治療幽門螺旋菌感染的新方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包括氨基酸序列的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列與包括對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的HPGGT區(qū)域的一段連續(xù)氨基酸序列至少80％相同，其中所述區(qū)域通過(guò)以下各項(xiàng)定義：(a)按照SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的氨基酸位置150?200，或(b)按照SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的氨基酸位置410?480，和其中所述多肽適合于引起能夠抑制HPGGT催化活性的免疫應(yīng)答。
【專利說(shuō)明】治療幽口螺旋菌感染的新方法
[0001 ] 本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2007/009106，國(guó)際申請(qǐng)日2007年10月19日，中國(guó)申請(qǐng) 號(hào)200780046762.3,發(fā)明名稱為"治療幽口螺旋菌感染的新方法"的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 本發(fā)明設(shè)及作為幽口螺旋菌（Helicobacter pylori) 丫谷氨酷基轉(zhuǎn)膚基酶 化PGGT)片段的多膚;包含它們的免疫原性組合物，包含HPGGT失活形式的免疫原性組合物； 所述多膚和HPGGT失活片段的用途;針對(duì)和特異性結(jié)合所述多膚和HPGGT失活形式的抗體、 適體、和鏡像異構(gòu)適體（spiegelmer);用于識(shí)別候選藥物的方法，用于開(kāi)發(fā)疫苗的方法； HPGGT的配體的用途。
[0003] 幽口螺旋菌是革蘭氏-陰性病原菌，其選擇性定居于人的胃粘膜，并普遍存在于世 界人口的多于50 %中。該感染通常持續(xù)一生，并在胃和十二指腸潰瘍、胃粘膜-相關(guān)淋己樣 組織淋己瘤、和胃癌的發(fā)病機(jī)制中有所設(shè)及。幽口螺旋菌感染的標(biāo)志是慢性的活躍性胃炎， 其特征在于嗜中性粒細(xì)胞、淋己細(xì)胞、和單核細(xì)胞/巨隧細(xì)胞對(duì)粘膜的密集浸潤(rùn)。若干研究 提供了運(yùn)樣的證據(jù)，即在幽口螺旋菌相關(guān)胃炎過(guò)程中，增加并活化T-輔助1型細(xì)胞，顯示出 體內(nèi)上調(diào)CD25和CD69。還引起了針對(duì)多種幽口螺旋菌抗原的強(qiáng)烈體液應(yīng)答。盡管其是炎性 應(yīng)答，宿主免疫系統(tǒng)不清除該感染。因此，似乎幽口螺旋菌干擾免疫系統(tǒng)，目前仍不清楚其 獨(dú)特的機(jī)制。
[0004] -些研究解決了運(yùn)個(gè)問(wèn)題，并描述了幽口螺旋菌逃脫免疫應(yīng)答的被動(dòng)和主動(dòng)方 式。報(bào)告了幽口螺旋菌對(duì)吞隧作用的抗性，并且其依賴于編碼IV型分泌裝置組分的毒力基 因，諸如vbB7和ybBlLZabaleta等報(bào)告幽口螺旋菌精氨酸酶抑制T-細(xì)胞增殖并減少T-細(xì) 胞受體ζ鏈的表達(dá)。顯示出幽口螺旋菌的促炎膚通過(guò)活化單核細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)性氧自由基誘 導(dǎo)淋己細(xì)胞功能異常。運(yùn)些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了細(xì)菌和非-特異性免疫應(yīng)答的相互作用;然而，特異 性Τ-細(xì)胞應(yīng)答對(duì)消除細(xì)菌似乎是決定性的，因?yàn)樵讦臣?xì)胞或干擾素-丫（IFN-丫）缺陷的小鼠 中疫苗接種試驗(yàn)失敗了。
[0005] 盡管付出運(yùn)些努力，但是關(guān)于胃病原菌的慢性持續(xù)性的原因仍不清楚。1已經(jīng)顯示 出CD4陽(yáng)性Τ細(xì)胞對(duì)細(xì)菌消除是關(guān)鍵的2但它們的增殖受到幽口螺旋菌的抑制。在該上下文 中，若干小組研究了來(lái)自幽口螺旋菌的蛋白質(zhì)的免疫抑制作用。Knipp和同事部分純化了所 謂的"增殖-抑制-蛋白（ΡΙΡΓ，其獨(dú)立于毒力因子化gA(細(xì)胞毒素相關(guān)基因 A)和VacA(空泡 細(xì)胞毒素 A)減少淋己細(xì)胞和單核細(xì)胞的增殖。4
[0006] 相反地，兩個(gè)小組近期報(bào)告了淋己細(xì)胞增殖在高濃度的純化的VacA的存在下受到 抑制。5'6然而，自相矛盾的是，VacA-缺陷型幽口螺旋菌突變體在它們的增殖抑制特性上沒(méi) 有缺陷。5另外，早期公認(rèn)了在受到VacA-表達(dá)的螺旋菌株感染的患者中胃炎不改變或甚至 不增加。7'8
[0007] 早期顯示，幽口螺旋菌的分泌產(chǎn)物通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1階段來(lái)抑制T淋己 細(xì)胞增殖。3運(yùn)種作用與已知的毒力因子包括蛋白質(zhì)化cA和化gA無(wú)關(guān)。
[000引盡管關(guān)于幽口螺旋菌逃脫宿主消除作用的可能機(jī)制的工作增加了，在開(kāi)發(fā)特異性 治療或預(yù)防幽口螺旋菌感染的臨床方法中尚未獲得實(shí)質(zhì)的成功。
[0009]作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題是提供適合于在動(dòng)物或人中引起免疫應(yīng)答的多膚，其中所 述免疫應(yīng)答賦予針對(duì)幽口螺旋菌感染和與幽口螺旋菌有關(guān)或由其引起的任何疾病的保護(hù)。
[0010] 作為本發(fā)明基礎(chǔ)的另一個(gè)問(wèn)題是提供適合于引起所述免疫應(yīng)答的免疫原性組合 物。
[0011] 作為本發(fā)明基礎(chǔ)的另一個(gè)問(wèn)題是提供確定用于治療和/或預(yù)防幽口螺旋菌感染的 新型候選藥物的方法，W及治療和預(yù)防運(yùn)種感染的方法。
[0012] 運(yùn)些和其他問(wèn)題是通過(guò)獨(dú)立權(quán)利要求的主題解決的。由從屬權(quán)利要求可W獲得優(yōu) 選的實(shí)施方案。
[0013] 更具體地，在第一方面通過(guò)包括氨基酸序列的多膚解決問(wèn)題，其中所述多膚的氨 基酸序列與HPGGT區(qū)域的一段連續(xù)氨基酸序列至少80%相同，所述HPGGT區(qū)域包括對(duì)應(yīng)于 SEQ. ID.No. 1的氨基酸序列，其中通過(guò)W下各項(xiàng)定義所述區(qū)域：
[0014] (a)按照SEQ. ID. No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或
[0015] (b)按照SEQ. ID. No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480，和
[0016] 其中所述多膚適合于引起能夠抑制HPGGT催化活性的免疫應(yīng)答。
[0017] 在第一方面的實(shí)施方案中，所述多膚包括約15-約30個(gè)氨基酸。
[0018] 在第二方面，通過(guò)多膚，優(yōu)選地，按照第一方面的多膚解決問(wèn)題，其中所述多膚包 括對(duì)應(yīng)下列各項(xiàng)的氨基酸序列：
[0019] (a)按照SEQ. ID. No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或
[0020] (b)按照SEQ. ID. No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480，
[0021] 其中所述多膚包括約15-約30個(gè)氨基酸。
[0022] 在第二和第一方面的實(shí)施方案中，所述多膚的氨基酸序列與所述位置的一段15- 30個(gè)連續(xù)氨基酸的序列一致。
[0023] 在第二和第一方面的實(shí)施方案中，所述多膚包括選自由下列各項(xiàng)組成的組的一個(gè) 序列：
[0024] QRQAETLKEARERFLKY(沈Q. ID.No.2)，
[0025] 抑IKPGNPNLYGLVGGDANAI(沈Q. ID.No.3)，
[00%] DFSIKPGNPNLYGLVGGDANAIEANKRPL(WQ.ID.No.4WP
[0027] SSMSPTIVLKNNKVFLVVGSP(SEQ. ID.No.5)〇
[0028] 在第Ξ方面，通過(guò)免疫原性組合物解決問(wèn)題，所述免疫原性組合物包括一種或數(shù) 種按照第一和第二方面的多膚。
[0029] 在第四方面，通過(guò)免疫原性組合物解決問(wèn)題，所述免疫原性組合物包括HPGGT的失 活形式。
[0030] 在第五方面，通過(guò)免疫原性組合物解決問(wèn)題，所述免疫原性組合物包括HPGGT的片 段，其中所述片段由包括HPGGT的氨基酸451和452的一段連續(xù)氨基酸序列組成。
[0031] 在第Ξ、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述組合物用于動(dòng)物或人的疫苗接種。
[0032] 在第Ξ、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述組合物能夠在動(dòng)物或人中誘導(dǎo)免疫 應(yīng)答。
[0033] 在第Ξ、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述免疫應(yīng)答是抗體應(yīng)答。
[0034] 在第Ξ、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述抗體應(yīng)答包括對(duì)HPGGT，更優(yōu)選地，對(duì) HPGGT的特異性活性具有抑制作用和/或?qū)α芗杭?xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制具有消除作用 的抗體。
[0035] 在第Ξ、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述組合物用于在患有幽口螺旋菌感染 或處于發(fā)展為幽口螺旋菌感染風(fēng)險(xiǎn)中的患者中促進(jìn)淋己細(xì)胞的活化和增殖。
[0036] 在第Ξ、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述淋己細(xì)胞是B或T細(xì)胞。
[0037] 在第Ξ、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述組合物包括一種或數(shù)種佐劑。
[0038] 在第Ξ、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述組合物包括一種或數(shù)種來(lái)自幽口螺 旋菌的抗原。
[0039] 在第Ξ、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述抗原選自包括外膜蛋白的組。
[0040] 在第Ξ、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述抗原選自包括化aA、0mpl8和其組合 的組。
[0041] 在第Ξ、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述組合物用于預(yù)防和/或治療由幽口螺 旋菌引起的或與之相關(guān)的疾病，更優(yōu)選地，由幽口螺旋菌感染引起的或與之相關(guān)的疾病。
[0042] 在第Ξ、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述疾病選自包括下列各項(xiàng)的組:幽口螺 旋菌感染、由幽口螺旋菌引起的胃與十二指腸病癥、胃炎、慢性胃炎、胃或十二指腸潰瘍、胃 癌和(MALT)淋己瘤。
[0043] 在第Ξ、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述免疫原性組合物是疫苗。
[0044] 按照第六方面，通過(guò)按照本發(fā)明第一方面的多膚用于制備藥物的用途解決作為本 發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題。
[0045] 在第屯方面，通過(guò)按照本發(fā)明第Ξ、第四和第五方面的免疫原性組合物用于制備 藥物的用途解決作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題。
[0046] 在本發(fā)明第六和第屯方面的實(shí)施方案中，所述藥物是疫苗。
[0047] 在本發(fā)明第六和第屯方面的實(shí)施方案中，所述藥物用于預(yù)防和/或治療由幽口螺 旋菌引起的或與之相關(guān)的疾病，更優(yōu)選地，由幽口螺旋菌感染引起的或與之相關(guān)的疾病。
[0048] 在第八方面，通過(guò)按照第一方面的多膚用于檢測(cè)樣品中抗體的用途解決作為本發(fā) 明基礎(chǔ)的問(wèn)題，其中所述抗體針對(duì)HPGGT。
[0049] 在第八方面的實(shí)施方案中，所述抗體能夠抑制HPGGT酶活性和/或HPGGT對(duì)淋己細(xì) 胞增殖的抑制活性。
[0050] 在第九方面，通過(guò)特異結(jié)合按照第一方面的多膚的抗體解決作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn) 題。
[0051 ]在第九方面的實(shí)施方案中，所述抗體具有對(duì)HPGGT，更優(yōu)選地，對(duì)HPGGT的特異性活 性的抑制作用和/或?qū)α芗杭?xì)胞增殖的HPGGT依賴性淋己細(xì)胞抑制的消除作用。
[0052] 在第十方面，通過(guò)編碼按照第九方面的抗體的核酸解決作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題。
[0053] 在第十一方面，通過(guò)特異結(jié)合按照第一方面的多膚或結(jié)合HPGGT的片段的核酸分 子解決作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題，其中所述片段由包括HPGGT的氨基酸451和452的一段連續(xù) 氨基酸序列組成，其中所述核酸分子選自包括適體和鏡像異構(gòu)適體的組。
[0054] 在第^^一方面的實(shí)施方案中，所述核酸具有對(duì)HPGGT，更優(yōu)選地，對(duì)HPGGT的特異性 活性的抑制作用和/或?qū)α芗杭?xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除作用。
[0055] 在第十二方面，通過(guò)按照第九方面的抗體用于制備藥物的用途解決作為本發(fā)明基 礎(chǔ)的問(wèn)題。
[0056] 在第十Ξ方面，通過(guò)按照第十一方面的核酸用于制備藥物的用途解決作為本發(fā)明 基礎(chǔ)的問(wèn)題。
[0057] 在第十二和第十Ξ方面的實(shí)施方案中，所述藥物用于治療和/或預(yù)防由幽口螺旋 菌引起的或與之相關(guān)的疾病，更優(yōu)選地，由幽口螺旋菌感染引起的或與之相關(guān)的疾病。
[0058] 在第十四方面，通過(guò)用于確定治療疾病的候選藥物的方法解決作為本發(fā)明基礎(chǔ)的 問(wèn)題，所述方法包括評(píng)估候選藥物的下列各項(xiàng)的步驟：
[0059] a.對(duì)幽口螺旋菌的丫 -谷氨酷基轉(zhuǎn)膚基酶的特異性活性的抑制作用和
[0060] b.對(duì)淋己細(xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除作用。
[0061] 在第十四方面的實(shí)施方案中，所述疾病是由幽口螺旋菌引起的或與之相關(guān)的疾 病，更優(yōu)選地，由幽口螺旋菌感染引起的或與之相關(guān)的疾病，和更優(yōu)選地，人中的幽口螺旋 菌感染。
[0062] 在第十五方面，通過(guò)用于開(kāi)發(fā)疫苗的方法解決作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題，所述方法 包括下列步驟：
[0063] a)提供包括HPGGT或至少一個(gè)它的片段的免疫原性組合物；
[0064] b)用所述免疫原性組合物免疫動(dòng)物，并由此產(chǎn)生抗體；
[0065] C)評(píng)估所述抗體對(duì)幽口螺旋菌的丫-谷氨酷基轉(zhuǎn)膚基酶的特異性活性的抑制作用 和它們對(duì)淋己細(xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除作用和
[0066] d)選擇合適的免疫原性組合物。
[0067] 在第十五方面的實(shí)施方案中，所述疫苗是針對(duì)人中幽口螺旋菌感染的疫苗。
[0068] 在第十六方面，通過(guò)HPGGT配體制備用于預(yù)防和/或疾病的藥物的用途解決作為本 發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題，其中所述配體顯著抑制HPGGT活性并消除淋己細(xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑 制。
[0069] 在第十六方面的實(shí)施方案中，所述疾病是由幽口螺旋菌引起的或與之相關(guān)的疾 病，更優(yōu)選地，由幽口螺旋菌感染引起的或與之相關(guān)的疾病。
[0070] 在第十六方面的實(shí)施方案中，所述配體是按照第九方面的抗體，或按照第十一方 面的核酸。
[0071] 在第十六方面的實(shí)施方案中，在淋己細(xì)胞增殖測(cè)定中評(píng)估淋己細(xì)胞增殖和/或活 化。
[0072] 在第十屯方面，通過(guò)HPGGT用于制備免疫抑制劑組合物的用途解決作為本發(fā)明基 礎(chǔ)的問(wèn)題。
[0073] 在第十八方面，通過(guò)免疫抑制劑組合物解決作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題，所述免疫抑 制劑組合物是可W在容許HPGGT特異性活性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)HPGGT和谷氨酷胺后作為上清 液獲得的。
[0074] 在不希望受到任何理論局限的條件下，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)針對(duì)幽口螺旋菌的 丫-谷氨酷基轉(zhuǎn)膚基酶化PGGTKE.C.2.3.2.2.)的配體可W用于治療和/或預(yù)防幽口螺旋菌 感染，具體地，胃與十二指腸病癥，其中所述配體是HPGGT催化活性的抑制劑并與對(duì)照相比 恢復(fù)淋己細(xì)胞增殖，所述對(duì)照在存在該酶的條件下受到抑制。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)與 HPGGT-起培養(yǎng)時(shí)，淋己細(xì)胞的增殖受到HPGGT特異性活性的阻斷，所述HPGGT特異性活性導(dǎo) 致淋己細(xì)胞中的G1細(xì)胞周期停滯，并由此抑制淋己細(xì)胞增殖。因此，HPGGT特異性活性的抑 審IJ消除淋己細(xì)胞增殖的抑制，并因此使幽口螺旋菌不可能逃脫宿主的免疫系統(tǒng)。因此，如本 發(fā)明提示的配體的使用預(yù)防或至少基本減少幽口螺旋菌定居在宿主/患者中。最后，本發(fā)明 人發(fā)現(xiàn)幽口螺旋菌的γ谷氨酷基轉(zhuǎn)膚基酶(GGT)的催化活性對(duì)于抑制淋己細(xì)胞增殖，特別 是宿主中Τ細(xì)胞增殖是必需的。運(yùn)由下列證據(jù)清楚地證實(shí)，所述證據(jù)顯示在GGT活性中有缺 陷的突變細(xì)菌喪失消除淋己細(xì)胞增殖的能力，并同時(shí)不能定居在小鼠中。對(duì)淋己細(xì)胞的抑 制作用由重組HPGGT完全呈現(xiàn)。關(guān)于其對(duì)Τ細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用的分析提示Ras信號(hào)傳導(dǎo) 通路的中斷，從而導(dǎo)致誘導(dǎo)G1細(xì)胞周期停滯。重要地，注意到每種幽口螺旋菌株具有HPGGT， 且由抑制配體祀向該酶將提供適用于每種幽口螺旋菌感染的新型療法，由此避免與抗生素 療法相關(guān)的問(wèn)題(抗性、副作用、突變體選擇等）。按照本發(fā)明，優(yōu)選地，對(duì)幽口螺旋菌感染的 保護(hù)是通過(guò)抑制HPGGT的催化活性和由此破壞免疫抑制而賦予的，所述免疫抑制否則阻止 針對(duì)幽口螺旋菌的有效免疫應(yīng)答。
[0075] HPGGT廣泛分布于動(dòng)物、植物和細(xì)菌中。其代表異源二聚體蛋白，其作為單多膚鏈 翻譯，并在翻譯后分裂為兩個(gè)具有不同分子量的亞單位。該酶的哺乳動(dòng)物形式是膜-結(jié)合的 蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)主要表達(dá)于全身的腺體和導(dǎo)管腔表面上。一些細(xì)菌性GGT，包括幽口螺 旋菌同源物的細(xì)胞定位與哺乳動(dòng)物的酶的細(xì)胞定位不同。先前顯示，HPGGT被分泌到細(xì)胞外 培養(yǎng)基中（Bumann等2002)。另外，不同GGT同源物氨基酸序列的排列掲示HPGGT與人和其他 哺乳動(dòng)物GGT之間22%的低同源性，而對(duì)細(xì)菌性同源物的較高同源性。HPGGT和來(lái)自其他物 種的同源物之間的另一個(gè)重要區(qū)別是在HPGGT的C-末端缺乏GY-殘基(化evalier等1999)。 因此，關(guān)于HPGGT和其哺乳動(dòng)物同源物之間的細(xì)胞定位和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本區(qū)別是明顯的。
[0076] 丫-谷氨酷基轉(zhuǎn)移酶還稱為谷氨酷基轉(zhuǎn)膚基酶;a-谷氨酷基轉(zhuǎn)膚基酶;g-谷氨酷基 膚基轉(zhuǎn)移酶;g-谷氨酷基轉(zhuǎn)膚基酶;g-GPT; g-GT; g-GTP; kg-谷氨酷基轉(zhuǎn)膚基酶;kg-谷氨 酷基轉(zhuǎn)移酶;k谷氨酷基轉(zhuǎn)移酶;GGT;g-谷氨酷基轉(zhuǎn)膚基酶。特異性(催化)活性是如下概述 的谷氨酷基殘基轉(zhuǎn)移：
[0077] (5寸-谷氨酷基)-膚+氨基酸=膚巧-心谷氨酷基氨基酸
[0078] 該反應(yīng)或進(jìn)行所述反應(yīng)的能力在本文中也指HPGGT的酶活性或HPGGT的特異性活 性。
[00巧]可W用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法（例如，使用k 丫-谷氨酷基-p-nitroanilide 作為供體底物;見(jiàn)下)評(píng)估GTT活性?？蒞如本文中所詳述地，在存在或缺乏HPGGT和/或配體 的條件下進(jìn)行淋己細(xì)胞增殖測(cè)定。
[0080] 早期，其他小組已經(jīng)描述了GGT作為來(lái)自幽口螺旋菌的因子對(duì)體內(nèi)定居很重要 。11' U然而，該發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)原因尚不清楚。
[0081] 本發(fā)明提供關(guān)于人T淋己細(xì)胞增殖的GGT-依賴性抑制和由幽口螺旋菌誘導(dǎo)G1停滯 的明確證據(jù)。運(yùn)在一方面通過(guò)使用細(xì)菌的同基因（isogenic)GGT敲除突變體得到證實(shí)，其未 能抑制抗原-刺激的初級(jí)人T細(xì)胞W及PBMC的增殖。在另一方面，大腸桿菌化.coli)中表達(dá) 的重組HPGGT在缺乏幽口螺旋菌分泌的其他蛋白的條件下，抑審化細(xì)胞增殖。有趣地，我們的 數(shù)據(jù)顯示哺乳動(dòng)物的GGT缺乏運(yùn)種抑制功能。如上提及地，報(bào)告了哺乳動(dòng)物和HPGGT的結(jié)構(gòu) 和定位中的區(qū)別。我們的結(jié)果指出哺乳動(dòng)物和HPGGT的催化機(jī)制和/或底物特異性的其他差 另IJ，運(yùn)是哺乳動(dòng)物GGT不能抑制淋己細(xì)胞增殖的原因。
[0082] 使用了結(jié)構(gòu)研究和誘變實(shí)驗(yàn)來(lái)確定絲氨酸殘基451和452對(duì)GGT催化活性而言是必 需的。u本文顯示HPGGT絲氨酸451/452位置-定向誘變?yōu)楸彼釋?dǎo)致完全消除其針對(duì)淋己細(xì) 胞的催化活性和特別地，抑制活性，運(yùn)與現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)教導(dǎo)相反，在現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)告了氨 基酸位置380(Τ380)對(duì)HPGGT的催化活性很關(guān)鍵"。因此，用GG巧Φ制劑阿西維辛(acivicin) 培養(yǎng)HPGGT完全消除該酶的催化活性W及抑制功能。所W，我們的數(shù)據(jù)證明HPGGT的催化結(jié) 構(gòu)域的結(jié)構(gòu)完整性是其免疫抑制作用的必要先決條件。按照來(lái)自幽口螺旋菌的GGT在體內(nèi) 定居過(guò)程中的重要作用ii'u，我們發(fā)現(xiàn)該酶甚至在宿主胃粘膜中存在的低pH值下是催化活 性的。
[0083] 非常確定地，人胃中的上皮細(xì)胞形成連續(xù)的屏障，所述屏障限制分子在內(nèi)部和外 部區(qū)室之間運(yùn)動(dòng)。另外，多種機(jī)制，包括緊密和粘著連接阻止大分子被動(dòng)擴(kuò)散經(jīng)過(guò)該屏障的 細(xì)胞旁空間。因此，出現(xiàn)了運(yùn)樣的問(wèn)題，即幽口螺旋菌分泌的GGT蛋白如何能夠與上皮屏障 另一側(cè)的宿主免疫系統(tǒng)相互作用，從而抑制T細(xì)胞增殖。在該上下文中，先前已經(jīng)證明了HP 能夠通過(guò)若干機(jī)制減弱胃上皮的屏障功能。另外，W前已經(jīng)證明了由HP蛋白VacA和化gA引 起上皮連接復(fù)合物的破壞W及由幽口螺旋菌脈酶引起增多的胞轉(zhuǎn)蛋白（transcytotic protein)穿過(guò)上皮屏障傳遞。運(yùn)些機(jī)制最終導(dǎo)致固有層中存在增多的HP蛋白，和它們與作 為幽口螺旋菌感染的結(jié)果浸潤(rùn)胃粘膜的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的相互作用。支持HPGGT對(duì)胃粘膜中T 細(xì)胞的影響，我們的結(jié)果顯示明確的血清抗體應(yīng)答HP感染的而非未感染的對(duì)照患者中的運(yùn) 種毒力因子。運(yùn)支持抗原處理GGT蛋白組分和將運(yùn)些抗原呈遞給免疫系統(tǒng)的組分，包括胃粘 膜中的T淋己細(xì)胞的想法。因此，通過(guò)HPGG巧審制胃粘膜中的T淋己細(xì)胞增殖可W有助于幽口 螺旋菌的免疫逃脫機(jī)制，從而促進(jìn)其在人胃中的慢性持久性。
[0084] 解釋本發(fā)明的研究的結(jié)果掲示了在與幽口螺旋菌野生型上清液和還有與重組 HPGGT溫育的過(guò)程中T細(xì)胞活化的重要機(jī)制是完整的。運(yùn)與本發(fā)明人先前的研究一致，所述 先前的研究顯示細(xì)胞表面抗原CD69和CD25(比-2受體α-鏈）的表達(dá)在存在幽口螺旋菌上清 液的條件下不減少。3另外，證明了 HPGGT對(duì)淋己細(xì)胞的抑制功能受到與調(diào)亡無(wú)關(guān)機(jī)制的介 導(dǎo)，因?yàn)橥ㄟ^(guò)Annexin V-FITC染色測(cè)量的憐脂酷絲氨酸的暴露，在存在幽口螺旋菌上清液 和重組HPGGT的條件下不增加。早期描述了 HPGGT誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞中的氧化壓力和調(diào)亡。u'16 然而，先前沒(méi)有確定該酶對(duì)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的作用，且觀察到的區(qū)別可W反映祀細(xì)胞之間 的區(qū)別。
[0085] 本發(fā)明人分析了在T細(xì)胞中用細(xì)胞周期進(jìn)展干擾HPGGT，并發(fā)現(xiàn)HPGGT通過(guò)引起細(xì) 胞周期G1階段中的停滯，抑制淋己細(xì)胞的增殖。G1停滯的特征在于增多的Cdk-抑制子p27的 量W及減低的細(xì)胞周期蛋白細(xì)胞水平。Ras-和PI3K-依賴性途徑在用它們的催化配偶體誘 導(dǎo)、合成和裝配D-型細(xì)胞周期蛋白的過(guò)程中非常重要。22'23Ras-信號(hào)傳導(dǎo)的活化通過(guò)設(shè)及C- Raf和其他激酶的蛋白級(jí)聯(lián)誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白D-轉(zhuǎn)錄。24另外，確定了誘導(dǎo)Ras信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致 增強(qiáng)合成c-Myc蛋白25,運(yùn)在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)、和轉(zhuǎn)化過(guò)程中起重要作用。26先前的 研究證明了 PI3K-信號(hào)傳導(dǎo)不依賴于T細(xì)胞中的Ras-信號(hào)傳導(dǎo)而進(jìn)行。U盡管重要介體PI3K- 信號(hào)傳導(dǎo)(AKT，p70S6K和化xo3)的活化狀態(tài)在存在HPGGT的條件下不改變，我們?cè)谟肏PGGT 培養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了降低的c-Raf憐酸化和c-Myc蛋白水平。因此，我們的數(shù)據(jù)提示由來(lái)自 幽口螺旋菌的GGT引起的Ras-而非PI3K-依賴性信號(hào)傳導(dǎo)的中斷在誘導(dǎo)T細(xì)胞中細(xì)胞周期停 滯的過(guò)程中起作用，從而導(dǎo)致消除的細(xì)胞增殖。
[0086] 另一個(gè)重要問(wèn)題是酶，如HPGGT如何能夠影響導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和抑制增殖的細(xì) 胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)事件。在轉(zhuǎn)膚基反應(yīng)過(guò)程中，GGT催化γ -谷氨酷基部分從供體轉(zhuǎn)移到受體基 質(zhì)中。27通過(guò)系統(tǒng)氨基酸消耗分析，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在缺乏來(lái)自培養(yǎng)基的氨基酸谷氨酷胺的條 件下完全消除HPGGT的抑制作用，運(yùn)提示來(lái)自幽口螺旋菌的GGT的抑制作用受到轉(zhuǎn)膚基作用 過(guò)程中形成代謝物的間接介導(dǎo)。運(yùn)通過(guò)我們運(yùn)樣的觀察得到支持，即與HPGGT-起預(yù)培養(yǎng)培 養(yǎng)基并隨后在加入到細(xì)胞前使酶失活足W抑制淋己細(xì)胞增殖。
[0087] 先前的研究描述了幽口螺旋菌的若干不同于GGT的因子，其抑制人Τ淋己細(xì)胞的增 殖。Wang和同事顯示處于300的101(300個(gè)細(xì)菌/Τ細(xì)胞）的幽口螺旋菌通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)亡，抑制Τ 細(xì)胞的增殖。然而，運(yùn)種高細(xì)菌量是否接觸到人胃的固有層中的T細(xì)胞是不確定的。在我們 先前的公開(kāi)文獻(xiàn)中（胃腸病學(xué)(Gas化oenterology)2005 2005; 128(5) :1327-39),本發(fā)明人 顯示甚至比1(1個(gè)細(xì)菌/T細(xì)胞)低300倍的M0I足W在我們的系統(tǒng)中抑制淋己細(xì)胞增殖。當(dāng)與 淋己細(xì)胞一起培養(yǎng)的HP培養(yǎng)物上清液的濃度升高超過(guò)10化g/ml時(shí)，觀察到與Wang等相似量 的調(diào)亡。運(yùn)提示本文中所述的HP對(duì)淋己細(xì)胞的抑制作用與該小組所述的機(jī)制相比更明確 (pronounced)并且不同。
[0088] 由Zabale化等進(jìn)行另一項(xiàng)研究描述了細(xì)胞質(zhì)HP蛋白精氨酸酶抑制T細(xì)胞增殖W。作 者使用來(lái)自HP的全細(xì)胞溶解物，其包含細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)和膜-結(jié)合蛋白。相反，本發(fā)明人使用 來(lái)自HP包含其分泌的蛋白的培養(yǎng)物上清液。由于HP不分泌精氨酸酶，所W該酶針對(duì)T細(xì)胞可 能的抑制作用是于此使用的系統(tǒng)中不可檢測(cè)的，且不太可能在體內(nèi)發(fā)生。
[0089] Gebed等進(jìn)行的工作提示由幽口螺旋菌分泌的空泡細(xì)胞毒素 A(VacA)抑制T細(xì)胞 增殖。作者使用了是我們?cè)谖覀兡壳肮ぷ髦惺褂脻舛龋?化g/ml)的25倍的濃度(250μg/ml) 的細(xì)菌上清液。在先前的研究中，本發(fā)明人證明了高HP培養(yǎng)物上清液濃度（>l(K)μg/ml)在 淋己細(xì)胞中誘導(dǎo)顯著量的調(diào)亡。另外，在我們的系統(tǒng)中存在或缺乏VacA對(duì)HP針對(duì)淋己細(xì)胞 的抑制沒(méi)有影響(Gastro 2005)。
[0090] 因此，不管前述由幽口螺旋菌引起T細(xì)胞抑制的其他方式，在本文中使用的系統(tǒng) 中，細(xì)菌分泌的GGT對(duì)抑制T細(xì)胞增殖是必需的和充分的。
[0091] 總之，解釋本申請(qǐng)的數(shù)據(jù)提供一種由幽口螺旋菌應(yīng)用的免疫逃避的新型機(jī)制，其 利用分泌的蛋白質(zhì)抑制免疫效應(yīng)子細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)展。顯示了酶GGT是造成幽口螺旋菌 抑審化細(xì)胞增殖的原因，因?yàn)樵诩?xì)菌的GGT-缺陷型突變體中抑制作用完全消除。該作用明顯 依賴于GGT的催化活性，因?yàn)橹亟MHPGGT蛋白的酶失活突變體缺乏抑制T細(xì)胞增殖的能力。另 夕h顯示了僅在存在來(lái)幽口螺旋菌的GGT條件下誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在T細(xì)胞的G1期。再一次， 在不希望受到任何理論限制的條件下，其他結(jié)果指出由HPGGT引起的Ras-而非PI3K-依賴性 信號(hào)傳導(dǎo)的中斷是G1停滯和抑制的T細(xì)胞增殖的原因。將HPGGT鑒定為淋己細(xì)胞抑制因子形 成在動(dòng)物模型中觀察的生物基礎(chǔ)，顯示HPGGT對(duì)于幽口螺旋菌定居的重要作用。在W0 00/ 01825和W098/17804中討論了HPGGT及其在宿主細(xì)胞的定居中的可能作用。然而，運(yùn)兩篇文 獻(xiàn)沒(méi)有提供運(yùn)樣的證據(jù)，即冊(cè)GGT活性是造成宿主免疫系統(tǒng)抑制的原因，且它們沒(méi)有記載 HPGGT對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)T細(xì)胞增殖和免疫抑制的影響。
[0092] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)不僅所述HPGGT，優(yōu)選地，具有按照SEQ. ID.No. 1的氨基酸序列的野 生型HPGGT，可W作為用于產(chǎn)生抗體、適體、和鏡像異構(gòu)適體的抗原使用，而且其不同片段也 可W，所述抗體、適體、和鏡像異構(gòu)適體各自優(yōu)選地與所述抗原特異性結(jié)合，運(yùn)適合于抑制 HPGGT的特異性活性和/或?qū)α芗杭?xì)胞增殖的淋己細(xì)胞抑制的HPGGT依賴性抑制的消除作 用。
[0093] 因此，在一方面，本發(fā)明設(shè)及特異性多膚。所述多膚包括氨基酸序列，其與HPGGT不 同區(qū)域的一部分或一段氨基酸序列相同或相對(duì)應(yīng)。優(yōu)選地，HPGGT的氨基酸序列包括按照 SEQ.ID.No.l的氨基酸序列。
[0094] 優(yōu)選地用于本文時(shí)，如果氨基酸的序列或順序在氨基酸性質(zhì)和其彼此間相對(duì)位置 方面相同，則氨基酸序列與另一個(gè)氨基酸序列相同。
[0095] 優(yōu)選地用于本文時(shí)，如果氨基酸的序列或順序在氨基酸性質(zhì)和其彼此間相對(duì)位置 方面相同，則氨基酸序列與另一個(gè)氨基酸序列相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一致的序列的一 級(jí)氨基序列是相同的。
[0096] 如本文所優(yōu)選使用的，如果氨基酸的序列或順序在氨基酸性質(zhì)和其彼此間相對(duì)位 置方面相同，則氨基酸序列與另一個(gè)氨基酸序列相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，彼此對(duì)應(yīng)的序 列的一級(jí)氨基酸序列相同，其中運(yùn)兩個(gè)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的全部鄰近序列（context)相同 或不同。由該氨基酸序列的一個(gè)或兩個(gè)末端相鄰的氨基酸定義氨基酸的全部鄰近序列。
[0097] 本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該公認(rèn)彼此相同或?qū)?yīng)的序列具有至少80% ,85% ,90%， 95%或100%的序列同源性。
[0098] 在實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的多膚包括或由與HPGGT的一段保守氨基酸序列相同 或?qū)?yīng)的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，且對(duì)本發(fā)明的任何實(shí)施方案和方面適用地，HPGGT具有 按照SEQ.ID.No.l的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該公認(rèn)可W存在HPGGT的變體和突變 體，其應(yīng)該包括在術(shù)語(yǔ)HPGGT之內(nèi)。本發(fā)明還包括，如果HPGGT的序列與如SEQ. ID. No. 1中指 定的HPGGT之一不同，則本文中關(guān)于具有如SEQ.ID.No.l中指定的氨基酸序列的HPGGT所公 開(kāi)的內(nèi)容也適用于HPGGT的所述不同形式。更具體地，本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該識(shí)別處于所述 不同形式的氨基酸，其在其位置、化學(xué)性質(zhì)和/或功能方面，與具有如SEQ.ID.No.l中指定的 氨基酸序列的HPGGT中確定的氨基酸和位置分別對(duì)應(yīng)。
[0099] 如本文中公開(kāi)地，按照本發(fā)明的多膚與HPGGT不同區(qū)域的氨基酸序列相同或?qū)?yīng)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述區(qū)域是由按照SEQ.ID.No.l的氨基酸序列的氨基酸位置150-200定 義的區(qū)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述區(qū)域是由按照SEQ.ID.No.l的氨基酸序列的氨基酸位 置410-480定義的區(qū)域。
[0100] 本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)由氨基酸150-200定義的HPGGT部分和由氨基酸410-480定義 的HPGGT部分特別有益于作為產(chǎn)生能夠抑制HPGGT的催化活性的抗體的抗原或疫苗使用，由 此提供運(yùn)樣的先決條件，即免疫應(yīng)答是針對(duì)幽口螺旋菌，或至少針對(duì)受到幽口螺旋菌感染 或處于其感染風(fēng)險(xiǎn)中的生物體中的HPGGT引起的。
[0101] 在不希望受到任何理論限制的條件下，本發(fā)明人假定由氨基酸位置150-200和氨 基酸位置410-480定義的區(qū)域都具有與HPGGT酶活性的特殊關(guān)系。更具體地，認(rèn)為由氨基酸 位置410-480定義的HPGGT區(qū)域與HPGGT的活性中屯、有關(guān)或接近。更具體地，該HPGGT區(qū)域包 括與所述活性中屯、直接接觸的環(huán)區(qū)域和所述活性中屯、本身的一部分。因此，運(yùn)部分HPGGT的 阻斷是抑制HPGGT酶活性的合適方法，大概是通過(guò)阻斷HPGGT催化活性物質(zhì)的進(jìn)入。運(yùn)些，在 原則上，對(duì)于由氨基酸位置15 0 - 2 0 0定義的Η P G G T區(qū)域也是正確的。按照S E Q. ID. N 0.1的 HPGGT的氨基酸位置150-200的區(qū)域設(shè)及或形成處于HPGGT活性中屯、外的環(huán)（的一部分），然 而，其與底物的結(jié)合袋緊密空間接近。由于運(yùn)些，所W任何特異干擾運(yùn)些區(qū)域的分子是如本 文中更詳細(xì)描述地能夠關(guān)于具有運(yùn)種類型結(jié)合特性的抗體使用的試劑。除抗體外，可w分 別產(chǎn)生和使用如現(xiàn)有技術(shù)中所述的膚適體、抗促成素(anticaline)、適體和鏡像異構(gòu)適體， W獲得本文中關(guān)于抗體公開(kāi)的多種目的。
[0102] 本申請(qǐng)?zhí)峁┒嗄w，其序列與下列氨基酸位置對(duì)應(yīng)或相同：
[0103] (a)(150+n)-(150+n+m)，其中η是0-35之間的任何整數(shù)，且m是15-30之間的任何整 數(shù)。應(yīng)該理解由此定義的位置是由η和m的任意組合產(chǎn)生的那些。還應(yīng)該理解所述組合優(yōu)選 地僅限于運(yùn)樣的范圍內(nèi)，即由此定義的上游位置是約200;由（150+n)定義的位置也稱為下 游位置;且由（150+n+m)定義的位置也稱為上游位置。
[0104] (b)(410+n)-(410+n+m)，其中η是0-55之間的任何整數(shù)，且m是15-30之間的任何整 數(shù)。應(yīng)該理解由此定義的位置是由η和m的任意組合產(chǎn)生的那些。還應(yīng)該理解所述組合優(yōu)選 地僅限于運(yùn)樣的范圍內(nèi)，即由此定義的上游位置是約200;由（410+n)定義的位置也稱為下 游位置;且由（410+n+m)定義的位置也稱為上游位置。
[0105] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的多膚是HPGGT的片段，優(yōu)選地，HPGGT的免疫原 性片段，和更有效地，適合于在宿主生物體內(nèi)引起免疫應(yīng)答，優(yōu)選地抗體應(yīng)答的HPGGT免疫 原性片段，其中所述抗體具有對(duì)HPGGT，更優(yōu)選地對(duì)HPGGT的特異性活性的抑制作用，和/或 對(duì)淋己細(xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除作用。優(yōu)選地，按照本發(fā)明的免疫原性片段包括 HPGGT的氨基酸451和或452。該片段可W是任何長(zhǎng)度。然而，使用10-約50個(gè)氨基酸殘基的 膚，更優(yōu)選的10-40、10-30,或最優(yōu)選的10-20。為了基于膚的疫苗的設(shè)計(jì)，在此應(yīng)用表位預(yù) 測(cè)算法。優(yōu)選地用于本文時(shí)，宿主生物體是動(dòng)物，優(yōu)選地哺乳動(dòng)物，或人，其優(yōu)選地能夠針對(duì) 抗原形成免疫應(yīng)答。
[0106]優(yōu)選地用于本文時(shí)，氨基酸是α-氨基酸。也優(yōu)選地用于本文時(shí)，氨基酸是〇-或心氨 基酸，優(yōu)選地，k氨基酸。更優(yōu)選地，氨基酸是天然存在的氨基酸。
[0107] 本發(fā)明人還意外地發(fā)現(xiàn)將HPGGT的絲氨酸殘基451和/或452誘變?yōu)楸彼嵬耆?除重組HPGGT的酶活性，并消除其對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制。然而，絲氨酸殘基385的取代(S385A) 不減少對(duì)T細(xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制作用，因管顯著降低運(yùn)種突變HPGGT的催化活性 (即，約50%)。因此，治療幽口螺旋菌感染的合適藥物物質(zhì)需要滿足2個(gè)要求，即（i)它必須 表現(xiàn)出對(duì)HPGGT催化活性的抑制作用，且在與HPGGT-起培養(yǎng)時(shí)還必須恢復(fù)T細(xì)胞增殖。按照 本發(fā)明用于識(shí)別合適候選藥物的有效方法因此包括運(yùn)兩種評(píng)估。
[0108] 由于運(yùn)些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的另一方面設(shè)及HPGGT失活形式的用途。
[0109] HPGGT的失活形式是HPGGT的一個(gè)實(shí)施方案，其缺乏如本文中所示的HPGGT酶活性。 本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該公認(rèn)，存在多種提供所述HPGGT失活形式的方法，包括刪除一個(gè)或數(shù) 個(gè)氨基酸，改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸，總是與酶活性的HPGGT相比較。HPGGT失活形式的一個(gè)實(shí) 施方案是在按照SEQ. ID.No. 1的氨基酸序列的位置451和452處缺少絲氨酸氨基酸的HPGGT。 在一個(gè)實(shí)施方案中，HPGGT的失活形式仍能夠引起如本文中所述的免疫應(yīng)答，優(yōu)選地，動(dòng)物 和/或人中的抗體應(yīng)答，其包括具有對(duì)野生型HPGGT，更優(yōu)選地，對(duì)HPGGT的特異性活性的抑 制作用和/或?qū)α芗杭?xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除作用的抗體。優(yōu)選地用于本文時(shí)， 術(shù)語(yǔ)HPGGT的特異性活性與酶活性，和更具體地，如本文中所述的HPGGT的酶活性，W同義方 式使用。冊(cè)GGT失活形式的另一個(gè)實(shí)施方案是具有野生型氨基酸序列的HPGGT，但通過(guò)向 HPGGT的酶活性添加抑制劑抑制酶活性。所述抑制劑可W是抗體、鏡像異構(gòu)適體、適體或剝 奪HPGGT的HPGGT酶活性所需的因子包括離子的任何分子。
[0110] 應(yīng)該理解，多膚、HPGGT失活形式和HPGGT在本文中也稱為祀分子，具體地，和與之 特異結(jié)合的抗體、適體和鏡像異構(gòu)適體的產(chǎn)生有關(guān)。
[0111] 本發(fā)明的另一方面設(shè)及抗體，所述抗體針對(duì)按照本發(fā)明的多膚、HPGGT的失活形式 或HPGGT，優(yōu)選地典型具有按照SEQ. ID. No. 1的氨基酸序列的野生型HPGGT。
[0112] 本文中優(yōu)選使用的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體，其制備和產(chǎn)生分別為本領(lǐng) 域中的技術(shù)人員所熟知。
[0113] 特異于所述祀標(biāo)的抗體的制備是本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的，例如，記述在化rlow， E.，和Lane,D.，"抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)"（"Antibodies:A Laboratoiy Manual，"）冷泉港實(shí)驗(yàn)室 (Cold Spring 化 rbor LaboratoiT)，冷泉港，紐約（Cold Spring 化;rbo;r，NY) ,(1988)中。 優(yōu)選地，單克隆抗體可W連同本發(fā)明使用，其可W按照Κ?jiǎng)eller和Milstein的方案和基于此 的其他發(fā)展方案而制備?？贵w，用于本文時(shí)，包括，但不僅限于，完全抗體、抗體片段或衍生 物，諸如化b片段、Fc片段和單鏈抗體或抗促成素，只要它們適合于且能夠結(jié)合于所述祀標(biāo)。 除單克隆抗體外，也可W使用和/或生成多克隆抗體。多克隆抗體的生成也是本領(lǐng)域中技術(shù) 人員已知的，例如，記述在化rl〇w，E .，和Lane，D.，"抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)"（"Antibodies :A LaboratoiT Manual/')冷泉港實(shí)驗(yàn)室（Cold Spring 化rbor LaboratoiT)，冷泉港，紐約 (Co Id Spring化rbor，NY)，（ 1988)中。優(yōu)選地，用于治療目的的抗體是人源化的或人抗體。
[0114] 按照本發(fā)明可W使用的抗體可W具有一個(gè)或數(shù)個(gè)標(biāo)記或標(biāo)簽。所述標(biāo)記或標(biāo)簽可 W在其診斷應(yīng)用或其治療應(yīng)用中有效檢測(cè)抗體。優(yōu)選地，所述標(biāo)記和標(biāo)簽選自包含抗生物 素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、生物素、金和巧光素的組，并用在例如化ISA法中。運(yùn)些和其他 標(biāo)記W及方法，例如記述在化rl〇w，E.，和Lane，D.，"抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)"（"Antibodies:A LaboratoiT Manual/')冷泉港實(shí)驗(yàn)室（Cold Spring 化rbor LaboratoiT)，冷泉港，紐約 (Cold Spring化ΛοΓ,ΝΥ)，（1988)中。另外地或備選地，本文中所述的抗體W及任何其他 祀括抗劑或相互作用配偶體可W是如本文中更一般描述的帶有標(biāo)簽的括抗劑。
[0115] 本發(fā)明還包括所述標(biāo)簽或標(biāo)記表現(xiàn)出除檢測(cè)W外的其他功能，諸如與其他分子相 互作用。所述相互作用可W是，例如與其他化合物的特異性相互作用。運(yùn)些其他化合物可W 是使用抗體的系統(tǒng)如人或動(dòng)物體中所固有的那些，或在通過(guò)使用各自抗體進(jìn)行分析樣品中 固有的那些。合適的標(biāo)記可W，例如，是生物素或巧光素，其具有其特異性相互作用配偶體， 諸如抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白等，所述配偶體存在于與由此標(biāo)記或帶有標(biāo)簽的抗 體相互作用的各種化合物或結(jié)構(gòu)上。而且，運(yùn)也應(yīng)用于本文中所述的其他祀相互作用配偶 體，諸如適體和鏡像異構(gòu)適體。
[0116] 在實(shí)施方案中，所述抗體是具有針對(duì)HPGGT表位的特異性活性的抗體，優(yōu)選地單克 隆抗體，其包括重組HPGGT的氨基酸451和/或452。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體應(yīng)該祀向 在空間上接近運(yùn)些氨基酸位置的表位，優(yōu)選地，祀向并特異結(jié)合于鄰近所述位置的環(huán)，更優(yōu) 選地，所述表位由下述序列所定義或包含在下述序列中：由SEQ. ID.No. 1的HPGGT氨基酸位 置150-200，更優(yōu)選地，位置174-190定義的運(yùn)段HPGGT序列，或通過(guò)SEQ. ID. No. 1的HPGGT氨 基酸位置410-480，更優(yōu)選地，位置423-443所定義的運(yùn)段HPGGT序列，和其在運(yùn)樣的附帶條 件下的衍生物，所述附帶條件是它們顯示基本相同的免疫反應(yīng)性。
[0117] 優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體W至少50%，更優(yōu)選地至少70 %，最優(yōu)選地至少80或90%， 抑審化PGGT特異性活性并抑制宿主中淋己細(xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制。還優(yōu)選地，體外評(píng) 估時(shí)，按照本發(fā)明的抗體還表現(xiàn)出對(duì)HPGGT特異性活性的抑制作用，并消除T細(xì)胞增殖的 HPGGT依賴性抑制。
[0118] 按照本發(fā)明可與所述抗體相同方式并由此為了相同目的使用的另一類相互 作用配偶體是所謂的"抗促成素"，其為祀結(jié)合多膚的特殊形式。其中，抗促成素及其制備方 法，記述在德國(guó)專利申請(qǐng)DE 197 42 706中。
[0119] 可與所述抗體相同的方式并由此為了相同的目的使用的另一類分子是所謂 的膚-適體。利用祀標(biāo)，可W使用篩選方法生成膚適體，所述篩選方法利用如本文中更詳細(xì) 描述的多膚文庫(kù)。選擇標(biāo)準(zhǔn)是分泌的多膚實(shí)際上并特異地結(jié)合于所述祀標(biāo)。
[0120] 更特別地，可W通過(guò)利用按照現(xiàn)有技術(shù)的方法，諸如隧菌體展示生成所述膚適體。 基本上，生成膚文庫(kù)，諸如處于隧菌體形式，且運(yùn)類文庫(kù)與祀分子接觸。隨后，從各個(gè)反應(yīng)中 去除運(yùn)些結(jié)合祀分子的膚，優(yōu)選地，作為與祀分子的復(fù)合物。本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知結(jié)合特 征，至少在一定程度上，依賴于具體實(shí)行的實(shí)驗(yàn)設(shè)置，諸如鹽濃度等。在將W較高親和性或 較大強(qiáng)度結(jié)合祀分子的那些多膚與所述文庫(kù)中的非-結(jié)合成員分開(kāi)后，且任選地，還在從祀 分子和多膚的復(fù)合物中去除祀分子后，可W隨后表征各個(gè)多膚。表征前，任選地，實(shí)行擴(kuò)增 步驟，諸如，例如，通過(guò)增殖編碼所述多膚的隧菌體。表征優(yōu)選地包括測(cè)序所述祀結(jié)合多膚， 和最后對(duì)作為如本文中定義的祀標(biāo)的括抗劑或相互作用配偶體的多膚進(jìn)行測(cè)序?；旧?， 所述多膚不受其長(zhǎng)度的限制，然而，優(yōu)選地，具有約8-20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多膚是在各種方法 中優(yōu)選獲得的。所述文庫(kù)的尺寸可W是約1〇2-1〇"，優(yōu)選地，1〇8-1〇15個(gè)不同的多膚，然而，不 受其限制。
[0121] 本發(fā)明的另一方面設(shè)及針對(duì)按照本發(fā)明的多膚，冊(cè)GGT的失活形式或HPGGT，優(yōu)選 地，典型地具有按照SEQ. ID.No. 1的氨基酸序列的野生型HPGGT的適體。
[0122] 適體是單鏈或雙鏈的D-核酸，且其與祀分子特異性相互作用。適體的制備或選擇， 例如，記述在歐洲專利EP 0 533 838中。基本上，實(shí)行下列步驟。第一，提供核酸混合物，即 潛在的適體，其中每種核酸典型地包括若干，優(yōu)選地至少8個(gè)隨后的隨機(jī)化核巧酸的區(qū)段。 該混合物隨后與祀分子接觸，其中與候選混合物相比，所述核酸，諸如基于對(duì)所述祀標(biāo)增強(qiáng) 的親和性或與其更大的強(qiáng)度結(jié)合祀分子。隨后將結(jié)合核酸從混合物的殘余物中分離。任選 地，利用，例如聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增由此獲得的核酸。運(yùn)些步驟可W重復(fù)若干次，從而最終提 供具有增高比例的特異性結(jié)合于祀標(biāo)的核酸的核酸混合物，然后任選地從所述核酸混合物 中選擇最終結(jié)合核酸。運(yùn)些特異性結(jié)合核酸指適體。顯然地，在生成或識(shí)別適體的方法的任 何階段，可W采用各種核酸的混合物樣品，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定其序列。本發(fā)明包括可W固定 適體，諸如，例如通過(guò)引入定義的化學(xué)基，運(yùn)些化學(xué)基是生成適體技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員已知 的。所述修飾可W例如存在于核巧酸糖部分的2'-位置處的氨基引入中。目前使用適體作為 治療和診斷劑。然而，本發(fā)明還包括由此選擇或生成的適體可W用于祀標(biāo)確認(rèn)和/或用作開(kāi) 發(fā)藥物，優(yōu)選地基于小分子的藥物的引導(dǎo)物質(zhì)。運(yùn)實(shí)際上是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定完成的，其中祀分 子和適體之間的特異性相互作用受到候選藥物的抑制，其中根據(jù)從祀標(biāo)和適體的復(fù)合物中 替換適體，可W假定各種候選藥物容許特異性抑制祀標(biāo)和適體之間的相互作用，且如果該 相互作用是特異性的，則所述候選藥物應(yīng)該，至少原則上，適合于阻斷所述祀標(biāo)并由此在包 括所述祀標(biāo)的各種系統(tǒng)中降低其生物學(xué)有效性或活性。然后，由此獲得的小分子可W進(jìn)行 進(jìn)一步的衍生化和修飾，從而最優(yōu)化其物理、化學(xué)、生物學(xué)和/或醫(yī)學(xué)特性，諸如毒性、特異 性、生物降解能力和生物有效性。
[0123] 本發(fā)明的另一方面設(shè)及針對(duì)按照本發(fā)明的多膚，冊(cè)GGT的失活形式或HPGGT，優(yōu)選 地，典型地具有按照SEQ. ID.No. 1的氨基酸序列的野生型HPGGT的鏡像異構(gòu)適體。
[0124] 鏡像異構(gòu)適體是特殊形式的適體。可W按照本發(fā)明利用所述祀標(biāo)使用或生成的鏡 像異構(gòu)適體的生成或制備基于相似的原則。鏡像異構(gòu)適體的制備記述在國(guó)際專利申請(qǐng)W0 98/08856中。鏡像異構(gòu)適體是k核酸，運(yùn)意味著它們由k核巧酸組成，而不是向適體那樣由 D-核巧酸組成。鏡像異構(gòu)適體的特征在于運(yùn)樣的事實(shí)，即它們?cè)谏飳W(xué)系統(tǒng)中具有非常高 的穩(wěn)定性，且類似于適體，與它們針對(duì)的祀分子特異性相互作用。為了生成鏡像異構(gòu)適體的 目的，在存在例如所述祀標(biāo)的天然存在的心對(duì)映異構(gòu)體的D-對(duì)映異構(gòu)體的情形中，創(chuàng)建了 D-核酸的異源群體，且該群體與祀分子的光學(xué)對(duì)映體接觸。隨后，分離不與祀分子的光學(xué)對(duì) 映體相互作用的那些D-核酸。然而，對(duì)與祀分子的光學(xué)對(duì)映體相互作用的那些D-核酸進(jìn)行 分離、任選地確定和/或測(cè)序，并且隨后基于獲自D-核酸的核酸序列信息合成相應(yīng)的心核 酸。運(yùn)些與前述與祀分子的光學(xué)對(duì)映體相互作用的D-核酸序列相同的心核酸應(yīng)該與天然存 在的祀分子，而非其光學(xué)對(duì)映體特異性相互作用。類似于生成適體的方法，還可能重復(fù)所述 多種步驟若干次，并由此富集與祀分子的光學(xué)對(duì)映體特異性相互作用的那些核酸。
[0125] 在另一方面，本發(fā)明設(shè)及免疫原性組合物。所述免疫原性組合物包括至少一種按 照本發(fā)明的多膚和/或HPGGT的失活形式，具體地，如本文中所述的HPGGT失活形式，和/或野 生型HPGGT。應(yīng)該理解所述按照本發(fā)明的多膚和/或所述HPGGT的失活形式，具體地如本文中 所述的HPGGT失活形式，和/或所述野生型HPGGT，在一個(gè)實(shí)施方案中，綴合于載體物質(zhì)，諸如 KLH或匙孔血藍(lán)蛋白、BSA、卵清蛋白等，從而W運(yùn)樣的方式對(duì)宿主的免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)各自的抗 原，所述方式容許或促進(jìn)引起免疫應(yīng)答和引起高滴度抗體。
[0126] 應(yīng)該理解，根據(jù)本發(fā)明，可W體外或體內(nèi)使用免疫原性組合物。在后者的情形中， 所述免疫原性組合物典型地是疫苗，且優(yōu)選地配置為所述疫苗。免疫原性組合物、包括所述 免疫原性組合物的藥物和疫苗，分別可W用于預(yù)防幽口螺旋菌感染，優(yōu)選地，在兒童中，或 用于治療和/或預(yù)防患有或處于患有幽口螺旋菌感染和由所述生物體引起或與其相關(guān)的任 何疾病的風(fēng)險(xiǎn)中動(dòng)物和人。
[0127] 在實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包括一種或數(shù)種佐劑。優(yōu)選地，佐劑是提 供免疫系統(tǒng)一般刺激的試劑。佐劑是本領(lǐng)域中已知的，且包括，但不僅限于，聚陽(yáng)離子多聚 體、免疫刺激脫氧核巧酸(0DN)、合成KLK膚、神經(jīng)活性化合物、alu皿、弗氏完全或不完全佐 劑、霍亂毒素。優(yōu)選地，聚陽(yáng)離子多聚體是聚陽(yáng)離子膚和/或其中神經(jīng)活性化合物是人生長(zhǎng) 激素。
[01%]在另一方面，免疫原性組合物包括幽口螺旋菌的外膜蛋白，諸如BabA、HpaA、0mp 18和其組合物。HpaA和0mpl8,例如，記述在Voland P.等.，感染和免疫性（Infection and Immunity) ,2003年7月，3837-3843頁(yè)中。本發(fā)明包括術(shù)語(yǔ)Bab A,Hpa A和Omp 18,該術(shù)語(yǔ)不 僅包括全長(zhǎng)多膚，還包括其任何的免疫原性片段或膚。HpaA是推定的N-乙酷神經(jīng)氨糖酸基 乳糖(N-acetylneuraminyllactose)-結(jié)合血凝素 ，Bab A是與路易斯血型抗原結(jié)合的黏著 蛋白。應(yīng)該理解，其他抗原和優(yōu)選地蛋白質(zhì)和多膚，和其各自的片段，可W用于增加針對(duì)幽 口螺旋菌的免疫應(yīng)答?？蒞在本發(fā)明的實(shí)施方案中使用的優(yōu)選蛋白質(zhì)和多膚，分別是外膜 蛋白，所述外膜蛋白典型地被引入幽口螺旋菌的外質(zhì)膜中，并對(duì)例如，離子運(yùn)輸、粘著、結(jié)構(gòu) 和滲透穩(wěn)定性和細(xì)菌毒力很重要。
[0129] 可W獲自幽口螺旋菌和可W是按照本發(fā)明的免疫原性組合物的一部分的其他抗 原是記述在公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng)20070042448中的那些。
[0130] 應(yīng)該承認(rèn)，優(yōu)選地配制本發(fā)明的多膚和蛋白質(zhì)，包括HPGGT的失活形式和野生型 HPGGT，W及本文中所述的意欲施用于動(dòng)物或人體的任何其他化合物。所述制劑是本領(lǐng)域中 技術(shù)人員已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑如美國(guó)專利6,838,089中所述。該美國(guó)專利 中所述的制劑是包括許多多聚體粒子的遞送系統(tǒng)，其中不溶于水的蛋白質(zhì)抗原與所述多聚 體粒子結(jié)合，所述多聚體粒子包括基質(zhì)多聚體，其包括一種或多種同聚物和/或共聚物，其 中所述方法包括：（a)混合水相(W)和有機(jī)相(0)，所述水相包括處于其臨界微團(tuán)濃度的0.1- 100倍濃度的不溶于水的試劑諸如蛋白質(zhì)和一種或多種親水性表面活性劑，所述有機(jī)相包 括處于有機(jī)溶劑中的基質(zhì)多聚體，所述溶劑不變性蛋白質(zhì)抗原且其中0與W不混溶，從而產(chǎn) W/0乳劑，其中W或0或二者還包括一種或多種穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑在混合前加入，從而在存 在增溶劑的條件下穩(wěn)定W/0乳劑，并在步驟(b)過(guò)程中促進(jìn)多聚體粒子中的不溶于水的蛋白 質(zhì)的引入;和(b)通過(guò)將所述乳劑分散在流動(dòng)的基質(zhì)中而形成所述W/0乳劑的小滴，和從所 述W/0乳劑小滴的0相中去除所述溶劑，從而形成引入不溶于水的蛋白質(zhì)抗原的多聚體粒 子。
[0131] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，關(guān)于本文中所述的試劑和化合物的制劑和遞送試劑是微球 系統(tǒng)，諸如，如美國(guó)專利6,372260中所述的那些。
[0132] 在本發(fā)明的一方面，按照本發(fā)明的多膚、HPGGT的失活形式、抗體、鏡像異構(gòu)適體和 適體、包括按照本發(fā)明的任意運(yùn)些的免疫原性組合物、藥物組合物優(yōu)選地用于預(yù)防和/或治 療由幽口螺旋菌引起的或與之相關(guān)的，更優(yōu)選地由幽口螺旋菌感染引起的疾病。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述疾病是由幽口螺旋菌感染引起的胃與十二指腸病癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述疾病是胃炎，大部分慢性胃炎。由于慢性胃炎設(shè)及胃或十二指腸潰瘍或甚至胃癌和 MALT淋己瘤的發(fā)病機(jī)理，本發(fā)明的方法和W上試劑可W用于預(yù)防運(yùn)些疾病。其還可W用于 治療，例如胃和十二指腸潰瘍病和(MALT)淋己瘤。按照本發(fā)明，使用一般術(shù)語(yǔ)"治療除非 另外明確定義-作為任何形式的治愈、減輕、診斷或預(yù)防病理學(xué)病癥。
[0133] 在另一方面，本發(fā)明和關(guān)于其對(duì)淋己細(xì)胞增殖，具體地T細(xì)胞增殖的抑制作用， HPGGT在宿主中誘導(dǎo)免疫抑制，并由此可W作為新型免疫抑制劑來(lái)應(yīng)用。免疫抑制劑可W， 例如，用于減小移植后的器官移植排異風(fēng)險(xiǎn)，或用于治療自體免疫疾病，諸如風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、局限性回腸炎或特應(yīng)性濕疹。HPGGT的催化活性需要存在谷氨酷胺，W起到丫谷氨酷基 的供體/受體的作用。因此，包括HPGGT的免疫抑制劑組合物優(yōu)選地還包括谷氨酷胺。
[0134] 而且，本發(fā)明人可W顯示用谷氨酷胺、亮氨酸和組氨酸和活性HPGGT預(yù)培養(yǎng)應(yīng)用于 淋己細(xì)胞增殖測(cè)定的細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)T細(xì)胞表現(xiàn)出抗-增殖作用，甚至在隨后對(duì)HPGGT進(jìn)行失 活時(shí)。因此，總結(jié)出免疫抑制作用是HPPGT依賴性的;然而，尚未確定該作用模式中設(shè)及酶反 應(yīng)的直接或間接產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案設(shè)及能夠通過(guò)優(yōu)選地，在藥用培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)HPGGT和谷氨酷胺、亮氨酸和組氨酸和容許HPGGT特異性反應(yīng)獲得的免疫抑制組合 物。然后將該反應(yīng)的上清液作為合適的免疫抑制組合物應(yīng)用。優(yōu)選地，該組合物包括谷氨酷 基-膚，例如，通過(guò)向所述物質(zhì)轉(zhuǎn)移谷氨酷基產(chǎn)生的多-谷氨酷基-谷氨酸(glutamate)或谷 氨酷基-衍生物。
[0135] 本發(fā)明包括根據(jù)運(yùn)個(gè)方面使用的HPGGT是任何具有本文中所述的特異性酶活性的 HPGGT。在運(yùn)種情況下，術(shù)語(yǔ)冊(cè)GGT包括野生型冊(cè)GGT、全長(zhǎng)冊(cè)GGT和任何的衍生物和更特別 地，其具有運(yùn)種酶活性的任何片段。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可W通過(guò)利用本領(lǐng)域中熟知的方 法生產(chǎn)所述衍生物和片段。
[0136] 優(yōu)選地用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)促進(jìn)淋己細(xì)胞的增殖意指在優(yōu)選的實(shí)施方案中促進(jìn)淋己 細(xì)胞的活化和增殖。
[0137] 在另一方面，本發(fā)明設(shè)及生產(chǎn)HPGGT，更具體地重組HPGGT的方法，所述重組HPGGT 缺乏分泌序列(信號(hào)膚)或具有非-功能性分泌序列。所述缺乏功能性分泌序列，即氨基酸1- 26，在POS. 26和27: LSA-AS之間的分裂位點(diǎn)的HPGGT有利地屬于運(yùn)樣的范圍，即所述HPGGT在 宿主細(xì)胞中產(chǎn)生過(guò)程中不從所述宿主細(xì)胞中分泌出來(lái)。根據(jù)運(yùn)個(gè)方面，宿主生物體優(yōu)選地 是原核生物，諸如大腸桿菌化.coli)，然而，不局限于此。
[013引本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知制備所述缺乏功能性分泌序列的HPGGT的方法。例如，運(yùn) 可W通過(guò)表達(dá)編碼無(wú)分泌前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)的基因而實(shí)現(xiàn)。所述修飾的HPGGT蛋白應(yīng)該保 持在其宿主細(xì)胞中，并由此可W從中純化出來(lái)。
[0139] 在另一方面，本發(fā)明設(shè)及按照本發(fā)明的多膚和按照本發(fā)明的失活HPGGT用于制備 抗體的用途。在密切相關(guān)的方面，用于免疫動(dòng)物，從而分別產(chǎn)生抗體和提供起始細(xì)胞和細(xì)胞 系，產(chǎn)生本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的雜交瘤細(xì)胞系。本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)可W進(jìn)一步 培養(yǎng)和進(jìn)一步選擇所述雜交瘤。因此，本發(fā)明還包括按照本發(fā)明的多膚和按照本發(fā)明的活 性和失活HPGGT用于篩選測(cè)定，從而識(shí)別產(chǎn)生針對(duì)和/或特異性結(jié)合按照本發(fā)明的多膚和按 照本發(fā)明的失活HPGGT的抗體的那些雜交瘤細(xì)胞系。具體地，可W通過(guò)應(yīng)用HPGGT活性測(cè)定 進(jìn)行篩選來(lái)選擇雜交瘤，從而識(shí)別產(chǎn)生消除HPGGT催化和抑制功能的抗體的雜交瘤。
[0140] 在另一方面，本發(fā)明設(shè)及編碼按照本發(fā)明的多膚和按照本發(fā)明的失活HPGGT的核 酸。本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)已知在宿主生物體中是遺傳密碼和，任選地密碼子來(lái)表示 所述核酸，本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可W制備所述核酸。在另一方面，所述核酸包含在載體，優(yōu) 選地表達(dá)載體中。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)載體包括質(zhì)粒、粘粒、病毒、隧菌體和通常用于遺 傳工程領(lǐng)域中的其他載體。在另一方面，本發(fā)明設(shè)及包括所述載體的宿主生物體。在實(shí)施方 案中，所述宿主生物體和具體地宿主細(xì)胞是重組宿主細(xì)胞，其瞬時(shí)或穩(wěn)定地包含本發(fā)明的 核酸分子或載體。理解宿主細(xì)胞或宿主生物體是能夠吸收體外重組DNA并，如果是運(yùn)種情 形，則合成由本發(fā)明核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的生物體。優(yōu)選地，運(yùn)些細(xì)胞是原核或真核細(xì) 胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或酵母細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的宿主細(xì)胞的特征 在于運(yùn)樣的事實(shí)，即引入的本發(fā)明的核酸分子對(duì)于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞而言是異源的，即它不天然 存在于運(yùn)些細(xì)胞中，或局限于基因組中的一個(gè)位置，該位置與相應(yīng)的天然存在的序列的位 置不同。
[0141] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案設(shè)及分離的蛋白質(zhì)，其表現(xiàn)出HPgGT，優(yōu)選地，其中正常 存在的分泌序列被除去或是非-功能性的，并由本發(fā)明的核酸分子編碼的HPgGT的生物學(xué)性 質(zhì)，W及設(shè)及用于它們的生產(chǎn)的方法，其中，例如，在容許合成所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)本 發(fā)明的宿主細(xì)胞和隨后從培養(yǎng)的細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離所述蛋白質(zhì)。重組生成的蛋白質(zhì) 的分離和純化可W通過(guò)常規(guī)方法，包括制備性層析法和設(shè)及單克隆或多克隆抗體親合層析 法的親合和免疫學(xué)分離執(zhí)行。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"分離的蛋白質(zhì)"包括基本無(wú)與之天然結(jié)合 的其他蛋白、核酸、脂質(zhì)、碳水化合物或其他物質(zhì)的蛋白。然而，所述蛋白質(zhì)不僅包括重組產(chǎn) 生的蛋白質(zhì)，還包括分離的天然存在的蛋白質(zhì)、合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、或通過(guò)運(yùn)些方法的組合 產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。用于制備所述蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的。本發(fā)明的蛋白質(zhì)優(yōu)選地處于 基本純化的形式。
[0142] 因此，本發(fā)明還設(shè)及在原核或真核宿主細(xì)胞制造蛋白質(zhì)的一般方法，外部應(yīng)用時(shí) 對(duì)所述細(xì)胞是有害的，所述方法包括：（a)在一定條件下培養(yǎng)用編碼所述蛋白質(zhì)的核酸序列 轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，所述蛋白質(zhì)具有刪除的或非-功能性分泌信號(hào)序列，所述條件是表達(dá)所述 蛋白質(zhì);和(b)從所述細(xì)胞中回收所述蛋白質(zhì)。也對(duì)用編碼按照本發(fā)明的多膚的核酸轉(zhuǎn)染的 宿主細(xì)胞應(yīng)用相同的方法，所述多膚是可W從所述細(xì)胞中回收的。
[0143] 應(yīng)該理解，優(yōu)選地，可W將按照本發(fā)明的抗體、抗促成素、膚適體、適體和鏡像異構(gòu) 適體認(rèn)作為針對(duì)幽口螺旋菌的丫谷氨酷基轉(zhuǎn)膚基酶(HPGGT)的配體。
[0144] 本發(fā)明包括術(shù)語(yǔ)野生型HPGGT或相似的表述優(yōu)選地意指野生型的HPGGT，其缺乏分 泌序列，但是是催化活性的，更具體地，催化本文中關(guān)于HPGGT所述的酶反應(yīng)。
[0145] 現(xiàn)在通過(guò)附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，從所述附圖和實(shí)施例可W獲得其他特 征、實(shí)施方案和優(yōu)點(diǎn)。
[0146] 圖1A是一個(gè)表，其指示根據(jù)Kim等和Bumann等9' IV人幽口螺旋菌中分泌的具有分 子量30-66kDa的蛋白。
[0147] 圖1B是銀染色后的SDS-PAGE，顯示了來(lái)自大小排阻層析的洗脫饋分中的蛋白質(zhì)， 其中只有饋分b-巧審制了人T細(xì)胞的增殖，而所有其他饋分沒(méi)有；由箭頭標(biāo)記了與饋分的抑 制特征相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)條帶。
[0148] 圖1C是柱形圖，表示通過(guò)如實(shí)施例1中所述的分光光度測(cè)定確定的凝膠過(guò)濾饋分 的酶GGT活性?；疨 =幽口螺旋菌）。
[0149] 圖2A-C是柱形圖，顯示在通過(guò)3H-胸巧引入測(cè)定確定存在或缺乏指定的HPSN的條 件下受刺激的PBMC(A)和分離的初級(jí)人T淋己細(xì)胞(C)的細(xì)胞增殖;構(gòu)建的敲除株的GGT表現(xiàn) 型是通過(guò)酶活性測(cè)定和利用針對(duì)大GGT-亞單位的多克隆抗體的免疫印跡證實(shí)的（B)。為了 免疫印跡，使用了30yg的HPSN蛋白。對(duì)抗-VacA抗體的免疫印跡用作裝載對(duì)照（見(jiàn)插入圖）。 數(shù)據(jù)表示Ξ次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。認(rèn)為如通過(guò)Student t-檢驗(yàn)確定的沖值< .001是顯 著的。化P =幽口螺旋菌，SN=上清液，WT =野生型）。
[0150] 圖3A和B描述對(duì)純化的具有針對(duì)其大亞單位的抗-GGT抗體的重組HPGGT饋分銀染 色(A)和免疫印跡(B)后的疑化，其顯不了GGT的處理。星號(hào)表不：***原-形式,**大和*小亞 單位。
[0151] 圖3C-3E是柱形圖，其顯示由大腸桿菌中表達(dá)的重組HPGGT(rHPGGT)引起的酶活性 (C)和人PBMC的增殖抑制（D)。作為對(duì)照使用的來(lái)自大腸桿菌的LPS不抑制PBMC增殖。重組 HPGGT在pH 2-10顯示出催化活性化）。數(shù)據(jù)表示Ξ次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。認(rèn)為如通過(guò) S化dent t-檢驗(yàn)確定的沖值<.001是顯著的。（FT =流經(jīng)，HP =幽口螺旋菌）。
[0152] 圖4A-D是柱形圖，顯示從馬腎中純化的GGT表現(xiàn)出催化GGT活性(A)但缺乏針對(duì)淋 己細(xì)胞的增殖-抑制作用（B)。重組HPGGT在Ser 451/452(S451/452A)處的位點(diǎn)定向誘變消 除GGT酶活性(A)和抑制作用(B)。用阿西維辛（50μΜ)在37 °C預(yù)培養(yǎng)HPWTSN2小時(shí)消除GGT活 性(C)和PBMC增殖的抑制（D)。數(shù)據(jù)表示Ξ次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。認(rèn)為如通過(guò)student t-檢驗(yàn)確定的沖值< .05是顯著的。化P =幽口螺旋菌，SN=上清液，WT =野生型）。
[0153] 圖5A和B是圖表，顯示由PBMC產(chǎn)生的細(xì)胞因子化-2(A)和IFN-丫（B)，如實(shí)施例中所 述地，運(yùn)是在通過(guò)化ISA24小時(shí)后測(cè)量的。數(shù)據(jù)表示Ξ次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。指示通過(guò) S化dent t-檢驗(yàn)確定的P值。
[0154] 圖5C描述化rkat T細(xì)胞的FACS-分析結(jié)果，所述化rkat T細(xì)胞是如所示（灰色曲 線)處理了 24小時(shí)，并用膜聯(lián)蛋白V-FITC和艦化丙錠染色的。通過(guò)測(cè)試10000個(gè)事件的FACS- 分析確定調(diào)亡化rkat T細(xì)胞的比率。抗癌藥星形抱菌素（空白曲線），用作陽(yáng)性對(duì)照，在ΙμΜ 的濃度時(shí)強(qiáng)烈誘導(dǎo)調(diào)亡?；?=幽口螺旋菌，WT =野生型）。
[0155] 圖6A顯示在存在或不存在指定的HPSN的條件下處理了24小時(shí)的化rkat T細(xì)胞的 細(xì)胞周期分析結(jié)果。描述了處于G1-期（左下）、早和晚S-期（左上和右上)和G2-期（右下）中 的細(xì)胞的百分比(廠軸:BrdU-FITC;x-軸:PI)。通過(guò)免疫印跡在相同細(xì)胞中確定細(xì)胞周期調(diào) 節(jié)蛋白的細(xì)胞水平。
[0156] 圖6B是獲自107PBMC的蛋白質(zhì)的SDS PAGE,所述PBMC是在不同濃度的HPWT和ΗΡΔ GGTSN或rHPGGT中培養(yǎng)了 24小時(shí)和48小時(shí)并隨后被溶解的。通過(guò)SDS-PAGE分離并通過(guò)免疫 印跡分析35yg總蛋白。利用相應(yīng)的抗體確定指定的蛋白質(zhì)的水平。W相似結(jié)果重新數(shù)據(jù)2 次?；疨 =幽口螺旋菌，SN=上清液，WT =野生型）。
[0157] 圖7是來(lái)自幽口螺旋菌陽(yáng)性(泳道1-9)和陰性(泳道10-14)的血清的免疫印跡，其 中通過(guò)如實(shí)施例1中所述的免疫印跡測(cè)試患者是否存在針對(duì)HPGGT的抗體。使用兔抗-GGT抗 體(日GGT)作為陽(yáng)性對(duì)照。星號(hào)表不:HPGGT蛋白的***原-形式和**大亞單位。
[0158] 圖8是柱形圖，顯示HPGG巧審制淋己細(xì)胞增殖依賴于谷氨酷胺，但不受谷氨酸或g- 谷氨酷基谷氨酷胺，也不受谷氨酷胺消耗的介導(dǎo)。用PMA/伊屋諾霉素(除基礎(chǔ)外的所有)刺 激并如所示處理PBMCdW化g/ml使用的Rek.HPGGT在24小時(shí)后失活。然后，改變培養(yǎng)基并在 刺激后，將HPGGT-處理的培養(yǎng)基加入到PBMC中。同時(shí)（未顯示）或也在24小時(shí)后，W2mM加入 谷氨酷胺，從而研究可能的谷氨酷胺消耗。BPMC刺激后加入谷氨酸或g-谷氨酷基谷氨酷胺， 從而研究可能的抑制作用。不具有(w/o)谷氨酷胺的氨基酸用于顯示抑制作用對(duì)谷氨酷胺 的依賴性。
[0159] 圖9是圖表，顯示來(lái)自免疫的或感染的小鼠的血清對(duì)HPGGT酶活性的抑制作用。小 鼠受到指定的制劑的免疫，或接受PBS作為對(duì)照，或受到活的幽口螺旋菌的感染。免疫或感 染后6周時(shí)，從尾靜脈獲取血清，并分析針對(duì)GGT催化活性的抑制活性。CT_GGT，可溶性CT和 失活GGT蛋白，[CT_GGT] enc，包封在微球中的CT和失活GGT蛋白。
[0160] 實(shí)施例1:材料和方法
[0161] 細(xì)菌培養(yǎng)。本研究中使用的幽口螺旋菌野生型菌株G27WT(vacA+ cagA+)獲自 A.CovacciQRIS，錫耶納，意大利）。將該細(xì)菌培養(yǎng)在增補(bǔ)了前述登特增補(bǔ)劑抗生素混合物 的（Dent supplement antibiotic mix) (Oxoid，Wesel，德國(guó)）Wilkins-Chalgren或腦屯、浸 液(BHI)板上。29在增補(bǔ)了 10 % FCS (西格瑪，慕尼黑，德國(guó)）和1 %登特增補(bǔ)劑的BHI肉湯中進(jìn) 行HP的液體培養(yǎng)。為了生產(chǎn)HP上清液，使細(xì)菌在板上生長(zhǎng)48小時(shí)，在憐酸鹽緩沖液(PBS)中 清洗3次，并調(diào)節(jié)至ODsGGnm為1(對(duì)應(yīng)于大約2xl08個(gè)細(xì)菌/ml)。在微需氧條件下，在PBS中劇烈 搖動(dòng)培養(yǎng)所述細(xì)菌2小時(shí)，并通過(guò)隨后W3000xg和lOOOOxg離屯、步驟沉淀去除細(xì)菌和膜。隨 后，利用超濾濃縮上清液(Amicon叫1:ra MWCO lOkDa，微孔(Millipore)，Schwa化ach，德 國(guó)）。^牛血清清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)布氏測(cè)定(Bra壯ord assay) (Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室(Bio-Rad Laboratories)，Richmond，VA)測(cè)量上清液的總蛋白含量，并保存在-80°C。在Luria肉湯 化B)瓊脂板(USB，Cleveland，OH)上，并且對(duì)于液體培養(yǎng)物在具有相關(guān)抗生素的LB肉湯中 (USB)培養(yǎng)大腸桿菌。
[0162] 幽口螺旋菌上清液的凝膠過(guò)濾層析。如上所述制備來(lái)自幽口螺旋菌野生型菌株 G27的上清液。如前所述進(jìn)行大小排阻層析3。簡(jiǎn)要地，將500yg蛋白質(zhì)加載到S叩erdex 20010/300柱(GE衛(wèi)生保健(GE化althcare)，慕尼黑，德國(guó)）上，并在4°C用脫氣的PBS洗脫。 標(biāo)準(zhǔn)蛋白α-淀粉酶（200kDa)，乙醇脫氨酶（150kDa)，牛血清清蛋白（6化Da),和碳酸酢酶 (29kDa)用于進(jìn)行洗脫的蛋白質(zhì)的分子量評(píng)估。如下所述測(cè)試每種饋分的增殖抑制和GGT活 性。
[0163] 生成GGT突變菌株。通過(guò)天然轉(zhuǎn)化將GGT k. 0.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到幽口螺旋菌菌株G27中。 在包含25μg/ml卡那霉素（西格瑪）的瓊脂板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株。3天后，挑取克隆并涂布在具有 卡那霉素的新鮮瓊脂板上。質(zhì)粒的插入是通過(guò)細(xì)菌DM的PCR(引物：有義鏈5/- AAACGATTGGCTTGGGTGTGATAG-3' (SEQ. ID. No. 6);反義鏈5'-64(^66(：1746了44〔641'刊64了八6- 3/ (SEQ. ID. No. 7))和來(lái)自幽口螺旋菌Δ GGT上清液的蛋白質(zhì)的Western印跡證實(shí)的。
[0164] 細(xì)胞培養(yǎng):如前所述進(jìn)行外周血淋己細(xì)胞(PBMC)的分離3。在37°C，5%C02下培養(yǎng)所 有的細(xì)胞。在具有10%。〔5的1^〇 1640(11^1付〇邑611，1(日^3圳}16，德國(guó)）中培養(yǎng)化'1?111'細(xì) 胞和？8船。在增補(bǔ)了10%馬血清（〔日加的義，￥6'￥16'3，比利時(shí)）的016]?(1醇1付〇旨611)培養(yǎng)化- 4 T細(xì)胞。
[0165] 分離初級(jí)人T淋己細(xì)胞。通過(guò)按照制造商的說(shuō)明書(shū)，使用化η T細(xì)胞分離試劑盒II (Milten}d生物技術(shù)(Miltenyi Biotech)，Bergisch Gla化ach，德國(guó)），通過(guò)陰性選擇，從來(lái) 自未感染幽口螺旋菌的健康志愿者的暗黃覆蓋層或肝素化的外周靜脈血中分離初級(jí)人T細(xì) 胞。
[0166] 細(xì)胞增殖測(cè)定:在96-孔平底板的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞（105PBMC，純化的初級(jí)T 細(xì)胞或l〇4Jurkat/化-4細(xì)胞/孔）。用PMA(20ng/ml;西格瑪)和伊屋諾霉素（lOOng/ml;西格 瑪)一式Ξ份地刺激PBMC，并使所有細(xì)胞在具有或不具有指定的幽口螺旋菌上清液或重組 蛋白的總蛋白濃度下生長(zhǎng)。如上所述用PMA/伊屋諾霉素或用處于1個(gè)珠 /T細(xì)胞的抗-CD3/ CD28珠（Invitrogen)刺激初級(jí)人T細(xì)胞。48小時(shí)后，使用化ckard直接β計(jì)數(shù)器矩陣9600 (Packard Direct Be1:a Counter Matrix 9600)(Packard儀器公司（Packard Instruments Co)，Downe;r's GroveJL)，通過(guò)甲基-[3H]-胸巧(GE Healthcare)的引入確定細(xì)胞增殖。
[0167] 制備重組蛋白。按照制造商的說(shuō)明書(shū)，將幽口螺旋菌的GGT蛋白表達(dá)為6址is-標(biāo)記 的蛋白質(zhì)(Qiagen，化Iden，德國(guó)）。通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)自幽口螺旋菌的GGT蛋白的編碼區(qū)（引物 有義鏈：5' -TGAAAGGAAAACCCATGGGACGGAG-3' (SEQ: ID .No . 8);反義鏈：5'- CAAAGGTACCAAATTCTTTCCTTGG-3'(沈Q. ID.No. 9))。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離并通過(guò)凝膠提 取純化PCR產(chǎn)物（Qiagen)。然而，用Ncol和ΚρηΙ(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室（New England Biolabs)，Ipswich,ΜΑ)對(duì)其進(jìn)行限制性酶切，并隨后在重新-純化后將其連接到pQE-化i系 統(tǒng)載體(Qiagen)中。將由此產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株M15中。用轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的過(guò)夜培 養(yǎng)物接種增補(bǔ)了 l(K)μg/ml氨節(jié)青霉素（西格瑪)和25μg/ml卡那霉素的LB肉湯，并在劇烈搖 動(dòng)下，在37°C生長(zhǎng)，直到ODsoo達(dá)到0.6。重組HPGGT的表達(dá)通過(guò)添加最終濃度為ImM的異丙基 β-D-1-硫代R比喃半乳糖巧（1?了6;49911油日111，0日1'11131日化，德國(guó)）受到誘導(dǎo)，并在25°[進(jìn)行4小 時(shí)，從而最小化內(nèi)含體的量。然后，在4 °C離屯、(5000xg)全部培養(yǎng)物10分鐘。為了在自然條件 下的細(xì)胞溶解，將沉淀溶解在包含蛋白酶抑制劑(關(guān)于化S-標(biāo)記的蛋白質(zhì)的蛋白酶抑制劑 混合物，西格瑪）的冰冷的結(jié)合緩沖液(20mM Tri s/肥1，500mM NaCl，20mM咪挫（西格瑪），抑 7.4)中。然后，通過(guò)在液化中進(jìn)行的兩個(gè)冷凍和融化循環(huán)和隨后在冰上進(jìn)行的超聲波降解 法(2x1分鐘超聲波降解，它們之間在冰上間隔5分鐘)溶解細(xì)胞。離屯、（17500xg，在4°C ) 10分 鐘后，對(duì)上清液進(jìn)行DNA和RNA消化。進(jìn)一步離屯、步驟（22000xg，10分鐘，4°C)后，準(zhǔn)備上清 液，W進(jìn)行純化。在第一純化步驟中，使用5ml HisTrapHP柱（GE衛(wèi)生保?。℅E Healthcare))。在RT下進(jìn)行純化，并將樣品始終保持在冰上。將大腸桿菌的溶解產(chǎn)物，W 1ml/分鐘，加載到M-瓊脂糖柱上，并收集流出液。樣品加載后，用10倍柱體積レv)的結(jié)合緩 沖液、10倍cv的清洗緩沖液(20mMTris/肥l，900mMNaCl，20mM咪挫，pH7.4)和另外的10倍 CV的結(jié)合緩沖液清洗該柱。利用階梯式咪挫梯度（lOOmM階梯），用洗脫緩沖液(20mM Tris/ 肥1，500mM NaCl，lOO-lOOOmM咪挫，pH 7.4)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。將洗出液收集在一份饋分/ 階梯度中。然后測(cè)試每份饋分的GGT酶活性，并進(jìn)行SDS-PAGE和免疫印跡分析。為了進(jìn)一步 純化重組的HPGGT，匯集來(lái)自Ni-瓊脂糖親合層析的酶活性饋分，在4°C針對(duì)20mM化is/HCl pH 7.5透析1小時(shí)，并進(jìn)行第二純化步驟。將透析的樣品加載到A訊-Gd⑩Blue(BioRad)柱 (。乂：12.31111)上。用2倍(3乂的結(jié)合緩沖液清洗該柱，并用洗脫緩沖液（201111時(shí)13/^(：1，50- lOOOmM化C1，pH 7.5)，利用階梯式化C1梯度(50mM階梯)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過(guò)利用抗- GGT抗體的免疫印跡(見(jiàn)下）和通過(guò)GGT酶活性測(cè)定(見(jiàn)下）分析所有收集的饋分是否存在重 組HPGGT。匯集活性饋分，在4°C針對(duì)20mMTris/HClpH7.5透析90分鐘，分成等分試樣，并 保存在-80°C直至進(jìn)一步使用。
[0168] 位點(diǎn)定向誘變。按照制造商的說(shuō)明書(shū)，利用Quik化ange位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖?(S化atagene，阿姆斯特丹，荷蘭）進(jìn)行HPGGT的位點(diǎn)定向誘變。引物序列如下：S451/452A有 義鏈：5' -CCAATAAGCGCCCTTTAGCCGCCATGTCGCCTACGATTGTG-3'（SEQ. ID:No. 10) ;S451/452A 反義鏈：5' -CACAATCGTAGGCGACATGGCGGCTAAAGGGCGCTTATTGG-3 '（ SEQ: ID: No. 11)。通過(guò)測(cè)序 證實(shí)了成功的誘變。
[0169] 免疫印跡。為了免疫印跡分析，使用了 107Jurkat T細(xì)胞或PBMC。在實(shí)驗(yàn)前，使 化rkat細(xì)胞在包含0.2%FCS的培養(yǎng)基中血清缺乏培養(yǎng)18小時(shí)。然后，用10%FCS釋放并如所 述地處理細(xì)胞。在指定的時(shí)間點(diǎn)處，收獲細(xì)胞，用冰冷的PBS清洗一次，重新混懸在包含蛋白 酶抑制劑(2.5mM焦憐酸鋼，ImM β-甘油憐酸，ImM化3V〇4，lμg/ml擬酶醒膚，ImM PMSF;西格 瑪）的lx細(xì)胞溶解緩沖液Cell Signaling Technology,Danvers,MA)中，并用微尖端超聲波 降解器在冰上超聲波處理30秒。在4°C，WlOOOOxg離屯、溶解產(chǎn)物10分鐘，上清液用于免疫印 跡。通過(guò)Tricine-SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)(通過(guò)化a壯ord測(cè)定確定，BioRad)，并將其電 轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上(BioRad)。為了檢測(cè)，用初級(jí)抗體抗-p27、抗-細(xì)胞周期蛋白D3、抗-細(xì) 胞周期蛋白 E、抗-c-Myc (Dianova，漢堡，德國(guó)），抗-Qlk2(San1:a-C;ruz生物技術(shù)（San1:a-C;ruz Biotechnology)，海德堡，德國(guó)），抗-憐-AKT(Ser 473)，抗-憐-c-Raf(Ser 338)，抗-憐- p70S6K(Thr 389;細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)（Cell Si即aling))，抗-憐-FKHRLl/Foxo3(Thr 32;上州， Placid湖，NY)，抗-肌動(dòng)蛋白（西格瑪）和抗-VacA(南部生物學(xué)(Austral Biologicals)，San Ramon, CA)探測(cè)膜。利用合適的過(guò)氧化物酶綴合的第二抗體（Dianova)和化學(xué)發(fā)光試劑 (Perbio Science,Bonn,德國(guó)）顯示初級(jí)抗體的結(jié)合。為了檢測(cè)HPGGT蛋白的大亞單位，使用 多克隆兔-抗-GGT抗體，所述抗體是針對(duì)包括HP 1118基因產(chǎn)物(化arles River，Kisslegg， 德國(guó)）的氨基酸殘基356-371的合成膚IQPDTVTPSSQIKPGM產(chǎn)生的。
[0170] 血清印跡。為了檢測(cè)人血清中的HPGGT特異性抗體，通過(guò)SDS-PAGE分離0.化g純化 的重組HPGGT蛋白，并如上所述轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。用麗春紅S溶液(處于此0中的0.2%麗 春紅S，3%S氯乙酸）對(duì)該膜進(jìn)行染色，并切割成條帶。封閉（1計(jì)85巧％低脂奶粉）后，在4 °C，隨著攬拌，分別用感染和未感染幽口螺旋菌的患者的血清（1:20000稀釋在封閉緩沖液 中）培養(yǎng)每個(gè)條帶過(guò)夜。清洗后，用HRP--綴合的抗-兔二級(jí)抗體(Dianova;稀釋1:10000)培 養(yǎng)膜條帶，并最后，在另一次清洗步驟后，如上所述，通過(guò)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)顯示血清抗體與 HPGGT蛋白的結(jié)合。利用常規(guī)幽口螺旋菌IgG ELISA評(píng)估患者幽口螺旋菌感染的狀況。
[0171] 細(xì)胞周期分析。分析前，使化rkat T細(xì)胞(5 X 106細(xì)胞/分析)在包含0.2 %FCS的培 養(yǎng)基中血清缺乏培養(yǎng)18小時(shí)。用10 %FCS釋放并用指定的幽口螺旋菌菌株上清液處理細(xì)胞 24小時(shí)后，通過(guò)使用FITC-綴合抗-BrdU抗體(抓生物科學(xué)(BD Bioscience)，海德堡，德國(guó)）， 按照制造商的說(shuō)明書(shū)，通過(guò)化加-FITC/PK西格瑪）染色，進(jìn)行細(xì)胞周期分析。在隨后的巧 光-活化細(xì)胞分類器(FACS)分析過(guò)程中，利用Becton-Dickinson FACScan流式細(xì)胞儀，獲得 10000個(gè)事件。利用Cell如est軟件包(生物科學(xué)(BD Biosciences))分析數(shù)據(jù)。
[0172] 丫-谷氨酷基轉(zhuǎn)膚基酶(GGT)活性測(cè)定。根據(jù)Meister等的方法改進(jìn)了GGT活性的測(cè) 定。27簡(jiǎn)要地，制備由20mM作為受體的甘氨酷甘氨酸（西格瑪）、2.5mM作為供體物質(zhì)的心丫 - 谷氨酷基-p-硝基酷苯胺（ani 1 ide) ((^dbiochem，Schwa化ach，德國(guó)）和lOOmM TriS-HC1 (抑 8.0)組成的反應(yīng)緩沖液。在一些實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定緩沖液的抑在2-10之間變化。加入不同幽口螺 旋菌菌株的上清液、純化的重組HPGGT或馬腎GGT(西格瑪），且在37Γ進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。通過(guò) 分光光度法，在405nm處監(jiān)測(cè)P-硝基酷苯胺的釋放。將1活性單位定義為在37°C釋放化mol p-硝基酷苯胺/分鐘/mg蛋白的酶量。
[0173] 化ISA。如所述地處理PBMC(各5xl〇s)24小時(shí)。在指定的時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)離屯、去除細(xì) 胞，并按照制造商的說(shuō)明書(shū)，通過(guò)化ISA分析上清液的IL-2(eBioscience，圣地亞哥，CA)和 IFN- 丫（生物來(lái)源(Bi0SourCe)，索林根，德國(guó)）的量。檢測(cè)的下限是4pg/m 1。
[0174] 分析調(diào)亡。如所示處理5xl05Jurkat T細(xì)胞。24小時(shí)后，通過(guò)離屯、收獲細(xì)胞，清洗， 重新混懸在500μlAnnexinV-結(jié)合緩沖液α0mM皿PES/化0H，pH7.4，140mM化Cl，2.5mM 化(：12)中，并用化1重組的41111糾111￥斗11'(：(〔日11日邑，811^1叫日1116，〔4)和0.化邑/1111?1在室 溫，黑暗下各染色10分鐘。通過(guò)FACS分析測(cè)量調(diào)亡的細(xì)胞(見(jiàn)上）。利用Cell如est軟件分析 數(shù)據(jù)。
[0175] 統(tǒng)計(jì)學(xué)。將數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。為了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Student t- 檢驗(yàn)。認(rèn)為P-值<0.05是顯著的。
[0176] 實(shí)施例2:確定作為幽口螺旋菌假定T細(xì)胞增殖抑制蛋白的GGT
[0177] 先前顯示了從幽口螺旋菌中分泌的低分子量蛋白抑制T淋己細(xì)胞的增殖。3為了確 定免疫抑制因子，對(duì)來(lái)自幽口螺旋菌菌株G27的上清液進(jìn)行大小排阻層析。符合先前的工 作，只有洗脫具有分子量30-6化化的饋分抑制淋己細(xì)胞的增殖，而所有其他饋分不抑制(數(shù) 據(jù)未顯示）。
[0178] 先前，兩個(gè)獨(dú)立的小組通過(guò)不同的蛋白質(zhì)組技術(shù)進(jìn)行分泌的幽口螺旋菌蛋白的系 統(tǒng)分析。利用運(yùn)些數(shù)據(jù)，列出了具有分子量30-6化化的所有分泌的幽口螺旋菌蛋白（圖 1A)。通過(guò)SDS-PAGE和銀染色進(jìn)一步分析所獲得的層析饋分的蛋白質(zhì)（圖1A)。發(fā)現(xiàn)四種具有 30-6化化尺寸的潛在候選者，其表現(xiàn)出與該饋分的抑制活性特征相匹配的洗脫特征（圖1B; 由箭頭表示）。抑制饋分中的所有其他蛋白質(zhì)條帶也出現(xiàn)在非-抑制的饋分中，并因此可W 不對(duì)T細(xì)胞增殖抑制負(fù)責(zé)。運(yùn)四種候選蛋白中的兩種的分子量（圖1B)對(duì)應(yīng)于分泌的幽口螺 旋菌蛋白丫-谷氨酷基轉(zhuǎn)膚基酶(GGT，HP1118)的片段。位于60kDa的第一條帶可能代表GGT- 原-形(MW 61W)a)，且位于38kDa的另一個(gè)條帶可能代表GGT的大亞單位。11為了研究運(yùn)些上 清液饋分中催化活性HPGGT的存在，進(jìn)行光度GGT活性測(cè)定。圖1C顯示只有抑制淋己細(xì)胞增 殖的饋分(b-f)也表現(xiàn)出GGT活性。
[0179] 實(shí)施例3 :GGT-缺陷型幽口螺旋菌突變體缺乏抑制T細(xì)胞增殖的能力
[0180] 為了確定GGT是否對(duì)觀察到的淋己細(xì)胞增殖抑制負(fù)責(zé)，產(chǎn)生幽口螺旋菌的同基因 GGT敲除突變體。如其他小組所述地，所述突變體正常體外生長(zhǎng)，運(yùn)說(shuō)明GGT對(duì)幽口螺旋菌的 存活不是必需的。ii'u'u測(cè)試運(yùn)些突變體的上清液，W獲得它們與相應(yīng)的野生型菌株相比， 對(duì)受到抗-CD3/CD28或PMA/伊屋諾霉素刺激的分離的人T細(xì)胞和PBMC的增殖抑制活性（圖 2A、C)。與野生型菌株相反，完全消除了ΔGGT細(xì)菌針對(duì)初級(jí)人T細(xì)胞和PBMC的抑制潛力。為 了排除GGT的自發(fā)重組和再活化，通過(guò)測(cè)量酶活性和通過(guò)利用我們針對(duì)HPGGT的大亞單位生 成的多克隆抗體的免疫印跡驗(yàn)證來(lái)自GGT-缺陷型細(xì)菌的上清液。加載對(duì)照顯示來(lái)自野生型 和GGT-缺陷型細(xì)菌的上清液中存在分泌的VacA蛋白質(zhì)（圖2B)。因此，GGT對(duì)由幽口螺旋菌引 起的T細(xì)胞增殖抑制負(fù)責(zé)。
[0181] 實(shí)施例4:重組HPGG巧Φ制淋己細(xì)胞的增殖。
[0182] 為了進(jìn)一步顯示觀察到的抑制作用是通過(guò)HPGGT單獨(dú)介導(dǎo)的，表達(dá)了大腸桿菌中 的重組化S-標(biāo)記的HPGGT蛋白。如"材料和方法"部分中所述，通過(guò)層析法將蛋白質(zhì)純化為同 質(zhì)性。SDS-PAGE和銀染色W及免疫印跡顯示將重組HPGGT合成為原-形，并隨后分別處理為 具有分子量~38和~20kDa的大和小亞單位（圖3A、B)。重組蛋白質(zhì)顯示強(qiáng)GGT活性（圖3C)并 有效抑制PBMC增殖（圖3D)。另外，其他實(shí)驗(yàn)顯示HPGGT在PH2-10范圍內(nèi)的催化活性（圖3E)支 持感染位點(diǎn)存在功能酶。
[0183] 實(shí)施例5: HPGGT的抑制作用依賴于催化GGT活性。
[0184] 由于GGT也通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括人T細(xì)胞表達(dá)，所W我試圖確定哺乳動(dòng)物GGT是 否也抑制淋己細(xì)胞增殖。從馬腎中純化的GGT表現(xiàn)出催化活性（圖4A)。然而，與HPGGT相比甚 至4倍更高量的馬GGT不能抑制PBMC增殖（圖4B)。為了探究抑制T細(xì)胞增殖是否需要GGT的催 化轉(zhuǎn)膚基酶活性，我們生成了重組蛋白質(zhì)的突變體。我們發(fā)現(xiàn)將絲氨酸殘基451和452誘變 為丙氨酸(S451/452A)完全消除重組HPGGT的酶活性（圖4A)，并且還消除淋己細(xì)胞增殖抑制 (圖 4B)。
[0185] 為了證實(shí)運(yùn)些結(jié)果，用GG巧Φ制劑阿西維辛預(yù)培養(yǎng)來(lái)自幽口螺旋菌野生型菌株G27 的重組HPGGT和上清液。該化合物起到GGT的不可逆轉(zhuǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的作用。顯示出由阿 西維辛引起的GG巧審制設(shè)及其在結(jié)合附著于GGT的指定徑基的抑制種類中的酶后的轉(zhuǎn)化 。14'1S酶GGT活性的測(cè)量和淋己細(xì)胞增殖的確定顯示利用阿西維辛的預(yù)處理通過(guò)幽口螺旋菌 野生型上清液，完全抑制GGT活性（圖4C)和PBMC增殖的抑制（圖4D)。對(duì)重組HPGGT獲得了相 似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示）。
[0186] 實(shí)施例6 :HPGGT在不減少比-2和IFN 丫-分泌物的條件下和在不誘導(dǎo)調(diào)亡的條件下 抑制淋己細(xì)胞增殖。
[0187] 至今尚不知HPGGT在抑制宿主免疫應(yīng)答過(guò)程中的作用。本文中報(bào)告的由HPGGT引起 的淋己細(xì)胞增殖抑制可W由干擾人PBMC的細(xì)胞因子分泌而產(chǎn)生。為了測(cè)試該假說(shuō)，用PMA和 伊屋諾霉素刺激細(xì)胞，并在具有或不具有處于不同濃度的幽口螺旋菌野生型和A GGT上清 液或重組HPGGT的條件下進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)。與受刺激的對(duì)照相比，運(yùn)些處理中沒(méi)有一種導(dǎo)致 IL-2分泌物的減少（圖5A)，已知運(yùn)對(duì)于淋己細(xì)胞增殖是必需的。另外，IFN- 丫分泌物沒(méi)有減 少（圖5B)。因此，我們顯示由HPGG巧植的T細(xì)胞增殖抑制不是由運(yùn)些細(xì)胞減少的活化引起 的。先前的報(bào)告提示在胃上皮細(xì)胞中由HPGGT誘導(dǎo)氧化壓力和調(diào)亡。u'ls然而，尚不知來(lái)自幽 口螺旋菌的GGT對(duì)淋己細(xì)胞的作用。
[0188] 另外的報(bào)告提示由幽口螺旋菌在T細(xì)胞中誘導(dǎo)的調(diào)亡作為通過(guò)該細(xì)菌抑制T細(xì)胞 增殖的機(jī)制(Wang等免疫學(xué)雜志(J Immunol)2001)。為了檢查調(diào)亡是造成由本文所述HPGGT 引起的淋己細(xì)胞增殖減少的原因的可能性，利用化rkat T細(xì)胞進(jìn)行了 Annex in V-FITC/PI 染色和隨后的FACS分析（圖5C)。來(lái)自幽口螺旋菌野生型和AGGT菌株的上清液或W導(dǎo)致強(qiáng) 烈淋己細(xì)胞增殖抑制的濃度使用的重組HPGGT均不誘導(dǎo)調(diào)亡的增加。因此，由HPGGT消除T細(xì) 胞增殖是由調(diào)亡-依賴性機(jī)制介導(dǎo)的。
[0189] 實(shí)施例7:HPGGT對(duì)T細(xì)胞中的細(xì)胞周期進(jìn)展的作用。
[0190] 接下來(lái)，我們?cè)噲D進(jìn)一步表征HPGGT對(duì)T細(xì)胞增殖中設(shè)及的細(xì)胞過(guò)程的作用。利用 化加/PI-染色的分析顯示由來(lái)自幽口螺旋菌的野生型而非由GGT-缺陷型上清液誘導(dǎo)的 Jurkat T細(xì)胞中的G1細(xì)胞周期停滯（圖6A)。該停滯的特征在于在存在幽口螺旋菌GGT條件 下，G1期（圖6A;左下象限）中細(xì)胞從35%增加至46%。因此，在用幽口螺旋菌的野生型而非 GGT-缺陷型上清液處理過(guò)程中，與對(duì)照(基礎(chǔ)的，55%)相比，S-期（左上和右上象限）中的細(xì) 胞量減少至38%。于此相符合地，相同樣品的免疫印跡分析顯示細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白D3W 及E1蛋白水平的明確減少。另外，(Mk-抑制劑p27Kip 1的量WGGT-依賴性方式升高（圖6A)。 用10和化g/ml HP WT上清液處理的細(xì)胞之間的細(xì)胞周期蛋白水平的差別說(shuō)明為了對(duì)抗淋 己細(xì)胞增殖，必須超過(guò)GGT活性的闊值。運(yùn)在上清液中總蛋白濃度為10μg/ml的情形中非常 明顯。在較低濃度扣g/ml時(shí)，GGT需要更長(zhǎng)時(shí)間抑制淋己細(xì)胞中的細(xì)胞周期進(jìn)展。利用重組 HPGGT蛋白，我們觀察到在低至化g/ml濃度時(shí)細(xì)胞周期蛋白水平的完全減少。
[0191] 在人PBMC情形中證實(shí)了運(yùn)些結(jié)果，其在受到重組HPGGT或來(lái)自幽口螺旋菌野生型 而非AGGT菌株的不同濃度上清液處理時(shí)，表現(xiàn)出相同細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白甚至更強(qiáng)烈的減 少（圖6B)。我們的結(jié)果清楚的指出GGT是造成由幽口螺旋菌誘導(dǎo)的T淋己細(xì)胞中的G1細(xì)胞周 期停滯的因素。
[0192] 實(shí)施例8:在T細(xì)胞中用Ras-依賴性信號(hào)傳導(dǎo)干擾HPGGT。
[0193] Ras-和PI3K-依賴性途徑是細(xì)胞周期進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子。由于顯示出運(yùn)些途徑在T 細(xì)胞中不彼此依賴地發(fā)生U，我們研究了幽口螺旋菌上清液W及重組HPGGT對(duì)運(yùn)兩個(gè)途徑中 重要成員活化狀態(tài)的影響。免疫印跡分析來(lái)自化rkat T細(xì)胞和PBMC的細(xì)胞溶解產(chǎn)物顯示 AKT、p70S化和化xo3,即PI3K-信號(hào)傳導(dǎo)的重要介體的細(xì)胞水平和憐酸化在存在HPGGT的條 件下不減少（圖6A)。相反，c-Myc的細(xì)胞水平W及c-Raf蛋白，即Ras-依賴性途徑的中屯、介導(dǎo) 子的憐酸化在相同細(xì)胞中存在HPGGT的條件下減少(圖6A、B)。
[0194] 實(shí)施例9:針對(duì)HP-陽(yáng)性患者血清中HPGGT的抗體應(yīng)答
[01M]盡管顯示出來(lái)自幽口螺旋菌的GGT由該細(xì)菌分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中（Bumann 等），但是該蛋白質(zhì)是否到達(dá)固有層中的T細(xì)胞，從而發(fā)揮其免疫抑制作用尚不清楚。為了解 決運(yùn)個(gè)問(wèn)題，我們測(cè)試了來(lái)自14名患者(9名感染幽口螺旋菌的和5名未感染幽口螺旋菌的） 的血清是否存在HPGGT特異性抗體。結(jié)果顯示在幽口螺旋菌-陽(yáng)性（圖7,1-9)而非未感染的 患者（圖7,10-14)中針對(duì)HPGGT的原形和大亞單位的強(qiáng)烈抗體應(yīng)答，運(yùn)提示了HPGGT與人免 疫系統(tǒng)的相互作用。
[0196] 實(shí)施例10:免疫而非感染后針對(duì)HPGGT的抑制免疫應(yīng)答
[0197] 用位于距幽口螺旋菌丫-谷氨酷基-轉(zhuǎn)膚基酶（HPGGT)的催化中屯、遠(yuǎn)程（fare dis化nee)的膚356IQPDTVTPSSQIKPGM 371或用與作為佐劑的CT聯(lián)合的失活重組HPGGT蛋白 接種動(dòng)物。只有在用HPGGT失活形式接種的動(dòng)物中，血清中的抑制性抗體是可W利用標(biāo)準(zhǔn) HPgGT活化測(cè)定檢測(cè)的。在僅接受緩沖液的對(duì)照動(dòng)物中、在感染的動(dòng)物中或在用膚356-371 接種的動(dòng)物中沒(méi)有檢測(cè)到抑制性免疫應(yīng)答。運(yùn)些結(jié)果證明針對(duì)HPGGT的抑制性免疫應(yīng)答是 可W實(shí)現(xiàn)的，且高度依賴于抗原的選擇。此外，幽口螺旋菌的感染不引起所述抑制性應(yīng)答。 [019引結(jié)果顯示在圖9中。
[0199] 參考文獻(xiàn)
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[0233] 說(shuō)明書(shū)、權(quán)利要求和/或附圖中公開(kāi)的本發(fā)明特征可^獨(dú)立地和^其任何組合作 為^其多種形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的材料。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種免疫原性組合物，其包含幽門螺旋菌(H.pylori) γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(HPGGT)的失 活形式， 其中HPGGT具有根據(jù)SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 1至少90%或至少95% 同一性的氨基酸序列， 其中HPGGT的失活形式包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的絲氨酸殘基451和452向丙氨 酸的突變(S451/452A)，并且 其中HPGGT的失活形式誘導(dǎo)抗體應(yīng)答，所述抗體應(yīng)答包括對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的HPGGT依賴 性抑制具有消除作用的抗體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中HPGGT的失活形式缺少功能性分泌信 號(hào)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫原性組合物，其中HPGGT的失活形式缺少SEQ ID NO: 1的 氨基酸1至26。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中所述抗體應(yīng)答包括對(duì) HPGGT具有抑制作用的抗體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原性組合物，其中所述抗體應(yīng)答包括對(duì)HPGGT的酶活性具 有抑制作用的抗體。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中所述組合物包含一種或多 種佐劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中所述組合物包含一種或多 種來(lái)自幽門螺旋菌的抗原。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫原性組合物，其中所述抗原選自包括外膜蛋白的組。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的免疫原性組合物，其中所述抗原選自包括HpaA、0mpl8及其組 合的組。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中所述組合物用于預(yù)防和/ 或治療由幽門螺旋菌引起的或與幽門螺旋菌相關(guān)的疾病。11. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中所述組合物用于預(yù)防和/ 或治療由幽門螺旋菌感染引起的或與幽門螺旋菌感染相關(guān)的疾病。12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的免疫原性組合物，其中所述疾病選自包括以下各項(xiàng)的組:幽 門螺旋菌感染、由幽門螺旋菌引起的胃與十二指腸病癥、胃炎、慢性胃炎、胃或十二指腸潰 瘍、胃癌和淋巴瘤。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的免疫原性組合物，其中所述淋巴瘤是MALT淋巴瘤。14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物是 疫苗。15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物用于制備藥物的用途，其中所 述藥物用于預(yù)防和/或治療由幽門螺旋菌引起的或與幽門螺旋菌相關(guān)的疾病。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其中所述藥物用于預(yù)防和/或治療由幽門螺旋菌感染 引起的或與幽門螺旋菌感染相關(guān)的疾病。17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其中所述疾病選自包括以下各項(xiàng)的組:幽門螺旋菌感 染、由幽門螺旋菌引起的胃與十二指腸病癥、胃炎、慢性胃炎、胃或十二指腸潰瘍、胃癌和淋 巴瘤。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中所述淋巴瘤是MALT淋巴瘤。19. 根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述藥物是疫苗。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK105879019SQ201610297263
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2007年10月19日
【發(fā)明人】馬爾庫(kù)斯·格哈德, 克里斯蒂安·施梅斯, 克里斯蒂安·普林茨
【申請(qǐng)人】伊梅瓦克斯有限公司