。所有動(dòng)物在6周時(shí)處死。熒光成 像（圖10A)和手術(shù)切除（圖10B)下觀察小鼠的腫瘤尺寸和轉(zhuǎn)移。數(shù)據(jù)顯示，載有miR-198的 PLGA-PEI納米顆粒的靜脈內(nèi)（IV)遞送顯著地減少了原位胰腺癌模型中的腫瘤荷載和轉(zhuǎn)移 擴(kuò)散。
[0203] 實(shí)施例13
[0204] 載有miR-198的PLGA-PEI納米顆粒的腹膜內(nèi)（IP)遞送和吉西他濱協(xié)同地降低了原 位胰腺癌模型中的腫瘤荷載和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散
[0205] 通過將3xl06胰腺細(xì)胞系（MIA-MSLN-GFP細(xì)胞）直接注射進(jìn)入胰腺來植入常位腫 瘤。腫瘤細(xì)胞植入后兩周，在3個(gè)組(4只小鼠/組）中進(jìn)行處理。對(duì)照小鼠不接受任何處理。吉 西他濱小鼠通過腹膜內(nèi)注射3次/周，持續(xù)3周，接受臨床化療試劑吉西他濱(50mg/kg體重）。 吉西他濱+miR-l98小鼠通過腹膜內(nèi)注射3次/周，持續(xù)3周，接受吉西他濱(50mg/kg體重）和 PLGA-PEI/miR-198質(zhì)粒(50mg)的組合。所有動(dòng)物在6周時(shí)處死。熒光成像（圖11A)和手術(shù)切 除（圖11B)下觀察小鼠的腫瘤尺寸和轉(zhuǎn)移。數(shù)據(jù)顯示，采用吉西他濱和PLGA-PEI納米顆粒包 封的miR-198的聯(lián)合治療有效地降低了原位PC小鼠模型中的胰腺癌生長和轉(zhuǎn)移。
[0206] 實(shí)施例14
[0207] 治療性XIST片段和基于PLGA-PEI的遞送系統(tǒng)用于胰腺癌的治療
[0208]胰腺癌(PC)是美國癌癥死亡率的第四主要原因。評(píng)估指示，在2014,有約46,420例 新病例將被診斷，而39,590名人類將死于PC。大多數(shù)患者被診斷患有晚期PC，并且不符合手 術(shù)切除條件。PC患者的死亡率在過去二十年并未得到顯著改善;PC的五年存活率仍保持低 于5%。急需對(duì)于PC的有效治療。PC的起始和進(jìn)展涉及兩步遺傳變異累積，例如導(dǎo)致腫瘤抑 制劑基因失活和癌基因活化的點(diǎn)突變、染色體易位和基因拷貝數(shù)變化。
[0209] 人X染色體攜帶大約1，500個(gè)基因，其中一些代表人類乳腺、卵巢、前列腺、睪丸、 肺、肝、結(jié)腸、皮膚、腎和其它器官癌癥中觀察到的遺傳變異的可能位點(diǎn)。在女性中，一拷貝 的X染色體通過若干機(jī)理正常失活，包括DNA甲基化和乙?；蛔?，和XI ST (X-失活-特異性 轉(zhuǎn)錄)RNA(-種沒有編碼能力的17kb剪接和聚腺苷酸化的RNA)的獨(dú)特功能。XIST RNA保持 受限于核，其在該處以順式分布在失活的X染色體上。在女性中，已發(fā)現(xiàn)XIST RNA的若干剪 接同種型，包括 AK054860(2.659kb，外顯子 6的部分）、AK025198(2.176kb)和 X56199 (1.614kb)。在男性中，XIST不表達(dá)，除了在睪丸中的生殖細(xì)胞中。已在女性中的一些乳腺、 卵巢和宮頸癌中觀察到XIST，并且其似乎與較差的癌癥預(yù)后相關(guān)聯(lián)。
[0210] 在XIST區(qū)域有新的發(fā)現(xiàn)，其在大多數(shù)女性人PC組織和癌細(xì)胞系中顯著下調(diào)（圖 13)。更重要地，通過施加XIST RNA的強(qiáng)行表達(dá)，在這些女性細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)XIST RNA表達(dá)損失 具有功能顯著性。XIST RNA向女性PC細(xì)胞系(其中XIST顯著下調(diào)）的基因遞送導(dǎo)致體外細(xì)胞 增殖的抑制，以及異種移植的小鼠模型中腫瘤生長的減少（圖14)。驚人地，XIST片段 (AK054860,2.659kb，外顯子6的部分)在男性人PC細(xì)胞系PANC-1 (其不表達(dá)XIST)中的強(qiáng)行 表達(dá)也顯著地降低細(xì)胞增殖(MTT測試）、體外轉(zhuǎn)移(Boyden室試驗(yàn)），和裸小鼠模型(n = 8，p〈 0.05)中抑制的腫瘤生長。將XIST基因片段(AK054860,2.659kb，外顯子6的部分)亞克隆進(jìn) 入質(zhì)粒PUMVC3載體，其是臨床試驗(yàn)的獲批載體。此外，采用一系列截短亞克隆試驗(yàn)，并在女 性和男性PC細(xì)胞系(分別是ASPC-1和PANC-1)中采用PLGA-PEI NP遞送系統(tǒng)的細(xì)胞增殖試驗(yàn) (MTT測試），鑒定了 XIST基因片段的短功能結(jié)構(gòu)域(486bp)(圖15)。
[0211] 參考文獻(xiàn)
[0212] 本說明書中涉及的所有專利和出版物指示本發(fā)明涉及領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。本文 中所有專利和出版物通過引用納入，就如各出版物被具體地和單獨(dú)地說明通過引用全文納 入本文一樣。
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[0238] 盡管已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明和其優(yōu)勢(shì)，但是應(yīng)當(dāng)理解，可對(duì)本文進(jìn)行各種變化、替 代和改變而不背離所附權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍。此外，本申請(qǐng)的范圍不是 旨在限制于本說明書所述的形式、手段、方法和步驟的過程、機(jī)器、制造、組合物的具體實(shí)施 方式。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過本發(fā)明的內(nèi)容將容易理解，現(xiàn)存或后續(xù)開發(fā)的與本文所述 相應(yīng)實(shí)施方式實(shí)施基本相同功能或?qū)崿F(xiàn)基本相同結(jié)果的形式、手段、方法、或步驟的過程、 機(jī)器、制造、組合物均可使用。因此，所附權(quán)利要求旨在將形式、手段、方法、或步驟的過程、 機(jī)器、制造、組合物包括在其范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種共聚物組合物，其包含聚（乳酸-共聚-乙醇酸）（PLGA)和聚乙烯亞胺(PEI)，其特 征在于，所述PLGA與PEI的w/w比是0 · 5:1、1:1、2:1或5:1。2. -種包含PLGA和PEI的共聚物組合物，其特征在于，所述PLGA與PEI的w/w比是0.5:1， 并且其中來自PLGA的約70-130個(gè)交酯-共聚-乙交酯單元通過酰胺鍵偶聯(lián)至PEI分子。3. -種包含PLGA和PEI的共聚物組合物，其特征在于，伯胺濃度是約40 %-約55 %。4. 如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述伯胺濃度是約45 %-約55 %。5. 如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述伯胺濃度是約45 %-約52 %。6. 如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述伯胺濃度是約46 %-約52 %。7. -種包含PLGA、PEI和選自下組的其他化合物的共聚物組合物：1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪(APMP)、2_(3_氨基丙基氨基）乙醇、2-甲基-1，5-二氨基戊燒、1_(3_氨基丙基）P比 咯烷、4-氨基苯基二硫化物和胱胺。8. 如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述化合物是APMP。9. 一種包含PLGA、PEI、APMP和接頭的共聚物組合物。10. 如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述接頭是聚乙二醇(PEG)接頭。11. 如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述PEG接頭是馬來酰亞胺-PEG-NHS。12. 如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述接頭是化學(xué)偶聯(lián)至PLGA-PEI或APMP-PLGA-PEI 聚合物的PEG生物接頭(Ma 1-PEG-NHS)，以分別產(chǎn)生Mai-PEG-PLGA-PEI或Ma 1-PEG-APMP-PLGA-PEI〇13. 如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于，所述Mal-TOG-PLGA-PEI或Mal-TOG-APMP-PLGA-PEI化學(xué)偶聯(lián)至Fc結(jié)合肽或抗體，用于特異性遞送。14. 如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含至少一種 治療和/或診斷劑，并且其中所述共聚物在納米顆粒中包含該試劑。15. 如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述治療和/或診斷劑被合適地配制，用 于動(dòng)物疾病、作為研究試劑、或二者兼具。16. 如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述治療試劑被合適地配制，用于人癌、 AIDS、心臟病、中風(fēng)、糖尿病、呼吸道疾病、腎疾病、細(xì)菌感染，和/或病毒感染。17. 如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述試劑是核酸、蛋白質(zhì)、肽、小分子、抗 原、疫苗或其混合物。18. 如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述核酸是DNA。19. 如權(quán)利要求18所述的組合物，其特征在于，所述DNA是雙鏈、單鏈或其混合物。20. 如權(quán)利要求18所述的組合物，其特征在于，所述DNA是寡核苷酸。21. 如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述核酸是RNA。22. 如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，所述RNA是雙鏈、單鏈或其混合物。23. 如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，所述RNA是s iRNA、shRNA、miRNA或其混合 物。24. 如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述診斷劑經(jīng)標(biāo)記。25. 如權(quán)利要求1、2、3或7所述的組合物，其特征在于，當(dāng)PLGA與PEI的比率是0.5 : lw/w 時(shí)，所述納米顆粒介于100和130nm之間。26. -種制備如權(quán)利要求8所述組合物的方法，所述方法包括以下步驟： 使APMP-共聚-1，4-丁二醇二丙烯酸酯與PEI混合以產(chǎn)生APMP-PEI聚合物;和 使所述APMP-PEI聚合物與PLGA混合以形成APMP-PLGA-PEI共聚物組合物。1，4_ 丁二醇 二丙烯酸酯-共聚-1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪。27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述APMP-共聚-1，4-丁二醇二丙烯酸酯和 ΡΕ?；旌现辽?4小時(shí)。28. 如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述APMP-PEI聚合物和PLGA混合至少24小 時(shí)。29. 如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述方法還包括如下步驟:使所述共聚物 組合物與至少一種治療和/或診斷劑混合。30. -種治療個(gè)體的醫(yī)學(xué)狀況的方法，所述方法包括如下步驟：向所述個(gè)體遞送治療有 效量的權(quán)利要求14所述的組合物。31. 如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述組合物被遞送超過一次。32. 如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述組合物通過注射遞送。33. 如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述組合物通過腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)遞送。34. 如權(quán)利要求30所述的方法，所述方法還包括：向所述個(gè)體遞送治療有效量的其他化 合物，用于治療所述醫(yī)學(xué)狀況。35. 如權(quán)利要求30所述的方法，所述方法還包括如下步驟:鑒定所述個(gè)體是否需要對(duì)其 醫(yī)學(xué)狀況進(jìn)行治療。36. 如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述醫(yī)學(xué)狀況是癌。37. 如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述組合物包含治療性核酸。38. 如權(quán)利要求37所述的組合物，其特征在于，所述治療性核酸包含XIST核酸的功能性 部分或全部。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK105873613SQ201480056399
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2014年8月13日
【發(fā)明人】呂建明, 姚奇志, 陳昌義
【申請(qǐng)人】貝勒醫(yī)學(xué)院