一種羽毛角蛋白接枝海藻酸海綿敷料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種生物相容性羽毛角蛋白接枝海藻酸鈉海綿敷料的制備方法。該方法以羽毛角蛋白、海藻酸鈉為原料，對羽毛角蛋白進(jìn)行預(yù)處理后與海藻酸鈉進(jìn)行接枝，然后加入縮合劑、增塑劑和無機(jī)交聯(lián)劑，反應(yīng)一段時(shí)間后在避光條件下用蒸餾水透析，冷凍干燥，得到羽毛角蛋白接枝海藻酸的羽毛角蛋白基生物外敷材料。該海綿敷料具有多級片層微孔結(jié)構(gòu)，質(zhì)地柔軟，可快速吸水溶脹，吸收傷口滲出液，保持創(chuàng)面透氣性；且海綿敷料的吸收性能具有鹽敏感性，對小分子藥物可實(shí)現(xiàn)緩釋效果，并具有一定的抑菌性能，可應(yīng)用于燒傷、機(jī)械損傷等多種類型皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)，有望作為一種新型功能化的生物外敷材料在醫(yī)藥領(lǐng)域得到應(yīng)用。
【專利說明】
一種羽毛角蛋白接枝海藻酸海綿敷料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的制備方法，主要用于燒傷、機(jī)械損傷等多種類型皮膚創(chuàng)傷的殺菌消炎和外敷材料。
【背景技術(shù)】
[0002]海綿材料具有特殊的多孔結(jié)構(gòu)，這使其具有很強(qiáng)的吸收性能，當(dāng)與創(chuàng)傷表面接觸時(shí)，血液和滲出液被海綿的毛細(xì)孔吸收，并向海綿內(nèi)部轉(zhuǎn)移，從而避免傷口長時(shí)間浸泡在血液和滲出液中，防止傷口潰爛。另一方面，吸入海綿材料內(nèi)部的滲出液不易揮發(fā)，且能保持創(chuàng)面的氣體通透性，這能提供一個(gè)適宜的濕潤環(huán)境，加速創(chuàng)面肉芽組織的生長，促進(jìn)創(chuàng)面快速愈合。因此海綿材料非常適合用于制作醫(yī)用外敷材料，而且工藝流程短，成本也較低。
[0003]近年來，通過冷凍干燥法，已經(jīng)制備了多種海綿外敷材料。如:用碘化殼聚糖制備的海綿敷料，其兼具殼聚糖的止血、防黏連，碘的廣譜高效殺菌和海綿高吸收性和保濕透氣性(李冉冉等，中國發(fā)明專利CN104610568 A);通過將殼聚糖、膠原和海藻酸鈣復(fù)合，制備的生物敷料具有促進(jìn)傷口愈合的活性功能及止血作用，其生物相容性好，粘附性強(qiáng)，可廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷、燒傷創(chuàng)面的處理(中國發(fā)明專利CN 1380109 A);由鮭魚膠原，羧甲基殼聚糖，明膠和羧甲基纖維素鈉制備的一種改性復(fù)合海綿敷料，其具有生物相容性，吸水性、透氣性、保濕性均較好，有利于傷口愈合(中國發(fā)明專利CN 104524620 A);以明膠為原料，采用冷凍干燥方法制備的創(chuàng)面止血與修復(fù)效果較好，價(jià)格較低的醫(yī)用膠原海綿材料(中國發(fā)明專利CN 1416907 A);以甲殼胺、膠原和甘油為原料，通過冷凍干燥法制備的一種生物復(fù)合的海綿醫(yī)用敷料(中國發(fā)明專利CN 1425471 A)。
[0004]隨著大眾生活水平的提升，患者和醫(yī)生對于創(chuàng)傷處理和愈合過程的有效性、適用性、易操作性乃至舒適性的要求也不短提升。因此關(guān)于外敷材料的研制也隨之成為研究的熱點(diǎn)。外敷材料不僅能夠覆蓋創(chuàng)面、起到暫時(shí)的阻隔作用從而避免傷口受到進(jìn)一步的傷害和感染，同時(shí)也能夠吸收傷口滲出液，保持創(chuàng)面氣體交換，創(chuàng)造出適宜的濕潤環(huán)境，促進(jìn)傷口愈合。
[0005]海藻酸鈉是一種具有生物相容性的大分子多糖，也是一類無毒的、線性的聚糖醛酸類天然高分子電解質(zhì)。海藻酸和二價(jià)金屬離子通過離子鍵形成的不溶于水的鹽，在與血液或滲出液接觸時(shí)，其中的鈉離子會(huì)與金屬離子發(fā)生離子交換，生成水溶性的海藻酸鈉，這在一定程度上促進(jìn)了傷口的愈合，但敷料的外形會(huì)很快被破壞，給傷口的后續(xù)處理帶來麻煩，這也是目前醫(yī)用海藻酸鹽敷料普遍存在的問題。因此，將羽毛角蛋白與海藻酸鈉通過共價(jià)鍵進(jìn)行接枝，可以改善材料的力學(xué)性能、耐水性、成形性和生物相容性，因而拓展角蛋白及材料的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的是提供一種羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的制備方法。
[0007]—、羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的制備將羽毛角蛋白按1:4?1:20 g/mL的固液比溶于分散液中，形成羽毛角蛋白溶液;將海藻酸鈉按1:4?1:20 g/mL的固液比溶于蒸餾水后加入到上述羽毛角蛋白溶液中，室溫?cái)嚢柘禄旌暇?；加入縮合劑，攪拌0.5?2 h;再加入縮合助劑，并調(diào)節(jié)體系pH值至4?7，攪拌I?5h;然后加入增塑劑和無機(jī)交聯(lián)劑，繼續(xù)攪拌0.5?2 h;反應(yīng)結(jié)束后，在避光條件下用蒸餾水透析20?24 h，冷凍干燥，得到羽毛角蛋白接枝海藻酸的羽毛角蛋白基生物外敷材料。
[0008]原料羽毛角蛋白為從廢棄家禽羽毛中提取的羽毛角蛋白，其提取工藝見CN200810150653.2, CN 201010161425.2。羽毛角蛋白與海藻酸鈉的質(zhì)量比為1:1?1:5。
[0009]分散液為濃度為0.8?8 mol/L尿素溶液或稀堿溶液，如氫氧化鈉、氫氧化鉀溶液等。
[0010]縮合劑采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽;縮合劑的加入量為羽毛角蛋白質(zhì)量的0.1?1.0倍。
[0011 ]縮合助劑采用N-羥基琥珀酰亞胺;縮合助劑的加入量為羽毛角蛋白質(zhì)量的0.05?
0.5倍。
[0012]增塑劑為甘油、乙二醇、山梨糖醇、麥芽糖醇中的至少一種；增塑劑的加入量為羽毛角蛋白質(zhì)量的0.3?3倍。
[0013]無機(jī)交聯(lián)劑為氯化鈣或氯化鎂;無機(jī)交聯(lián)劑的加入量為羽毛角蛋白質(zhì)量的0.02?I倍。
[0014]二、羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的結(jié)構(gòu)表征
下面通過紅外光譜、熱分析、掃描電鏡等現(xiàn)代儀器手段對其結(jié)構(gòu)與微結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征與分析。
[0015]1、宏觀形貌
圖1為本發(fā)明制備的羽毛角蛋白接枝海藻酸海綿敷料的宏觀形貌。可以看出，羽毛角蛋白接枝海藻酸海綿敷料為海綿狀固體材料，且具有優(yōu)異的柔韌性。
[0016]2、紅外譜圖分析
圖2為本發(fā)明制備的羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的紅外譜圖。該紅外譜圖中，在1654 cm^a535 cm^U224 cm—1附近出現(xiàn)了蛋白的特征吸收峰(酰胺1、I1、III帶)。在1400 cm—1處出現(xiàn)海藻酸鈉中羧酸根產(chǎn)生的對稱伸縮振動(dòng)峰，說明羽毛角蛋白與海藻酸已成功接枝。
[0017]3、熱重分析
采用熱重分析(TG)(N2保護(hù);升溫范圍:25°0800°C;升溫速度:10°C/min)測試了其熱穩(wěn)定性(圖3)。結(jié)果表明，羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的主要失重區(qū)間為200t>400°C、400°C>74(rC，與原料羽毛角蛋白、海藻酸鈉相比，熱穩(wěn)定性大幅度提高。
[0018]4、掃描電鏡分析
圖4為羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的掃描電鏡圖。由圖4可以看出，羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的內(nèi)部有多級片層，且具有大小不一、連通的孔隙結(jié)構(gòu)，孔徑為50?ΙΟΟμπι。這種結(jié)構(gòu)可以快速吸收傷口滲出液，保持創(chuàng)面干燥，也能有利于水蒸氣的透過；同時(shí)也有利于藥物的負(fù)載，使海綿敷料具有良好的載藥性能。
[0019]三、羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的性能
下面考察本發(fā)明制備的羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的吸水性能、吸鹽性能、保水性能、水蒸氣透過性、抗菌性和體外藥物釋放行為。
[0020]1、吸水性能和吸鹽溶液性能
為了評價(jià)羽毛角蛋白接枝海藻酸海綿敷料作為生物醫(yī)用外敷材料的適合性，測試了室溫(25°C)下，海綿敷料的吸水性能(圖5)和吸鹽溶液性能(圖6)。結(jié)果表明:羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料對水的吸收量達(dá)到50%以上，其溶脹率達(dá)到2400%。在鹽溶液中的溶脹率達(dá)到950%，吸收鹽溶液量超過40%。表明羽毛角蛋白接枝海藻酸海綿敷料具有優(yōu)異的吸收能力，且對鹽溶液較為敏感，完全可以滿足其在醫(yī)用外敷材料中的應(yīng)用。
[0021]2、保水性能和水蒸氣透過性能
羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的保水性能測試結(jié)果見圖7。發(fā)現(xiàn)該生物海綿敷料的保水率達(dá)到1130%。表明羽毛角蛋白接枝海藻酸海綿敷料能為傷口愈合創(chuàng)造適宜的濕潤環(huán)境，促進(jìn)傷口快速愈合。
[0022]羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的水蒸氣透過性能測試結(jié)果見圖8。發(fā)現(xiàn)該生物海綿敷料的水蒸氣透過量為153 g.m—2.h—1，與空白組(193.8 g.m—2.h—工)接近，表明該海綿敷料能保持水分和空氣通透，消除創(chuàng)面異味，避免傷口積液，促進(jìn)愈合。
[0023]3、抗菌性能
以羽毛角蛋白接枝海藻酸海綿敷料為藥物載體，選用廣譜抗菌藥物(苯扎氯銨)，考察了海綿敷料的抗菌性能。采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基是一種常用的固體培養(yǎng)基，宜培養(yǎng)酵母菌、霉菌等。)進(jìn)行抗菌活性測試。在培養(yǎng)皿中，分三個(gè)區(qū)域，以濾紙作為基底，在濾紙上分別涂覆馬鈴薯培養(yǎng)基(A)、馬鈴薯培養(yǎng)基與加未加苯扎氯銨溶液的海綿敷料(B)，第三個(gè)區(qū)域是馬鈴薯培養(yǎng)基與加入苯扎氯銨溶液的海綿敷料(C)。將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱后，觀察三個(gè)區(qū)域的情況并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)72 h后，空白組(A)處開始出現(xiàn)少許黑色霉菌斑;對照組(B)樣品表面沒有出現(xiàn)較多黑色霉菌斑;樣品組(C)也沒有出現(xiàn)黑色的霉菌斑。培養(yǎng)120 h后，空白組(A)表面大部分區(qū)域已覆蓋了非常多的黑色霉菌斑;對照組(B)出現(xiàn)部分霉菌斑，但在樣品周邊區(qū)域，霉菌斑出現(xiàn)較少;樣品組(C)處，只在培養(yǎng)基邊緣處出現(xiàn)少量霉菌斑，其他區(qū)域基本沒有出現(xiàn)霉菌斑。培養(yǎng)168 h后，空白組(A)的霉菌已完全覆蓋培養(yǎng)基表面;對照組(B)在樣品周邊，霉菌斑出現(xiàn)較少;樣品組(C)出現(xiàn)較少的霉菌斑(圖9)。這表明羽毛角蛋白接枝海藻酸海綿敷料具有一定的抗菌性，通過負(fù)載抗菌劑，使其具有較強(qiáng)的抑菌性能。
[0024]4、體外釋放行為
在體表溫度(37 °C )，模擬血液pH=7.4的條件下，通過負(fù)載小分子模型藥物(羅丹明B)，考察了羽毛角蛋白接枝海藻酸海綿敷料的體外藥物釋放行為，結(jié)果如圖10所示。在最初的3h，羅丹明B從羽毛角蛋白接枝海藻酸海綿敷料中釋放，其累積釋放率為53%，之后釋放逐漸平緩。在13 h后，其累積釋放率已達(dá)74%。因此，利用羽毛角蛋白接枝海藻酸海綿敷料的多級片層微孔結(jié)構(gòu)，可實(shí)現(xiàn)藥物分子的可控釋放。
[0025]綜上所述，本發(fā)明以生物相容的天然高分子角蛋白、海藻酸鈉為原料，制備的一種羽毛角蛋白接枝海藻酸天然高分子生物海綿敷料，具有優(yōu)異的吸收性能、保水性能和水蒸氣透過性能，且海綿敷料具有鹽敏感性，能為傷口愈合創(chuàng)造適宜的濕潤環(huán)境，促進(jìn)傷口快速愈合?？咕阅芎腕w外釋放研究表明，該生物海綿敷料具有較強(qiáng)的抑菌性能，且對小分子模型藥物具有緩釋效果，有望作為一種新型功能化的生物外敷材料在醫(yī)藥領(lǐng)域得到應(yīng)用。
【附圖說明】
[0026]圖1為羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的宏觀形貌。
[0027]圖2為羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的紅外譜圖。
[0028]圖3為羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的熱重圖。
[0029]圖4為羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的掃描電鏡圖。
[0030]圖5為羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的吸水性能(25°C)。
[0031 ]圖6為羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的吸鹽溶液性能(25°C)。
[0032]圖7為羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的保水性能(25°C)。
[0033]圖8為羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的水蒸氣透過性能(37°C)。
[0034]圖9為羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的抗菌性能。
[0035]圖10為羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的體外釋放行為(25°C，pH=7.4)。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明生物外敷材料的制備等做進(jìn)一步說明。
[0037]實(shí)施例1
將2.0 g羽毛角蛋白溶于20 mL的2 mol/L氫氧化鈉溶液中，得到羽毛角蛋白溶液;將4g海藻酸鈉溶于60 mL蒸餾水中，加入到羽毛角蛋白溶液，室溫?cái)嚢柘禄旌暇鶆?再加入I g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽作為縮合劑，攪拌2 h后，加入0.5 g N-羥基琥珀酰亞胺作為縮合助劑，調(diào)節(jié)體系pH值至5，攪拌5 h;然后加入I g山梨糖醇作為增塑劑，I g氯化鈣作為無機(jī)交聯(lián)劑，繼續(xù)攪拌2 h，反應(yīng)結(jié)束后，避光條件下，用蒸餾水透析24 h后，冷凍干燥，得到羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料。
[0038]生物外敷材料的外觀形貌見圖1。對水的吸收量達(dá)到50%以上，其溶脹率可以達(dá)到2400%;在鹽溶液中的溶脹率達(dá)到950%，吸收鹽溶液量超過40%;保水率達(dá)到1130%。水蒸氣透過量為 153 g*m—2.1Γ、
[0039]實(shí)施例2
將1.0 g羽毛角蛋白溶于20 mL的8 mol/L尿素溶液中，得到羽毛角蛋白溶液;將I g海藻酸鈉溶于20 mL蒸餾水中，加入到羽毛角蛋白溶液，室溫?cái)嚢柘禄旌暇鶆?再加入I g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽作為縮合劑，攪拌1.5 h后，加入0.25 g N-羥基琥珀酰亞胺作為縮合助劑，調(diào)節(jié)體系pH值至6，攪拌3 h;然后加入0.5 g乙二醇作為增塑劑，
0.5 g氯化鎂作為無機(jī)交聯(lián)劑，繼續(xù)攪拌1.5 h，反應(yīng)結(jié)束后，在避光條件下，用蒸饋水透析24 h后，冷凍干燥，得到羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料。
[0040]生物外敷材料的外觀形貌及各項(xiàng)性能類似于實(shí)施例1。
[0041 ] 實(shí)施例3
將2.5 g羽毛角蛋白溶于20 11^的0.8 mol/L氫氧化鉀鈉溶液中，得到羽毛角蛋白溶液；將2 g海藻酸鈉溶于20 mL蒸餾水中，加入到羽毛角蛋白溶液，室溫?cái)嚢柘禄旌暇鶆?再加入
0.5 g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽作為縮合劑，攪拌1.5 h后，加入0.5 gN-羥基琥珀酰亞胺作為縮合助劑，調(diào)節(jié)體系pH值至7，攪拌I h;然后加入0.8 g山梨糖醇作為增塑劑，0.5 g氯化鈣作為無機(jī)交聯(lián)劑，繼續(xù)攪拌1.5 h，反應(yīng)結(jié)束后，在避光條件下，用蒸餾水透析22 h后，冷凍干燥，得到羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料。
[0042]生物敷材料的外觀形貌及各項(xiàng)性能類似于實(shí)施例1。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的制備方法，是將羽毛角蛋白按I: 4-1:20g/mL的固液比溶于分散液中，形成羽毛角蛋白溶液;將海藻酸鈉按1:4?1:20 g/mL的固液比溶于蒸餾水后加入到上述羽毛角蛋白溶液中，室溫?cái)嚢柘禄旌暇鶆?加入縮合劑，攪拌0.5?I h;再加入縮合助劑，并調(diào)節(jié)體系pH值至4?7，攪拌I?5 h;然后加入增塑劑和無機(jī)交聯(lián)劑，繼續(xù)攪拌0.5?2 h;反應(yīng)結(jié)束后，在避光條件下用蒸餾水透析20?24 h，冷凍干燥，得到羽毛角蛋白接枝海藻酸的羽毛角蛋白基生物外敷材料。2.如權(quán)利要求1所述羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的制備方法，其特征在于:羽毛角蛋白與海藻酸鈉的質(zhì)量比為1:1?1: 5。3.如權(quán)利要求1所述羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的制備方法，其特征在于:分散液為濃度為0.8-8 mol/L尿素溶液或稀堿溶液。4.如權(quán)利要求1所述羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的制備方法，其特征在于:縮合劑采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽;縮合劑的加入量為羽毛角蛋白質(zhì)量的0.1?I倍。5.如權(quán)利要求1所述羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的制備方法，其特征在于:縮合助劑采用N-羥基琥珀酰亞胺;縮合助劑的加入量為羽毛角蛋白質(zhì)量的0.05?0.5倍。6.如權(quán)利要求1所述羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的制備方法，其特征在于:增塑劑為甘油、乙二醇、山梨糖醇、麥芽糖醇中的至少一種;增塑劑的加入量為羽毛角蛋白質(zhì)量的0.3?3倍。7.如權(quán)利要求1所述羽毛角蛋白接枝海藻酸生物海綿敷料的制備方法，其特征在于:無機(jī)交聯(lián)劑為氯化鈣或氯化鎂;無機(jī)交聯(lián)劑的加入量為羽毛角蛋白質(zhì)量的0.02?I倍。
【文檔編號】A61L15/42GK105879102SQ201610378592
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】王榮民, 李濤, 何玉鳳, 王煜晟, 孫康祺
【申請人】西北師范大學(xué)