Fam96a基因及其編碼蛋白的新應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及人類基因FAM96A及其編碼蛋白的新應(yīng)用。FAM96A及其編碼蛋白作為生物藥治療炎癥(急性和慢性)和自身免疫性疾病的作用。本發(fā)明還涉及FAM96A及其編碼蛋白可以通過(guò)調(diào)控TH17細(xì)胞的相關(guān)細(xì)胞因子IL-23/IL-22/IL-17的通路治療炎癥、自身免疫病以及進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的作用。本發(fā)明還涉及用于治療炎癥和自身免疫病的藥物組合物。
【專利說(shuō)明】
FAM96A基因及其編碼蛋白的新應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及FAM96A的新應(yīng)用，具體地說(shuō)，本發(fā)明設(shè)及FAM96A蛋白或編碼其的多核 巧酸制備用于治療急、慢性炎癥、自身免疫病及免疫調(diào)節(jié)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 炎癥是機(jī)體對(duì)應(yīng)激，組織損傷，感染等的反應(yīng)，炎癥反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，對(duì)炎 癥的調(diào)控也是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，各種細(xì)胞和分子參與其中，構(gòu)成了炎癥調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。巨 隧細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著核屯、作用，是炎癥反應(yīng)的主要介導(dǎo)者。巨隧細(xì) 胞和樹突狀細(xì)胞通過(guò)其表面的模式識(shí)別受體識(shí)別多種抗原分子，如Toll樣受體（TLRs)， RIG-I樣受體巧LRs)，N孤樣受體WLRs)等；不同的受體識(shí)別不同的分子，包括病原相關(guān)模 式分子和損傷相關(guān)模式分子，模式分子結(jié)合到模式識(shí)別受體后活化固有免疫細(xì)胞，釋放各 種炎性細(xì)胞因子和趨化因子，如IL-6、TNF-a、MCP-1等，觸發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。除此之外， 巨隧細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞還直接向T細(xì)胞提呈抗原成分，同時(shí)分泌一系列細(xì)胞因子調(diào)節(jié)T細(xì) 胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫。固有免疫細(xì)胞通過(guò)分泌一系列細(xì)胞因子對(duì)適應(yīng)性免疫和炎癥反應(yīng)類 型起著核屯、的調(diào)控作用，如由固有免疫細(xì)胞分泌的IL-1 β，IL-6和IL-23可W促進(jìn)化17細(xì) 胞的分化，促進(jìn)其分泌IL-17和IL-22,介導(dǎo)化17相關(guān)的炎癥反應(yīng)，抵抗外來(lái)入侵和誘導(dǎo)病 理性炎癥反應(yīng)。而由活化的樹突狀細(xì)胞感受抗原刺激后分泌的IL-12可W促進(jìn)Thl細(xì)胞的 分化，DC 的 TLR3，TLR4、TLR7、TLR8、TLR9 和 TLR11 被激活后，在 I 型干擾素和 IFN-丫，CD40L 的共同刺激下能夠分泌大量的IL-12,介導(dǎo)化1型炎癥反應(yīng)，化細(xì)胞分泌大量的IFN-丫，反 過(guò)來(lái)又促進(jìn)IL-12的分泌，由此形成一個(gè)正反饋環(huán)路，進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞向化1型分化。由 此可見(jiàn)，固有免疫細(xì)胞中不同的通路和分子調(diào)控著不同的固有免疫反應(yīng)類型，它們之間存 在著精細(xì)的平衡和復(fù)雜的調(diào)控。固有免疫細(xì)胞在炎癥反應(yīng)過(guò)程中起著重要的紐帶作用，它 連接著致炎因子（如感染、損傷等）和適應(yīng)性免疫，同時(shí)又可W通過(guò)直接的抗原提呈和間接 的通過(guò)其分泌細(xì)胞因子調(diào)控著T細(xì)胞和炎癥反應(yīng)的類型。因此固有免疫細(xì)胞是炎癥調(diào)控和 治療的重要祀點(diǎn)，研究其對(duì)炎癥的作用具有重要意義。
[0003] 人類基因組計(jì)劃確定了人類基因組的全部序列，然而許多基因的功能仍然一無(wú) 所知。根據(jù)人類轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)H-Invitational化t油ase(H-InvDB)的最新釋放的數(shù)據(jù) 庫(kù)統(tǒng)計(jì)信息，在目前已注釋的36, 789個(gè)人類編碼基因中，有功能報(bào)道的只有16, 139個(gè) 化ttp:http://h-invit曰tion曰 1. jp/hinv/曰hg-db/st曰tistics. jsp)。因此，大量人類親jf基 因的功能及開發(fā)有待發(fā)掘，其中必然包括眾多免疫相關(guān)基因。本實(shí)驗(yàn)室一直致力于通過(guò) 免疫組學(xué)和反向生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)新的免疫相關(guān)基因，免疫組學(xué)研究免疫相關(guān)的全套分子、 它們的作用祀分子及其功能，主要包括免疫基因組學(xué)（Immunogenomics)、免疫蛋白質(zhì)組學(xué) (Immunoproteomics)和免疫信息學(xué)（Immunoinformatics) Ξ方面的研究。免疫組學(xué)強(qiáng)調(diào)在 基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，充分利用生物信息學(xué)、生物忍片、系統(tǒng)生物學(xué)、結(jié)構(gòu) 生物學(xué)、高通量篩選等技術(shù)，開展大規(guī)模免疫系統(tǒng)和免疫應(yīng)答分子機(jī)理研究，發(fā)現(xiàn)新的免疫 相關(guān)分子，為全面系統(tǒng)了解免疫系統(tǒng)和免疫應(yīng)答奠定基礎(chǔ)?；A(chǔ)免疫學(xué)、臨床免疫學(xué)（腫瘤 和感染免疫學(xué)）和疫苗設(shè)計(jì)運(yùn)些免疫學(xué)領(lǐng)域都充分體現(xiàn)了免疫組學(xué)戰(zhàn)略的成功應(yīng)用。反向 生物學(xué)方法即：從核酸到蛋白質(zhì)途徑，主要包括：細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞的cDNA的大規(guī)模測(cè)序 和生物信息學(xué)分析；染色體中細(xì)胞因子聚集區(qū)的大規(guī)模測(cè)序；差異顯示技術(shù)；生物信息學(xué) 技術(shù)等。
[0004] 本研究基于整個(gè)人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物信息學(xué)分析高通量篩選潛在細(xì)胞因 子，得到動(dòng)態(tài)的細(xì)胞因子候選庫(kù)；構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒并驗(yàn)證分泌；對(duì)于存在分泌形式 的蛋白進(jìn)行廣泛表達(dá)譜分析；在此基礎(chǔ)上，對(duì)潛在新細(xì)胞因子進(jìn)行分泌蛋白的表達(dá)優(yōu)化、純 化、鑒定、N端測(cè)序及分泌途徑的分析；對(duì)N端明確的分泌蛋白構(gòu)建原核細(xì)胞表達(dá)載體，并進(jìn) 行原核蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化和鑒定；利用純化的重組蛋白進(jìn)行系列體內(nèi)、外功能研究；功 能明確者，將制備、純化單克隆抗體和多克隆抗體，研究其受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；對(duì)于功能 重要者，將構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠和基因敲除小鼠，并進(jìn)行表型鑒定和功能研究。
[0005] 通過(guò)高通量篩選技術(shù)成功的篩選出了 FAM96A運(yùn)一功能未知的基因，本實(shí)驗(yàn)室前 期的研究發(fā)現(xiàn)該基因可W調(diào)控上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過(guò)程（EMT)，當(dāng)內(nèi)源性敲減FAM96A后可 W強(qiáng)烈的誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞分化，表現(xiàn)為一系列上皮細(xì)胞特征的消失和間質(zhì)細(xì)胞特 征的出現(xiàn)W及一些相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化。我們?cè)趧傞_始進(jìn)行此研究時(shí)還沒(méi)有該基因功能文 章發(fā)表，后來(lái)有文章報(bào)道該基因編碼的蛋白產(chǎn)物在體外能夠形成二聚體，與FAM96B和CIA0 有相互作用參與鐵硫中屯、的成熟，參與細(xì)胞生物化學(xué)過(guò)程。
[0006] 炎癥性腸病包括克羅恩?。ɑ痮hn' S disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis, UC)，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，多種因素參與其發(fā)病過(guò)程。固有免疫細(xì)胞，如巨隧 細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，在IBD發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。巨隧細(xì)胞分泌多種炎癥性細(xì)胞因子 和趨化因子，如TNF-a、比-6、IL-1 β、MIP等，介導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)。DSS (葡聚糖硫酸鋼） 是由薦糖合成的一種硫酸多糖，具有抗止血和抗凝血作用。在小鼠飲水中加入3% (w/v)的 DSS能夠誘導(dǎo)小鼠明顯的結(jié)腸炎癥狀，主要表現(xiàn)為血性腹瀉、結(jié)腸潰瘍W及大量炎性浸潤(rùn)。 目前認(rèn)為DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎主要由固有免疫細(xì)胞介導(dǎo)，因?yàn)樵赗AG1-/-小鼠中也能誘導(dǎo)出 類似的結(jié)腸炎改變，因?yàn)槠渑R床癥狀與人類炎癥性腸病極為相似，目前被廣泛運(yùn)用于人類 炎癥性腸病的研究。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)內(nèi)源性FAM96A在炎性刺激過(guò)程中下調(diào)，且Fam96a-/-巨 隧細(xì)胞中11-6, 11-1 β和11-23產(chǎn)生降低，而且大量的文獻(xiàn)均證實(shí)IL-23參與腸炎過(guò)程。 因此我們推測(cè)FAM96A可能在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎中發(fā)揮作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供FAM96A蛋白或其編碼的多核巧酸在治療炎癥（包括急、 慢性炎癥）、自身免疫病及免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。
[0008] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了 FAM96A蛋白或編碼其的多核巧酸在制備炎癥（包括 急性炎癥和慢性炎癥）損傷之藥劑中的用途。
[0009] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了 FAM96A蛋白或編碼其的多核巧酸在制備用于自 身免疫病中的應(yīng)用。
[0010] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了 FAM96A蛋白或編碼其的多核巧酸在制備用于免 疫調(diào)節(jié)療法中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明還設(shè)及一種用于治療炎癥及治療自身免疫病的藥物組合物，其包含治療有 效量的選自抗生素類或者其任意組合藥W及增敏有效量的FAM96A蛋白。
[001引在一個(gè)實(shí)施方案中，所述FAM96A蛋白選自下組：（1)具有SEQ ID N0:2所示氨基 酸序列的多膚；或（2)包含與SEQ ID N0:2所述氨基酸序列有至少70%、75%、80%、85%、 90%、95%或97%同源性的氨基酸序列的多膚，其具有與（1)所述多膚基本相同的生物學(xué) 功能或活性；或（1)或（2)所述多膚的功能性片段、變體、類似物或衍生物，它們具有與（1) 或（2)所述多膚基本相同的生物學(xué)功能或活性。
[0013] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核巧酸包括：（a)編碼SEQ ID No :1所示氨基酸序列 的核巧酸序列；化）在嚴(yán)格條件下與（a)所述的核巧酸序列雜交的核巧酸序列；或（C)與 (a)所示核巧酸序列具有至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或97 % -致性的核巧酸序 列。
[0014] 在本發(fā)明中，所述蛋白的生物學(xué)功能或活性例如但不限于，如本文所述的，治療 急、慢性炎癥和治療自身免疫病。
【附圖說(shuō)明】
[001引附圖1、FAM96A在免疫系統(tǒng)中廣泛表達(dá)
[0016] 研究顯示，F(xiàn)AM96A在全身各組織中廣泛表達(dá)，為了探明FAM96A在免疫系統(tǒng)中的表 達(dá)情況，我們采用Clontech公司的免疫組織cDNA為模板，用real-time PCR對(duì)FAM96A的轉(zhuǎn) 錄本進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明FAM96A廣泛表達(dá)在免疫系統(tǒng)各個(gè)組織中，其中胎肝表達(dá)量最高， 骨髓，胸腺，白細(xì)胞，淋己結(jié)和脾都有比較均一的相對(duì)低水平的表達(dá)，W上數(shù)據(jù)說(shuō)明FAM96A 可能在胚胎造血過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。
[0017] 附圖2、FAM96A內(nèi)源性表達(dá)水平在LPS和炎性細(xì)胞因子刺激后降低
[0018] 為探討FAM96A在炎性環(huán)境中的表達(dá)，在THP1細(xì)胞中加入10化g/ml的LPS，分別 刺激化、1化、24h后收集細(xì)胞進(jìn)行mRNA檢測(cè)，定量PCR結(jié)果顯示FAM96A的轉(zhuǎn)錄被明顯的抑 制；純化的小鼠腹腔巨隧細(xì)胞，分別加入LPS、polyI :C刺激化后發(fā)現(xiàn)Fam96a的轉(zhuǎn)錄也被抑 審IJ。在人外周血單個(gè)核細(xì)胞加入PMA分別刺激化、1化后發(fā)現(xiàn)FAM96A的表達(dá)量明顯降低， 在人肺癌上皮A549細(xì)胞中加入IL-10后也得出類似的結(jié)論。W上數(shù)據(jù)說(shuō)明，在抗原和炎 性細(xì)胞因子刺激下FAM96A表達(dá)明顯下調(diào)，提示FAM96A在炎癥反應(yīng)尤其是固有免疫免疫介 導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過(guò)程中可能發(fā)揮重要的作用。
[0019] 附圖3、FAM96A存在分泌形式
[0020] 生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)FAM96A存在N端信號(hào)膚，預(yù)測(cè)其切割位點(diǎn)位于第26和27個(gè) 氨基酸之間，由此推斷FAM96A可能存在分泌形式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次證實(shí)FAM96A蛋白在細(xì)胞 培養(yǎng)上清中存在，同時(shí)檢測(cè)了 β -actin，結(jié)果顯示其不存在于上清中，由此排除細(xì)胞死亡導(dǎo) 致的細(xì)胞內(nèi)容物釋放到培養(yǎng)上清中的可能。
[0021] 附圖4、重組人FAM96A蛋白誘導(dǎo)、表達(dá)及純化
[002引為了研究FAM96A的功能，大量的高純度的FAM96A重組蛋白是必不可少的T具，我 們構(gòu)建了去掉信號(hào)膚序列的FAM96A原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)、表達(dá)、純化了人重組FAM96A蛋白， 純化后通過(guò)DEAE柱去除內(nèi)毒素，最后得到了高純度的重組FAM96A蛋白。
[002引 附圖5、Fam96a基因敲除鼠結(jié)腸炎癥狀明顯加重
[0024] 前述實(shí)驗(yàn)提示FAM96A可能參與腸炎的發(fā)生過(guò)程。為了探究FAM96A在腸炎發(fā)病過(guò) 程中的具體作用，我們選取性別和周齡一致的Fam96a基因敲除小鼠和WT對(duì)照鼠，分別在它 們的飲水中加入3 %的DSS，每天監(jiān)測(cè)小鼠的體重，腹瀉，便血情況。DSS處理小鼠9天后， Fam96a基因敲除小鼠平均體重下降了 30%左右，而WT對(duì)照小鼠體重只下降了 10%左右。疾 病活動(dòng)指數(shù)（DAI)是腸炎活動(dòng)的綜合反應(yīng)，其指標(biāo)囊括了體重減低情況，腹瀉和血便情況， 評(píng)分越高則反應(yīng)出疾病越嚴(yán)重。評(píng)估顯示Fam96a基因敲除小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI)更高； 結(jié)腸長(zhǎng)度是反應(yīng)腸炎嚴(yán)重程度的另一個(gè)重要的宏觀指標(biāo)，腸炎發(fā)生時(shí)，小鼠結(jié)腸水腫縮短， 腸炎癥狀越嚴(yán)重，結(jié)腸越短。3% DSS處理9天后處死小鼠，分離小鼠結(jié)腸組織，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng) 度后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)am96a基因敲除小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯較WT對(duì)照鼠短。將小鼠結(jié)腸組織固定包埋 后切片肥染色，鏡下觀察小鼠結(jié)腸組織學(xué)改變情況。與WT小鼠相比，F(xiàn)am96a基因敲除小 鼠總體組織學(xué)評(píng)分明顯升高，結(jié)腸炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，結(jié)腸組織損壞程度也明顯高于WT對(duì) 照鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。W上數(shù)據(jù)說(shuō)明FAM96A對(duì)DSS腸炎具有保護(hù)作用。
[002引 附圖6、FAM96A轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的腸炎抵抗
[0026] 為了進(jìn)一步證實(shí)FAM96A對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的作用，在FAM96A轉(zhuǎn)基因小鼠 中又做了類似的實(shí)驗(yàn)；選取性別和周齡匹配的FAM96A轉(zhuǎn)基因小鼠和野生對(duì)照鼠，在其飲 水中加入3% DSS，6天后處死小鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，WT體重下降比FAM96A轉(zhuǎn)基因鼠明顯嚴(yán) 重，疾病活動(dòng)指數(shù)也明顯升高；結(jié)腸長(zhǎng)度的測(cè)量發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM96A轉(zhuǎn)基因鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯較WT 小鼠結(jié)腸長(zhǎng)，檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中炎性細(xì)胞因子的含量，ELISA和qPCR結(jié)果均顯示，F(xiàn)AM96A 轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)腸組織中IL-1 β，IL-6 W及TNF-a的含量均明顯低于WT小鼠，W上結(jié)果進(jìn) 一步證實(shí)FAM96A對(duì)DSS誘導(dǎo)的腸炎具有明顯的保護(hù)作用。
[0027] 附圖7、人重組FAM96A原核蛋白對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有保護(hù)作用
[002引通過(guò)序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)FAM96A人鼠同源性具有高度的同源性（高達(dá)87% )。給小鼠 注射人重組FAM96A蛋白觀察其對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的作用，為避免微量?jī)?nèi)毒素殘留對(duì) 實(shí)驗(yàn)的影響，采用煮沸加熱的FAM96A蛋白作為對(duì)照，運(yùn)種方法能夠滅活掉FAM96A蛋白的活 性，但是不能去除里面殘留的內(nèi)毒素活性。8周齡，性別，體重均匹配的小鼠，在其飲用水中 加入3 %的DSS誘導(dǎo)小鼠腸炎，同時(shí)每組每天分別注射人重組FAM96A原核蛋白50ug/25g體 重，100yg/25g體重和等量加熱滅活的FAM96A蛋白。每天記錄小鼠的體重。DSS處理8天 后，對(duì)照組小鼠體重降低了 10% W上，而注射FAM96A蛋白組小鼠體重至多下降了 5%左右， 100 μ g組保護(hù)作用比50 μ g組保護(hù)作用更明顯。FAM96A重組蛋白注射組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度 明顯比對(duì)照組小鼠長(zhǎng)，W上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明重組人FAM96A蛋白在體內(nèi)同樣具有抗炎活性。
[0029] 附圖8、Fam96a-/-小鼠腹腔巨隧細(xì)胞刺激后與化17分化相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生減少
[0030] 為探討Fam96a在炎癥反應(yīng)過(guò)程中的作用，分別分離Fam96a+/+和Fam96a-/-小鼠 腹腔巨隧細(xì)胞，在體外加入l(K)ng/ml LI^刺激6小時(shí)后收集細(xì)胞，提取RNA，用qPCR檢測(cè)巨 隧細(xì)胞中細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)情況。通過(guò)篩查發(fā)現(xiàn)Fam96a-/-巨隧細(xì)胞中11-10， 11-6,11-23表達(dá)量明顯下調(diào)，其中11-6和11-23尤為明顯；而與化1細(xì)胞分化密切相關(guān)的 細(xì)胞因子11-12沒(méi)有明顯變化，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)趨化中性粒細(xì)胞的趨化因子Cxcll也有明顯下 調(diào)，但Ccl20, Mcp-1沒(méi)有明顯變化，與巨隧細(xì)胞極化相關(guān)的分子iNOS和Argl也沒(méi)有明顯變 化。
[003。 附圖9、Fam96a基因敲除小鼠結(jié)腸組織中比-22的表達(dá)量降低
[0032] 比-22主要由ILC細(xì)胞和T細(xì)胞分泌，它作用于腸上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)腸上皮損傷 修復(fù)，促進(jìn)上皮杯狀細(xì)胞細(xì)胞分泌粘液和抗菌膚類物質(zhì)進(jìn)而保護(hù)腸上皮。在DSS誘導(dǎo) 的腸炎模型中比-22表達(dá)上調(diào)，介導(dǎo)腸上皮的保護(hù)作用，抑制腸道炎癥反應(yīng)。檢測(cè)了 Fam96a-/-和Fam96a+/+小鼠結(jié)腸組織中IL-22的表達(dá)情況，在用3 % DSS水喂養(yǎng)小鼠8天 后，F(xiàn)am96a-/-結(jié)腸組織中比-22表達(dá)量明顯降低，Regllie和Reglll 丫是由腸道上皮分 泌的一種C型凝集素，它能夠阻止病原體與腸上皮結(jié)合，保護(hù)腸上皮，是IL-22發(fā)揮作用的 效應(yīng)分子，運(yùn)用qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在Fam96a-/-小鼠結(jié)腸組織中，RegHI β和RegllI 丫的表 達(dá)量明顯降低。值得注意的是，我們還發(fā)現(xiàn)Fam96a-/-小鼠結(jié)腸組織中11-17的表達(dá)也有 所下降，有文獻(xiàn)報(bào)道，IL-17A敲除的小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎敏感性增加，我們的實(shí) 驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道是一致的。結(jié)果顯示Fam96a可能通過(guò)影響IL-22的表達(dá)對(duì)DSS誘導(dǎo)的 腸炎起保護(hù)作用。
[0033] 附圖10、Fam96a通過(guò)比-23調(diào)控比-22的分泌
[0034] 體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Fam96a-/-小鼠腹腔巨隧細(xì)胞11-23、11-6產(chǎn)生減少，比-23可W調(diào) 控IL-22的表達(dá)，11-23敲除小鼠11-22產(chǎn)生減少，對(duì)巧樣酸桿菌易感；此外，在抗CD3和 CD28抗體的刺激下，11-6可W直接促進(jìn)naive T分泌11-22。首先用化ISA檢測(cè)了小鼠結(jié)腸 組織中11-23的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，F(xiàn)am96a-/-小鼠結(jié)腸組織中11-23的表達(dá)量明顯下調(diào)， FAM96A轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)腸組織中11-23的表達(dá)量明顯高于WT對(duì)照鼠，W上數(shù)據(jù)提示Fam96a 對(duì)11-23具有重要的調(diào)控作用，F(xiàn)am96a可能是通過(guò)11-23調(diào)控11-22。比-23通過(guò)比-23R 活化STAT3調(diào)控一系列祀基因的轉(zhuǎn)錄，包括112化和Rorc。R0R 丫 t是化-17細(xì)胞分化的關(guān) 鍵轉(zhuǎn)錄因子，在正常小鼠，它表達(dá)于未成熟的胸腺細(xì)胞和腸固有層淋己細(xì)胞，R0R 丫 t直接結(jié) 合在IL-22的上游啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)控IL-22的轉(zhuǎn)錄。用qPCR檢測(cè)了小鼠結(jié)腸組織中Ι123Γ 和Rorc的表達(dá)情況，F(xiàn)am96a-/-小鼠結(jié)腸組織中112化和Rorc表達(dá)下調(diào)。因此，DSS誘導(dǎo) 的腸炎過(guò)程中Fam96a通過(guò)影響11-23來(lái)調(diào)節(jié)11-22和11-17分泌。
[003引附圖11、FAM96A基因敲除鼠的構(gòu)建
[0036] 小鼠 Fam96a基因具有5個(gè)外顯子，通過(guò)在2號(hào)和3號(hào)外顯子兩側(cè)插入Loxp標(biāo)簽 構(gòu)建打祀載體，電穿孔轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性克隆，囊胚注射后得到帶有Loxp標(biāo)簽 的Fam96a-floxed小鼠。Loxp序列位于Fam96a基因第二和第Ξ外顯子兩側(cè)，中間插入肥0 新霉素篩選基因。 具體實(shí)施例
[0037] 在本發(fā)明中，F(xiàn)AM96A包括FAM96A基因或FAM96A蛋白。所述FAM96A蛋白為如沈Q ID NO : 2所示的氨基酸序列，其編碼160個(gè)氨基酸。所述FAM96A基因?yàn)榫幋a本發(fā)明的SEQ ID NO :2的多核巧酸序列，其可W為SEQ ID NO :2所示氨基酸的編碼序列，或者除了上述氨 基酸序列的編碼序列之外，還可W包括非編碼序列，例如內(nèi)含子、編碼序列5'或3'端的非 編碼序列等。所述多核巧酸序列可W是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因組DNA W及合 成的DNA。其中優(yōu)選的基因?yàn)镾EQ ID NO :1所示的多核巧酸序列，該序列全長(zhǎng)1108個(gè)核巧 酸，編碼序列為第1-1108位核巧酸（CDS :第1-1108位核巧酸）?；蛘?，更優(yōu)選一種分離的 核巧酸序列，其只包含編碼FAM96A蛋白序列，例如SEQ ID NO :1所示的編碼序列：核巧酸 1-1108。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，本發(fā)明的FAM96A的核巧酸序列可W完全相同于如SEQ ID NO :1所示的編碼序列，也可W由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不完全等同于上述核巧酸的編碼 序列。
[003引本發(fā)明的FAM96A多核巧酸序列可W依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)將cDNA，mRNA或者 基因組DM作為模板，并選取合適的寡核巧酸引物擴(kuò)增得到。運(yùn)樣得到的核巧酸可W克隆 進(jìn)合適的載體中，并用DNA分析技術(shù)進(jìn)行序列描述。也可W通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)得到。 本發(fā)明的FAM96A蛋白可W通過(guò)常規(guī)方法獲得，例如通過(guò)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并在被轉(zhuǎn)染的宿主 細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用適當(dāng)?shù)姆椒ǎㄈ鐪囟茸儎?dòng)或化學(xué)特質(zhì)誘導(dǎo)）誘導(dǎo)啟動(dòng)子， 然后繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，可用離屯、法收集細(xì)胞，并用任何已知的方法，如凍融法、超聲 處理法、溶菌酶溶解法或機(jī)械破碎法破碎細(xì)胞。可W用各種已知的方法從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物 中回收和純化本發(fā)明的FAM96A蛋白，運(yùn)些方法包括硫酸錠或乙醇沉淀法、酸萃取法、超濾 法、離子交換層析法、憐酸纖維層析法、疏水相互作用層析法、凝膠過(guò)濾法、親和層析法及高 壓液柱層析法。也可W通過(guò)原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ǎㄈ鐪囟茸?動(dòng)或化學(xué)特質(zhì)誘導(dǎo)）誘導(dǎo)啟動(dòng)子，然后繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，可用離屯、法收集細(xì)胞，并用 任何已知的方法，如凍融法、超聲處理法、溶菌酶溶解法或機(jī)械破碎法破碎細(xì)胞。可W用各 種已知的方法從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的FAM96A蛋白，運(yùn)些方法包括硫酸 錠或乙醇沉淀法、酸萃取法、超濾法、離子交換層析法、憐酸纖維層析法、疏水相互作用層析 法、凝膠過(guò)濾法、親和層析法及高壓液柱層析法。
[0039] 本發(fā)明的FAM96A還可W通過(guò)慢病毒，腺病毒等載體感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi) 和體內(nèi)發(fā)揮作用。
[0040] 本發(fā)明的FAM96A蛋白還可W通過(guò)化學(xué)的方法合成得到。
[0041] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，F(xiàn)AM96A可W抑制比-22和IL-17信號(hào)通路，因此可 W抑制炎癥性疾病和自身免疫性疾病。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供一種治療炎癥的藥物組合物。該藥物組合 物包含F(xiàn)AM96A的重組蛋白。還可W包含一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。所述載 體或賦形劑可W包括生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、緩沖鹽水、甘油、乙醇及上述溶液的組合。 所述藥物組合物還可W進(jìn)一步包含滲透促進(jìn)劑、抗氧化劑和/或蛋白酶抑制劑等。
[0043] 為治療目的，所述藥物組合物可W采用適當(dāng)?shù)慕o藥途徑來(lái)施用?？蒞將所述藥物 組合物制成各種劑型，例如溶液劑、脂質(zhì)體制劑、聚合物制劑、微膠囊劑及其他緩釋制劑等。
[0044] 本發(fā)明的藥物組合物可W全身給藥，例如通過(guò)靜脈注射；或者局部給藥，例如對(duì)患 癌部位局部注射。最適的劑量要根據(jù)患者的病情、年齡、性別或體重，給藥方式和所需功效 而定，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可在其知識(shí)范圍內(nèi)無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可確定最佳的施用方式。
[0045] W下將參考實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。
[0046] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了 FAM96A蛋白或編碼其的多核巧酸在制備炎癥治療藥物 的用途。在一些實(shí)施方案中，所述FAM96A蛋白或編碼其的多核巧酸通過(guò)抑制IL-22和IL-17 信號(hào)通路抑制炎癥和自身免疫病。
[0047] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了使用FAM96A蛋白或編碼其的多核巧酸治療炎癥和自身 免疫病的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的FAM96A蛋白或編碼其的多核巧 酸。在又一些實(shí)施方案中，所述多核巧酸可W是多種形式，包括但不限于克隆載體、表達(dá)載 體、腺病毒、慢病毒、質(zhì)粒、隧粒、粘粒、裸DNA等形式。在另一些實(shí)施方案中，所述FAM96A蛋 白或編碼其的多核巧酸通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞因子的分泌實(shí)現(xiàn)抑制炎癥和自身免疫病。在又一 些實(shí)施方案中，治療炎癥和自身免疫病通過(guò)w上兩種方式實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，所述方法在體內(nèi)或 離體實(shí)施。
[0048] 本發(fā)明的又一個(gè)方面提供了一種用于治療炎癥和自身免疫病的藥物組合物，其包 含治療有效量的FAM96A蛋白和化療藥物。
[0049] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述FAM96A蛋白選自下組：（1)具有SEQ ID N0:2 所示氨基酸序列的多膚；或（2)包含與SEQ ID NO :2所述氨基酸序列有至少70%同源性的 氨基酸序列的多膚，其具有與（1)所述多膚基本相同的生物學(xué)功能或活性；或（1)和（2)所 述多膚的功能性片段、變體，類似物和衍生物，它們具有與（1)或（2)所述多膚基本相同的 生物學(xué)功能或活性；其中所述多核巧酸包括：(a)編碼上述（1)、（2)或（3)所述的FAM96A 蛋白的多核巧酸；化）在嚴(yán)格條件下與（a)所述的多核巧酸雜交并與其有至少70%-致性 的多核巧酸；和（C)包含（a)或化）所述多核巧酸的多核巧酸片段。
[0050] 優(yōu)選地，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述FAM96A蛋白包含與SEQ ID N0:2所述 氨基酸序列有至少75 %，優(yōu)選地至少80 %，更優(yōu)選地至少85 %，還更優(yōu)選地至少90 %，甚至 更優(yōu)選地至少95 %，最優(yōu)選地至少97 %同源性的氨基酸序列。
[0051] 優(yōu)選地，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，編碼所述FAM96A蛋白的多核巧酸具有與 沈Q IDN0 :1所示核酸序列至少70%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，至少85%，至少 90%，至少95%，甚至至少97%-致性的序列，最優(yōu)選其中所述多核巧酸具有SEQ ID NO :1 所示核酸序列。
[0052] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究顯示人FAM96A蛋白是一分泌蛋白，具有細(xì)胞因子的特點(diǎn)，通過(guò) 與細(xì)胞的相關(guān)受體結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制炎癥的信號(hào)而發(fā)揮作用。。
[0053] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"受試者"是指哺乳動(dòng)物，如人類，但也可W是其它動(dòng)物， 如家養(yǎng)動(dòng)物（如狗、貓等），家畜（如牛、羊、豬、馬等）或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物（如猴子、大鼠、小鼠、兔 子、豚鼠等）。
[0054] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"多膚"指通過(guò)共價(jià)鍵（例如膚鍵）相互連接的一串至少 兩個(gè)氨基酸殘基，可W是重組多膚、天然多膚或合成多膚。
[0055] 如本文所使用的，F(xiàn)AM96A蛋白的功能性片段、變體、衍生物和類似物可W是：一個(gè) 或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守的氨基酸殘基所取代（優(yōu)選保守的氨基酸殘基），取 代的氨基酸殘基是或不是由遺傳密碼所編碼的氨基酸；一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基帶有取代基 團(tuán)；成熟多膚與另一化合物融合在一起；一個(gè)或多個(gè)另外的氨基酸與成熟多膚相融合，諸 如幫助純化成熟蛋白的序列或蛋白原序列；在一端或兩端或內(nèi)部插入和/或添加和/或缺 失一個(gè)或多個(gè)氨基酸。從運(yùn)些公開內(nèi)容看，運(yùn)樣的片段、衍生物和類似物相信處于本領(lǐng)域技 術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
[005引如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"一致性"、"百分比一致性"、"同源性"或"同一性"指兩個(gè)氨 基酸序列之間或者核酸序列之間的序列同一性?？蒞通過(guò)比對(duì)兩個(gè)序列來(lái)確定百分比一致 性，百分比一致性指所比較的序列共有位置相同殘基（即氨基酸或核巧酸）的數(shù)量?？墒?用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)算法（例如 Smith 和 Waterman, 1981，Adv. Appl. Math. 2 :482 ;Needleman 和 Wunsch，1970, J.Mol. Biol. 48 :443 ;化arson 和 Lipman，1988, Proc.化tl. Acad. Sci.，USA， 85 :2444)或者通過(guò)運(yùn)些算法的計(jì)算機(jī)化版本（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer G;roup，575Science Drive, Madison, WI)進(jìn)行序列比對(duì) 和比較，所述計(jì)算機(jī)化版本公開可用為BLAST和FASTA。另外，通過(guò)美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院 度ethesda MD)可用的ENTREZ可用于序列比較。當(dāng)使用BLAST和缺口 BLAST程序時(shí)，可使 用各個(gè)程序（例如BLASTN，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中屯、的因特網(wǎng)站點(diǎn)上可用）的缺省參 數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用缺口權(quán)重為1的GCG來(lái)確定兩個(gè)序列的百分比同一性，使得 每個(gè)氨基酸缺口給予權(quán)重如同它是兩個(gè)序列間的單氨基酸不匹配?；蛘?，可使用ALIGN程 序（2. 0版），其是GCG(Accebys，San Diego, CA)序列比對(duì)軟件包的一部分。
[0057] "雜交"指兩個(gè)單鏈多核巧酸非共價(jià)結(jié)合W形成穩(wěn)定雙鏈多核巧酸的過(guò)程。術(shù)語(yǔ) "雜交"還可W指Ξ鏈雜交。所產(chǎn)生的（通常是）雙鏈的多核巧酸為"雜交體"或"雙鏈體"。 "雜交條件"一般包括低于約1M、更通常低于約500mM和低于約200mM的鹽濃度。雜交溫度 可W低至5°C，但通常高于約22°C，更通常高于約30°C，優(yōu)選高于約37°C。雜交通常在嚴(yán)格 條件（即探針會(huì)與其祀序列雜交的條件）下進(jìn)行。嚴(yán)格雜交條件取決于序列，并在不同的 情況下存在差異。較長(zhǎng)的片段可能需要較高的雜交溫度來(lái)進(jìn)行特異性雜交。由于其他因素 (包括互補(bǔ)鏈的堿基組成和長(zhǎng)度、有機(jī)溶劑的存在和堿基錯(cuò)配程度）可能影響雜交的嚴(yán)格 度，因此參數(shù)的組合比任何一個(gè)單獨(dú)參數(shù)的絕對(duì)值更為重要。一般而言，將嚴(yán)格條件選擇成 比確定的離子強(qiáng)度和抑下該特定序列的Tm低約5°C。示例性嚴(yán)格條件包括抑7. 0至8. 3下 至少0. 01M至不高于1M的化離子濃度（或其他鹽）和至少25°C的溫度。對(duì)于嚴(yán)格條件， 參閱女日 Sambrook，F(xiàn)ritsche 和 Maniatis. "Molecular Cloning A laboratory Manual"第 二版 Col d Spring Harbor Press (1989) W及 Anderson "Nucleic Acid Hybridization" 第一版，BIOS Scientific化blishers Limited (1999)，它們對(duì)于所有上述目的均通過(guò)參考 整體并入本文。
[0058] 藥物組合物
[0059] 本發(fā)明還提供了包含F(xiàn)AM96A蛋白（或者編碼FAM96A蛋白的核酸）的藥物組合物。 除了活性成分之外，根據(jù)本發(fā)明W及根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物可包含藥學(xué)可接受賦形 劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的物質(zhì)。運(yùn)些物質(zhì)應(yīng)為非毒性的，并且 應(yīng)不干擾所述活性成分的療效。所述載體或其它物質(zhì)的確切性質(zhì)會(huì)取決于施用途徑，所述 途徑例如可W是經(jīng)口、靜脈內(nèi)或局部。
[0060] 所述制劑可W是液體，例如含有P冊(cè).8-7. 6的非憐酸緩沖液的生理鹽溶液或者凍 干粉末。
[0060 劑量
[0062] 本文所述的FAM96A蛋白優(yōu)選W "治療有效量"或"有效量"施用給個(gè)體。所述組 合物優(yōu)選治療有效量"施用給個(gè)體，所述治療有效量或增敏有效量或有效量足W顯示其 對(duì)于所述個(gè)體的益處。施用的實(shí)際量，W及施用的速率和時(shí)間過(guò)程會(huì)取決于所治療者的自 身情況和嚴(yán)重程度。治療的處方（例如對(duì)劑量的決定等）最終是全科醫(yī)生及其它醫(yī)生的責(zé) 任并依賴其做決定，通常考慮所治療的疾病、患者個(gè)體的情況、遞送部位、施用方法W及對(duì) 于醫(yī)生來(lái)說(shuō)已知的其它因素。
[0063] 在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)AM96A蛋白的劑量范圍可W是加 g/只鼠/天至lOug/只鼠/ 天。
[0064] 施用
[0065] 本發(fā)明中的蛋白質(zhì)單獨(dú)施用，其通常包括根據(jù)施用的計(jì)劃方式所選的適合的藥物 賦形劑、稀釋劑或載體。多膚可w通過(guò)任何適合的方式適用于需要治療的患者。精確的計(jì) 量將取決于多個(gè)因素，包括該多膚精確的性質(zhì)。
[0066] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，F(xiàn)AM96A蛋白與抗炎藥或者免疫抑制藥分開施用。在 另一些實(shí)施方案中，F(xiàn)AM96A蛋白與抗炎藥或者免疫抑制藥組合施用。
[0067] 一些合適的使用方式包括（但不限于）口服、直腸、鼻部、局部（包括口腔和舌 下）、皮下、陰道或胃腸外的（包括皮下、肌肉、靜脈、皮內(nèi)、銷內(nèi)和硬腦膜外）施用。
[0068] 對(duì)于靜脈注射和在病痛位置的注射，活性成分將為一種胃腸外接受的水溶液形 式，其不含熱源并具有合適的抑值、等張性和穩(wěn)定性。
[0069] 本領(lǐng)域中相關(guān)技術(shù)人員使用，例如：等張賦形劑如氯化鋼注射液、林格氏注射液， 乳酸林格氏注射液，能夠很好的制備適合的溶液。根據(jù)要求，可W加入防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖 劑、抗氧化劑和/或其它一些添加劑?？诜┯玫乃幬锝M合物可W是片劑、膠囊、粉劑或口 服液等形式。片劑可W包括固體載體，如明膠或輔劑。液體藥物組合物通常包括液體載體， 如水、石油、動(dòng)物或植物油、礦物油或合成油。也可W包括生理鹽水溶液、葡萄糖或其它糖溶 液或二醇類，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
[0070] W上所提到的技術(shù)和方案的例子W及其它一些根據(jù)本發(fā)明所使用的技術(shù)和方案 可 W在 Remington，S Pharmaceutical Sciences，16th edition, Oslo, A. (ed)，1980.中找 到。
[0071] 實(shí)施例1、FAM96A轉(zhuǎn)基因鼠表達(dá)載體構(gòu)建
[0072] 轉(zhuǎn)基因小鼠用pCAGGS質(zhì)粒由美國(guó)范德比爾大學(xué)吳冠青教授饋贈(zèng)，PCAGGS-FAM96A 質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建，真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3. 1-Myc/化sB(-)(本論文中簡(jiǎn)稱PCDB)購(gòu)白 Invitrogen公司，其基本過(guò)程如下：設(shè)計(jì)包含化〇1酶切序列的FAM96A基因特異性引物，W PCDNA3. 1-Myc/化sB(-)質(zhì)粒為模板，克隆方案中，上下游引物具體序列分別為：
[0073] FAM96A-PCAGGS-F ：5'-CCGCTCGAGATGCTGCCGCTTCTGCT-3' ；
[0074] FAM96A-PCAGGS-R :5--CCGCTCGAGTCAATGATGATGATGATG-3-，
[007引 PCR擴(kuò)增得到的片段連同真核表達(dá)載體PCDNA3. l-myc/his(-)B采用同樣的限制 性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，切膠回收回收目的條帶?；?收的載體和PCR片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，16°C，12小時(shí)。將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，W下 為轉(zhuǎn)化過(guò)程：將連接產(chǎn)物放入感受態(tài)大腸桿菌化1-BLUE中，冰上解育半小時(shí)，然后42°C水 浴熱激90秒，LB培養(yǎng)液培養(yǎng)45分后將菌液均勻涂抹在含有氨節(jié)青霉素的固體LB培養(yǎng)板 上培養(yǎng)過(guò)夜，挑取克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。鑒定是否有插入片段、插入片段的大 小、片段插入的方向。對(duì)符合目的要求的陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI標(biāo)準(zhǔn)數(shù) 據(jù)庫(kù)中的FAM96A 0RF序列進(jìn)行比對(duì)，準(zhǔn)確無(wú)誤后進(jìn)行質(zhì)粒大量提取，質(zhì)粒線性化，定量除菌 后提供給中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所制作轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0076] 實(shí)施例2、Fam96a條件性基因敲除打祀載體構(gòu)建
[0077] 小鼠 Fam96a基因具有5個(gè)外顯子，通過(guò)在2號(hào)和3號(hào)外顯子兩側(cè)插入Loxp標(biāo)簽 構(gòu)建打祀載體，電穿孔轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性克隆，囊胚注射后得到帶有Loxp標(biāo)簽 的Fam96a-floxed小鼠。Loxp序列位于Fam96a基因第二和第Ξ外顯子兩側(cè)，中間插入肥0 新霉素篩選基因。
[0078] 實(shí)施例3、質(zhì)粒提取
[0079] 實(shí)驗(yàn)中所用質(zhì)粒均使用Qiagen Maxi純化柱制備，過(guò)程簡(jiǎn)述如下。小提純化的質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌化化lue后涂至相應(yīng)抗性的細(xì)菌培養(yǎng)皿上，14-16小時(shí)后挑單細(xì)菌菌落于 1ml抗性培養(yǎng)基中，37°C搖床（300轉(zhuǎn)/分鐘）培養(yǎng)8小時(shí)，擴(kuò)大培養(yǎng)體系至lOOmU繼續(xù)培 養(yǎng)14-16小時(shí)；6, OOOg離屯、10分鐘收獲細(xì)菌，加入lOmlPl (含0. 5mg/mL RNase)，充分重懸 后加入10ml P2,輕柔翻轉(zhuǎn)3-4次，液體澄清后加入10ml 4°C預(yù)冷的P3,輕柔翻轉(zhuǎn)3-4次， 冰浴10分鐘后20, OOOg離屯、15分鐘；用15ml地T預(yù)先平衡Qiagen純化柱，將離屯、上清 經(jīng)濾紙過(guò)濾后上柱，用30ml QC洗涂純化柱，重復(fù)1次；加入10ml QF洗脫質(zhì)粒，重復(fù)1次， 在洗脫液中加入12ml異丙醇，翻轉(zhuǎn)充分混勻后4°C離屯、30分鐘；棄上清，加入70%乙醇洗 涂，離屯、15分鐘；棄上清，空氣干燥10分鐘后加入400ul超純水，待沉淀完全溶解后移入EP 管；紫外分光光度計(jì)定量，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，高速離屯、除菌并分裝備用
[0080] 實(shí)施例4、鼠尾基因組提取W及PCR鑒定
[0081] 鼠尾裂解液配制：
[0082] 12. 5ml 20%SDS/10ml 5M 化Cl/lOml 0. 5M 邸TA/lOml 1M Tris pH 7. 6/加水定 容至500ml
[0083] 蛋白酶Κ保存液（lOmg/ml，MILI Q水配制）分裝-20保存
[0084] 鼠尾基因組提取：在剪取鼠尾的前一天配制鼠尾裂解液；編號(hào)并剪去小鼠的尾己 0. 5cm左右，放入EP管中；在每個(gè)EP管中加入上述的裂解液500ul并加入0.1 mg/ml的蛋白 酶K(化oteinase K)放入55°C水浴鍋里過(guò)夜；第二天，加入300 μ 1飽和的化C1 (35. 2g化C1 定容至100ml)，顛倒混勻6-8次，冰浴15分鐘；12000巧m，，室溫離屯、15分鐘；轉(zhuǎn)移400 μ 1 上清液至另一新的離屯、管，加入700 μ 1的異丙醇，顛倒直至形成絮狀沉淀；12000rpm室溫 離屯、15分鐘；棄掉上清，加入1ml 70%乙醇洗涂沉淀，棄除乙醇并驚干；根據(jù)得到的沉淀 (即DNA)的量加入適量的雙蒸水溶解。
[0085] FAM96A 轉(zhuǎn)基因鼠 PCR 鑒定：PCR 反應(yīng)體系：5μ1 2*TAQ-Mix，4yl 肥0,0. 2μ1 前 向引物，0. 2 μ 1反向引物，0. 6ul模板，反應(yīng)結(jié)束后取5 μ 1進(jìn)行1 %瓊脂糖電泳，如果出現(xiàn)有 條帶則表明該小鼠基因組帶有人FAM96A基因序列。
[0086] Fam96a條件性敲除鼠 PCR鑒定：Fam96a floxed小鼠基因組上帶有Loxp序列，因 此我們根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物用于檢測(cè)小鼠是否帶有Loxp序列?；痚重組酶的PCR鑒定： Fam96a基因敲除鑒定
[0087] 鼠 Fam96a共含有5個(gè)外顯子，根據(jù)敲除策略，如果該基因被敲出將缺失第2和第 3外顯子，據(jù)此設(shè)計(jì)引物可W擴(kuò)出特異大小的條帶。
[0088] 實(shí)施例5、FAM96A轉(zhuǎn)基因鼠繁殖
[0089] 小鼠編號(hào)：小鼠出生后10-12天左右采用剪趾法進(jìn)行編號(hào)，采用此方法可W編號(hào) 1-99 〇
[0090] 轉(zhuǎn)基因小贏F1代的繁殖：將FAM96A轉(zhuǎn)基因贏首建贏（founder) (FAM96A & 1、7、 17、23、66,罕5、14、22、3、65、29、54、18)分別與育齡期的野生型C57BL/6J小鼠交配，小鼠一 般在受精后19-21天分娩，據(jù)此，我們?cè)诖蠹s兩周之后觀測(cè)小鼠腹部并用指揉法判斷小鼠 的胚胎情況，如果證實(shí)確已受孕，即把雌鼠分籠。小鼠一代生育的子鼠在6-12只左右，在F1 代小鼠出生12天左右對(duì)小鼠編號(hào)并鑒定小鼠的基因型，得到FAM96A雜合子轉(zhuǎn)基因小鼠，在 4周時(shí)將新生小鼠離乳。
[00川 F2代轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育：用FI代鑒定陽(yáng)性的FAM96A雜合子小鼠進(jìn)行近親交配， 即同窩陽(yáng)性小鼠的雌雄交配，根據(jù)最適的雌雄比例（雄：雌=1 : 2)進(jìn)行，編號(hào)及鑒定方 法同F(xiàn)1代。
[009引 F2轉(zhuǎn)基因純合子小鼠的篩選：根據(jù)孟德爾遺傳定律，我們知道F2代小鼠中有一定 概率出現(xiàn)純合子，因此我們通過(guò)測(cè)交的方法來(lái)篩選F2代中的純合子小鼠，即我們把得到的 每一只FAM96A陽(yáng)性F2代小鼠與野生型的巧7BL/6J小鼠進(jìn)行交配，通過(guò)子代小鼠判斷F2 代小鼠是否為純合子，如果子代小鼠經(jīng)過(guò)PCR鑒定100%為FAM96A陽(yáng)性，則表明親代小鼠為 純合子小鼠，否則則為雜合子小鼠。PCR鑒定方法同上。
[0093] 陰性鼠的來(lái)源：把F1代小鼠中的陰性小鼠進(jìn)行交配，并大量繁殖，得到用于實(shí)驗(yàn) 對(duì)照的陰性小鼠。
[0094] 實(shí)施例6、Fam96a條件性基因敲除鼠的繁殖
[009引化e重組酶工具鼠：為了能夠在小鼠全身敲除Fam96a，我們選取了只在卵細(xì)胞表 達(dá)化e重組酶的Zp3-化e小鼠作為工具鼠。
[0096] 繁殖策略：第一步，將Fam96a floxed/-鼠與Zp3-Cre轉(zhuǎn)基因鼠雜交得到floxed 和化e雙陽(yáng)性小鼠，由于Zp3-化e只在卵細(xì)胞表達(dá)，因此只有雌性的小鼠被保留。
[0097] 第二步，將上述的雌性floxed和化e雙陽(yáng)性小鼠與雄性野生型巧7BL6/J交配，根 據(jù)遺傳規(guī)律，后代有50 %的小鼠為Fam96a+/-雜合性敲除小鼠。
[009引第Ξ步，將上述雜合敲除小鼠同窩繁殖即可得到Fam96a-/-純合敲除小鼠和同窩 的野生型小鼠。后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用小鼠均為此種繁殖方式得到的。
[0099] 實(shí)施例7、Fam96a條件性基因敲除鼠的鑒定
[0100] 小鼠組織RT-PCR檢測(cè)：分離小鼠組織300mg，置于勻漿管中，加入1ml TRIzol，勻 漿3至4次，每次20s ;4度12000g離屯、5min后吸上清，按照TRIzol說(shuō)明書所述步驟提取 總RNA，RNA定量后用化ermo化rmentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA文庫(kù)用于后續(xù)基因檢測(cè)。
[0101] 小鼠組織蛋白提取及Western blot檢測(cè)
[0102] 1)分離小鼠各器官，稱重，每lOOmg組織中加入500 μ1的RIPA裂解液（其中加入 ImM的PMS巧至勻漿管中，勻漿20S后，將勻漿管從勻漿機(jī)上取回迅速插入冰上30s W防止 蛋白降解，然后再勻漿20s。2)把組織勻漿液放入離屯、機(jī)1200化pm，4°C，20分鐘，小屯、吸取 上清液至另一離屯、管中。
[0103] 3)蛋白定量：按BCA定量試劑盒說(shuō)明書提供的方法進(jìn)行蛋白定量。
[0104] 4)收集上一步的組織勻漿液上清，加入SDS加樣緩沖液（β琉基乙醇，甘油， 20%505,0.1漠酪藍(lán)），99°(：保溫10分鐘，離屯、后取上清，12.5%的不連續(xù)聚丙締酷 胺凝膠電泳，電泳分離蛋白樣品后，用1〇〇ν，1.5小時(shí)，濕法電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上， W TBSTUris-肥1，化C1，0. 1 % Tween-20)配制5 %脫脂牛奶，4 °C封閉2小時(shí)后，與 一抗結(jié)合4°C過(guò)夜，之后用TBST震蕩洗膜Ξ次，每次10分鐘，再加入相應(yīng)的IRDyeTM 800/700conjugated二抗避光反應(yīng)一小時(shí)，TBST重復(fù)洗膜Ξ次，然后用Odyssey Imaging System儀器掃描成像分析。
[0105] 流式細(xì)胞術(shù)分析
[0106] 小鼠細(xì)胞的獲取
[0107] 1) PC (腹腔細(xì)胞）
[010引準(zhǔn)備：冰PBS20ml ; 10ml針筒；26號(hào)針頭，尖吸管，眼科剪，眼科綴。
[0109] 將小鼠安樂(lè)死，吸入5-lOml PBS到針筒中，安裝上針頭注入小鼠腹腔內(nèi)，按摩 2mins。在小鼠下腹部開一小口，用眼科綴夾住開口的邊沿提起腹壁，防止液體流出，將尖吸 管伸入腹腔吸出打入的PBS，轉(zhuǎn)移到15ml離屯、管中。
[0110] 。脾臟
[0111] 準(zhǔn)備：6cm培養(yǎng)皿中加入5mll640培養(yǎng)基，200目篩網(wǎng)，無(wú)菌玻璃試管。
[0112] 取出脾臟至篩網(wǎng)上，用無(wú)菌玻璃試管搗碎研磨，1640沖洗幾遍轉(zhuǎn)移到15ml離屯、管 中。加入5ml培養(yǎng)基沖洗一遍，轉(zhuǎn)移到15ml離屯、管中，共10ml。1200巧m 40C離屯、5min。吸 掉上清，加入紅細(xì)胞裂解液2ml，室溫2min，加入10ml培養(yǎng)基中和。1200巧m 4oC離屯、5min。 吸掉上清，用10ml培養(yǎng)基重懸，通過(guò)200目篩網(wǎng)轉(zhuǎn)移至新15ml離屯、管中。
[011引扣骨髓
[0114] 準(zhǔn)備：1ml針筒、針頭、6cm培養(yǎng)皿中加入5mll640培養(yǎng)基，眼科剪，眼科綴。
[0115] 眼科剪分離腿部肌肉，完整取出股骨，剪斷股骨下端的盲端，吸入1ml培養(yǎng)基于 1ml注射器內(nèi)，用注射器針頭在股骨大轉(zhuǎn)子和小轉(zhuǎn)子之間鉆孔，鉆穿后向髓腔注入培養(yǎng)基， 將骨髓吸入6cm培養(yǎng)皿中，至股骨變白。吹打骨髓細(xì)胞使之成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 15ml離屯、管，120化pm 4oC離屯、5min。吸掉上清，加入紅細(xì)胞裂解液2ml，吹打到無(wú)大塊沉 淀，加入10ml培養(yǎng)基混勻。1200巧m 40C離屯、5min吸掉上清，用7ml培養(yǎng)基重懸，通過(guò)200 目篩網(wǎng)轉(zhuǎn)移至新15ml離屯、管中。
[011引 4)胸腺
[0117] 準(zhǔn)備：6cm培養(yǎng)皿中加入5mll640培養(yǎng)基，200目篩網(wǎng)，眼科剪，眼科綴，玻璃試管。
[0118] 將小鼠安樂(lè)死，取出胸腺，至200目篩網(wǎng)上，用玻璃試管搗碎研磨，用1640沖洗篩 網(wǎng)然后轉(zhuǎn)移到15ml離屯、管中。1200巧m 40C離屯、5min。吸掉上清，加入紅細(xì)胞裂解液2ml， 室溫2min，加入10ml培養(yǎng)基中和。1200巧m 4oC離屯、5min。吸掉上清，用10ml培養(yǎng)基重 懸，通過(guò)200目篩網(wǎng)轉(zhuǎn)移至新15ml離屯、管中。
[0119] 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)
[0120] 膜表面分子的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：收獲上述需要染色的細(xì)胞，用PBS洗涂1次；加 入100 μ 1封閉液（2. 5% FBS/PB巧，4°C封閉30分鐘；加入PBS，離屯、洗一遍，隨后加入巧光 素標(biāo)記抗體，4°C避光解育30min ;使用巧光素標(biāo)記的相應(yīng)IgG作為同型對(duì)照。最后用PBS 洗涂?jī)纱魏?，?00 μ 1 PBS重懸，通過(guò)流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞，使用Flow化軟件對(duì)結(jié)果進(jìn) 行分析。抗體配在封閉液中，所有步驟和試劑均保持在4°C。胞內(nèi)分子流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)： 將上述需要檢測(cè)的細(xì)胞按1X106每孔鋪到12孔板內(nèi)，加入10化g/ml PMA和lOOOng/ml ;[0]1〇1]17(^]1，同時(shí)加入1〇11旨/1]111^^4培養(yǎng)化后收集細(xì)胞，用？135洗兩遍，4%多聚甲醒固定 30min，然后用打孔封閉液打孔30min，隨后加入巧光標(biāo)記的流式抗體4°C避光解育半小時(shí)， PBS洗兩遍，用lOOul PBS重懸細(xì)胞，然后流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞，使用Flow化軟件分析數(shù)據(jù)。
[0121] 肥染色
[012引1)將小鼠安樂(lè)死，分離小鼠各器官組織，W中性甲酸液固定組織，石蠟包埋切片， 常規(guī)脫蠟至水。，
[0123] 2)流水沖洗化nin，蘇木紫染5min，流水沖洗Imin。
[0124] 3)0. 5 %鹽酸乙醇分化30s，流水沖洗。
[0125] 4)95%酒精1111111，伊紅染色1111111。
[0126] 5)70%、85%、95% . 100%酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。
[0127] 實(shí)施例8、FAM96A分泌驗(yàn)證及原核蛋白的載體構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白純化
[0128] 將肥K293T細(xì)胞鋪如6孔板，待培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)其后，準(zhǔn)備PCDA3. 1-FAM96A-His 質(zhì)粒，用Vigo化ct轉(zhuǎn)染細(xì)胞。6小時(shí)后換成無(wú)血清的肥KG條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4她， 然后收集上清，用0. 45陽(yáng)的濾器過(guò)濾后，免疫印跡法檢測(cè)上清中FAM96A的表達(dá)情況。
[0129] FAM96A原核表達(dá)載體陽(yáng)T32a-GST-FAM96A的構(gòu)建：
[0130] 使用帶化〇1的上游引物和帶化ndlll的下游引物從人cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增 FAM96A (帶信號(hào)膚），產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后連入pGEM-Teasy T載體，連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化大腸桿菌化-IBlue，藍(lán)白斑篩選，挑選白色菌落，并測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤。再使用化〇1， HinduI酶切構(gòu)建好的pGEM-Teasy-FAM96A質(zhì)粒，釋放FAM96A片段，電泳，回收純化后，分別 連接至化〇I，HindIII酶切的陽(yáng)T32a載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌化-1B1 μ e，酶切鑒定 陽(yáng)性克隆，測(cè)序驗(yàn)證，獲得陽(yáng)T32a-GST-FAM96A質(zhì)粒。FAM96A上游引物：5' -CTCGAGATGGACC TTCTTCAGTTCCTG-3'，下游引物：5' -AAGCTTCGCAACTCAGACTGGGATCTTGAA-3'。擴(kuò)增條件為： 94°C 巧min) - 94°C (30s)，56°C (30s)，72°C (30s)，擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)一 72°C (7min)。
[0131] riiFAM96A蛋白原核表達(dá)及純化
[0132] 基本步驟如下：
[0133] 1、1L無(wú)菌搖瓶，加入含Amp的LB (Amp終濃度為lOOug/ml)培養(yǎng)基200ml。
[0134] 2、Wl : 100的比例加入活化的菌種，220rmp，37°C，振蕩培養(yǎng)大約2h。檢測(cè)0D600 值，在0. 6-0. 8之間。加誘導(dǎo)劑IPTG (終濃度為0. 2mM)，30°C，220巧m振蕩培養(yǎng)化。
[0135] 3、收集菌液，冰上超聲裂解細(xì)菌，提取蛋白。
[0136] 4、將細(xì)菌裂解液穿過(guò)谷脫甘膚偶聯(lián)的se地arose 4B柱料，在紫外分光光度計(jì)的 監(jiān)控下先用PBS洗去未結(jié)合和非特異結(jié)合的雜蛋白，直到吸光度值不再變化為止。
[0137] 5、向柱料中加入凝血酶，4°C，酶切24h。
[0138] 6、分別用PBS和G甜進(jìn)行洗脫，分別得到FAM96A-V1和GST蛋白。
[0139] 7、用DEAE Se地arose去除內(nèi)毒素，采用PBS緩沖系統(tǒng)，平衡柱料至抑值7. 4,然后 將柱料和上述得到的FAM96A-V1蛋白結(jié)合，再用不同濃度的氯化鋼和谷脫甘膚洗脫。
[0140] 實(shí)施例9、FAM96A轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體構(gòu)建
[0141] 轉(zhuǎn)基因小鼠用pCAGGS質(zhì)粒由美國(guó)范德比爾大學(xué)吳冠青教授饋贈(zèng)，PCAGGS-FAM96A 質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建，真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3. 1-Myc/化sB(-)(本論文中簡(jiǎn)稱PCDB)購(gòu) 自Invitrogen公司，其基本過(guò)程如下：設(shè)計(jì)包含化〇1酶切序列的FAM96A基因特異性 引物，WpcDNA3. 1-Myc/化sB(-)質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到的片段連同真核表達(dá)載體 PCDNA3. l-myc/his(-)B采用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電 泳進(jìn)行分離，切膠回收回收目的條帶?；厥盏妮d體和PCR片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接， 16°C，12小時(shí)。將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，W下為轉(zhuǎn)化過(guò)程：將連接產(chǎn)物放入感受態(tài)大腸桿菌 XL1-BLUE中，冰上解育半小時(shí)，然后42°C水浴熱激90秒，LB培養(yǎng)液培養(yǎng)45分后將菌液均 勻涂抹在含有氨節(jié)青霉素的固體LB培養(yǎng)板上培養(yǎng)過(guò)夜，挑取克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行 鑒定。鑒定是否有插入片段、插入片段的大小、片段插入的方向。對(duì)符合目的要求的陽(yáng)性克 隆進(jìn)行質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)中的FAM96A 0RF序列進(jìn)行比對(duì)，準(zhǔn)確無(wú)誤后 進(jìn)行質(zhì)粒大量提取，質(zhì)粒線性化，定量除菌后提供給中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 制作轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0142] 小鼠骨髓來(lái)源巨隧細(xì)胞度MDM)的誘導(dǎo)：
[0143] 1、準(zhǔn)備無(wú)血清的RPMI1640和56°C滅活過(guò)的胎牛血清，常規(guī)配置培養(yǎng)基。
[0144] 2、按照第一部分所述方法分離小鼠股骨及腔骨，收集骨髓細(xì)胞，裂解紅細(xì)胞。
[0145] 3、骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至每毫升1 X 107個(gè)細(xì)胞，接種細(xì)胞質(zhì)25cm細(xì)胞培 養(yǎng)瓶，加入終濃度為lOng/ml的GM-CSF放入5 % C02細(xì)胞培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)7天，中間第Ξ天 更換含有GM-CSF的新鮮培養(yǎng)基。
[0146] 4、7天后收集細(xì)胞，CDUb，F(xiàn)4/80流式檢測(cè)細(xì)胞分化情況。
[0147] 小鼠腹腔巨隧細(xì)胞的分離
[0148] 第一天，每只小鼠腹腔注射無(wú)菌的β琉基乙酸肉湯2ml。
[0149] 第Ξ天，放血處死小鼠，向腹腔內(nèi)注射5ml冰浴過(guò)的PBS，并按摩腹腔50下左右。
[0150] 在下腹部開一小口，用綴子提起腹壁防止液體流出，用尖吸管伸入腹腔小屯、的吸 出腹腔灌洗液，將液體吸入15ml離屯、管。
[0151] 300g離屯、5min，棄上清，如有紅細(xì)胞，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞。
[0152] 用含10% 56°C滅活的胎牛血清（FB巧的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪入60mm 直徑細(xì)胞培養(yǎng)皿中，靜置化使巨隧細(xì)胞貼壁。
[0153] 用尖吸管吸走未貼壁的懸浮細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮刀輕輕將巨隧細(xì)胞 刮下來(lái)，計(jì)數(shù)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
[0154] 實(shí)施例10、FAM96A在免疫系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，LI^刺激后內(nèi)源性表達(dá)下調(diào)
[0155] 用Clontech公司的免疫組織cDNA為模板，rea]_-time PCR對(duì)FAM96A的轉(zhuǎn)錄本進(jìn) 行擴(kuò)增，結(jié)果表明FAM96A廣泛表達(dá)在免疫系統(tǒng)各個(gè)組織中，其中胎肝表達(dá)量最高，骨髓，胸 腺，白細(xì)胞，淋己結(jié)和脾都有比較均一的相對(duì)低水平的表達(dá)，但是，F(xiàn)AM96A在炎性環(huán)境中的 表達(dá)變化仍不清楚。我們?cè)赥HP1細(xì)胞中加入10化g/ml的LPS，分別于刺激化、1化、24h后 收集細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，realtime PCR結(jié)果顯示FAM96A的轉(zhuǎn)錄被明顯的抑制；同時(shí)用 貼壁法純化了小鼠腹腔巨隧細(xì)胞，分別加入LPS、polyl :C刺激化后發(fā)現(xiàn)Fam96a的轉(zhuǎn)錄也 被抑制。在人的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)加入PMA分別刺激化、1化后發(fā)現(xiàn)FAM96A的表 達(dá)量明顯降低，最后在人肺上皮A549細(xì)胞中加入IL-10后也得出類似的結(jié)論。W上數(shù)據(jù) 說(shuō)明，F(xiàn)AM96A廣泛表達(dá)在免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞中，在抗原和炎性細(xì)胞因子刺激下其表達(dá)明 顯下調(diào)，提示FAM96A在炎癥反應(yīng)尤其是固有免疫免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過(guò)程中可能發(fā)揮重 要的作用。
[0156] 實(shí)施例11、檢測(cè)腹腔巨隧細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA和蛋白水平的表達(dá)
[0157] 將分離的腹腔巨隧細(xì)胞鋪入12孔板，每孔鋪IX 106個(gè)細(xì)胞。
[015引每孔加入濃度為10化g/ml的LI^刺激化后收集細(xì)胞。
[0159] 運(yùn)用QIAGEN公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒，按照操作手冊(cè)提取RNA。
[0160] RNA定量，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一條鏈。
[016。 qPCR儀檢測(cè)目的基因表達(dá)。
[0162] LPS刺激細(xì)胞20小時(shí)收集培養(yǎng)上清，ELISA檢測(cè)IL-6, TNF- α，比-10等細(xì)胞因 子的表達(dá)情況，步驟如下：100 μ 1包被抗體（cap化re antibody)包被過(guò)夜；PBST(0. 05% Tween/PBS，v/v)洗五遍；200 μ 1 封閉液（1 Xassay diluent)封閉，室溫 1 小時(shí)；PBST 洗五遍；加入100 μ 1細(xì)胞培養(yǎng)上清，室溫解育2小時(shí)；PBST洗五遍；100 μ 1檢測(cè)抗體 化iotin-detection antibody)，室溫解育 2 小時(shí)；PBST 洗五遍；100 μ 1 Avidin-HRP，室溫 解育1小時(shí)；PBST洗五遍；加入50 μ 1TMB顯色5分鐘，50 μ 1 2M肥S04終止；酶標(biāo)儀測(cè)定 0D490-570。每個(gè)樣本設(shè)立Ξ個(gè)復(fù)孔。ELISA試劑盒購(gòu)于eBIOSCIENCE公司。
[0163] 實(shí)施例12、FAM96A基因敲除鼠在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中癥狀明顯加重
[0164] 葡聚糖硫酸鋼（dextran sulfate sodium, DS巧具有抗止血和抗凝血作用，能夠 影響腸上皮的通透性，導(dǎo)致腹瀉W及腸道菌群移位及腸道潰瘍的發(fā)生。其誘導(dǎo)的動(dòng)物模型， 在臨床表現(xiàn)、病理學(xué)改變與人類炎癥性腸病極為相似，被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性I抓研究。3% DSS在飲水中供給實(shí)驗(yàn)小鼠，持續(xù)給藥6-10天，每天定時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠的體重變化、糞便狀態(tài)和 直腸出血，并按照
[0165] W下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分記錄。
[0166] 糞便狀態(tài)（Stool) :0-正常：2軟便；4-水樣腹瀉。
[0167] 直腸出血度leeding) :〇-正常；2-可見(jiàn)血便；4-直腸出血
[016引根據(jù)每天的體重和腹瀉血便情況計(jì)算出小鼠每天的疾病活動(dòng)指數(shù)，W此來(lái)判斷小 鼠腸炎的嚴(yán)重程度。計(jì)算方法如下：0 :無(wú)體重減輕，正常糞便，無(wú)血便；1 :體重減輕1-3% ; 2 :3-6%體重減輕，松軟變，肉眼血便；3 :體重減輕6-9% ;4 :> 9%體重減輕，腹瀉，和大量 出血。指數(shù)評(píng)分最高12分。
[0169] 持續(xù)觀測(cè)到第6~10天后取小鼠結(jié)腸進(jìn)行組織化學(xué)檢測(cè)（H&E)，觀察炎性浸潤(rùn)程 度W及結(jié)直腸表面的潰瘍形成，并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。同時(shí)記錄小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度作為結(jié)腸炎嚴(yán) 重程度的指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0170] 實(shí)施例13、人FAM96A轉(zhuǎn)基因鼠在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中癥狀明顯減輕
[0171] 使用實(shí)施例6的方法誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型，人FAM96A轉(zhuǎn)基因鼠的癥狀明顯減輕
[0172] 實(shí)施例14、人重組FAM96A蛋白在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中具有明顯的保護(hù)作 用
[0173] DSS水飼飲小鼠，分3組，腹腔注射，煮沸的人重組FAM96A蛋白作為對(duì)照，人重組 FAM96A蛋白的小鼠按注射的不同劑量分兩組，50ug/只/天，lOOug/只/天。連續(xù)7天，結(jié) 果表明人重組FAM96A蛋白在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中具有明顯的保護(hù)作用。
[0174] 實(shí)施例15、LPS刺激K0鼠腹腔巨隧細(xì)胞后，TH17相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)
[0175] 前述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FAM96A在炎性刺激條件下表達(dá)下調(diào)，為了探討Fam96a在炎癥反 應(yīng)過(guò)程中的作用，我們分別分離Fam96a+/+和Fam96a-/-小鼠腹腔巨隧細(xì)胞，在體外加入 lOOng/ml LI^刺激化后收集細(xì)胞，提取RNA，用qPCR檢測(cè)巨隧細(xì)胞中細(xì)胞因子和趨化因子 的表達(dá)情況。通過(guò)篩查發(fā)現(xiàn)Fam96a-/-巨隧細(xì)胞中11-1 β，11-6, 11-23表達(dá)量明顯下調(diào)， 其中11-6和11-23尤為明顯；而與化1細(xì)胞分化密切相關(guān)的細(xì)胞因子11-12沒(méi)有明顯變 化，同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)對(duì)趨化中性粒細(xì)胞有重要趨化作用的趨化因子Cxcll也有明顯下調(diào)， 但Ccl20, Mcp-1沒(méi)有明顯變化，與巨隧細(xì)胞極化相關(guān)的分子iNOS和Argl也沒(méi)有明顯變化
[0176] 實(shí)施例16、DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型組織學(xué)評(píng)分
[0177] 結(jié)腸 H&E染色：將小鼠安樂(lè)死，分離小鼠結(jié)腸組織，在靠近肛口處去一段1cm左 右組織，W中性甲酸液固定組織，石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟至水，流水沖洗化nin，蘇木紫染 5min，流水沖洗Imin。
[0178] 0. 5%鹽酸乙醇分化30s，流水沖洗。95%酒精I(xiàn)min，伊紅染色I(xiàn)min。70%、85%、 95% . 100%酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。結(jié)腸標(biāo)本組織學(xué)評(píng)分有專業(yè)的病理學(xué) 專家來(lái)完成，參考文獻(xiàn)中的評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)分。組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：〇,正常組織，無(wú)組織損 傷；1，腸上皮輕微損傷無(wú)潰瘍2,粘膜局部發(fā)生潰瘍；3,深度潰瘍。炎性細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)： 0 :散在的少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；1 :粘膜固有層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；2 :成片狀分布的炎性細(xì)胞浸潤(rùn) 至粘膜下層；3 :炎性細(xì)胞深度浸潤(rùn)，進(jìn)入肌層。
[0179] 實(shí)施例17、結(jié)腸組織RT-PCR檢測(cè)
[0180] 分離小鼠結(jié)腸組織，沿長(zhǎng)軸剪開，用冰PBS徹底洗凈后，與每只小鼠結(jié)腸組織同 一位置剪1cm左右結(jié)腸組織，放入無(wú) RNAase的勻漿管中，每管加入1ml TRIzol，勻漿30s 后置于冰上冷卻后，重復(fù)幾次，直至勻漿完全為止。勻漿后離屯、取上層粉紅色液體，按照 TRIzol說(shuō)明書所述操作步驟提取總RNA，RNA定量后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一條 鏈，rea^timePCR檢測(cè)目的基因表達(dá)。
[0181] 實(shí)施例18、結(jié)腸組織中炎性細(xì)胞因子檢測(cè)
[0182] 3% DSS水喂養(yǎng)小鼠6-8天后，處死小鼠，分離小鼠結(jié)腸組織，沿結(jié)腸長(zhǎng)軸剪開，用 無(wú)菌冰浴PBS洗凈腸內(nèi)容物，將結(jié)腸組織剪成5mm左右的小段，加入含有2%青霉素和鏈霉 素的無(wú)血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24后，離屯、收集培養(yǎng)上清，放入-80°C冰箱保存W備化ISA 檢測(cè)炎性細(xì)胞因子。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 人類基因 FAM96A及其編碼蛋白在制備用于治療受試者急、慢性炎癥藥物的用途，其 中所述多肽選自下組： (1) 具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽；或（2)包含與SEQ ID NO :2所述氨基 酸序列有至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或97 %同源性的氨基酸序列的多肽，其具 有與（2)所述多肽基本相同的生物學(xué)功能或活性；或 (2) 所述多肽的功能性片段、變體、類似物或衍生物，它們具有與（2)所述多肽基本相 同的生物學(xué)功能或活性。2. 權(quán)利要求1的用途，其中所述多核苷酸包括： (1)編碼SEQ ID No :1所示氨基酸序列的核苷酸序列；（2)在嚴(yán)格條件下與（1)所述 的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或（1)所示核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %或97 % -致性的核苷酸序列。3. 人類基因 FAM96A及其編碼蛋白的新應(yīng)用在制備用于受試者自身免疫病的藥物和免 疫調(diào)節(jié)的用途，其中所述多肽選自下組： (1) 具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽；或（2)包含與SEQ ID NO :2所述氨基 酸序列有至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或97 %同源性的氨基酸序列的多肽，其具 有與（2)所述多肽基本相同的生物學(xué)功能或活性；或 (2) 所述多肽的功能性片段、變體、類似物或衍生物，它們具有與（2)所述多肽基本相 同的生物學(xué)功能或活性。4. 權(quán)利要求3的用途，其中所述多核苷酸包括： (1)編碼SEQ ID No :1所示氨基酸序列的核苷酸序列；（2)在嚴(yán)格條件下與（1)所述 的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或（1)所示核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %或97 % -致性的核苷酸序列。5. -種治療急、慢性炎癥藥物組合物，該藥物組合物包含人類基因 FAM96A氨基酸序列 或編碼該序列的多核苷酸序列，以及一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑；其中所述多 肽選自下組： (1) 具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽；或（2)包含與SEQ ID NO :2所述氨基 酸序列有至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或97 %同源性的氨基酸序列的多肽，其具 有與（2)所述多肽基本相同的生物學(xué)功能或活性；或 (2) 所述多肽的功能性片段、變體、類似物或衍生物，它們具有與（2)所述多肽基本相 同的生物學(xué)功能或活性。6. 權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述多核苷酸包括： (a)編碼SEQ ID No :1所示氨基酸序列的核苷酸序列；（2)在嚴(yán)格條件下與（1)所述 的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或（1)所示核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %或97 % -致性的核苷酸序列。7. -種治療自身免疫病和免疫調(diào)節(jié)的藥物組合物，該藥物組合物包含人類基因 FAM96A的氨基酸序列或編碼該序列的多核苷酸序列，以及一種或多種藥學(xué)可接受的載體或 賦形劑；其中所述多肽選自下組： (1)具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽；或（2)包含與SEQ ID NO :2所述氨基 酸序列有至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或97 %同源性的氨基酸序列的多肽，其具 有與（2)所述多肽基本相同的生物學(xué)功能或活性；或 (2)所述多肽的功能性片段、變體、類似物或衍生物，它們具有與（2)所述多肽基本相 同的生物學(xué)功能或活性。8.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述多核苷酸包括： (1)編碼SEQ ID No :1所示氨基酸序列的核苷酸序列；（2)在嚴(yán)格條件下與（1)所述 的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或（1)所示核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %或97 % -致性的核苷酸序列。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK105879054SQ201410497615
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年9月26日
【發(fā)明人】王露, 馬大龍, 羅陽(yáng), 尹昂
【申請(qǐng)人】北京大學(xué)