抗腫瘤藥與mri造影劑共傳遞白蛋白納米粒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒及其制備方法，還提供一種包含MRI造影劑的白蛋白納米粒載體，通過藥物與載體間的靜電吸附和配位作用，以及載體自身氨基酸殘基的交聯(lián)實現(xiàn)載藥。本發(fā)明還公開了藥物與造影劑共傳遞白蛋白納米粒的最優(yōu)制備工藝及其在腫瘤診療結(jié)合方面的作用。本發(fā)明的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒，能夠提高細胞對藥物的攝取率，并減少耐藥細胞對藥物的外排，進而逆轉(zhuǎn)耐藥性，實現(xiàn)藥物的高效傳遞；藥物與造影劑共傳遞白蛋白納米粒具備優(yōu)秀的T1加權(quán)成像能力，為腫瘤的診療結(jié)合提供了一種有效手段。
【專利說明】
抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒，以及包含該載體的MRI造影劑與藥物組合物，屬于藥物載體技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤的化學(xué)療法在近半個世紀以來已取得很多重大成果，成為治療腫瘤的方法之一，是常見腫瘤綜合治療中不可缺少的重要手段。然而治療過程中伴隨的毒副作用及多藥耐藥性極大地阻礙了化療藥物的臨床應(yīng)用。納米藥物傳遞系統(tǒng)可以通過規(guī)避或降低耐藥腫瘤細胞的排外作用而實現(xiàn)耐藥性的逆轉(zhuǎn)。與其他載體材料相比，白蛋白(BSA)具有無毒、低抗原性、可生物降解等優(yōu)點，并且其結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基提供了豐富的載藥位點;此外，BSA化學(xué)結(jié)構(gòu)會隨PH變化發(fā)生可逆性改變，為pH響應(yīng)性藥物釋放提供了可能。因此BSA可用于制備納米藥物傳遞系統(tǒng)，實現(xiàn)藥物的安全高效傳遞。
[0003]腫瘤組織內(nèi)氧供通常無法滿足腫瘤細胞代謝需求，因此大部分腫瘤均處于缺氧微環(huán)境中。腫瘤的缺氧微環(huán)境對增強腫瘤侵襲性和耐藥性有著不可忽略的重要作用。在缺氧狀態(tài)下，腫瘤細胞內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子-1 (HIF-1)活化，與缺氧應(yīng)答元件結(jié)合，進而促進包括多藥耐藥基因(MDR1)在內(nèi)的下游基因的表達；同時，活化的HIF-1會促進細胞從有氧代謝向無氧代謝的轉(zhuǎn)換，增加腫瘤微環(huán)境中的活性氧簇(R0S)，降低pH。因此，調(diào)節(jié)腫瘤缺氧微環(huán)境可以作為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的一種手段。
[0004]在酸性環(huán)境中，二氧化錳(MnO2)能與過氧化物反應(yīng)，在產(chǎn)生氧氣的同時，被還原為錳離子。上述反應(yīng)可用于調(diào)節(jié)腫瘤缺氧微環(huán)境，同時實現(xiàn)腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性MRI造影。MnO2弛豫效率(ri)低，無法用作MRI造影劑;被還原為錳離子后，其順磁中心(錳離子)與水分子間距離減小，η增加，T1加權(quán)成像能力增加。錳是生理必需微量元素，安全無毒。因此，MnO2可用于替代目前臨床上常用的釓類造影劑，用于腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性磁共振成像(MRI)造影。
[0005]綜上，本發(fā)明擬利用BSA穩(wěn)定MnO2膠體納米粒，構(gòu)建可實現(xiàn)腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性MRI造影的藥物載體;并通過去溶劑化-化學(xué)交聯(lián)法包載模型藥物阿霉素(DOX)，制備抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒BMDN。本發(fā)明探討了BSA對MnO2和DOX包載率對載體體系理化性質(zhì)的影響，期待借助白蛋白納米粒的特性高效傳遞藥物，逆轉(zhuǎn)耐藥性，并在腫瘤細胞中實現(xiàn)響應(yīng)性MRI造影。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]目的:為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒。
[0007]技術(shù)方案:為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒，其特征在于:所述MRI造影劑為MnO2膠體納米粒，抗腫瘤藥為蒽環(huán)類抗癌藥;是以白蛋白為載體骨架，通過靜電相互作用及配位作用穩(wěn)定MnO2膠體納米粒，隨后通過去溶劑化-化學(xué)交聯(lián)法包載抗腫瘤藥，制成的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒。
[0008]所述抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒載藥量為I% - 20.00 %，粒徑為30 - 300 nm，表面電勢為-50 - O mV。
[0009]作為優(yōu)選方案，所述抗腫瘤藥為阿霉素D0X。
[0010]上述的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒的制備方法，如下:
以氧化還原法制備MnO2膠體納米粒，隨后將一定濃度的白蛋白BSA溶液與MnO2膠體納米粒溶液混合，4 - 30 °(:下通入氮氣保護，攪拌6 - 24小時，制得BSA-MnO2溶液；
BSA-MnO2溶液與抗腫瘤藥以一定比例混合，攪拌狀態(tài)下滴加無水乙醇，并加入交聯(lián)劑，4 - 30 °C下攪拌6 - 24小時，透析純化后即得抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒。
[0011]具體包括以下步驟:
(I )BSA-Mn02溶液的制備:攪拌狀態(tài)下，以恒定速率將Na2S2O3溶液滴入KMnO4溶液中，氮氣保護在4 - 30 °C下反應(yīng)1- 4小時，得MnO2膠體納米粒溶液;攪拌狀態(tài)下向MnO2膠體納米粒溶液中滴入BSA溶液，氮氣保護下4 - 30 °C反應(yīng)6 - 24小時，以純水透析純化，得穩(wěn)定的褐色膠體溶液，S卩BSA-MnO2溶液；
(2 )去溶劑化-化學(xué)交聯(lián)法包載抗腫瘤藥:按照一定比例將抗腫瘤藥溶液滴加到BSA-MnO2溶液中，隨后滴加一定體積的無水乙醇，4 - 30 °C攪拌10 - 60分鐘后，加入交聯(lián)劑，密封4 - 30 °C下攪拌6 - 24小時，減壓蒸餾除去乙醇，透析純化后即得抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒。
[0012]作為優(yōu)選方案，所述MnO2膠體納米粒溶液由0.03- 0.3 mg/mL的Na2S2O3溶液和
0.08-0.8 mg/mL的KMnO4溶液按照體積比1:1 _ 10:1混合后反應(yīng)制得。
[0013]作為優(yōu)選方案，反應(yīng)中，按照每毫克MnO2加入10 - 50 mg BSA的比例加入BSA溶液。
[0014]作為優(yōu)選方案，所述抗腫瘤藥的加入量為抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒載藥量的1- 40 %。
[0015]按照無水乙醇:純水體積比為1:1加入無水乙醇，交聯(lián)劑使用量為每毫克BSA加入
0.07 - 0.40 yL質(zhì)量濃度為25 %的戊二醛。
[0016]本發(fā)明還提供上述的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒在制備診療腫瘤藥物中的用途。
[0017]有益效果:本發(fā)明提供的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點:
(1)同時包載并傳遞抗癌藥和MRI造影劑，并實現(xiàn)腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性造影及藥物釋放；能夠?qū)崿F(xiàn)對腫瘤的診療結(jié)合；
(2)通過多種途徑逆轉(zhuǎn)細胞的耐藥性，包括通過白蛋白與細胞表面受體的相互作用提高藥物的細胞攝取，規(guī)避耐藥細胞的外排作用，及抑制腫瘤多藥耐藥基因的表達等；
(3)可以藥物的pH響應(yīng)性釋放，并通過多種機制逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性，避免藥物對于正常組織的毒性；
(4)使用安全無毒的錳作為造影劑:MnO2在提供造影劑的同時，還可以調(diào)節(jié)腫瘤缺氧微環(huán)境，從而進一步逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性。
【附圖說明】
[0018]圖1是抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒BMDN的形態(tài)學(xué)表征；
圖2是BMDN pH響應(yīng)性釋放藥物表征圖；
圖3是BMDN對多藥耐藥細胞MCF-7/ADR耐藥性的逆轉(zhuǎn)；
圖4A是BMDN在多藥耐藥細胞MCF-7/ADR中的攝取情況；
圖4B是游離DOX在多藥耐藥細胞MCF-7/ADR中的攝取情況；
圖5是BMDN抑制多藥耐藥細胞MCF-7/ADR藥物外排的量化表征；
圖6是BMDN對多藥耐藥細胞MCF-7/ADR耐藥基因表達的影響；
圖7是BMDN在多藥耐藥細胞MCF-7/ADR中的T1W權(quán)成像。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作更進一步的說明。
[°02°] 一種抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒，所述MRI造影劑為Μηθ2膠體納米粒，抗腫瘤藥為蒽環(huán)類抗癌藥;是以白蛋白為載體骨架，通過靜電相互作用及配位作用穩(wěn)定MnO2膠體納米粒，隨后通過去溶劑化-化學(xué)交聯(lián)法包載抗腫瘤藥，制成的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒。以下實施例中，抗腫瘤藥以阿霉素DOX為例，蒽環(huán)類抗癌藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理作用相似，不再一一列舉。
[0021]所述抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒載藥量為I% - 20.00 %，粒徑為30 - 300 nm，表面電勢為-50 - O mV。
[0022]上述的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒的制備方法如下:
以氧化還原法制備MnO2膠體納米粒，隨后將一定濃度的白蛋白BSA溶液與MnO2膠體納米粒溶液混合，4 - 30 °(:下通入氮氣保護，攪拌6 - 24小時，制得BSA-MnO2溶液；
BSA-MnO2溶液與抗腫瘤藥以一定比例混合，攪拌狀態(tài)下滴加無水乙醇，并加入交聯(lián)劑，4 - 30 °C下攪拌6 - 24小時，透析純化后即得抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒。
[0023]具體包括以下步驟:
(I )BSA-Mn02溶液的制備:攪拌狀態(tài)下，以恒定速率將Na2S2O3溶液滴入KMnO4溶液中，氮氣保護在4 - 30 °C下反應(yīng)1- 4小時，得MnO2膠體納米粒溶液;攪拌狀態(tài)下向MnO2膠體納米粒溶液中滴入BSA溶液，氮氣保護下4 - 30 °C反應(yīng)6 - 24小時，以純水透析純化，得穩(wěn)定的褐色膠體溶液，S卩BSA-MnO2溶液；
(2 )去溶劑化-化學(xué)交聯(lián)法包載抗腫瘤藥:按照一定比例將抗腫瘤藥溶液滴加到BSA-MnO2溶液中，隨后滴加一定體積的無水乙醇，4 - 30 °C攪拌10 - 60分鐘后，加入交聯(lián)劑，密封4 - 30 °C下攪拌6 - 24小時，減壓蒸餾除去乙醇，透析純化后即得抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒。
[0024]實施例1: BMDN的制備
配制0.3 mg/mL的Na2S2O3溶液和0.8 mg/mL的KMnO4溶液，在攪拌狀態(tài)下以恒流栗將20mL Na2S2O3溶液滴入10 mL KMnO4溶液中，在氮氣保護下，室溫攪拌I小時。向反應(yīng)液中滴加
7.5mL的BSA(25 mg/mL)，氮氣保護下室溫攪拌12小時。所得產(chǎn)物以純水透析4次，每次半小時。
[0025]攪拌狀態(tài)下按照理論載藥量10 °M_D0X溶液(5 mg/mL)滴加到BSA-MnO2溶液中，隨后立即將I倍體積的無水乙醇滴加到上述溶液中。攪拌15分鐘后，向體系內(nèi)加入0.25 %戊二醛，(每毫克BSA加入0.367此戊二醛)，將反應(yīng)瓶密封，室溫條件下繼續(xù)攪拌12小時。減壓蒸餾除去乙醇，以純水透析4小時，所得產(chǎn)物即為BMDN ο使用高分辨率透射電鏡觀察BMDN的形態(tài)學(xué)特征，結(jié)果如圖1所示。
[0026]實施例2:BMDN pH響應(yīng)性釋放藥物
取1.5 mL BMDN溶液于透析袋中，扎緊袋口，浸沒于盛有28.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH5.0或7.4)的錐形瓶中。隨后將錐形瓶置于恒溫搖床中，37 0C ,120 rpm震蕩。在特定時間點取3 mL釋放介質(zhì)測定479 nm處的吸光度，并補充3 mL新鮮磷酸鹽緩沖溶液。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算釋放介質(zhì)中DOX的濃度，從而計算釋放度并繪制釋放曲線，結(jié)果如圖2所示。
[0027]實施例3: BMDN對多藥耐藥細胞MCF-7/ADR耐藥性的逆轉(zhuǎn)
MCF-7/ADR細胞接96孔板，每孔I X 14個細胞，培養(yǎng)24小時。以不加血清的培養(yǎng)基配制不同濃度的BMDN溶液(D0X分別為I，5，10，20，40，50，60 yg/mL)，以同濃度的游離DOX作為對照組。接板24小時后，吸去培養(yǎng)基，向孔中加入配好的樣品，每孔100此，每個樣品設(shè)三個副孔。僅加入100此無血清培養(yǎng)基的細胞作為空白對照。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，避光條件下向孔中加入20 yL MTT，放入恒溫搖床，37 0C , 100 rpm繼續(xù)培養(yǎng)4小時。取出細胞板，吸走培養(yǎng)基，每孔加入150 yL DMS0，以恒溫搖床搖晃10分鐘后，放入全波長酶標(biāo)讀數(shù)儀測定各孔在560 nm處的吸光度，計算細胞生存率。結(jié)果如圖3所示。
[0028]實施例4: BMDN促進多藥耐藥細胞MCF-7/ADR藥物攝取
MCF-7/ADR細胞接共聚焦皿，細胞數(shù)量為I X 15個，培養(yǎng)24小時。吸走培養(yǎng)基，每皿加Al mL含有BMDN(D0X的濃度為60 yg/mL)的無血清培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)2，4，8，12小時，同濃度的游離DOX用作對照組。隨后將培養(yǎng)基吸走，用PBS清洗細胞3次，按照試劑盒說明書用LysoTracker Green給細胞的溶酶體染色I小時；用I3BS清洗細胞3次后，以I mL 4 %多聚甲醛處理20分鐘，吸走，用PBS清洗細胞I次；按照試劑盒說明書用DAPI給細胞核染色20分鐘；用I3BS清洗3次，隨后以50 %(v/v)的甘油緩沖液浸潤樣品，用激光共聚焦顯微鏡拍照，BMDN和游離DOX在細胞中的攝取情況分別如圖4A和圖4B所示。
[0029]實施例5: BMDN抑制多藥耐藥細胞MCF-7/ADR藥物外排
MCF-7/ADR細胞接12孔板，每孔I X 15個細胞，培養(yǎng)24小時。吸走培養(yǎng)基，每孔加入ImL含BMDN(D0X濃度為20 yg/mL)的無血清培養(yǎng)基，以同濃度的游離DOX作對照組，培養(yǎng)4小時后，換新鮮的不含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)I，2，4小時，各外排時間設(shè)2個副孔。收集細胞于
1.5mL EP管中，以流式細胞儀檢測經(jīng)過不同時間外排后細胞中DOX的熒光強度，計算藥物在細胞中的蓄積量，結(jié)果如圖5所示。
[0030]實施例6:BMDN對多藥耐藥細胞MCF-7/ADR耐藥基因表達的影響
MCF-7/ADR細胞接6孔板，每孔3 X 15個細胞，培養(yǎng)24小時。吸走培養(yǎng)基，加入I mL含有BMDN(D0X濃度為20 yg/mL)的無血清培養(yǎng)基，以同濃度的游離DOX溶液及BSA-MnO2溶液作為對照組，僅以無血清培養(yǎng)基處理的細胞作為空白對照組，每組設(shè)2個副孔。給藥后細胞于三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時。隨后按照蛋白印跡法操作，定性半定量研究BMDN對MCF-7/ADR細胞中HIF-1a及MDRl表達量的影響，結(jié)果如圖6所示。[0031 ] 實施例7: BMDN在多藥耐藥細胞MCF-7/ADR中的T1加權(quán)成像能力
將細胞接種在6孔板，每孔3 X 15個細胞，培養(yǎng)24 h后，分別加入含有不同濃度BMDN的培養(yǎng)基培養(yǎng)4小時。以PBS將細胞表面納米粒洗掉之后，消化并收集細胞，將細轉(zhuǎn)移到EP管內(nèi)進行MRI，T1W權(quán)成像結(jié)果如圖7所示。
[0032]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出:對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒，其特征在于:所述MRI造影劑為MnO2膠體納米粒，抗腫瘤藥為蒽環(huán)類抗癌藥;是以白蛋白為載體骨架，通過靜電相互作用及配位作用穩(wěn)定MnO2膠體納米粒，隨后通過去溶劑化-化學(xué)交聯(lián)法包載抗腫瘤藥，制成的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒，其特征在于:所述抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒載藥量為1.00 % - 20.00 %，粒徑為30 -.300 nm，表面電勢為-50 - O mV。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒，其特征在于:所述抗腫瘤藥為阿霉素D0X。4.根據(jù)權(quán)利要求1- 3任一項所述的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒的制備方法，如下: 以氧化還原法制備Μηθ2膠體納米粒，隨后將一定濃度的白蛋白BSA溶液與Μηθ2膠體納米粒溶液混合，4 - 30 °(:下通入氮氣保護，攪拌6 - 24小時，制得BSA-MnO2溶液； BSA-MnO2溶液與抗腫瘤藥以一定比例混合，攪拌狀態(tài)下滴加無水乙醇，并加入交聯(lián)劑，4-30 °C下攪拌6 - 24小時，透析純化后即得抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒的制備方法，具體包括以下步驟: (I )BSA-Mn02溶液的制備:攪拌狀態(tài)下，以恒定速率將Na2S2O3溶液滴入KMnO4溶液中，氮氣保護在4 - 30 °C下反應(yīng)1- 4小時，得MnO2膠體納米粒溶液;攪拌狀態(tài)下向MnO2膠體納米粒溶液中滴入BSA溶液，氮氣保護下4 - 30 °C反應(yīng)6 - 24小時，以純水透析純化，得穩(wěn)定的褐色膠體溶液，S卩BSA-MnO2溶液； (2)去溶劑化-化學(xué)交聯(lián)法包載抗腫瘤藥:按照一定比例將抗腫瘤藥溶液滴加到BSA-MnO2溶液中，隨后滴加一定體積的無水乙醇，4 - 30 °C攪拌10 - 60分鐘后，加入交聯(lián)劑，密封4 - 30 °C條件下攪拌6 - 24小時，減壓蒸餾除去乙醇，透析純化后即得抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒的制備方法，其特征在于:所述Μηθ2膠體納米粒溶液由0.03 - 0.3 mg/mL的Na2S203溶液和0.08 - 0.8 mg/mL的KMnO4溶液按照體積比1:1 - 10:1混合后反應(yīng)制得。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒的制備方法，其特征在于:反應(yīng)中，按照每毫克MnO2加入10 - 50 mg BSA的比例加入BSA溶液。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒的制備方法，其特征在于:所述抗腫瘤藥的加入量為抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒載藥量的1-.40 %。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒的制備方法，其特征在于:按照無水乙醇:純水體積比為1:1加入無水乙醇，交聯(lián)劑使用量為每毫克BSA加入.0.07 - 0.40 yL質(zhì)量濃度為25 %的戊二醛。10.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的抗腫瘤藥與MRI造影劑共傳遞白蛋白納米粒在制備診療腫瘤藥物中的用途。
【文檔編號】A61K47/48GK105879045SQ201610228149
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月13日
【發(fā)明人】姜虎林, 張美 , 邢磊
【申請人】中國藥科大學(xué)