一種雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊的制備方法，包括以下步驟：（1）巰基化透明質(zhì)酸的制備；（2）乙烯基功能化的二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖的制備；（3）巰基化透明質(zhì)酸上接枝二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖；（4）載藥納米膠囊的制備。該方法制備出的載藥納米膠囊與腫瘤細(xì)胞親和性強(qiáng)，對高濃度的谷胱甘肽及酸性環(huán)境的雙重高敏感響應(yīng)性，實(shí)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高選擇性的快速釋藥，抗腫瘤效率高，安全性好。
【專利說明】
一種雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康的重要疾病之一，近年來納米藥物制劑在腫瘤治療方面顯現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。納米技術(shù)在解決傳統(tǒng)抗腫瘤藥物水溶性差、選擇性低、毒副作用大等方面取得了很大進(jìn)展，例如運(yùn)載抗腫瘤藥物的聚合物納米粒子、膠束、脂質(zhì)體、組裝的樹狀大分子粒子等，這些納米載體由特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)組成，可以對藥物進(jìn)行很好的運(yùn)載和保護(hù)；同時納米載體的各種功能化修飾，可以實(shí)現(xiàn)粒子在特定環(huán)境條件下的選擇性降解，可以有效解決載藥納米粒子在體內(nèi)的系統(tǒng)屏障及細(xì)胞攝取屏障等問題。這種環(huán)境刺激響應(yīng)的納米載體，在腫瘤病變部位特殊的生理環(huán)境下選擇性“智能化”釋放藥物，提高了化療藥物的抗腫瘤效果，同時明顯減少治療過程中對正常組織的毒副作用。
[0003]透明質(zhì)酸(HA)是一種天然的高分子聚合物，大量存在于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及細(xì)胞基質(zhì)(ICM)，具有重要的生理功能，同時可以被特殊的細(xì)胞受體識別，從而調(diào)控相關(guān)功能。由于透明質(zhì)酸良好的理化性質(zhì)和各種生物學(xué)功能，使HA和HA衍生物廣泛用于藥物輸送，治療關(guān)節(jié)炎、眼科手術(shù)，組織工程支架等領(lǐng)域。在納米載藥領(lǐng)域，由于透明質(zhì)酸良好的生物相容性以及腫瘤部位過表達(dá)的透明質(zhì)酸受體(CD44，RHAMM等)，使透明質(zhì)酸的應(yīng)用更加成為研究的熱點(diǎn)。由于透明質(zhì)酸含有大量的功能基團(tuán)(羧基，羰基，乙酰胺基)，通常將抗腫瘤藥物(阿霉素，紫杉醇等)通過化學(xué)鍵或者交聯(lián)連接于透明質(zhì)酸上來實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。但一種操作過程簡單且有效的物理包裹，無疑為一些不能進(jìn)行化學(xué)連接的藥物提供了很好的運(yùn)載方法，同時也更利于載藥體系向臨床的推廣應(yīng)用。
[0004]隨著納米載體的不斷發(fā)展，有研究表明尺度合適的納米粒子在體循環(huán)過程中可以有效避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(MPS)的清除作用，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的長循環(huán)，最終通過腫瘤部位的增強(qiáng)的滲透和滯留作用(EPR)有效富集于腫瘤部位。為了控制透明質(zhì)酸納米粒子的尺度，研究者提出表面活性劑輔助的逆向油包水乳化和無機(jī)鹽誘導(dǎo)礦化等方法，但無論是引入有機(jī)的表面活性劑還是無機(jī)鹽，都需要較多的步驟，這從很大程度上限制了透明質(zhì)酸納米粒子的發(fā)展和臨床應(yīng)用，所以尋求一種操作簡單同時可調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸納米粒子，進(jìn)而提高以透明質(zhì)酸為骨架的載藥納米載體釋放藥物速度、抗腫瘤效果和安全性是非要有必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明提供一種雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊及其制備方法，可有效解決抗腫瘤過程中操作復(fù)雜，載藥納米粒子釋放藥物速度慢，抗腫瘤效果和安全性差的問題。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
一種雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊的制備方法，包括以下步驟: (1)巰基化透明質(zhì)酸的制備
將透明質(zhì)酸溶于濃度為0.01mol/L，pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和1-羥基苯并三唑，活化2-3h，然后再加入胱胺二鹽酸鹽，攪拌反應(yīng)12-16h，用去離子水透析72h，最后加入二硫蘇糖醇，透析，冷凍干燥后得巰基化透明質(zhì)酸;其中透明質(zhì)酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、1-羥基苯并三唑、胱胺二鹽酸鹽和二硫蘇糖醇的摩爾比分別為1-2:3-4:3-4:3:5-6;
(2)乙烯基功能化的二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖的制備
將3-氯-2-氯甲基丙烯和NaH溶于四氫呋喃中，然后加入異亞丙基保護(hù)的吡喃半乳糖和催化劑，65-70 0C加熱回流22-24h，加水終止反應(yīng)，再用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物，得乙烯基功能化的二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖;其中3-氯-2-氯甲基丙烯、NaH、異亞丙基保護(hù)的吡喃半乳糖和催化劑的摩爾比為3:3-4:1-2: 0.005-0.015；
(3)巰基化透明質(zhì)酸上接枝二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖
將巰基化透明質(zhì)酸和乙烯基功能化的二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖溶于二甲基甲酰胺與磷酸鹽緩沖液以體積比為1:3混合的混合液中，然后再加入2，2_二甲氧基-2-苯基苯乙酮，在波長為365nm，功率為6W的紫外光下照射2-3h后透析，冷凍干燥;其中，巰基化透明質(zhì)酸、乙烯基功能化的二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖和2，2_ 二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩爾比為 1-2:0.5-1:0.05-0.1;
(4)載藥納米膠囊的制備
將溶解有抗腫瘤藥物的氯仿與溶解有步驟(3)所得物的PBS溶液按體積比為1:20混合，在超聲探頭作用下，利用超聲乳化法制備納米膠囊，將得到的白色乳液置于黑暗環(huán)境下?lián)]發(fā)除去溶劑中的氯仿，再利用去離子水透析，除去未被包裹的抗腫瘤藥物后，冷凍干燥，形成載藥納米膠囊;其中抗腫瘤藥物和步驟(3)所得物的質(zhì)量比為1-2.5:8-10。
[0007]進(jìn)一步地，步驟(I)中透明質(zhì)酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺、1-羥基苯并三唑、胱胺二鹽酸鹽和二硫蘇糖醇的摩爾比分別為1:3:3:3: 5。
[0008]進(jìn)一步地，步驟(I)中攪拌反應(yīng)時間為12h。
[0009]進(jìn)一步地，步驟(2)中3-氯-2-氯甲基丙烯、NaH、異亞丙基保護(hù)的吡喃半乳糖和催化劑的摩爾比為3:3.13:1:0.0075。
[0010]進(jìn)一步地，步驟(2)中所述催化劑為K1、18-冠醚-6和15-冠醚-5按質(zhì)量比為1:1:1混合所得的混合物。
[0011]進(jìn)一步地，步驟(2)中加熱回流反應(yīng)24h。
[0012]進(jìn)一步地，步驟(3)中巰基化透明質(zhì)酸、乙稀基功能化的二代異亞丙基保護(hù)卩比喃半乳糖和2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩爾比為1:0.5:0.05ο
[0013]進(jìn)一步地，步驟(4)中抗腫瘤藥物和步驟(3)所得物的質(zhì)量比為1:8。
[0014]進(jìn)一步地，步驟(4)中抗腫瘤藥物為阿霉素和/或紫杉醇。
[0015]由上述方法制備出的雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊。
[0016]本發(fā)明提供的一種雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊及其制備方法，具有以下有益效果:
(I)本發(fā)明利用腫瘤細(xì)胞內(nèi)溶酶體(PH為4.5-6.0 )與正常體液(pH為7.4 )的酸度差異，同時利用腫瘤細(xì)胞內(nèi)相對較高的谷胱甘肽濃度(lOmmol/L)，雙重刺激響應(yīng)使載藥納米膠囊可以對腫瘤環(huán)境更加敏感，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)藥物突釋，有效發(fā)揮藥效。
[0017](2)本發(fā)明首先將透明質(zhì)酸巰基化得巰基化透明質(zhì)酸，然后在巰基化透明質(zhì)酸上連接二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖，所含的縮酮鍵在酸性條件下發(fā)生斷裂，進(jìn)而使納米膠囊具有酸敏感性;其次二硫鍵的引入，使納米膠囊具有氧化還原敏感性;縮酮鍵和二硫鍵在腫瘤環(huán)境刺激下斷裂，使載藥納米膠囊發(fā)生膨脹和解體，實(shí)現(xiàn)載藥納米膠囊的溶酶體逃逸，快速釋放藥物。
[0018](3)本發(fā)明以天然的聚合物透明質(zhì)酸作為納米膠囊的骨架材料，其透明質(zhì)酸是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)的主要成分，具有很好的生物安全性，通過特定的制備過程，制備出的雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的載藥納米膠囊，骨架材料透明質(zhì)酸(HA)可以與腫瘤部位過表達(dá)的受體結(jié)合，可增強(qiáng)載藥納米膠囊對腫瘤細(xì)胞的親和性;其載藥納米膠囊粒徑在EPR效應(yīng)范圍內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)被動靶向；載藥納米膠囊對高濃度的谷胱甘肽及酸性環(huán)境的雙重高敏度響應(yīng)性，可實(shí)現(xiàn)其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高選擇性的快速釋藥，因此制備出的載藥納米膠囊具有生物相容性好、生物可降解性、無免疫原性以及對腫瘤細(xì)胞的高親和性等特點(diǎn)，其安全性高、無毒副作用。
【附圖說明】
[0019]圖1為雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊的制備過程；
圖2為制備過程中所得中間產(chǎn)物的1H-NMR表征圖；
圖3為雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊的粒徑分布圖；
圖4為雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊的透射電鏡圖；
圖5為雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊的原子力顯微鏡圖；
圖6為雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊在PBS(0.01mol/L，pH7.4)中的電位圖；
圖7為雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊在pH5.0，GSH濃度為10 mmol/L條件下的粒徑圖；
圖8為雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊在pH6.8，GSH濃度為2.8ymol/L條件下的粒徑圖；
圖9為雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊在不同pH及谷胱甘肽濃度下的藥物釋放曲線；
圖10為不同濃度的雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊抑制肝腫瘤細(xì)胞存活率圖；
圖11為不同濃度空白納米膠囊對肝腫瘤細(xì)胞的毒副作用圖；
圖12為雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊在不同時間點(diǎn)被細(xì)胞攝取的激光共聚焦照片。
【具體實(shí)施方式】
[0020]本發(fā)明以天然的聚合物透明質(zhì)酸作為骨架材料，利用胱胺二鹽酸鹽制備巰基化透明質(zhì)酸，再利用異亞丙基保護(hù)的吡喃半乳糖和3-氯-2-氯甲基丙烯制備乙烯基功能化的二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖，接著利用紫外光催化的巰烯反應(yīng)，在巰基化透明質(zhì)酸上連接二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖，將該所得物溶解于PBS緩沖液中，再包裹上抗腫瘤藥物，利用超聲乳化法制備納米膠囊，最后利用透析袋透析，除去未被包載的抗腫瘤藥物，得到雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊，制備過程見圖1。
[0021]實(shí)施例1巰基化透明質(zhì)酸的制備
將透明質(zhì)酸(HA)溶于濃度為0.01mol/L，pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和1-羥基苯并三唑，活化2h，之后再逐滴加入胱胺二鹽酸鹽，攪拌反應(yīng)12h，將所得物在去離子水中用3.5kD透析袋透析72h，除去縮合劑等小分子物質(zhì)，最后加入二硫蘇糖醇來打斷已形成的二硫鍵，再次通過去離子水透析純化，冷凍干燥后得巰基化透明質(zhì)酸;其中透明質(zhì)酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、1-羥基苯并三唑、胱胺二鹽酸鹽和二硫蘇糖醇的摩爾比分別為I:3:3:3:5;
將透明質(zhì)酸和所得的巰基化透明質(zhì)酸分別溶于D2O中，做400 MHz 1H-NMR掃描，結(jié)果見圖2，圖中a表示透明質(zhì)酸的1H-NMR掃描圖，b表示巰基化透明質(zhì)酸的1H-NMR掃描圖。
[0022]實(shí)施例2乙烯基功能化的二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖的制備
將3-氯-2-氯甲基丙烯和NaH溶于無水的四氫呋喃中，然后加入異亞丙基保護(hù)的吡喃半乳糖，同時加入少量K1、18-冠醚-6(18-Crown-6)和15-冠醚-5(15- Crown-5)作為催化劑，65-70°C加熱回流24h，加水終止反應(yīng)，再用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物，旋蒸除去有機(jī)溶劑后，再以乙酸乙酯:正己烷=1:3(體積比)為洗脫劑，用硅膠色譜柱進(jìn)行純化，除去有機(jī)溶劑得乙烯基功能化的二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖;其中3-氯-2-氯甲基丙烯、NaH、異亞丙基保護(hù)的吡喃半乳糖和催化劑的摩爾比為3:3.13:1:0.0075;其中催化劑為K1、18-冠醚-6和15-冠醚-5按質(zhì)量比為I: I: I混合所得的混合物。
[0023]將所得的乙烯基功能化的二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖溶于⑶Cl3，做400MHz1H-NMR掃描，結(jié)果見圖2中C。
[0024]實(shí)施例3巰基化透明質(zhì)酸上接枝二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖
將巰基化透明質(zhì)酸和乙烯基功能化的二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖溶于二甲基甲酰胺與磷酸鹽緩沖液以體積比為1:3混合的混合液中，然后再加入光引發(fā)劑2，2_ 二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DAPA)，在波長為365nm，功率為6W的紫外光下照射2h，反應(yīng)完成后，用去離子水透析，除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，最后冷凍干燥得產(chǎn)物;其中巰基化透明質(zhì)酸、乙烯基功能化的二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖和2，2_二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩爾比為1:0.5:0.05ο
[0025]將所得產(chǎn)物做1H-匪R掃描，核磁圖譜如圖2中d所示，用鹽酸斷裂產(chǎn)物中的縮酮鍵后，再做1H-NMR掃描，核磁圖譜如圖2中e所示。
[0026]實(shí)施例4雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的載藥納米膠囊的制備
將溶解有阿霉素的氯仿與溶解有實(shí)施例3所得物的PBS溶液按體積比為1:20混合，在超聲探頭作用下，利用超聲乳化法制備納米膠囊，將得到的白色乳液置于黑暗環(huán)境下?lián)]發(fā)除去溶劑中的氯仿，再利用去離子水透析，除去未被包裹的阿霉素后，冷凍干燥，得到雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊，簡稱載藥納米膠囊;其中阿霉素和實(shí)施例3所得物的摩爾比為1:8。
[0027]將未加阿霉素的納米膠囊作為空白對照即空白納米膠囊。
[0028]通過馬爾文激光粒度儀測定載藥納米膠囊的粒徑大小及分布，結(jié)果見圖3，由圖3可知載藥納米膠囊的粒徑為195±53nm。
[0029]用透射電子顯微鏡(TEM)觀察載藥納米膠囊的尺寸及形態(tài)，結(jié)果見圖4，由圖4可知，載藥納米膠囊呈規(guī)則的球形，且可見明顯的內(nèi)腔結(jié)構(gòu)，由于透明質(zhì)酸納米膠囊所包裹水分的揮發(fā)，粒子的粒徑明顯變小(66.71±9.29nm);同時用原子力顯微鏡觀察載藥粒子的立體結(jié)構(gòu)，結(jié)果與TEM結(jié)果相符，見圖5。
[0030]測定載藥納米膠囊在PBS(0.01mol/L，pH7.4)中的電位圖，結(jié)果見圖6，由圖6可知，載藥納米膠囊的表面電荷為-0.216mV，可以有效避免由于電荷引起的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對其的清除作用。
[0031 ]實(shí)施例5 不同pH值及不同谷胱甘肽濃度下載藥納米膠囊的粒徑變化及分布將載藥納米膠囊分別分散于pH 5.0，GSH濃度為lOmmol/L的PBS緩沖液中和pH 6.8，GSH濃度為2.8ymol/L的PBS緩沖液中，設(shè)定的不同時間點(diǎn)，通過馬爾文激光粒度儀分別測定其粒徑分布，結(jié)果分別見圖7和圖8。
[0032]如圖7所示，在類腫瘤細(xì)胞內(nèi)環(huán)境條件下(pH 5.0，65田農(nóng)度為10_01/1)，載藥納米膠囊粒徑隨著作用時間的延長，逐漸增大至416.2±154nm，分布變寬，且在5407nm處出現(xiàn)一個較明顯的峰，證明載藥納米膠囊在谷胱甘肽的作用下發(fā)生了膨脹;之后在Sh時，粒徑分布變?yōu)閮蓚€甚至多個峰，證明膨脹之后的膠囊發(fā)生了降解。
[0033]在類腫瘤微環(huán)境條件下(pH 6.8，GSH濃度為2.8ymol/L)，作用24 h后，粒徑僅從195土53nm增大至348.2± 104.5nm，如圖8所示，這一結(jié)果驗(yàn)證了該載藥納米膠囊對酸及谷胱甘肽的刺激敏感性。
[0034]實(shí)施例6納米膠囊對阿霉素的包載量及不同環(huán)境條件下的藥物釋放曲線通過熒光色譜法檢測載藥納米膠囊的載藥量:稱取適量實(shí)施例4中的凍干載藥納米膠囊，溶解于水與DMF(二甲基甲酰胺)按體積比為1:5的混合溶液中，分別在λ ex=480nm和λ em=589nm下，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定對阿霉素的包載量，有63.9%的藥物被包封在納米膠囊中，其中膠囊的載藥量范圍為6%-8%。
[0035]稱取適量實(shí)施例4中的凍干載藥納米膠囊，分散于PBS中，然后將該溶液分裝于透析袋中，每截透析袋中分裝lmL，然后分別浸沒于以下緩沖液中:20 mL的I)磷酸緩沖液(0.01M,pH 7.4，不含GSH); 2)醋酸緩沖液 I (0.01M,pH 6.8，GSH濃度為2.8μΜ); 3)醋酸緩沖液2 (0.01Μ,pH 5.0，GSH濃度為1mM)中，每個條件下設(shè)置3個平行，然后放置于37°C恒溫?fù)u床水浴中，在設(shè)計的時間點(diǎn)吸取透析袋外部的溶液lmL，用于后續(xù)測量時間點(diǎn)處藥物的釋放量，同時及時補(bǔ)充相應(yīng)的新鮮緩沖液ImL，以維持透析袋外圍液體體積的恒定。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定相應(yīng)時間點(diǎn)處藥物的累計釋放量，并繪制釋放曲線，結(jié)果見圖9，如圖9所示，在pH 5.0，GSH濃度為1mM的條件下，載藥納米膠囊中的藥物在12h內(nèi)快速釋放(斜率2.591)，之后釋藥速度有所變緩(斜率0.407),在96h時，累計釋藥量到達(dá)75%，隨著時間的延長，釋藥量趨于不變;而在其他兩個條件下(pH 6.8，GSH濃度為2.8μΜ和pH 7.4，不含GSH)，釋藥量相較于pH 5.0，GSH濃度為1mM明顯變小，且釋藥速率明顯變緩;在120h時，pH 6.8，GSH濃度為2.8μΜ累計釋藥量為30%，pH 7.4，不含GSH累計釋藥量為12%。這一釋藥結(jié)果說明該載藥納米膠囊對PH和谷胱甘肽的刺激都有較敏感的響應(yīng)，也證明了該載藥納米膠囊可以選擇性地在低pH和高谷胱甘肽濃度的腫瘤細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)藥物突釋，實(shí)現(xiàn)良好的抗腫瘤效果。
[0036]實(shí)施例7細(xì)胞毒性評價采用CCK-8法測定本發(fā)明中載藥納米膠囊對細(xì)胞的抑制作用:將一定數(shù)量的肝腫瘤細(xì)胞HepG2接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的阿霉素(DOX.HCl)和載藥納米膠囊(DOX/HA-NCs)，繼續(xù)養(yǎng)48h，之后每孔加入1yL CCK-8溶液，在37 °C下避光孵育2h，用酶標(biāo)儀測定450nm處96孔板各孔的吸光值，計算細(xì)胞存活率，每個實(shí)驗(yàn)組設(shè)置5個平行樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，載藥納米膠囊的抗腫瘤效率隨著濃度的增加而增加，對HepG2的半抑制濃度(IC50)為0.42yg/mL，同時，與鹽酸阿霉素組(D0X.HCl)相比，載藥納米膠囊(D0X/HA-NCs)需要經(jīng)歷進(jìn)入細(xì)胞后將包封的藥物釋放的過程，作用于細(xì)胞核的速率會相對減慢，故IC50輕微增大。
[0037]用上述同樣的方法，對空白納米膠囊的安全性進(jìn)行評價，結(jié)果如圖11所示，橫坐標(biāo)為不同濃度的HA，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率(Cell Viability 100%)，由圖11可知，細(xì)胞較高的存活率證明了該納米膠囊材料具有良好的生物相容性和較小的毒性。
[0038]實(shí)施例8細(xì)胞攝取評價
利用激光共聚焦顯微鏡對細(xì)胞攝取該載藥納米膠囊進(jìn)行評價:將該載藥納米膠囊與培養(yǎng)皿中對數(shù)期的肝腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)不同的時間(0.5h，2h，4h)，載藥納米膠囊所包裹的阿霉素濃度為5yg/mL，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察載藥納米膠囊在細(xì)胞內(nèi)的分布和變化情況，結(jié)果見圖12，左邊一列為阿霉素通道下圖片，中間為明場圖片，右邊為重合后的圖片，圖中標(biāo)尺為25μηι。
[0039]如圖12所示，共培養(yǎng)0.5h，僅有少量載藥納米膠囊進(jìn)入細(xì)胞，隨著共孵育時間的增加;在2h時，載藥納米膠囊進(jìn)入細(xì)胞的量不斷增加，且有少量釋放后的阿霉素進(jìn)入細(xì)胞核；4h時，更多的載藥納米膠囊被攝取進(jìn)入細(xì)胞，且逐漸釋放阿霉素進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用，也證明了該載藥納米膠囊可以很好的被腫瘤細(xì)胞攝取，并在環(huán)境刺激下釋放藥物，殺死腫瘤細(xì)胞。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)巰基化透明質(zhì)酸的制備 將透明質(zhì)酸溶于濃度為0.01mol/L，pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和1-羥基苯并三唑，活化2-3h，然后再加入胱胺二鹽酸鹽，攪拌反應(yīng)12-16h，用去離子水透析72h，最后加入二硫蘇糖醇，透析，冷凍干燥后得巰基化透明質(zhì)酸;其中透明質(zhì)酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、1-羥基苯并三唑、胱胺二鹽酸鹽和二硫蘇糖醇的摩爾比分別為1-2:3-4:3-4:3:5-6; (2)乙烯基功能化的二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖的制備 將3-氯-2-氯甲基丙烯和NaH溶于四氫呋喃中，然后加入異亞丙基保護(hù)的吡喃半乳糖和催化劑，65-70 0C加熱回流22-24h，加水終止反應(yīng)，再用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物，得乙烯基功能化的二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖;其中3-氯-2-氯甲基丙烯、NaH、異亞丙基保護(hù)的吡喃半乳糖和催化劑的摩爾比為3:3-4:1-2:0.005-0.015; (3)巰基化透明質(zhì)酸上接枝二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖 將巰基化透明質(zhì)酸和乙烯基功能化的二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖溶于二甲基甲酰胺與磷酸鹽緩沖液以體積比為1:3混合的混合液中，然后再加入2，2_二甲氧基-2-苯基苯乙酮，在波長為365nm，功率為6W的紫外光下照射2-3h后透析，冷凍干燥;其中，巰基化透明質(zhì)酸、乙烯基功能化的二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖和2，2_ 二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩爾比為 1-2:0.5-1:0.05-0.1; (4)載藥納米膠囊的制備 將溶解有抗腫瘤藥物的氯仿與溶解有步驟(3)所得物的PBS溶液按體積比為1:20混合，在超聲探頭作用下，利用超聲乳化法制備納米膠囊，將得到的白色乳液置于黑暗環(huán)境下?lián)]發(fā)除去溶劑中的氯仿，再利用去離子水透析，除去未被包裹的抗腫瘤藥物后，冷凍干燥，形成載藥納米膠囊;其中抗腫瘤藥物和步驟(3)所得物的質(zhì)量比為1-2.5:8-10。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊的制備方法，其特征在于，步驟(I)中透明質(zhì)酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、1-羥基苯并三唑、胱胺二鹽酸鹽和二硫蘇糖醇的摩爾比分別為1:3:3:3: 5。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊的制備方法，其特征在于，步驟(I)中攪拌反應(yīng)時間為12h。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊的制備方法，其特征在于，步驟(2)中3-氯-2-氯甲基丙烯、NaH、異亞丙基保護(hù)的吡喃半乳糖和催化劑的摩爾比為 3:3.13:1:0.0075。5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述催化劑為K1、18-冠醚-6和15-冠醚-5按質(zhì)量比為1:1:1混合所得的混合物。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊的制備方法，其特征在于，步驟(2 )中加熱回流反應(yīng)24h。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊的制備方法，其特征在于，步驟(3)中巰基化透明質(zhì)酸、乙烯基功能化的二代異亞丙基保護(hù)吡喃半乳糖和2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩爾比為1:0.5:0.05。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊的制備方法，其特征在于，步驟(4)中抗腫瘤藥物和步驟(3)所得物的質(zhì)量比為1:8。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊的制備方法，其特征在于，步驟(4)中抗腫瘤藥物為阿霉素和/或紫杉醇。10.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的制備方法制備出的雙重細(xì)胞微環(huán)境敏感的抗腫瘤載藥納米膠囊。
【文檔編號】A61K47/36GK105878212SQ201610359368
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】顧忠偉, 馬瑾, 易強(qiáng)英, 康珂
【申請人】四川大學(xué)