一種麝香壯骨微乳及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種麝香壯骨微乳及其制備方法。所述麝香壯骨微乳由麝香壯骨揮發(fā)油、吐溫?80、無水乙醇、水提醇沉液、麝香、冰片、樟腦和薄荷腦制成，所述水提醇沉液中乙醇的體積濃度為90％。以質(zhì)量百分含量計，所述麝香壯骨微乳的組成如下：麝香壯骨揮發(fā)油3.15％，吐溫?80 24.35％，無水乙醇12.17％，所述中藥材的水提醇沉液58.50％，麝香0.20％，冰片0.49％，樟腦0.49％，薄荷腦0.65％。與麝香壯骨膏相比，麝香壯骨微乳的應用范圍更加廣泛、使用更加方便，擴大了適用人群范圍。麝香壯骨膏為中藥復方制劑，將其改進為麝香壯骨微乳后，為其他中藥復方制劑的微乳制備提供了參考。
【專利說明】
一種麝香壯骨微乳及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種麝香壯骨微乳及其制備方法，屬于中藥制劑技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 疼痛，是多種疾病的常見臨床癥狀，是相關(guān)疾病的特征反應，如風濕關(guān)節(jié)痛、癌痛、 神經(jīng)痛、軟組織挫傷痛等等。不論中醫(yī)方面，還是西醫(yī)方面，鎮(zhèn)痛措施一直是醫(yī)學研究的一 個重要課題。西醫(yī)所用藥物一般為非留體類抗炎藥(如吲哚美辛、阿司匹林等），但其經(jīng)口服 給藥后對胃腸道刺激性強，易引發(fā)副作用。中醫(yī)藥中常用膏劑(如橡膠膏劑、巴布劑等)等為 主要治療手段，其中麝香壯骨膏具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎功效，是臨床較常用、較有效的鎮(zhèn)痛 膏劑。麝香壯骨膏，藥方源于《皇帝內(nèi)經(jīng)》，歷史悠久，現(xiàn)收載于《衛(wèi)生部標準?中藥成方制 劑》第十一冊。國內(nèi)目前按照生產(chǎn)批準文號統(tǒng)計已有60多家企業(yè)生產(chǎn)。其原名為麝香虎骨 膏，因老虎為珍稀動物，并依據(jù)國發(fā)（1993)39號《國務院關(guān)于禁止犀牛角和虎骨貿(mào)易的通 知》，衛(wèi)生部于1993年11月25日發(fā)布了《關(guān)于對原處方含有犀牛角和虎骨的中成藥改變成份 和更改名稱等有關(guān)問題的通知》，該通知將麝香虎骨膏正式更名為麝香壯骨膏，取豹骨代替 虎骨。本品為淡黃色至淡棕色的片狀橡膠膏，氣香，主要功效是鎮(zhèn)痛、消炎，在風濕痛、關(guān)節(jié) 痛、腰痛、神經(jīng)痛、肌肉酸痛、扭傷、挫傷等方面有很好的療效。如：（類)風濕關(guān)節(jié)痛是中老年 人群中常見的慢性疾病，發(fā)病率高，從精神和肉體方面都給人們帶來一定程度的痛苦+ 9]。 臨床上，其往往作為風濕、類風濕病的首發(fā)癥狀。西醫(yī)認為其致病因素有免疫反應、遺傳因 素、感染、內(nèi)分泌因素等，可發(fā)病至全身，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛。由于其診斷、治療的雙重困 難和復雜，西醫(yī)學將其歸類為疑難雜癥，如果不正規(guī)進行醫(yī)療措施，將更加難以控制。中醫(yī) 學則認為風濕、類風濕關(guān)節(jié)疼痛的病機風、寒、濕、熱四邪所致，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》中就 有記載："其風氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹"和"其熱者，陽氣多，陰氣 少，病氣勝，陽遭陰，故為痹熱"等論述。后世醫(yī)家們基于病機將其主要分為一下幾類:風痹、 寒痹、濕痹、熱痹、風寒濕痹、濕熱痹等。也有學者認為其病機是"先天稟賦不足，正氣虧虛， 感受風、寒、濕邪，痹阻于肌肉、骨節(jié)、經(jīng)絡(luò)之間使氣血運行不暢而導致疼痛"的說法。由于其 病機復雜，難以根治，目前還尚未找到根治方法。橡膠膏劑指的是以橡膠為主要基質(zhì)，將藥 材提取物或化藥與其混勻，再涂布于背襯材料上制成的貼膏劑。臨床使用時主要用于治療 風濕病、氣管炎、高血壓、心絞痛等疾病，是止痛中藥外用常選擇的一個劑型。其載藥量小， 不適于中藥復方的制備，容易過敏。微乳(Microemulsion)，是將藥材提取物與適宜的油相、 乳化劑、助乳化劑所制得的具有透明、均質(zhì)、穩(wěn)定等特性的乳劑。眾多研究表明，微乳具有增 加藥物的溶解度、促進吸收、提高藥物穩(wěn)定性、延長藥物作用時間、維持恒定的血藥濃度等 特點，因此日益受到研究者的重視。因此，需要提供一種麝香壯骨微乳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種麝香壯骨微乳及其制備方法，所述麝香壯骨微乳能夠擴 大臨床適用范圍，其使用更方便、攜帶更方便，味道小、易于接受，可起到局部乃至全身的治 療作用，提高制劑穩(wěn)定性及可開發(fā)性。
[0004] 本發(fā)明首先提供一種麝香壯骨揮發(fā)油及其制備方法，所制備的麝香壯骨揮發(fā)油作 為所述麝香壯骨微乳的油相。
[0005] 所述麝香壯骨揮發(fā)油的制備方法，包括如下步驟:稱取下述中藥材，經(jīng)單獨粉碎后 進行混合，然后置于水中進行浸泡;所述浸泡結(jié)束后采用水蒸氣蒸餾法進行提取，收集揮發(fā) 性成分即為所述麝香壯骨揮發(fā)油；
[0006] 以質(zhì)量份數(shù)計，所述中藥材的組成如下：
[0007] 八角茴香3.5~4.5份，山奈4.5~5.5份，生川烏5.85~6.34份，生草烏5.85~6.34 份，麻黃5.5~6.5份，白芷7.5~8.5份，蒼術(shù)11.5~12.5份，當歸11.5~12.5份，干姜16.5~ 17.5 份。
[0008] 以質(zhì)量份數(shù)計，所述中藥材的組成具體如下：
[0009] 八角茴香4份，山奈5份，生川烏6份，生草烏6份，麻黃6份，白芷8份，蒼術(shù)12份，當歸 12份，干姜17份。
[0010] 上述的制備方法中，在水中浸泡的時間可為〇~1小時，優(yōu)選為〇.5小時；
[0011] 所述浸泡和所述提取時水的質(zhì)量用量均可為所述中藥材的總質(zhì)量的8倍，即浸泡 后直接進行提取，即浸泡采用的水直接進行提取；
[0012] 所述提取的溫度范圍為140°C~200°C，優(yōu)選為180°C ;
[0013] 所述提取的時間范圍為8h~12h，優(yōu)選為1 Oh;
[0014] 所述粉碎得到的粉末的粒徑范圍為0(藥材飲片)~60目，優(yōu)選為40目。
[0015] 上述方法制備得到的麝香壯骨揮發(fā)油也是本發(fā)明的保護范圍。
[0016] 本發(fā)明進一步提供了一種麝香壯骨微乳，其所述麝香壯骨揮發(fā)油、吐溫-80、無水 乙醇、所述中藥材的水提醇沉液、麝香、冰片、樟腦和薄荷腦制成。
[0017] 上述的麝香壯骨微乳液中，所述中藥材的水提醇沉液中乙醇的體積濃度可為 90%，所述中藥材的水提醇沉液是按照如下方法制備的：制備所述麝香壯骨揮發(fā)油的水煎 液，經(jīng)濃縮后，向其加入乙醇進行沉淀，得上清液即為所述中藥材的水提醇沉液;所述水提 醇沉液作為所述麝香壯骨微乳的水相，通過采用醇沉液能夠最大程度的保證所制備是麝香 壯骨微乳的物質(zhì)基礎(chǔ)與原方的物質(zhì)基礎(chǔ)一致。
[0018] 上述的麝香壯骨微乳液中，以質(zhì)量百分含量計，所述麝香壯骨微乳的組成如下：
[0019] 麝香壯骨揮發(fā)油3.15%，
[0020] 吐溫-80 24.35%，
[0021] 無水乙醇 12.17%，
[0022]所述中藥材的水提醇沉液58.50%，
[0023] 麝香 0.20%，
[0024] 冰片 0.49%，
[0025] 樟腦 0.49%，
[0026] 薄荷腦 0.65%。
[0027] 本發(fā)明還提供了所述麝香壯骨微乳的制備方法，包括如下步驟：
[0028] 1)利用所述無水乙醇超聲溶解所述麝香，并經(jīng)微孔濾膜過濾得到濾液；
[0029] 2)將一部分的所述薄荷腦加入到所述濾液中，然后加入所述麝香壯骨揮發(fā)油、所 述吐溫-80、所述冰片和所述樟腦進行混合；
[0030] 3)將步驟2)得到的混合液中加入所述中藥材的水提醇沉液和剩余量的所述薄荷 腦，即得到所述麝香壯骨微乳。
[0031 ]上述的制備方法中，步驟1)中，所述超聲溶解的時間可為30分鐘；
[0032]所述微孔濾膜的孔徑可為0.22ym;
[0033]步驟2)中，將所述薄荷腦質(zhì)量的1/3部分加入至所述濾液中。
[0034]本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0035] 1、將麝香壯骨膏這一劑型改進制備出了麝香壯骨微乳。
[0036] 2、與麝香壯骨膏相比，麝香壯骨微乳的應用范圍更加廣泛、使用更加方便，擴大了 適用人群范圍。
[0037] 3、目前，中藥微乳劑型的制備中，所選擇的模型藥物大多為單味中藥、以藥對為主 的兩味中藥等，而麝香壯骨膏為含有17味藥的復方制劑，將其制備成微乳本身就具有創(chuàng)新 性。
[0038] 4、麝香壯骨膏為中藥復方制劑，將其改進為麝香壯骨微乳后，為其他中藥復方制 劑的微乳制備提供了參考。
【附圖說明】
[0039 ]圖1為本發(fā)明實施例1中揮發(fā)油提取率隨提取時間的變化曲線。
[0040]圖2為本發(fā)明實施例1中揮發(fā)油提取率隨粉碎粒度(混合粉碎)的變化曲線。
[0041 ]圖3為本發(fā)明實施例1中揮發(fā)油提取率隨浸泡時間的變化曲線。
[0042]圖4為本發(fā)明實施例1中揮發(fā)油提取率隨液固比的變化曲線。
[0043 ]圖5為本發(fā)明實施例1中揮發(fā)油提取率隨粉碎粒度(單獨)的變化曲線。
[0044]圖6為本發(fā)明實施例1中揮發(fā)油提取率隨提取溫度的變化曲線。
[0045]圖7為本發(fā)明實施例2中RH-40與無水乙醇的體積比為3:1時的偽三元相圖。
[0046]圖8為本發(fā)明實施例2中0P-10與無水乙醇的體積比為3:1時的偽三元相圖。
[0047]圖9為本發(fā)明實施例2中TWeen80與無水乙醇的體積比為3:1時的偽三元相圖。 [0048]圖10為本發(fā)明實施例2中HS-15與無水乙醇的體積比為3:1時的偽三元相圖。
[0049]圖11為本發(fā)明實施例2中0P-10與1，2_丙二醇混合條件下的偽三元相圖。
[0050]圖12為本發(fā)明實施例2中0P-10與PEG400混合條件下的偽三元相圖。
[00511圖13為本發(fā)明實施例2中0P-10與無水乙醇混合條件下的偽三元相圖。
[0052]圖14為本發(fā)明實施例2中TweenSO與1，2_丙二醇混合條件下的偽三元相圖。
[0053]圖15為本發(fā)明實施例2中Tween80與PEG400混合條件下的偽三元相圖。
[0054]圖16為本發(fā)明實施例2中TweenSO與無水乙醇混合條件下的偽三元相圖。
[0055]圖17為本發(fā)明實施例2中0P-10與無水乙醇的Km為1:3時的偽三元相圖。
[0056]圖18為本發(fā)明實施例2中0P-10與無水乙醇的Km為1:2時的偽三元相圖。
[0057]圖19為本發(fā)明實施例2中0P-10與無水乙醇的Km為1:1時的偽三元相圖。
[0058]圖20為本發(fā)明實施例2中0P-10與無水乙醇的Km為2:1時的偽三元相圖。
[0059]圖21為本發(fā)明實施例2中0P-10與無水乙醇的Km為1:1時的偽三元相圖。
[0060]圖22為本發(fā)明實施例2中Tween80與無水乙醇的Km為1:3時的偽三元相圖。
[0061 ]圖23為本發(fā)明實施例2中Tween80與無水乙醇的Km為1:2時的偽三元相圖。
[0062]圖24為本發(fā)明實施例2中Tween80與無水乙醇的Km為1:1時的偽三元相圖。
[0063]圖25為本發(fā)明實施例2中Tween80與無水乙醇的Km為2:1時的偽三元相圖。
[0064]圖26為本發(fā)明實施例2中Tween80與無水乙醇的Km為3:1時的偽三元相圖。
[0065]圖27為本發(fā)明實施例2中效應面分析的吐溫等高線圖(粒徑）。
[0066]圖28為本發(fā)明實施例2中效應面分析的吐溫三維效果曲線圖(粒徑）。
[0067]圖29為本發(fā)明實施例2中效應面分析的吐溫等高線圖(PDI)。
[0068]圖30為本發(fā)明實施例2中效應面分析的吐溫三維效果曲線圖(PDI)。
[0069]圖31為本發(fā)明實施例2中效應面分析的0P等高線圖(粒徑）。
[0070]圖32為本發(fā)明實施例2中效應面分析的0P三維效果曲線圖(粒徑）。
[0071]圖33為本發(fā)明實施例2中效應面分析的0P等高線圖(PDI)。
[0072]圖34為本發(fā)明實施例2中效應面分析的0P三維效果曲線圖(PDI)。
[0073]圖35為本發(fā)明實施例2中吐溫組星點設(shè)計驗證粒徑檢測圖。
[0074]圖36為本發(fā)明實施例2中0P組星點設(shè)計驗證粒徑檢測圖
[0075]圖37為本發(fā)明實施例2中吐溫80組的電鏡照片（圖37(A))和粒徑檢測結(jié)果（圖37 (B))〇
[0076]圖38為本發(fā)明實施例2中0P組的電鏡照片（圖38(A))和粒徑檢測結(jié)果（圖38(B))。 [0077]圖39為本發(fā)明實施例2中在第1天（圖39(A))和第30天圖39(B)、第60天圖39(C)測 定的0P組樣品的粒徑圖。
[0078] 圖40為本發(fā)明實施例2中麝香壯骨微乳的粒徑檢測圖。
[0079] 圖41為本發(fā)明實施例2中麝香壯骨微乳的電鏡照片圖。
[0080] 圖42為本發(fā)明實施例3中各組大鼠每5min內(nèi)疼痛表現(xiàn)評分值的變化曲線。
【具體實施方式】
[0081 ]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0082]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0083]下述實施例中所使用的儀器如下：
[0084] JA5003精密電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；揮發(fā)油提取裝置（北 玻）；ZNHW- Π 智能恒溫電熱套(鞏義市予華儀器有限責任公司）；磁力攪拌器(C-MAG，HS 4 S25，IKA); IT-09B-5型磁力攪拌器(雷磁）；KQ5200DE型數(shù)顯超聲清洗器(昆山市超聲儀器有 限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-5205;上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-m循環(huán)水式多用真空栗（臨海 市譚氏真空設(shè)備有限公司）；NDJ-8S數(shù)字式粘度計(上海尼潤智能科技有限公司）；KDC-1044 低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司）；Zan〇-90馬爾文激光粒徑檢測儀(英國）； JEM-100CXII型透射電鏡(JE0L日本電子)BSA224S電子天平(201309;賽多利斯科學儀器(北 京)有限公司）。
[0085]實施例1、麝香壯骨揮發(fā)油的制備 [0086]本實施例中所使用的藥材及試劑如下：
[0087] 4質(zhì)量份的八角茴香(廣西，151001);5質(zhì)量份的山奈(廣西，141202) ;6質(zhì)量份的生 川烏（四川，20140923) ;6質(zhì)量份的生草烏（四川，20141010) ;6質(zhì)量份的麻黃（內(nèi)蒙古， 151001 );8質(zhì)量份的白芷(安徽，150901); 12質(zhì)量份的蒼術(shù)（內(nèi)蒙古，150501); 12質(zhì)量份的當 歸(甘肅，201508056); 17質(zhì)量份的干姜（四川，151001)均采購于北京同仁堂藥店;無水乙醇 (分析純，天津科密歐）。
[0088] 一、方法
[0089] 1.1單因素考察
[0090] 以揮發(fā)油提取率為指標，對其加水量、粉碎粒度、浸泡時間、提取時間、提取溫度以 及是否單獨粉碎等因素進行考察。
[0091] "揮發(fā)油提取率"指的是得到的揮發(fā)油的質(zhì)量與原料的質(zhì)量的比值，再乘以100%。
[0092] 1.1.1考察提取時間對干姜、蒼術(shù)等九味中藥飲片中揮發(fā)油提取率的影響
[0093] 按處方量稱取各藥材飲片，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，固定加水量(質(zhì)量)為 12倍、浸泡0h，平行三次，以揮發(fā)油得率為指標進行實驗，考察不同提取時間對其影響。實驗 結(jié)果見圖1。
[0094] 由圖1可知，提取時間為10h時，得油率最多，大于或者小于10h均會使揮發(fā)油得率 降低，故選擇l〇h為提取時間的中間值。
[0095] 1.1.2考察粉碎粒度(混合粉碎)對干姜、蒼術(shù)等九味中藥飲片中揮發(fā)油提取率的 影響
[0096] 按處方量稱取各藥材飲片，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，固定加水量為12倍、浸 泡〇h，提取10h，平行三次，以揮發(fā)油得率為指標進行實驗，考察不同混合粉碎時的粉碎粒度 對其影響。實驗結(jié)果見圖2。
[0097] 由圖2可知，隨著粉碎粒度(混合粉碎）的不斷減小，揮發(fā)油得率逐漸增多，然后降 低;且當其達到40目時得油率最高。
[0098] 1.1.3考察浸泡時間對干姜、蒼術(shù)等九味中藥飲片中揮發(fā)油提取率的影響
[0099] 按處方量稱取各藥材飲片，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，固定加水量、粉碎粒 度，提取時間，平行三次，以揮發(fā)油得率為指標進行實驗，考察不同浸泡時間對其影響。實驗 結(jié)果見圖3。
[0100] 由圖3可知，隨著浸泡時間的改變，揮發(fā)油的提取率呈現(xiàn)不規(guī)律的變化，且對得油 率沒有顯著影響。因此選擇浸泡時間為0.5h時，為進一步實驗的固定條件。
[0101 ] 1.1.4考察液固比（Ι/g)對干姜、蒼術(shù)等九味中藥飲片中揮發(fā)油提取率的影響
[0102] 按處方量稱取各藥材飲片，采用水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油，固定浸泡時間、粉碎粒 度，提取時間，平行三次，以揮發(fā)油得率為指標進行實驗，考察不同液固比對其影響。實驗結(jié) 果見圖4。
[0103] 由圖4可知，液固比從8~12逐漸增大時，對揮發(fā)油得油率影響較小，而當液固比為 8時，得油量相對較多，因此選擇液固比為8進行下一步正交實驗的提取條件之一。
[0104] 1.1.5考察單獨粉碎與混合粉碎對干姜、蒼術(shù)等九味中藥飲片中揮發(fā)油提取率的 影響
[0105] 按處方量稱取各藥材飲片，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，固定浸泡時間、粉碎粒 度，提取時間，平行三次，以揮發(fā)油得率為指標進行實驗，考察單獨粉碎時不同粉碎粒度對 得油率的影響。實驗結(jié)果見圖5。
[0106] 由圖5可知，隨著粉碎粒度的減小，得油率顯著提高，且當單獨粉碎40目時，得油率 達到最大，且與1.1.2相比，得油率更高。其中60目時，得油率降低，可能是由于粒度過小導 致的粒子間吸附力增加有關(guān)。
[0107] 1.1.6考察提取溫度對干姜、蒼術(shù)等九味中藥飲片中揮發(fā)油提取率的影響
[0108] 按處方量稱取各藥材飲片，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，固定浸泡時間、加水 量、粉碎粒度，提取時間，平行三次，以揮發(fā)油得率為指標進行實驗，考察不同提取時間對得 油量的影響。實驗結(jié)果見圖6。
[0109] 由圖6可知，伴隨提取溫度的逐漸升高，得油率也逐漸增大，而后有趨向于平行的 趨勢。當提取溫度為180 °C時，得油率最高。
[0110] 1.2干姜、蒼術(shù)等九味中藥飲片中揮發(fā)油提取工藝的優(yōu)化
[0111] 1.2.1正交實驗設(shè)計法優(yōu)化揮發(fā)油提取工藝
[0112]篩選出對揮發(fā)油得量影響較為顯著的三個因素進行三因素三水平的正交試驗。因 此，以揮發(fā)油的提取率為指標，選取提取時間、粉碎粒度和提取溫度，建立因素水平表，見表 1。然后按L9(3 4)正交試驗設(shè)計表進行三因素三水平的正交實驗，優(yōu)化揮發(fā)油提取工藝。
[0113] 表1三因素三水平表
[0114]
[0115] 表2 L9(34)正交實驗結(jié)果
[0116]
[0117] 注:FQ.Q5(2,2)=19.00^0.(^2,2)=99.00。* 表示顯著差異。
[0118] 由表2和表3可知，3種因素對揮發(fā)油得率影響的主次順序為：B>D>A。且據(jù)方 差分析結(jié)果顯示粉碎粒度、提取時間和提取溫度是影響麝香壯骨揮發(fā)油提取效率的顯著因 素。因此在優(yōu)選提取工藝時，應當考慮這三個因素。正交實驗結(jié)果為:揮發(fā)油提取的最佳工 藝組合為A 3B2D2，即浸泡30min、提取溫度12h、單獨粉碎40目、提取溫度180 °C，與正交表中的 結(jié)果一致。
[0119] 1.2.2最佳工藝驗證實驗
[0120]在確定的最佳提取工藝條件下進行揮發(fā)油提取的驗證性實驗，平行三次。所得的 揮發(fā)油均為亮黃色油狀物，并具有特殊濃郁的香味，提取率為1.585%，RSD為2.335%( <3%)。
[0121] 驗證實驗:按照攪拌時間為12h、粉碎粒度(單獨粉碎)為40目、提取溫度為180°C的 工藝提取揮發(fā)油，計算得油率，實驗結(jié)果如表4所示。
[0122] 表4最佳工藝下的得油率
[0123] 二、結(jié)論
[0124] 1、對麝香壯骨揮發(fā)油提取條件的單因素考察結(jié)果為:提取時間、粉碎粒度和提取 溫度對其具有較為顯著的影響。
[0125] 2、經(jīng)正交實驗設(shè)計得到的麝香壯骨揮發(fā)油的最佳條件組合為:提取時間為12 h、 粉碎粒度(單獨粉碎)為40目、提取溫度為180 °C。
[0126] 3、麝香壯骨揮發(fā)油的最佳提取工藝條件為:浸泡0.5h、8倍加水量、180°C下，粉碎 粒度(單獨粉碎)為40目，提取時間12h，為進一步制備麝香壯骨微乳奠定了基礎(chǔ)。
[0127] 實施例2、麝香壯骨微乳的制備
[0128] 本實施例所用的試劑如下：
[0129] Tween-80(生產(chǎn)批號：20150714;天津市光復精細化工）；RH-40(聚氧乙烯蓖麻油， 生產(chǎn)批號141112，BASF) ;EL-35(聚氧乙烯蓖麻油德國，BASF) ;Solutrol HS-15(聚乙二醇十 二羥基硬脂酸鋰，BASF，130813) ;0P-10(生產(chǎn)批號：20140918;天津市光復精細化工有限公 司）；無水乙醇（分析純，生產(chǎn)批號：20150626,天津市科密歐化學試劑有限公司）；1，2_丙二 醇（分析純，生產(chǎn)批號= 20121012,天津市風船化學試劑科技有限公司）；PEG400(分析純，生 產(chǎn)批號:20140924，天津市方得科技有限公司）。蒸餾水等。
[0130] -、麝香壯骨揮發(fā)油微乳處方的篩選
[0131] 1.1表面活性劑的篩選
[0132] 將Tween-80、RH-40(聚氧乙烯蓖麻油）、HS-15、聚氧乙烯氫化蓖麻油、0P-10分別與 無水乙醇（以下簡稱Eth)按照Km = 3:l混合，磁力攪拌器下攪拌均勻后，再分別與麝香壯骨 揮發(fā)油按體積比9:1、8:2、7 :3、6:4、5:5、4:6、3:7、2 :8和1:9混合，攪拌均勻，在磁力攪拌器 上邊攪拌邊用蒸餾水滴定來制備微乳，以體系由濁(澄清)至透明（渾濁)為微乳形成的臨界 點，記錄臨界點處的加水量。平行3次，偽三元相圖法篩選出最佳表面活性劑。
[0133] 1.2助表面活性劑的篩選
[0134] 將無水乙醇、1，2-丙二醇、PEG400分別與篩選出來的表面活性劑按Km = 2:1混合， 攪拌均勻，再分別與麝香壯骨揮發(fā)油按體積比9:1、8:2、7 :3、6:4、5:5,4:6、3:7、2 :8和1:9混 合，攪拌均勻，在磁力攪拌器上邊攪拌邊用蒸餾水滴定來制備微乳，以體系由濁(澄清)至透 明（渾濁)為微乳形成的臨界點，記錄臨界點處的加水量。平行3次，偽三元相圖法篩選出最 佳助表面活性劑。
[0135] 1.3Km值的篩選
[0136] 將表面活性劑與助表面活性劑從Km= 1:1開始，向兩側(cè)延伸(3:1、2:1、1:2、1:3)混 合拌均勻，再分別與麝香壯骨揮發(fā)油按體積比9:1、8: 2、7: 3、6: 4、5: 5、4: 6、3: 7、2:8和1:9混 合，攪拌均勻，在磁力攪拌器上邊攪拌邊用蒸餾水滴定來制備微乳，以體系由濁(澄清)至透 明（渾濁)為微乳形成的臨界點，記錄臨界點處的加水量。平行3次，偽三元相圖法篩選出最 佳Km值。
[0137] 1.4 結(jié)果
[0138] 1.4.1表面活性劑篩選結(jié)果
[0139] 經(jīng)偽三元相圖篩選出表面活性劑為Tween-80和0P-10,結(jié)果如圖7、圖8、圖9和圖10 所示。
[0140] 由圖8-10可知：當Km值為3:1時，0P-10與Tween80所繪制的微乳區(qū)域最大。
[0141 ] 1.4.2助表面活性劑篩選結(jié)果
[0142] 經(jīng)偽三元相圖篩選出助表面活性劑為無水乙醇，結(jié)果如圖11-16。
[0143] 由圖11-16可知：當以Tween80和0P-10為表面活性劑時，與無水乙醇混合制備的微 乳區(qū)域最大。
[0144] 1.4.3Km值篩選結(jié)果
[0145] 經(jīng)偽三元相圖篩選出Km值為2:1。結(jié)果如圖17-26。
[0146] 由17-26可知:相同表面活性劑與助表面活性劑按不同Km值（1:3、1:2、1:1、2 :1、3: 1)混合篩選所得到的微乳區(qū)域有所差別，且當Km值為2:1時，不論是0P-10還是TweenSO,所 得微乳區(qū)域均為最大。
[0147] 1.5 結(jié)論
[0148] 麝香壯骨揮發(fā)油微乳處方組成為① Tween-80、無水乙醇、Km = 2:l，油相為麝香壯 骨揮發(fā)油，水相為蒸餾水;②0P-10、無水乙醇、Km=2:l，油相為麝香壯骨揮發(fā)油，水相為蒸 餾水。
[0149] 二、星點設(shè)計-效應面法優(yōu)選麝香壯骨揮發(fā)油微乳處方
[0150]經(jīng)偽三元相圖法篩選出了表面活性劑、助表面活性劑及Km值，為明確麝香壯骨微 乳處方中各組分的具體量，需要進一步進行優(yōu)化實驗。
[0151]本發(fā)明以微乳處方中混合表面活性劑、揮發(fā)油的含量為考察因素，采用馬爾文粒 徑檢測儀測定微乳粒徑，進行2因素、5水平的星點設(shè)計-效應面法優(yōu)化設(shè)計，擬合多元二次 回歸方程，以粒徑、PDI為指標，用效應面法優(yōu)選處方工藝并進行工藝驗證。
[0152] 2.1因素水平的確定
[0153] 確定混合表面活性劑含量A( % )、揮發(fā)油含量B( % )兩個考察因素，采用2因素5水 平的星點設(shè)計-效應面法優(yōu)化法微乳處方，以微乳的粒SYKnmhYdPDI)為指標進行考察。 分別選取范圍A:35%~50%，B:1%~15%。其中因素水平表見表5和表7，星點設(shè)計表及結(jié) 果見表6和表8。
[0154] 表5 Tween80組星點設(shè)計因素水平表
[0155]
[0156] 表6 Tween80組星點設(shè)計表及結(jié)果
[0157]
[0158]
[0159] 表7 OP-10組星點設(shè)計因素水平表
[0160]
[0161] 表8 0P-10組星點設(shè)計表及結(jié)果
[0162]
[0163] 2.2數(shù)據(jù)結(jié)果與處理
[0164]采用軟件Design-Expert 8.0安排試驗，按"2. Γ項下方法制備麝香壯骨揮發(fā)油微 乳，以粒徑、PDI值為評價指標對麝香壯骨揮發(fā)油微乳處方進行優(yōu)化，粒徑、PDI值越小，微乳 越穩(wěn)定，結(jié)果見表6、表8。
[0165] 2.3效應面分析
[0166] 固定2個自變量之一并取中間值，以擬合的目標函數(shù)為數(shù)學模型，繪制三維效應面 圖和二維等高線圖，見圖27-34,并從效應面的較優(yōu)區(qū)域讀取較佳工藝條件得:① TweenSO: 組4 = 37.2%，8 = 3.21%。@0卩-10組4 = 37.14%，8 = 20%。
[0167] 由圖27-34可見，每個效應面都具有其較優(yōu)區(qū)域，將各效應面的較優(yōu)區(qū)域進行重 疊，可進一步縮小較優(yōu)區(qū)域的范圍。
[0168] 2.4驗證實驗
[0169] 以粒徑、PDI為指標，按照星點設(shè)計-響應面法優(yōu)化的麝香壯骨揮發(fā)油微乳處方進 行驗證，平行三次。結(jié)果見表9和表10及圖35和圖36。
[0174] 2.5麝香壯骨揮發(fā)油微乳理化性質(zhì)檢查
[0175] 2.5.1外觀及性狀
[0176] 吐溫80組為澄清透明、具有芳香氣味的均一淡黃色液體。0P組為外觀澄清、具有芳 香性的黃色透明液體。
[0177] 2.5.2電鏡觀察
[0178] 經(jīng)高壓電鏡下觀察，均為球形或近球形的顆粒，粒徑在10~100nm之間。
[0179] 吐溫80組的電鏡照片和粒徑檢測結(jié)果圖如圖37所示，分別為圖37(A)和圖37圖 ⑶。
[0180] 0P組的電鏡照片和粒徑檢測結(jié)果圖如圖38所示，分別為圖38(A)和圖38圖(B)。
[0181] 2.5.3穩(wěn)定性考察
[0182] 將0P組及吐溫80組揮發(fā)油微乳處方制備的微乳樣品分別置于常溫避光處、5°C冷 藏處、室溫不避光處保存(分別編號:組別+樣品1、2、3)，考察其在制備后第ld、第16d、第30d 和第60d分別測定其微乳粒徑及roi，觀察其指標變化，進而判斷其穩(wěn)定性。
[0183] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：吐溫80組處方樣品穩(wěn)定性良好，且在常溫避光處放置的樣品隨著時間 的推移而顯現(xiàn)出更加穩(wěn)定的趨勢。而0P組微乳處方樣品在放置30d后其粒徑、PDI指標發(fā)生 改變，可能是因為放置時間長之后微乳內(nèi)部粒子間發(fā)生凝聚等原因造成的，如圖39所示。
[0184] 綜上所述，經(jīng)星點設(shè)計-效應面法優(yōu)化最終得到的麝香壯骨揮發(fā)油微乳處方(按處 方組成的質(zhì)量分數(shù)計）① TWeen80 24.8%、無水乙醇12.4%、揮發(fā)油3.21%、蒸餾水 59.59%。②0P-10 24.76%、無水乙醇12.38%、揮發(fā)油20%、蒸餾水42.86%。經(jīng)過穩(wěn)定性試 驗發(fā)現(xiàn)，0P組微乳處方不穩(wěn)定，放置半個月后粒徑、PDI發(fā)生明顯變化，故在此舍去0P組揮發(fā) 油微乳處方。最終確定麝香壯骨揮發(fā)油微乳處方為:Tween80 24.8%、無水乙醇12.4%、揮 發(fā)油3.21 %、蒸餾水59.59 %。
[0185] 三、麝香壯骨微乳的制備
[0186] 3.1醇沉濃度的選擇
[0187] 在麝香壯骨微乳的配方組成確定后，將用麝香壯骨水煎液代替蒸餾水，制備麝香 壯骨微乳。根據(jù)其原方中藥材提取條件(使用90%的乙醇回流提取制備麝香壯骨膏），因此 選擇醇沉濃度為90%，使用無水乙醇對麝香壯骨水煎液進行醇沉，至醇沉濃度達到90%，冷 藏、靜置48h后，經(jīng)抽濾、減壓濃縮后再經(jīng)過四層濾紙過濾，得到透明澄清的濾液，將其作為 麝香壯骨微乳的水相。
[0188] 3.2麝香加入方法
[0189] 3.2.1用制備好的微乳溶解
[0190] 先制備出空白揮發(fā)油微乳，再將處方量的麝香加入到微乳中，觀察微乳外觀。結(jié)果 麝香不能夠完全溶解。
[0191] 3.2.2無水乙醇提取后制備微乳
[0192] 精密稱取0.02mg麝香，加入處方量的無水乙醇(科密歐)超聲30min提取，0.22μπι的 微孔濾膜過濾，以含有麝香的無水乙醇上清液作為助表面活性劑，然后依次加入TweenSO、 揮發(fā)油、蒸餾水等其他組分制備微乳，得到澄清透明的溶液。
[0193] 3 · 2 · 3冰片、樟腦、薄荷腦加入方法：
[0194] ①按處方量，將其溶解于揮發(fā)油；②按處方量，將其加入到制備好的微乳中；③按 處方量，溶解于無水乙醇中，再制備微乳;④按處方量，將其溶解于揮發(fā)油與混合表面活性 劑的混合物中攪拌均勻后，再加入水相，進而制備微乳。⑤根據(jù)0.5%的冰片的量折算樟腦 和薄荷腦的量后，再將其溶解于揮發(fā)油與混合表面活性劑的混合物中攪拌均勻后，再加入 水相，進而制備微乳。⑥按照0.5%冰片折算后，將1/3量的薄荷腦加入到含有麝香的無水乙 醇中，再按微乳處方加入表面活性劑、揮發(fā)油、冰片、樟腦進行配制，混合均勻后加入90 %水 提醇沉液后再加入剩余的2/3量的薄荷腦進而制備微乳。
[0195] 結(jié)果：①~④均有未溶解晶體，可能是因為其處方量較大，超出了微乳的溶解能 力，使其達到過飽和的狀態(tài)。只有⑤和⑥最終能夠得到澄清透明的微乳液，且粒徑檢測確定 為微乳，粒徑較小，但⑤耗時相對較長于⑥。
[0196] 3.2.4水楊酸甲酯、硫酸軟骨素、鹽酸苯海拉明的加入方法
[0197] A.按處方量，先將水楊酸甲酯溶解于揮發(fā)油，之后加入其它藥，加入以90%的水提 醇沉液為水相制備好微乳后，繼續(xù)攪拌進行制備。
[0198] B.按0.5%冰片折算后的量，先將水楊酸甲酯溶解于揮發(fā)油，之后按照2.2.3項下 ⑤法依次加入其它藥，再加入水相，加入硫酸軟骨素、鹽酸苯海拉明，進而制備微乳。
[0199] C.按0.5%冰片折算后的量，先將水楊酸甲酯揮發(fā)油與混合表面活性劑的混合物 中攪拌均勻后，之后按照3.2.3項下⑤法依次加入其它藥，以90%的水提醇沉液為水相制備 好微乳后，加入硫酸軟骨素、鹽酸苯海拉明，繼續(xù)攪拌進行制備。
[0200] D.按0.5%冰片折算后的量，依次加入混合表面活性劑、揮發(fā)油、水楊酸甲酯，攪拌 均勻后加入1/3發(fā)油微乳處方量的蒸餾水，攪拌后再將其加入加入硫酸軟骨素、鹽酸苯海拉 明，攪拌均勻后2/3的麝香壯骨揮發(fā)油微乳處方量的90%的水提醇沉液。
[0201] E.按0.5%冰片折算后的量，依次加入混合表面活性劑、揮發(fā)油、水楊酸甲酯，攪拌 均勻后加入1/2發(fā)油微乳處方量的蒸餾水，攪拌后再將其加入加入硫酸軟骨素、鹽酸苯海拉 明，攪拌均勻后1/2的麝香壯骨揮發(fā)油微乳處方量的90%的水提醇沉液。
[0202] 結(jié)果:A~C均有未溶解晶體，且A不成乳，為渾濁的乳狀液。D在起初的時候能夠形 成澄清的微乳，但經(jīng)放置24h后又有晶體析出。E能夠形成得到澄清透明的微乳液，且經(jīng)粒徑 檢測確定為微乳。
[0203] 3.3麝香壯骨微乳處方組成的確定
[0204]在揮發(fā)油微乳組成的基礎(chǔ)上，最終確定麝香壯骨微乳的處方組成為：TweenSO 24.35%、無水乙醇12.17%、麝香0.20%、揮發(fā)油3.15%、冰片0.49%、樟腦0.49%、薄荷腦 0.65 %，90 %的水提醇沉液58.50 %。
[0205] 3.3.1驗證實驗
[0206] 以粒徑、PDI為指標，按照星點設(shè)計-響應面法優(yōu)化的麝香壯骨揮發(fā)油微乳處方進 行驗證，平行三次。結(jié)果見表11。
[0207]表11麝香壯骨微乳驗證實驗結(jié)果 [0208]
[0209]由表9可知，驗證實驗結(jié)果為:粒徑、PDI平均值為15.19nm、0.089，表明制備的麝香 壯骨微乳是微乳，且roi值較小，性質(zhì)穩(wěn)定。
[0210] 3.3.2麝香壯骨微乳的理化性質(zhì)研究
[0211] 3.3.2.1 外觀性狀
[0212] 外觀為均一、透明的紅棕色液體。
[0213] 3.3.2.2微乳類型的判斷
[0214] 蘇丹紅、亞甲基藍染料分別為油溶性、水溶性的染料，對比其在微乳液中的擴散速 度，若亞甲基藍擴散速度大，則為0/W型微乳;反之，蘇丹紅的擴散速度大，則為W/0型微乳。
[0215] 取兩份等體積的麝香壯骨微乳，置于適宜的西林瓶中，編號1、2,分別同時向1、2號 試管中加入新鮮配制的蘇丹紅染料、亞甲基藍染料溶液，各兩滴，靜止。以染料的擴散速度 為指標，判斷微乳的類型。
[0216] 結(jié)果:亞甲基藍的擴散速度大，說明該微乳為0/W型微乳。
[0217] 3· 3·2· 3pH 值的測定。
[0218] 取適量的麝香壯骨微乳，測其pH，為5.47。
[0219] 3.3.2.4粒徑的測定
[0220] 精密取0.5mL麝香壯骨微乳，加9.5mL水，稀釋10倍，用馬爾文激光粒度測其粒徑， 實驗結(jié)果如圖40:測得麝香壯骨微乳的粒徑為15.19nm。
[0221] 3.3.2.5麝香壯骨微乳的電鏡圖
[0222] 采用負染色法制備樣品：取麝香壯骨微乳適量，經(jīng)染色、自然晾干等操作后，在TEM (透射電鏡)下觀察微乳的形態(tài)，結(jié)果見圖41。
[0223] 3.3.2.6初步穩(wěn)定性考察
[0224] 取適量的麝香壯骨微乳，在3000rpm轉(zhuǎn)速下，離心15min。未出現(xiàn)分層現(xiàn)象。
[0225] 3.4結(jié)論
[0226] 麝香壯骨微乳的處方組成為Tween80 24.35%、無水乙醇12.17%、麝香0.20%、揮 發(fā)油3.15 %、冰片0.49 %、樟腦0.49 %、薄荷腦0.65 %，90 %的水提醇沉液58.50 %。
[0227] 加入次序及方法為:按照0.49 %冰片折算處方中冰片、樟腦、薄荷腦的量后，先將 麝香用處方量的無水乙醇超聲30min，經(jīng)0.22μπι微孔濾膜過濾后，再將1/3量的薄荷腦加入 到含有麝香的無水乙醇中，然后和按微乳處方加入表面活性劑、揮發(fā)油、冰片、樟腦進行配 制，混合均勻后加入90 %水提醇沉液后再加入剩余的2/3量的薄荷腦，lOOr/min下攪拌平衡 lh，進而制備微乳。
[0228] 實施例3、麝香壯骨微乳及其揮發(fā)油微乳的藥效試驗
[0229] 1.儀器和材料
[0230] m實驗儀器
[0231] 微量高速離心機（TG16W型，長沙湘智離心機儀器有限公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱 (鎮(zhèn)江市科密儀器儀表有限公司，GNP-9080型）。滅菌96孔聚苯乙烯U型微孔板(北京華美生 科生物技術(shù)有限公司）；洗板機(Thermo Labsystems AC8型，芬蘭）。全自動多功能酶標儀 (Labsystems Multiskan MS 352型，芬蘭），PB602_E型分析電子天平(瑞士梅特勒-托利公 司），超低溫冰箱（中科）。
[0232] 1.2實驗材料
[0233] 1.2.1材料、試劑
[0234] ELISA試劑盒（TNF-α、PGE2、IL-6，美國RD公司）；40 % 甲醛（批號：2015062901，成都 市科龍化工試劑廠）；扶他林乳膠劑(北京諾華制藥有限公司，0.01 g/g，生產(chǎn)批號:X5012); 空白微乳(麝香壯骨膏揮發(fā)油微乳，實施例1中確定的最優(yōu)工藝制備）、麝香壯骨微乳(實施 例2中確定的最優(yōu)配比和方法制備）；甲醛溶液（成都市科龍化工試劑廠，批號： 2015062901)〇
[0235] 1.2.2 動物
[0236] SD大鼠，體重（200±20)g，48只，北京海淀興旺實驗動物養(yǎng)殖場（許可證號：SCXK (京)2014-0013) SPF級，雌雄各半。
[0237] 2.實驗方法
[0238] 2.1分組與給藥、造模
[0239] 2.1.1分組與給藥
[0240] 2.1.1.1分組
[0241] 給予適量水、食物，適應性分籠飼養(yǎng)，維持7d。將SD大鼠隨機分為6組:正常對照組 (不致炎，給等量的蒸餾水）；模型組(致炎，給等量蒸餾水）；揮發(fā)油微乳組；陽性對照組(扶 他林乳膠劑，〇.〇lg/g)。麝香壯骨微乳治療組:按給藥時間的不同將其分為兩組，編號1、2組 (即 SX-ME 1組、SX-ME 2組）。
[0242] 2.1.1.2給藥方案
[0243] 給藥方式:將致炎足(正常對照組右后足)局部浸泡于相應藥物lmin。
[0244] SX-ME 1組在致炎后0min、10min、30min各給藥1次，lmin/次。SX-ME 2組分別于致 炎前15min、致炎后0min、10min、30min各給藥1次，lmin/次。正常對照組和模型組等量的蒸 餾水浸泡相同的時間；陽性對照給予扶他林乳膠劑。給藥要求每次浸泡藥物之后吹干、按 摩。
[0245] 2.1.2造模
[0246] 在室溫恒為27°C左右的條件下，進行實驗造模、觀察。除空白對照組外，其余5組組 均用甲醛誘導大鼠炎癥痛模致炎模型造模，即：給每只大鼠右后足跖皮下注射甲醛溶液 (4%，0. lml)致炎。致炎后立即放置于自制的玻璃容器內(nèi)，并在容器下方置一傾斜30°左右 的大鏡子，以方便觀察60min內(nèi)大鼠致炎足部反應。記錄其在0~10min、10~60min內(nèi)的疼痛 反應及疼痛反應發(fā)生的時間（即，記錄致炎后至發(fā)生疼痛反應的時間），并評分疼痛反應。于 實驗結(jié)束后繪制每5min內(nèi)，各組大鼠疼痛行為學評分隨時間變化的曲線圖。
[0247] 2.2致炎大鼠行為學觀察
[0248] 2.2.1致炎足疼痛反應評分標準
[0249] 舔、咬或抖足計3分，提足計2分，輕觸地面但不負重、跛行計1分，正常負重、行走自 如計〇分。累計分=(〇 X tl+Ι X t2+2 X t3+3 X t4)，其中tl、t2、t3、t4分別為疼痛評分0、1、2、3分 的持續(xù)時間（單位:S)，進而得出各組大鼠第一相和第二相的累計分。
[0250] 2.2.3大鼠致炎足足腫脹度的測定
[0251] 分別測量大鼠致炎足致炎前后的足圍，比較各組大鼠致炎足足腫脹度之間的差 另IJ。足腫脹度=致炎后足圍一致炎前足圍。
[0252] 2.3統(tǒng)計學處理
[0253] 使用SPSS17.0,進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料、計量資料分別使用X2檢驗、t檢驗(?士s) 檢驗。Ρ〈0.05時，差異具有統(tǒng)計學意義。
[0254] 3.實驗結(jié)果
[0255] 3.1致炎大鼠疼痛行為學的變化
[0256] 3.1.1對第一相、第二相反應發(fā)生時間的影響
[0257] 模型組大鼠第一相反應發(fā)生的時間為（14.00± 13.58)s，與正常對照組比較，小于 正常對照組(600.00±0.00)，差異顯著(P<0.01)，具有統(tǒng)計學意義;相比于模型組，陽性對 照組、揮發(fā)油微乳組、SX-ME 1組、SX-ME 2組發(fā)生第一相反應的時間大于模型組，差異有統(tǒng) 計學意義(P<〇.05)。就第二相反應發(fā)生的時間而言，模型組較正常對照組發(fā)生第二相疼痛 反應的時間較小，差異顯著，P<〇.01，具有統(tǒng)計學意義;與模型組比較時發(fā)現(xiàn):空白對照組、 SX-ME 1組第二相反應發(fā)生的時間顯著高于模型組(P<0.05,有統(tǒng)計學意義）；相比于陽性 對照組，揮發(fā)油微乳組(P<0 · 05)、SX-ME 1組(P<0 · 05)、SX-ME 2組(Ρ<0 · 01)第二相反應 發(fā)生時間均延長，優(yōu)于陽性對照組，有統(tǒng)計學意義。且SX-ME 1組、SX-ME 2組的第二相反應 發(fā)生時間長于揮發(fā)油微乳組，顯著性差異(P<〇.05)，但前兩者比較無明顯差異。詳見表12。
[0258] 表12發(fā)生疼痛反應的時間比較結(jié)果（_x±s ,.n = 8)
[0259]
[0260] 注:①第一相反應發(fā)生的時間：與正常對照組比較，，<0.01;與模型組比較，ΘΡ< 0.05,差異顯著。②第二相反應發(fā)生的時間：與正常對照組比較，np<0.01;與模型組比較， Α ?<0.05，^^<0.01。與陽性對照組比較/?<0.05/卞<0.01。與揮發(fā)油微乳組比較，￥< 0.05〇
[0261 ] 3.1.2第一相、第二相疼痛行為學評分結(jié)果
[0262] 模型組大鼠第一相行為學評分總計為（1123.32±53.18)分，明顯高于正常對照組 陽性對照組、揮發(fā)油微乳組、SX-ME 1組、SX-ME 2組，差異顯著(有統(tǒng)計學意義）。對比于模型 組，正常對照組第二相行為學評分與之差異顯著(Ρ<〇.01);其余四組第二相行為學總評分 明顯小于模型組，具有統(tǒng)計學意義(Ρ < 0.01)。與陽性對照組相比，對SX-ME 1組、SX-ME 2 組、揮發(fā)油微乳組的兩相行為學評分與其均表現(xiàn)為不顯著差異，無統(tǒng)計學意義(Ρ>〇.05)。 詳見表13。
[0263] 表13行為學評分比較結(jié)果(_x_±.s:，η = 8)
[0264]
[0265] 注：①第一相行為學評分：與正常對照組比較，ΜΡ<0.01;與模型組比較， ΘΡ< 0.05,差異顯著。②第二相行為學評分:與正常對照組比較，呻<0.01;與模型組比較，^P< 0.01ο
[0266] 3.1.3時-效關(guān)系曲線的繪制
[0267] 以5min為單位，繪制60min內(nèi)各組大鼠疼痛行為學表現(xiàn)評分值的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)： 大鼠右后足經(jīng)皮下注射4%甲醛后，除正常對照組外均出現(xiàn)不同程度的舔咬或抖足、抬足等 疼痛表現(xiàn)，其中模型組大鼠的行為學反應最為明顯。不難發(fā)現(xiàn)：甲醛致炎后，各組大鼠的第 一相疼痛反應主要集中發(fā)生在第5min，并在第一相反應結(jié)束后疼痛程度逐漸減弱、疼痛評 分逐漸降低，且模型組第一相反應疼痛評分高于陽性對照組、揮發(fā)油微乳組、SX-ME 1組及 SX-ME 2組。而模型組大鼠的第二相反應在第15min左右時疼痛表現(xiàn)逐漸劇烈而使疼痛評分 逐漸升高，在第35min到第60min之間疼痛評分基本穩(wěn)定，為最高狀態(tài)，表現(xiàn)最為劇烈。揮發(fā) 油微乳組的第二相反應在第35min之后開始逐漸表現(xiàn)較為強烈，且疼痛評分持續(xù)升高。SX-ME 1組、SX-ME 2組與揮發(fā)油微乳組大鼠疼痛表現(xiàn)相似，但疼痛評分相對低于空白微乳在。 陽性對照組的第二相反應在第45min之后疼痛評分才出現(xiàn)明顯的升高，且顯著低于模型組 及其他組。見圖42。
[0268] 3.1.4致炎足足腫脹度比較結(jié)果
[0269] 與正常對照組比較，模型組大鼠致炎足足腫脹度(0.74±0.22)cm明顯高于正常對 照組(0.00 ±0.00)cm，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。SX-ME 1組、陽性對照組、SX-ME 2組足腫 脹度顯著小于模型組，具有統(tǒng)計學意義(P<〇.01);而揮發(fā)油微乳組與之比較亦具有顯著差 異(P<0.05)。將陽性對照組與SX-ME 1組、揮發(fā)油微乳組、SX-ME 2組組間比較，P > 0.05，無 統(tǒng)計學意義，詳見表14。
[0270] 表14致炎足足腫脹度比較結(jié)果(i±s ,n = 8)
[0273] 注:與正常對照組比較，ααΡ<0.01;與模型組比較，ΘΡ<0.05、 ΘΘΡ<0.01。
[0274] 4.鎮(zhèn)痛抗炎作用研究小結(jié)
[0275] 揮發(fā)油微乳及麝香壯骨微乳、扶他林對該模型下大鼠的疼痛行為學、炎性介質(zhì)、組 織形態(tài)學均有不同程度的作用。具體總結(jié)如下：
[0276] 4.1對致炎大鼠疼痛行為學的影響
[0277] 4.1.1對發(fā)生第一相疼痛反應的抑制作用：
[0278] 如表9所示，表明扶他林、揮發(fā)油微乳、麝香壯骨微乳能夠有效延遲甲醛致痛后大 鼠的第一相反應發(fā)生的時間。
[0279] 4.1.2對第二相疼痛反應發(fā)生的延遲作用：
[0280] 相較與模型組，除正常對照組外，其余四組均對第二相反應的發(fā)生表現(xiàn)出一定的 延遲作用；且SX-ME 1組和SX-ME 2組的延遲作用優(yōu)于揮發(fā)油微乳組。即：SX-ME 2組~SX-ME 1組 > 揮發(fā)油微乳組 > 陽性對照組~模型組。
[0281] 因此，研究結(jié)果表明扶他林乳膠雖然能夠顯著延遲第一相反應的發(fā)生，但對第二 相反應不能顯著延遲其發(fā)生。而揮發(fā)油微乳及麝香壯骨微乳對兩相反應均有顯著延遲作 用，后者比前者更能抑制致炎大鼠第二相反應的發(fā)生。
[0282] 4.1.3對大鼠致炎后疼痛行為學評分的影響：
[0283] ①扶他林乳膠劑、揮發(fā)油微乳、麝香壯骨微乳對甲醛致痛的第一相反應有很好的 鎮(zhèn)痛效果。②對于大鼠第二相行為學評分結(jié)果表明，四組藥物對其抑制作用強弱依次為麝 香壯骨微乳~扶他林乳膠劑>揮發(fā)油微乳>模型組。③SX-ME 1組與SX-ME 2組的行為學評 分結(jié)果差異不大，說明提前15min給麝香壯骨微乳和致炎同時給藥的這兩種方式之間鎮(zhèn)痛 效果相近。
[0284] 4丄4時-效關(guān)系曲線：
[0285] 結(jié)果說明：①甲醛致炎后大鼠的第一相與第二相反應之間有一段可以近似看作間 歇期的時段，并在某一時刻第二相反應才表現(xiàn)的更加劇烈;②陽性對照組、SX-ME 1組、SX-ME 2組中甲醛致炎大鼠的第一相、第二相反應發(fā)生規(guī)律近似于模型組，存在一定的規(guī)律，可 尋，但疼痛程度不盡相同，可以大致說明各自的鎮(zhèn)痛效果。
[0286] 4.1.5足腫脹度的改變：
[0287] ①陽性對照組、SX-ME 1組、SX-ME 2組均能夠顯著抑制大鼠致炎足的腫脹程度，組 間無顯著差異，表明扶他林乳膠劑、麝香壯骨微乳對其有抗炎作用，且作用相近，優(yōu)于揮發(fā) 油微乳組，即抑制足腫脹度的程度為:扶他林乳膠劑~麝香壯骨微乳> 揮發(fā)油微乳組 >模 型組。
[0288] ②不同時間給藥的SX-ME 2組和1組作用亦無顯著差別，抗足腫脹度作用相近。
【主權(quán)項】
1. 一種廳香壯骨揮發(fā)油的制備方法，包括如下步驟:稱取下述中藥材，經(jīng)單獨粉碎后進 行混合，然后置于水中進行浸泡;所述浸泡結(jié)束后采用水蒸氣蒸饋法進行提取，收集揮發(fā)性 成分即為所述廳香壯骨揮發(fā)油； W質(zhì)量份數(shù)計，所述中藥材的組成如下： 八角茵香3.5~4.5份， 山奈4.5~5.5份， 生川烏5.85~6.34餘， 生草烏5.85~6.34份， 麻黃5.85~6.5份， 白立7.5~8.5份， 苔術(shù)：11.5~；12.5 份， 當歸11.5~12.5份， 干姜16.5~17.5份。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:在水中浸泡的時間為0.5小時； 所述浸泡和所述提取時水的質(zhì)量用量均為:每g所述中藥材需要加入SmL所述水;所述 提取的溫度范圍為140°C~200°C ; 所述提取的時間范圍為8h~12h; 所述粉碎得到的粉末的粒徑范圍為0~60目。3. 權(quán)利要求1或2所述方法制備的廳香壯骨揮發(fā)油。4. 一種廳香壯骨微乳，其由權(quán)利要求3所述廳香壯骨揮發(fā)油、吐溫-80、無水乙醇、所述 中藥材的水提醇沉液、廳香、冰片、精腦和薄荷腦制成。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的廳香壯骨微乳液，其特征在于:所述中藥材的水提醇沉液中乙 醇的體積濃度為90 %。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的廳香壯骨微乳液，其特征在于：W質(zhì)量百分含量計，所述廳 香壯骨微乳的組成如下： 魔呑壯骨揮發(fā)油3.15%， 吐溫-80 24.35%， 無水己醇12.17%， 所述中藥材的水提醇沉液58.50%， 廳香0.20%， 減片化49%， 憧腦0.49%， 薄荷腦0.65%。7. 權(quán)利要求4-6中任一項所述廳香壯骨微乳的制備方法，包括如下步驟： 1) 利用所述無水乙醇超聲溶解所述廳香，并經(jīng)微孔濾膜過濾得到濾液； 2) 將一部分的所述薄荷腦加入到所述濾液中，然后加入所述廳香壯骨揮發(fā)油、所述吐 溫-80、所述冰片和所述精腦進行混合； 3)將步驟2)得到的混合液中加入所述中藥材的水提醇沉液和剩余量的所述薄荷腦，即 得到所述廳香壯骨微乳。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于：步驟1)中，所述超聲溶解的時間為30 分鐘； 所述微孔濾膜的孔徑為0.22皿； 步驟2)中，將所述薄荷腦質(zhì)量的1/3部分加入至所述濾液中。9. 權(quán)利要求3所述廳香壯骨揮發(fā)油或權(quán)利要求4-6中任一項所述廳香壯骨微乳在抗炎 鎮(zhèn)痛或制備抗炎鎮(zhèn)痛的藥物中的應用。10. 權(quán)利要求3所述廳香壯骨揮發(fā)油或權(quán)利要求4-6中任一項所述廳香壯骨微乳在抑制 風濕關(guān)節(jié)痛、癌痛、神經(jīng)痛或軟組織挫傷痛或制備抑制風濕關(guān)節(jié)痛、癌痛、神經(jīng)痛或軟組織 挫傷痛的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P25/00GK105902493SQ201610389567
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】季新燕, 王秀環(huán), 馮前進, 宋強, 楊李旺
【申請人】山西中醫(yī)學院