具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸?乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料及其制備方法，該透明質(zhì)酸/聚乳酸?乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料在圓柱形復(fù)合支架中存在沿徑向取向分布的管狀孔結(jié)構(gòu)，復(fù)合支架由透明質(zhì)酸和聚乳酸?乙醇酸共聚物構(gòu)成。其中透明質(zhì)酸具有誘導(dǎo)軟骨再生的能力，可以促進(jìn)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化，提高軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和沉積；聚乳酸?乙醇酸共聚物提供力學(xué)支撐。徑向取向的孔結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)周圍組織細(xì)胞向支架內(nèi)部的遷移，促進(jìn)新生組織與原生組織的物質(zhì)交換和生物信號溝通，從而提高組織的再生速度。該軟骨修復(fù)材料可以有效地誘導(dǎo)軟骨組織的原位再生，可應(yīng)用于全層軟骨缺損的修復(fù)。
【專利說明】
具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]關(guān)節(jié)軟骨是一種致密的結(jié)締組織，在緩沖關(guān)節(jié)之間的應(yīng)力，減少關(guān)節(jié)面之間的摩擦等方面起到極其重要的作用。但是關(guān)節(jié)軟骨又是很容易受損的一種組織，過度肥胖、關(guān)節(jié)炎、運動創(chuàng)傷等因素都可能給關(guān)節(jié)帶來損害，即使是小面積的缺損也存在嚴(yán)重退變的潛在風(fēng)險。由于關(guān)節(jié)軟骨致密的結(jié)構(gòu)，以及軟骨細(xì)胞自身較低的增殖能力，關(guān)節(jié)軟骨一旦受到損傷很難自我修復(fù)。因此，其結(jié)構(gòu)和功能的再生一直是臨床上一個難以完全攻克的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的軟骨修復(fù)手段有很多種，例如自體軟骨細(xì)胞移植、骨髓刺激術(shù)，骨軟骨移植等。這些方法都存在著一些問題，例如自體軟骨細(xì)胞要求病人經(jīng)歷二次手術(shù)，而且體外細(xì)胞擴(kuò)增過程難以維持軟骨細(xì)胞表型。骨髓刺激術(shù)后新生的軟骨通常是纖維化軟骨，在生物學(xué)和力學(xué)性能上遠(yuǎn)不如正常的透明軟骨。骨軟骨移植則面臨供體不足的缺點。具有關(guān)節(jié)軟骨誘導(dǎo)再生能力的支架材料能夠有效的促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨缺損部位結(jié)構(gòu)和功能的再生。傳統(tǒng)的再生醫(yī)學(xué)涉及的支架材料一般以水凝膠或無規(guī)大孔支架的形式存在。水凝膠雖然能夠保持軟骨細(xì)胞的表型，但是致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)限制了物質(zhì)的交換。對于單純利用材料誘導(dǎo)軟骨再生的研究，無規(guī)大孔結(jié)構(gòu)在一定程度上也對細(xì)胞向支架內(nèi)部的滲透和迀移產(chǎn)生了阻礙。因此，具有規(guī)則取向孔結(jié)構(gòu)的軟骨誘導(dǎo)再生支架更加有利于細(xì)胞的快速滲透以及生物信號的溝通，從而更加利于軟骨缺損的修復(fù)。尤其是具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的支架，更有利于誘導(dǎo)周圍組織細(xì)胞長入支架，并有利于其在支架中的保持作用。
[0003]選擇支架材料時需要考慮材料的軟骨誘導(dǎo)再生能力、力學(xué)性能、組織相容性、免疫原性、體內(nèi)降解性等問題。透明質(zhì)酸作為一種天然多糖，與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的粘多糖具有相似的結(jié)構(gòu)。此外，透明質(zhì)酸能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。透明質(zhì)酸作為一種抗炎制劑廣泛應(yīng)用在關(guān)節(jié)炎的治療中。而聚乳酸-乙醇酸共聚物是經(jīng)批準(zhǔn)可臨床應(yīng)用的醫(yī)用材料，復(fù)合到支架中可以提供所需的力學(xué)支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種可在軟骨缺損處原位誘導(dǎo)軟骨組織再生的具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料及其制備方法。
[0005]本發(fā)明的具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料，其特征是在圓柱形復(fù)合支架中存在沿徑向取向分布的管狀孔結(jié)構(gòu)，管狀孔的內(nèi)徑為100 μπι?150μπι，復(fù)合支架的孔隙率70%?80%，復(fù)合支架由數(shù)均分子量為100 kDa的透明質(zhì)酸和重均分子量為122 kDa的聚乳酸-乙醇酸共聚物構(gòu)成，透明質(zhì)酸與聚乳酸-乙醇酸共聚物的質(zhì)量比為1.3?1.7，聚乳酸-乙醇酸共聚物中乳酸和乙醇酸的摩爾比例為75:25。
[0006]具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料的制備方法，其步驟如下:
1)將I?3g透明質(zhì)酸完全溶解在100 mL去離子水中，攪拌條件下加入2?6 mL甲基丙稀酸酐，保持溶液PH值為8?9，溫度為O °C條件下，反應(yīng)12?24小時，反應(yīng)物經(jīng)過乙醇反復(fù)沉淀、干燥后得到甲基丙烯酸改性的透明質(zhì)酸；
2)將改性后的透明質(zhì)酸溶解在去離子水中，配制質(zhì)量濃度為5~8%的透明質(zhì)酸水溶液，將溶液置于聚乙烯模具中，于37 °C下恒溫I?2小時；
3)將聚乙烯模具置于-15?-20°C預(yù)冷的銅質(zhì)模具中，使熱量沿著徑向方向傳遞，溶劑結(jié)晶同樣沿著徑向，溶劑完全結(jié)晶后冷凍干燥，干燥后的支架在紫外光下交聯(lián)2?4小時，得到具有徑向取向孔的透明質(zhì)酸支架；
4)將聚乳酸-乙醇酸共聚物溶解在二氧六環(huán)中，配制質(zhì)量濃度為8?10%的聚乳酸-乙醇酸共聚物的二氧六環(huán)溶液，將步驟3)中得到的具有徑向取向孔的透明質(zhì)酸支架浸泡在聚乳酸-乙醇酸共聚物的二氧六環(huán)溶液中，使溶液完全滲透進(jìn)透明質(zhì)酸支架；
5)取出透明質(zhì)酸支架，冷凍干燥，得到具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料。
[0007]本發(fā)明制備過程中，所述的聚乳酸-乙醇酸共聚物，其乳酸和乙醇酸的摩爾比例為75:25。
[0008]本發(fā)明中，透明質(zhì)酸經(jīng)過甲基丙烯酸酐改性后在紫外光照射下可發(fā)生交聯(lián)，從而保持取向孔結(jié)構(gòu)。
[0009]本發(fā)明的優(yōu)點:
本發(fā)明提供的具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料，以透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物支架作為基質(zhì)，其中透明質(zhì)酸具有誘導(dǎo)軟骨再生的能力，可以促進(jìn)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化，提高軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和沉積;聚乳酸_乙醇酸共聚物提供力學(xué)支撐。特殊的徑向取向的孔結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)周圍組織細(xì)胞向支架內(nèi)部的迀移，促進(jìn)新生組織與原生組織的物質(zhì)交換和生物信號溝通。
[0010]本發(fā)明的具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料，其透明質(zhì)酸經(jīng)過甲基丙烯酸酐接枝改性，每個糖單元上平均接枝率為27.5%。支架在PBS中的溶脹率為150?200%，濕態(tài)壓縮模量為120 kPa左右。
[0011 ]透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物支架在體外培養(yǎng)過程中能誘導(dǎo)干細(xì)胞發(fā)生自聚集，繼而誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。
[0012]本發(fā)明完全基于生物材料本身具有的軟骨生成誘導(dǎo)能力，避免了傳統(tǒng)組織工程方法中使用細(xì)胞時昂貴、復(fù)雜、富有爭議的操作手段，避免了使用生長因子所存在的活性半衰期短、易失活等問題。通過材料本身的生物活性及生物體本身的自我修復(fù)機(jī)制，實現(xiàn)了目標(biāo)組織再生能力的激活和保持，從而實現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的再生。具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料移植到體內(nèi)后，表現(xiàn)出良好的生物相容性，可以實現(xiàn)軟骨缺損的原位誘導(dǎo)再生，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0013]圖1為具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料掃描電鏡圖。
[0014]圖2為具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料植入骨軟骨缺損12周后的大體觀察。
[0015]圖3為具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料植入骨軟骨缺損12周后的HE圖。
[0016]圖4為具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料植入骨軟骨缺損12周后的粘多糖染色。
[0017]圖5為具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料植入骨軟骨缺損12周后的II型膠原免疫組化染色圖。
[0018]圖6為具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料植入骨軟骨缺損12周后的軟骨及骨染色圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合實施實例對本發(fā)明作詳細(xì)說明，但這些實施例并不用于限制本發(fā)明。
[0020]實施例1:
1)將Ig透明質(zhì)酸完全溶解在100 mL去離子水中，攪拌條件下加入2 mL甲基丙烯酸酐，保持溶液PH值為8，溫度為O °C條件下，反應(yīng)12小時，反應(yīng)物經(jīng)過乙醇反復(fù)沉淀、干燥后得到甲基丙烯酸改性的透明質(zhì)酸；
2)將改性后的透明質(zhì)酸溶解在去離子水中，配制質(zhì)量濃度為5%的透明質(zhì)酸水溶液，將溶液置于聚乙烯模具中，于37 °C下恒溫I小時；
3)將聚乙烯模具置于-20°C預(yù)冷的銅質(zhì)模具中，使熱量沿著徑向方向傳遞，溶劑結(jié)晶同樣沿著徑向，溶劑完全結(jié)晶后冷凍干燥，干燥后的支架在紫外光下交聯(lián)2小時，得到具有徑向取向孔的透明質(zhì)酸支架；
4)將聚乳酸-乙醇酸共聚物溶解在二氧六環(huán)中，配制質(zhì)量濃度為8%的聚乳酸-乙醇酸共聚物的二氧六環(huán)溶液，將步驟3)中得到的具有徑向取向孔的透明質(zhì)酸支架浸泡在聚乳酸-乙醇酸共聚物的二氧六環(huán)溶液中，使溶液完全滲透透明質(zhì)酸支架；
5)取出透明質(zhì)酸支架，冷凍干燥，得到具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料。其掃描電鏡圖見圖1，由圖可見支架材料具有明顯沿徑向取向分布的管狀孔結(jié)構(gòu)。其中，管狀孔的內(nèi)徑為100 μπι-150 μπι，復(fù)合支架的孔隙率70%?80%。
[0021]實施例2:
1)將2g透明質(zhì)酸完全溶解在100 mL去離子水中，攪拌條件下加入4 mL甲基丙烯酸酐，保持溶液PH值為9，溫度為O °C條件下，反應(yīng)持續(xù)16小時，反應(yīng)物經(jīng)過反復(fù)乙醇沉淀、干燥后得到甲基丙烯酸改性的透明質(zhì)酸；
2)將改性后的透明質(zhì)酸溶解在去離子水中，配制質(zhì)量濃度為8%的透明質(zhì)酸水溶液，將溶液置于聚乙烯模具中，于37 °C下恒溫2小時；
3)將聚乙烯模具置于-15°C預(yù)冷的銅質(zhì)模具中，使熱量沿著徑向方向傳遞，溶劑結(jié)晶同樣沿著徑向，溶劑完全結(jié)晶后冷凍干燥，干燥后的支架在紫外光下交聯(lián)4小時，得到具有徑向取向孔的透明質(zhì)酸支架；
4)將聚乳酸-乙醇酸共聚物溶解在二氧六環(huán)中，配制質(zhì)量濃度為8%的聚乳酸-乙醇酸共聚物的二氧六環(huán)溶液，將步驟3)中得到的具有徑向取向孔的透明質(zhì)酸支架浸泡在聚乳酸-乙醇酸共聚物的二氧六環(huán)溶液中，使溶液完全滲透透明質(zhì)酸支架；
5)將步驟4)中的透明質(zhì)酸支架取出，冷凍干燥，得到具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料。
[0022]實施例3:
1)將3g透明質(zhì)酸完全溶解在100 mL去離子水中，攪拌條件下加入6 mL甲基丙烯酸酐，保持溶液PH值為8，溫度為O °C條件下，反應(yīng)持續(xù)24小時，反應(yīng)物經(jīng)過反復(fù)乙醇沉淀、干燥后得到甲基丙烯酸改性的透明質(zhì)酸；
2)將改性后的透明質(zhì)酸溶解在去離子水中，配制質(zhì)量濃度為8%的透明質(zhì)酸水溶液，將溶液置于聚乙烯模具中，于37 °C下恒溫1.5小時；
3)將聚乙烯模具置于-20°C預(yù)冷的銅質(zhì)模具中，使熱量沿著徑向方向傳遞，溶劑結(jié)晶同樣沿著徑向，溶劑完全結(jié)晶后冷凍干燥，干燥后的支架在紫外光下交聯(lián)4小時，得到具有徑向取向孔的透明質(zhì)酸支架；
4)將聚乳酸-乙醇酸共聚物溶解在二氧六環(huán)中，配制質(zhì)量濃度為10%的聚乳酸-乙醇酸共聚物的二氧六環(huán)溶液，將步驟3)中得到的具有徑向取向孔的透明質(zhì)酸支架浸泡在聚乳酸-乙醇酸共聚物的二氧六環(huán)溶液中，使溶液完全滲透透明質(zhì)酸支架；
5)將步驟4)中的透明質(zhì)酸支架取出，冷凍干燥，得到具有徑向取向分布的管狀孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料。其中，管狀孔的內(nèi)徑為100 μπι-150μπι，復(fù)合支架的孔隙率70%?80%。
[0023]6)將步驟5)得到的材料，移植到兔股關(guān)節(jié)滑槽的骨軟骨缺損處，其中缺損直徑和深度皆為為4毫米。12周之后缺損的修復(fù)效果，大體觀察見圖2，組織切片的HE染色結(jié)果見圖3，組織切片的粘多糖染色見圖4，11型膠原的免疫組化染色見圖5，軟骨-骨分層染色見圖6。
[0024]由圖2可見，新生軟骨表面光滑，與周圍組織的結(jié)合性良好。由圖3，圖4圖5和圖6中組織切片染色可見，缺損部位的軟骨與軟骨下骨均得到良好修復(fù)，軟骨層中具有大量的粘多糖及II型膠原的沉積，軟骨與軟骨下骨緊密結(jié)合，具有明顯的潮線結(jié)構(gòu)。說明本發(fā)明的具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料能夠有效誘導(dǎo)軟骨組織的原位再生，實現(xiàn)全層軟骨及軟骨下骨缺損的修復(fù)。
【主權(quán)項】
1.具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料，其特征是在圓柱形復(fù)合支架中存在沿徑向取向分布的管狀孔結(jié)構(gòu)，管狀孔的內(nèi)徑為100 μπ??150 μm，復(fù)合支架的孔隙率70%?80%，復(fù)合支架由數(shù)均分子量為100 kDa的透明質(zhì)酸和重均分子量為122 kDa的聚乳酸-乙醇酸共聚物構(gòu)成，透明質(zhì)酸與聚乳酸-乙醇酸共聚物的質(zhì)量比為1.3?1.7，聚乳酸-乙醇酸共聚物中乳酸和乙醇酸的摩爾比例為75:25。2.具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料的制備方法，其步驟如下: 1)將I?3g透明質(zhì)酸完全溶解在100 mL去離子水中，攪拌條件下加入2?6 mL甲基丙稀酸酐，保持溶液PH值為8?9，溫度為O °C條件下，反應(yīng)12?24小時，反應(yīng)物經(jīng)過乙醇反復(fù)沉淀、干燥后得到甲基丙烯酸改性的透明質(zhì)酸； 2)將改性后的透明質(zhì)酸溶解在去離子水中，配制質(zhì)量濃度為5~8%的透明質(zhì)酸水溶液，將溶液置于聚乙烯模具中，于37 °C下恒溫I?2小時； 3)將聚乙烯模具置于-15?-20°C預(yù)冷的銅質(zhì)模具中，使熱量沿著徑向方向傳遞，溶劑結(jié)晶同樣沿著徑向，溶劑完全結(jié)晶后冷凍干燥，干燥后的支架在紫外光下交聯(lián)2?4小時，得到具有徑向取向孔的透明質(zhì)酸支架； 4)將聚乳酸-乙醇酸共聚物溶解在二氧六環(huán)中，配制質(zhì)量濃度為8?10%的聚乳酸-乙醇酸共聚物的二氧六環(huán)溶液，將步驟3)中得到的具有徑向取向孔的透明質(zhì)酸支架浸泡在聚乳酸-乙醇酸共聚物的二氧六環(huán)溶液中，使溶液完全滲透進(jìn)透明質(zhì)酸支架； 5)取出透明質(zhì)酸支架，冷凍干燥，得到具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合軟骨修復(fù)材料的制備方法，其特征是所述的聚乳酸-乙醇酸共聚物，其乳酸和乙醇酸的摩爾比例為75:25。
【文檔編號】A61L27/26GK105903085SQ201610366083
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】高長有, 代元坤
【申請人】浙江大學(xué)