一種多肽在制備Nav1.7鈉通道調(diào)制劑中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物活性多肽在制備電壓門控鈉通道工具試劑?Nav1.7型鈉通道抑制劑中的應(yīng)用方法，所述的生物活性多肽為蜘蛛抑鈉肽?IX（SPNP?IX），試驗(yàn)驗(yàn)證該活性多肽對(duì)Nav1.7型電壓門控鈉通道具有明顯的抑制作用。在制備電壓門控鈉通道亞型工具試劑時(shí)，配制細(xì)胞外給藥的濃度為1 μmol/L。SPNP?IX的半數(shù)有效作用劑量IC50為110 nmol/L。SPNP?IX對(duì)Nav1.7型鈉通道的抑制呈現(xiàn)時(shí)間依從性，是一種較好的Nav1.7型鈉通道工具試劑。
【專利說明】
一種多肽在制備Nav1.7鈉通道調(diào)制劑中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種活性多肽在離子通道工具試劑中的用途，尤其是用化學(xué)法制備的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1x(簡(jiǎn)寫為SPNP-1X)在制備電壓門控鈉通道工具試劑-Navl.7型鈉通道抑制劑中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]電壓門控鈉通道廣泛分布于神經(jīng)元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可興奮性組織中，是一種重要的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，其參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、血管收縮、胰腺分泌和骨骼肌興奮性等多種生理過程，同時(shí)也是治療藥物作用的重要靶標(biāo)之一。鈉通道在動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳播過程中的關(guān)鍵性作用，電壓門控鈉通道成為很多動(dòng)植物毒素的作用靶標(biāo)。鈉離子通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究已經(jīng)成為國(guó)際上的研究熱點(diǎn)。電壓門控鈉通道很可能成為神經(jīng)性和心血管等疾病的重要治療靶點(diǎn)。自然界的動(dòng)物毒素是一類具有很高實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景的工具試劑或藥物導(dǎo)向物質(zhì)，不僅是有毒動(dòng)物抵御天敵的有力武器，也是從事神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)研究、天然創(chuàng)新藥物開發(fā)以及蛋白質(zhì)基礎(chǔ)研究的寶貴材料，同時(shí)也是研究離子通道的獨(dú)特“分子探針和解密器”。迄今為止，從多種動(dòng)物(如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋動(dòng)物等)的毒液中鑒定到了很多作用于鈉通道的活性成分。它們通過與鈉通道的不同位置相結(jié)合從而引起通道的動(dòng)力學(xué)特征發(fā)生相應(yīng)的變化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延緩等。通過闡述這些特異性調(diào)制劑作用于鈉通道的分子機(jī)制，除了在理論上可深入推測(cè)鈉通道亞型之間的功能活動(dòng)區(qū)別和門控活動(dòng)機(jī)制外，還可以為將它們開發(fā)成治療人類相關(guān)疾病的新藥提供充分的理論基礎(chǔ)和廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明旨在于提供一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X在制備電壓門控鈉通道工具試劑-Navl.7型鈉通道抑制劑的應(yīng)用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽_IX(簡(jiǎn)寫為SPNP-1X)，其氨基酸序列為:
NH2~G1u Cys Thr Lys Leu Leu Gly Gly Cys Thr Lys Asp Ser Glu Cys Cys ProHis Leu Gly Cys Arg Lys Lys Trp Pro Tyr His Cys Gly Trp Asp Gly Thr Phe-
NH2,
其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X作為單一有效活性組份用于制備Navl.7型鈉通道抑制劑。
[0004]所述的蜘蛛抑鈉肽-1X的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，N端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。
[0005]該蜘蛛抑鈉肽-1X作為單一有效活性組分用于制備Navl.7型鈉通道抑制劑，以細(xì)胞外給藥的方式制備成Navl.7型鈉通道工具試劑。
[0006]蜘蛛抑鈉肽-1X在制備Navl.7型鈉通道工具試劑或抑制劑時(shí)，配制細(xì)胞外給藥的劑量為I μπιοΙ/L。
[0007]蜘蛛抑鈉肽-1X抑制Navl.7型鈉通道的半數(shù)有效作用劑量IC5q為110 nmol/L0
[0008]蜘蛛抑鈉肽-1X對(duì)Navl.7型鈉通道的抑制呈現(xiàn)時(shí)間依從性，是一種較好的Navl.7型鈉通道工具試劑。
【附圖說明】
[0009]圖1是I ymol/L SPNP-1X對(duì)大鼠DRG神經(jīng)元上Navl.7型鈉通道的影響。
[0010]圖2是SPNP-1X作用于大鼠DRG細(xì)胞Navl.7鈉通道的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系曲線。
[0011]圖3是SPNP-1X作用于大鼠DRG細(xì)胞Navl.7鈉通道的濃度-效應(yīng)關(guān)系曲線。
[0012]圖4是SPNP-1X對(duì)大鼠DRG細(xì)胞Navl.7鈉通道電流-電壓關(guān)系的影響。
[0013]圖5是SPNP-1X對(duì)大鼠DRG細(xì)胞Navl.7鈉通道的穩(wěn)態(tài)失活動(dòng)力學(xué)的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0014]為了更好的理解和更充分公開本發(fā)明，下面將通過細(xì)胞外給藥途徑，采用轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞模型來說明蜘蛛抑鈉肽-1X的Navl.7型鈉通道抑制作用。
[0015]
1、實(shí)驗(yàn)材料和方法
1.1人胚腎細(xì)胞(HEK293T)的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
HEK293T細(xì)胞適應(yīng)酸性環(huán)境，pH值在6.9?7.1時(shí)，可順利貼壁生長(zhǎng)，換液時(shí)動(dòng)作要輕。一般用高糖的DMEM培養(yǎng)基。
[0016]1.1.1細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
(I) HEK293細(xì)胞傳代時(shí)機(jī)為達(dá)80-90%匯合，待細(xì)胞在60mm培養(yǎng)皿中長(zhǎng)滿后，吸掉培養(yǎng)液。
[0017](2)加適量PBS漂洗兩次，吸掉。
[0018](3)加0.5mL 0.25%胰酶，搖勻。37°C培養(yǎng)箱中胰酶處理2_3min。于顯微鏡下觀察細(xì)胞是否全部脫壁。加入適量10%新生牛血清DMEM培養(yǎng)液終止胰酶反應(yīng)。
[0019](4)用移液管將細(xì)胞團(tuán)輕輕吸打成單個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞按1:3平均分入裝有預(yù)熱培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，于37°C、5% C02、15%相對(duì)濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0020]1.1.2陽離子性的脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染方法:
(I)在轉(zhuǎn)染前一天，對(duì)于35mm培養(yǎng)皿，每皿用2mL不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)。
[0021 ] (2)轉(zhuǎn)染的當(dāng)天，細(xì)胞密度最好達(dá)到80-90%，吸掉舊培養(yǎng)液，PBS漂洗一次，換成2mL無血清op t 1-MEM培養(yǎng)液。
[0022](3)每皿DNA用量為4ug，用無血清無血清opt1-MEM培養(yǎng)液分別稀釋到250UL，輕輕混勻，室溫靜置5min。
[0023](4)同時(shí)將1yL脂質(zhì)體加入250UL無血清opt1-MEM培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫靜置5min0
[0024](5)將稀釋的脂質(zhì)體加入等體積DNA混勻，室溫靜置20min。
[0025](6)將0.5mLDNA/脂質(zhì)體復(fù)合物輕輕混勻，滴加入細(xì)胞中，輕輕混勻，常規(guī)條件培養(yǎng)。
[0026](7)讓DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物與細(xì)胞接觸4-6h后，換成10%新生牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。24-72h內(nèi)可以進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。
[0027]1.2膜片鉗電生理活性實(shí)驗(yàn)
膜片鉗實(shí)驗(yàn)均在室溫(25±1°C)進(jìn)行，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)。挑選質(zhì)膜光滑可見、胞質(zhì)均勻的有綠色熒光的HEK293T細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。電流記錄通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)利用EPC9放大器(HEKA公司，German)在電腦上進(jìn)行。計(jì)算機(jī)記錄和分析系統(tǒng)采用Pulse+Pulsefit 8.0軟件。玻璃電極管為硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管(南京泉水教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠)。玻璃電極兩步拉制而成，經(jīng)拋光儀(Narishige,Japan)拋光后電極尖端直徑約為3 μπι，充灌電極液后電極電阻為1-3ΜΩ。膜片鉗實(shí)驗(yàn)要在室溫條件下進(jìn)行，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中溫度的變動(dòng)最多上下不超過2°C。采用SigmaPlot 9.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0028]
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
2.1 SPNP-1X對(duì)Navl.7型電壓門控鈉通道的影響
運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，我們研究了SPNP-1X對(duì)瞬時(shí)表達(dá)于HEK293T細(xì)胞的鈉通道亞型Navl.7的抑制作用。鈉通道亞型電流以同一種去極化方式誘導(dǎo):將細(xì)胞膜電位鉗制在-80mV，以50 ms的時(shí)程給予一測(cè)試電壓_10mV，每隔5 s重復(fù)一次。
[0029]如圖1所示，I μΜ SPNP-1X對(duì)Navl.7通道有一定的抑制作用，其抑制程度分別為83.2 ± 4.3%(η=6)。SPNP-1X對(duì)Nav1.7通道的抑制作用呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依從性，當(dāng)毒素濃度為I μΜ時(shí)，約在I min左右的時(shí)間達(dá)到最大抑制。I μΜ SPNP-1X抑制Navl.7通道的時(shí)間常數(shù)為15.8 s(圖2)。如圖3所示，SPNP-1X對(duì)Nav1.7通道的抑制作用呈現(xiàn)明顯的濃度依從性，半數(shù)有效抑制濃度(IC5q)是110 ηΜ。當(dāng)劑量曲線用Hi 11公式擬合時(shí)，可得出SPNP-1X抑制Navl.7通道的濃度效應(yīng)曲線的Hill常數(shù)，它的大小為0.85。
[0030]2.2 SPNP-1X對(duì)Navl.7型電壓門控鈉通道激活狀態(tài)的影響
在全細(xì)胞電壓鉗模式下，將細(xì)胞鉗制在-100 mV時(shí)，分別給予一系列測(cè)試電壓，其變化范圍為-80?+60 mV，持續(xù)時(shí)間為50 ms，步幅為+10 mV，我們進(jìn)一步檢測(cè)了 SPNP-1X對(duì)Navl.7通道1-V曲線的影響，探究其對(duì)鈉通道亞型激活過程的影響，結(jié)果如圖4所示?？瞻讓?duì)照條件下，當(dāng)細(xì)胞膜電位鉗制在-100 mV時(shí)，Navl.7通道的起始激活電壓為-40 mV，最大電流峰值激活電壓為-20 mV。在細(xì)胞周圍加入SPNP-1X，毒素與細(xì)胞作用3 min后，再以相同的去極化脈沖誘導(dǎo)1-V曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPNP-1X能使Navl.7鈉通道的起始激活電位和峰值電流激活電壓向去極化方向漂移約+10 mV，但反轉(zhuǎn)電位變化不明顯，說明毒素與通道的相互作用沒有改變通道對(duì)離子通透的選擇性。
[0031]2.3 SPNP-1X對(duì)Navl.7型電壓門控鈉通道穩(wěn)態(tài)失活的影響
我們運(yùn)用一標(biāo)準(zhǔn)雙脈沖刺激方式，進(jìn)一步觀察了 SPNP-1X對(duì)Navl.7通道穩(wěn)態(tài)失活特征的影響。結(jié)果如圖5，對(duì)于Nav1.7通道，對(duì)照條件下，￥1/2為-77.3 ± 1.4 mV(n=8)，加SPNP-1X后，V1/2變?yōu)?79.7 ± 1.2 mV(n=7)。結(jié)果表明SPNP-1X對(duì)hNavl.7的穩(wěn)態(tài)失活特征幾乎沒影響，而且沒有明顯改變Navl.7通道對(duì)照曲線的斜率。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X在制備電壓門控鈉通道工具試劑-Navl.7型鈉通道抑制劑中的應(yīng)用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X(簡(jiǎn)寫為SPNP-1X)，其氨基酸序列為: Mfe-Glu Cys Thr Lys Leu Leu Gly Gly Cys Thr Lys Asp Ser Glu Cys Cys Pro His Leu Gly Cys Arg Lys Lys Trp Pro Tyr His Cys Gly Trp Asp Gly Thr Phe-NH2, 其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X作為單一有效活性組份用于制備Navl.7型鈉通道抑制劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X在制備電壓門控鈉通道工具試劑-Navl.7型鈉通道抑制劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述的蜘蛛抑鈉肽-1X的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，N端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，蜘蛛抑鈉肽-1X作為單一有效活性組分用于制備Navl.7型鈉通道抑制劑。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，蜘蛛抑鈉肽-1X制備成細(xì)胞外給藥的Navl.7型鈉通道工具試劑。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，蜘蛛抑鈉肽-1X在制備Navl.7型鈉通道工具試劑或抑制劑時(shí)，配制細(xì)胞外給藥的劑量為I ymol/L。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，蜘蛛抑鈉肽-1X的半數(shù)有效作用劑量IC50為 110 nmol/Lο7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，蜘蛛抑鈉肽-1X的作用是時(shí)間依從的。
【文檔編號(hào)】A61P25/00GK105879011SQ201610249727
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年4月20日
【發(fā)明人】鄧梅春, 羅旋
【申請(qǐng)人】長(zhǎng)沙沁才生物科技有限公司