通過(guò)施用物質(zhì)p(sp)逆轉(zhuǎn)新近發(fā)作的1型糖尿病(t1d)的方法
【專(zhuān)利摘要】本文描述了包括下述步驟的治療：(a)向個(gè)體的腹腔動(dòng)脈注射治療有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物逆轉(zhuǎn)新近發(fā)作的1型糖尿病(T1D)。還描述了用于鑒定將響應(yīng)該治療的個(gè)體的方法。此外，描述了用于將所述藥物組合物注射進(jìn)所述腹腔動(dòng)脈的包含所述藥物組合物的裝置。
【專(zhuān)利說(shuō)明】通過(guò)施用物質(zhì)P(SP)逆轉(zhuǎn)新近發(fā)作的1型糖尿病(T1D)的方法
[0001]發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及新近發(fā)作的1型糖尿病(T1D)的神經(jīng)肽療法。
[0003] 相關(guān)技術(shù)
[0004] 治療和管理1型糖尿病(T1D)的當(dāng)前方法包括胰島素替代療法、胰腺移植以及胰島 細(xì)胞移植。胰島素替代療法是飽受副作用的具有挑戰(zhàn)性且不舒服的終身過(guò)程，并且其不能 治愈T1D。臨床挑戰(zhàn)是在分分鐘變化需求的控制下調(diào)整胰島素釋放的必要性。實(shí)行的胰島素 替代療法挽救了生命，但是不能防止最終使小血管和大血管的功能退化的低血糖和高血糖 事件的慢性演替，伴隨著廣泛地漸進(jìn)性組織損壞和神經(jīng)病變。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 根據(jù)一個(gè)寬泛方面，本發(fā)明提供了包括下述步驟的方法：（a)將治療有效量的藥物 組合物注射進(jìn)個(gè)體的腹腔動(dòng)脈，其中藥物組合物至少部分逆轉(zhuǎn)新近發(fā)作的1型糖尿病 (TlD)〇
[0007] 根據(jù)第二寬泛方面，本發(fā)明提供了用于將藥物組合物注射進(jìn)個(gè)體的腹腔動(dòng)脈的裝 置，其中所述裝置包含治療有效量的藥物組合物，并且其中所述藥物組合物至少部分逆轉(zhuǎn) 新近發(fā)作的1型糖尿病(T1D)。
[0008] 根據(jù)第三寬泛方面，本發(fā)明提供了包括下述步驟的方法：（a)鑒定患有新近發(fā)作的 1型糖尿病(T1D)的個(gè)體，所述個(gè)體將積極響應(yīng)向個(gè)體的腹腔動(dòng)脈注射治療有效量的藥物組 合物，其中所述藥物組合物至少部分逆轉(zhuǎn)個(gè)體中的新近發(fā)作的1型糖尿病(T1D)。
[0009] 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0010] 并入本文且構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的一部分的附圖闡明了本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，并且 連同上文給出的一般描述和下文給出的詳細(xì)描述來(lái)解釋本發(fā)明的特征。
[0011] 圖1為顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案向個(gè)體的腹腔動(dòng)脈注射藥物組合物的導(dǎo)管 的圖。
[0012] 圖2為顯示胰腺動(dòng)脈內(nèi)注射物質(zhì)P(sP)之后，新近發(fā)作的糖尿病小鼠中血糖水平的 變化的圖。
[0013] 圖3為顯示攜帶致糖尿病的T細(xì)胞受體(TCR)的轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠的胰腺淋巴結(jié)內(nèi) CFSE T細(xì)胞增殖分析的圖。
[0014] 圖4為1型糖尿病新近發(fā)作和胰腺動(dòng)脈內(nèi)遞送物質(zhì)P之后的典型的不再浸潤(rùn)的胰島 的圖像。
[0015] 圖5為顯示胰腺動(dòng)脈內(nèi)注射物質(zhì)P和伊文斯藍(lán)染料標(biāo)志物之后，小鼠中血管擴(kuò)張的 胰腺組織的圖像(觀察:胰腺選擇性灰藍(lán)著色）。
[0016] 圖6為示例整體研究計(jì)劃的替代結(jié)果模型(alternative outcome model)的圖。
[0017] 圖7顯示了可用于本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的DNA采集試劑盒。
[0018] 優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述
[0019] 當(dāng)術(shù)語(yǔ)的定義脫離該術(shù)語(yǔ)的常用含義時(shí)，
【申請(qǐng)人】意圖使用下文提供的定義，除非 明確指明。
[0020] 出于本發(fā)明的目的，如果數(shù)值、確定或特性是利用所述數(shù)值、特性或其它因素，通 過(guò)進(jìn)行數(shù)學(xué)計(jì)算或邏輯判定得到的，則所述值、確定或特性"基于"該具體數(shù)值、數(shù)據(jù)、信息、 特性、病況的滿意度或其它因素。例如，個(gè)體患有1型糖尿病(T1D)的確定基于獲自來(lái)自個(gè)體 的唾液樣本的DNA。
[0021 ]出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"導(dǎo)管"指有助于接近胰腺的從醫(yī)用級(jí)材料擠壓的薄管。
[0022] 出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"個(gè)體"指哺乳動(dòng)物。例如，術(shù)語(yǔ)"個(gè)體"可以指人類(lèi)個(gè)體。
[0023] 出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"神經(jīng)肽"指由感覺(jué)傳入神經(jīng)元釋放的以與其受神經(jīng)支配 的靶組織通訊的小蛋白樣分子或肽。
[0024] 出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"新近發(fā)作的1型糖尿病(T1D)"指在逆轉(zhuǎn)療法之前發(fā)病至 多30個(gè)月的臨床疾病。
[0025] 出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"積極響應(yīng)向個(gè)體的腹腔動(dòng)脈注射治療有效量的藥物組 合物"指對(duì)所述個(gè)體而言該藥物組合物的注射將至少部分逆轉(zhuǎn)其新近發(fā)作的1型糖尿病 (T1D)的影響的個(gè)體。
[0026] 出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"治療有效量"指向個(gè)體施用的有效地完全或至少部分逆 轉(zhuǎn)個(gè)體中新近發(fā)作的1型糖尿病的物質(zhì)P的量。
[0027] 出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"1型糖尿病(T1D)"指由自身免疫破壞或胰腺產(chǎn)生胰島素 的β細(xì)胞的去分化導(dǎo)致的糖尿病形式。
[0028] 描述
[0029] 瞬時(shí)受體電位香草酸亞型_1(神經(jīng)元Ca++_通道，TRPV1)是感覺(jué)傳入神經(jīng)或"疼痛" 神經(jīng)中主要的熱敏蛋白。當(dāng)被激活時(shí)，這些神經(jīng)釋放非常小的生物介質(zhì)神經(jīng)肽，如11個(gè)氨基 酸的物質(zhì)Pc^sP使動(dòng)脈變寬，并吸引了TRPV1被激活的區(qū)域中的免疫系統(tǒng)的許多元件。已知 TRPV1產(chǎn)生介導(dǎo)的熱感覺(jué)。已知由通過(guò)激活的TRPV1神經(jīng)末梢釋放的sP所產(chǎn)生的灼熱感(在 腦中產(chǎn)生)和局部血管舒張/充血(變紅)導(dǎo)致皮膚感覺(jué)熱損傷(~45°C):遇到"熱"的某物時(shí) 初學(xué)走路的孩子習(xí)得的"哎喲"應(yīng)答。
[0030] SP/SP-受體(也被稱(chēng)作NK1R-)通路基本普遍，在不同的組織/器官隔室中具有多種 作用、一般作用和組織特異性作用。在本文件的工作中，根據(jù)獨(dú)立檢索，關(guān)于不同的體內(nèi)或 體外相互作用和效果，估計(jì)有多于30,000篇科學(xué)文章利用、測(cè)量、定位sP及其同源神經(jīng)肽 (CGRP)。當(dāng)查詢(xún)"物質(zhì)P"時(shí)，目前的NIH trials. gov注冊(cè)網(wǎng)站列出了近2000條當(dāng)前的臨床試 驗(yàn)。
[0031] SP作為神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用，并且沿SP/NK1R通路的中樞神經(jīng)傳遞新近被鑒定為多 種神經(jīng)精神性病況焦慮、抑郁、憂慮、恐懼、偏頭疼以及不同的壓力綜合征的病理生理學(xué)中 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，大大超出了其在急性和慢性疼痛、痛覺(jué)缺失、嘔吐中的早期公認(rèn)的作用-在 健康和疾病中涉及sP/sP受體軸的進(jìn)程的列表仍在發(fā)展(Haneda等人，2007 29;Michelgard等 人，200730)。
[0032] 存在TRPV樣感受器家族，其中TRPV1是基本成員以及最廣泛表達(dá)的成員（Dorf man 等人，20104)。在大腦中，TRPV1整合了多個(gè)不同的身體位圖。當(dāng)你使你的腳趾發(fā)癢、折斷、灼 傷或冷凍時(shí)，所述感覺(jué)由TRPV1家族成員感受到，向相關(guān)的腦中樞發(fā)出信號(hào)，然后你的意識(shí) 產(chǎn)生癢或痛的感覺(jué)。然而，由于小"神經(jīng)肽"如SP的局部釋放，腳趾將會(huì)腫脹。它們發(fā)出組織 損傷的信號(hào)并引起利于腳趾免于惡化和重復(fù)損傷/應(yīng)激的逃避應(yīng)答。
[0033]已對(duì)糖尿病進(jìn)行了數(shù)十年研究的一組研究者差不多十年前就研究了朗格漢斯胰 島中產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞。這些研究者對(duì)漂浮于提供大量消化酶的緊密堆積的外分泌胰腺 組織中的這些島內(nèi)部和外部觀察到的密集的神經(jīng)系統(tǒng)元件感到困惑(Winer等人，2003 2，。 該神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)部分中突出的是大量的TRPV1+感覺(jué)神經(jīng)，它們的作用是違反直覺(jué)的：TRPV1熱 感受器在胰腺中的作用是什么_45°C的胰腺溫度與生命真不兼容。
[0034]事實(shí)上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(Razavi等人，20069)，在小鼠模型中，通過(guò)功能性辟田胞的逐漸 丟失，動(dòng)物發(fā)展成糖尿病，因?yàn)樗鼈兊腡RPV1基因具有產(chǎn)生分泌缺陷的兩個(gè)編碼突變，僅釋 放〈5% 的神經(jīng)肽，包括sP(Razavi等人，20069; Tsui等人，200812; Tsui等人，200715): sP是β細(xì) 胞的生長(zhǎng)因子和存活因子。存在局部控制回路，其中局部胰島素結(jié)合TRPV1末端的胰島素受 體，這在未向大腦傳入信號(hào)的情況下激活了釋放局部的sP的通道。在有T1D傾向的小鼠中 (以及也在糖尿病患者中，參見(jiàn)下文），辟田胞在一段時(shí)間克服了sP分泌缺陷，誘導(dǎo)更多sP和 胰島素從"它們的"TRPV1+神經(jīng)末梢釋放。但是過(guò)多的胰島素(被稱(chēng)作胰島素過(guò)多）引起血糖 過(guò)低，低血糖，并且身體的其余部分通過(guò)增加對(duì)胰島素的抗性進(jìn)行斗爭(zhēng)-向?qū)λ鼈兊拇婊钜?子sP已經(jīng)饑餓的細(xì)胞加壓的逐步惡化循環(huán)。疾病發(fā)作之前胰島素過(guò)多和胰島素抗性對(duì)于 小鼠模型是典型的，并且對(duì)于具有1型糖尿病高風(fēng)險(xiǎn)的年輕患者來(lái)說(shuō)也是典型的（Tsui等 人，2011 14)，事實(shí)上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這甚至對(duì)于具有2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的成年患者也是真的(Winer 等人，201118; Winer等人，200919)。
[0035] 物質(zhì)P(sP)的胰腺遞送在數(shù)小時(shí)內(nèi)逆轉(zhuǎn)了小鼠中新近發(fā)作的1型糖尿?。═1D) (Razavi等人，Cell :20069)。胰島中近乎同步的sP受體結(jié)合重置了調(diào)節(jié)回路，并全面逆轉(zhuǎn)了 辟田胞的壓力。這一在T1D患者中提出的初期轉(zhuǎn)化研究旨在確定動(dòng)脈內(nèi)（i .a.)胰腺sP注射是 否安全，并為細(xì)胞的再分化和-功能、增加的細(xì)胞量、在胰島素抗性和葡萄糖耐受性正常 化的情況下逆轉(zhuǎn)胰島素過(guò)多、以及局部糖尿病自身免疫性的下調(diào)帶來(lái)持久的希望，如同其 在相關(guān)動(dòng)物模型中所實(shí)現(xiàn)的(Tsui等人，Diabetes Metab ·Res ·Rev: 201114)。
[0036] 物質(zhì)P發(fā)現(xiàn)于約80年前，已被廣泛用于人類(lèi)臨床研究中，具有至多罕見(jiàn)的不良事 件，在某種程度上反映了其一分鐘或更少的極短的組織半衰期。人類(lèi)臨床sP試驗(yàn)的數(shù)十年 經(jīng)驗(yàn)證明其沒(méi)有毒性。選擇的更近期的臨床sP試驗(yàn)的出版物，和關(guān)于T1D緩解（"蜜月"）期的 T1D的神經(jīng)元元件的分析文本以及對(duì)sP在胰腺炎中的作用的研究綜述見(jiàn)于加拿大衛(wèi)生部臨 床試驗(yàn)組的CTA提案的研究者手冊(cè)第1.2.3模塊。
[0037] sP是無(wú)毒的llmer神經(jīng)肽，具有極短的組織半衰期，其主要由感覺(jué)的傳入感覺(jué)神經(jīng) 釋放。WWW. trials .gov仍列出了近2000項(xiàng)涉及sP、sP激動(dòng)劑和/或sP詰抗劑的當(dāng)前試驗(yàn)，在 其中或較早的文獻(xiàn)中顯著地未注意到可歸因于sP的不良事件。盡管在臨床使用其它神經(jīng)肽 (例如1^!^冊(cè)、0^、6!11^、生長(zhǎng)激素釋放抑制激素)時(shí)使人回憶起沒(méi)有毒性的該方面，但是 sP的短的組織半衰期目前為止已妨礙了臨床用途。在在此提出的研究中，短的半衰期變成 了優(yōu)勢(shì)，其允許嚴(yán)格地局部胰腺藥物遞送，具有很少的全身性泄露卻具有極好的局部功效 (Razavi等人，Cell: 20069;Tsui等人，Diabetes : 200812;Tsui等人，Vanilloid Receptor TRPVlin Drug Discovery:Targeting Pain and Other Pathological Disorders：201013； Tsui等人，Diabetes Metab Res Rev:201114;Tsui等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.:200816)。
[0038] 這些動(dòng)物數(shù)據(jù)表明，向患糖尿病的胰腺的單一sP遞送通過(guò)以下的兩種協(xié)同機(jī)制迅 速(一夜)且持久地清除炎癥損傷：1.立即減輕β細(xì)胞的壓力，伴隨著持久存活支持(Razavi 等人，Cel 1:20069)以及（可能地）重新激活去分化或靜止的β細(xì)胞（Talchai等人， Nat.Genet. :20121Q;Talchai等人，Cell :201211);2.新近激活的胰腺和局部淋巴組織中的 炎性病變的sP受體介導(dǎo)的快速、選擇性凋亡消除。像在所有的組織中一樣，sP的胰腺動(dòng)脈內(nèi) 注射引起短暫的（數(shù)分鐘）、劑量依賴(lài)的充血。在實(shí)驗(yàn)條件下，這可以通過(guò)在前注射雨蛙肽 (有效的胰腺毒素）而擴(kuò)展為短暫的胰腺炎樣反應(yīng)(Koh等人，J. Cell.Mol.Med. :20117)。在 無(wú)此類(lèi)預(yù)處理的情況下，尚未觀察到嚙齒動(dòng)物中的sP胰腺毒性，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，即使大的sP 劑量在大型動(dòng)物(狗）的研究中也無(wú)胰腺毒性。擴(kuò)展對(duì)兒童的潛在毒性的認(rèn)識(shí)是本研究的主 要目標(biāo)。
[0039] 最近，基于數(shù)千項(xiàng)以前的sP試驗(yàn)，基本上首次在動(dòng)物模型中實(shí)現(xiàn)了該目標(biāo)，這為將 該生理學(xué)治療策略轉(zhuǎn)化至患者而無(wú)全身性的毒性提供了強(qiáng)的理論基礎(chǔ)和推動(dòng)。
[0040] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如圖1所示，使用包含藥物組合物的導(dǎo)管112將治療 有效量的藥物組合物注射進(jìn)個(gè)體的腹腔動(dòng)脈114,從而部分逆轉(zhuǎn)新近發(fā)作的1型糖尿病 (T1D)。將導(dǎo)管112與藥物組合物的供給(未在圖1中示出）相連。還在圖1中示出了胰腺122、 脾臟124、胃126、十二指腸128、脾動(dòng)脈142、門(mén)靜脈144以及脾靜脈146。
[0041] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這樣注射的藥物組合物可完全逆轉(zhuǎn)新近發(fā)作的T1D。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可以短暫地(持續(xù)數(shù)月至數(shù)年)逆轉(zhuǎn)新近發(fā)作的T1D。在 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物有助于胰腺中的辟田胞儲(chǔ)存、產(chǎn)生和釋放胰島素。在 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含神經(jīng)肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合 物包含物質(zhì)P。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將物質(zhì)P溶于藥物組合物的鹽水中。
[0042] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如圖1所示進(jìn)行治療的個(gè)體被診斷患有1型糖尿病 (T1D)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述個(gè)體為人。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述個(gè)體為人 時(shí)，藥物組合物的治療有效量為至少ΙΟηΜ/kg。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述個(gè)體為人時(shí)，藥物 組合物的治療有效量為至少50nM/kg。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述個(gè)體為人時(shí)，藥物組合物 的治療有效量為至少l〇〇nM/kg。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述個(gè)體為人時(shí)，藥物組合物的治療 有效量為至少250nM/kg。
[0043] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了糖尿病發(fā)展中的意外的神經(jīng)元元素（Tsui等人，Rev Endocr .Metab·Disord· : 2003;Winer等人，Nat Med: 200317)。隨后，已經(jīng)證實(shí)（Razavi等人， Cell :20069)，TID發(fā)展的關(guān)鍵元素是胰腺sP缺乏，反映了NOD小鼠 TRPV1基因的突變。這些突 變產(chǎn)生低功能/低分泌表型（Tsui等人，Vanilloid Receptor TRPV1 in Drug Discovery: Targeting Pain and Other Pathological Disorders : 201013; Tsui等人，Trends Mol.Med. :200715)〇
[0044] 在無(wú)任何胰島素療法的情況下，經(jīng)由腹腔動(dòng)脈的單一胰腺sP注射逆轉(zhuǎn)了4-6月齡 的N0D小鼠中新近發(fā)作的T1D，4-6月齡的時(shí)期大約相當(dāng)于人的約6-8歲（Tsui等人， Diabetes: 200812)。
[0045]人TRPV1是非常多態(tài)的，其中在高加索人群和亞洲人群中有數(shù)千種不同的等位基 因組合，然而在低T1D發(fā)生率的地區(qū)例如非洲，它是單態(tài)基因（Dorfman等人，Vanilloid Receptor TRPVlin Drug Discovery: Targeting Pain and Other Pathological Disorders: 20104)。對(duì)超過(guò)8000名高加索人T1D患者和對(duì)照的測(cè)序證明了TRPV1等位基因選 擇的重大偏差，在轉(zhuǎn)染研究中他們共有顯著的低功能表型（未發(fā)表的中間結(jié)果，Toronto-Pittsburgh-Helsinki TRPVlconsortium)〇
[0046]通過(guò)新近開(kāi)發(fā)的HNKlR(sP受體)連接分析已直接證明了大多數(shù)TID患者有全身性 sP缺乏，發(fā)現(xiàn)在一級(jí)親屬的相當(dāng)大的子集中有中等水平的sP缺乏(Cheung，R. K等人，手稿在 準(zhǔn)備中）。
[0047]之前發(fā)現(xiàn)的TRPVl、i3細(xì)胞和自身免疫之間的基本關(guān)系擴(kuò)展到了代謝綜合征和2型 糖尿病，強(qiáng)調(diào)了神經(jīng)元控件在糖尿病內(nèi)分泌學(xué)中的基本作用（Tsui等人，Diabetes Metab Res Rev: 201114;Winer等人，Nat Med: 201118;Winer等人，Nat Med: 200919)。
[0048]最近已完成了在狗中的大型動(dòng)物研究，其尋找經(jīng)腹腔動(dòng)脈的sP胰腺注射之后，sP 引起的胰腺毒性的證據(jù)。利用重復(fù)性生化血液測(cè)試的廣泛篩選(>1200個(gè)分析）以及與提出 的試驗(yàn)無(wú)關(guān)的由獸醫(yī)病理學(xué)家在多倫多大學(xué)表型基因組中心盲目實(shí)施的大量組織病理學(xué) 研究，在研究相關(guān)的劑量范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)藥物引起的毒性。注射由病童醫(yī)院的臨床影像團(tuán)隊(duì) 實(shí)施。由于該VanilloidGenetics發(fā)起的研究不太可能被單獨(dú)發(fā)表，因而在方案附錄中提供 了摘錄的影像數(shù)據(jù)，如用共注射的惰性藍(lán)色染料標(biāo)志物所測(cè)量的，其顯示了胰腺選擇性的、 迅速短暫（~7分鐘）的sP效應(yīng)，。短暫的生理學(xué)sP應(yīng)答(充血-胰腺-選擇性過(guò)度灌注和外 滲-正常的胰腺外觀)闡明了期望在T1D患者中被復(fù)制的核心作用。
[0049]所述研究有三個(gè)階段(A、B、C)，其應(yīng)用了所有患者最終均接受干預(yù)的交叉設(shè)計(jì):階 段A，毒性和sP劑量探索，12名患者;階段B，有限的功效測(cè)試，40名隨機(jī)患者，交叉設(shè)計(jì);階段 C，對(duì)所有患者隨訪6個(gè)月，可能將隨訪延長(zhǎng)6個(gè)月。
[0050] 階段A的主要目的是確定用彡0.2pm〇le/mL的基礎(chǔ)c-肽水平在新近(〈30個(gè)月）發(fā)作 的1型糖尿病患者中進(jìn)行的sP的胰腺遞送是否伴有意外的不良事件。階段A的第二目的是比 較注射前和注射后20-22天的混合餐耐受試驗(yàn)(MMTT)數(shù)據(jù)，以確定10、50、10(M250nmole/ kg體重劑量的sP注射(每一劑量3例患者)是否改善了胰島素需求和/或基礎(chǔ)c-肽水平或刺 激的c-肽水平。如果一名或多名階段A患者最初接受了無(wú)效的小劑量，則可以在試驗(yàn)即將結(jié) 束時(shí)提供有效劑量。
[0051] 階段B的主要目的是確定在干預(yù)后3周刺激的（MMTT)C-肽水平顯著高于基線水平 的sP治療患者（"應(yīng)答者"）的普遍性。階段B的第二目的是確定在干預(yù)后3周，應(yīng)答者是否顯 示出減少的胰島素需求、改善的胰島素過(guò)多以及改善的/正?；奶茄?MMTT數(shù)據(jù)）。
[0052] 階段C的主要目的確定在干預(yù)后6個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間，應(yīng)答者是否維持了治療效果， 如果隨訪被延長(zhǎng)，則改變預(yù)先計(jì)劃的DSMB批準(zhǔn)的方案。
[0053]這些研究目的承認(rèn)逐步式方法的最初轉(zhuǎn)化努力的事實(shí)以測(cè)試其潛在的臨床效用， 證實(shí)不存在意外的毒性并產(chǎn)生兩個(gè)核心功能性問(wèn)題的試探性回答:人T1D是否像小鼠 T1D- 樣對(duì)sP應(yīng)答，以及此類(lèi)效果的可能的壽命是多長(zhǎng)？
[0054] 使研究目的與之前公開(kāi)的動(dòng)物研究盡可能近地類(lèi)似(Razavi等人，Cell:20069; Tsui等人，Vanilloid Receptor TRPVlin Drug Discovery:Targeting Pain and Other Pathological Disorders:2010 13;Tsui等人，Trends Mol.Med. :200715，Tsui等人，Ann N Y Acad. Sci. :200816)。臨床上，該發(fā)作后的研究基于2012年出版物-TID發(fā)作后第一個(gè)2年的 NIH-試驗(yàn)網(wǎng)絡(luò)元研究（TrialNet meta study) (Greenbaum等人，Diabetes: 20125)和共同記 錄發(fā)病后意外減緩的3細(xì)胞死亡/喪失的研究報(bào)道〇&1(^&丨等人，似16611的. ：20121(); Talchai 等人，Cell:2012n)。
[0055]確認(rèn)關(guān)于sP的不同結(jié)論的多種方法之一 (1^1^，201013;1^1^等人，200813)是將# 注射進(jìn)新近糖尿病小鼠的胰腺，這是一種相當(dāng)良性的療法，因?yàn)閟P是十分脆弱的生理性無(wú) 毒分子，并通過(guò)專(zhuān)用的且非特異的蛋白水解降解以及在數(shù)秒內(nèi)與組織中常見(jiàn)的NK1R的結(jié)合 而失活。如圖2所示，注射sP的糖尿病小鼠對(duì)治療迅速應(yīng)答，使血糖和急性糖尿病中典型的 其它代謝異常正常化。用介質(zhì)（鹽水)注射的對(duì)照動(dòng)物只能迅速死于糖尿病。在某種程度上 讓人聯(lián)想到重新啟動(dòng)故障的計(jì)算機(jī)，sP的注射具有持久的效果，重建了正常的胰島素控制 (持續(xù)數(shù)月），盡管糖尿病將最終復(fù)發(fā)-但是將再次響應(yīng)單一 sP注射。
[0056]其中，sP的作用具有幾方面，顯著的作用依然是作為促進(jìn)細(xì)胞再生/再分化的辟田 胞存活因子。然而，意外的益處是，在激活期間，在短暫的時(shí)間內(nèi)造血細(xì)胞(包括靶向胰島和 辟田胞的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞)對(duì)sP高度敏感:與sP受體結(jié)合短暫的時(shí)間，設(shè)置了通過(guò)細(xì)胞 凋亡、程序化死亡應(yīng)答的形式殺死各淋巴細(xì)胞的死亡信號(hào)。事實(shí)上，免疫系統(tǒng)通常利用sP來(lái) 終止每天的免疫應(yīng)答:在經(jīng)受免疫應(yīng)答的炎性組織中，起始和限制所述過(guò)程都是必要的。圖 3為胰腺淋巴結(jié)（自身免疫性淋巴細(xì)胞的"繁殖場(chǎng)所"）中發(fā)生情況的簡(jiǎn)介(snap shot)。對(duì)這 些自身免疫性T細(xì)胞的體內(nèi)增殖進(jìn)行測(cè)量，作為通過(guò)細(xì)胞分裂的克隆擴(kuò)增的波，圖中的各個(gè) 峰代表胰腺淋巴結(jié)內(nèi)的1次細(xì)胞分裂:在糖尿病對(duì)照(312)中存在多次分裂，即它們迅速產(chǎn) 生更多能殺死分泌胰島素的辟田胞的自身免疫性T細(xì)胞。如圖3所示，sP處理的小鼠（314)中 的大多數(shù)T細(xì)胞完全不分裂(粉色陰影），事實(shí)上它們已經(jīng)死亡。然而同時(shí)接受sP受體(NK1R) 拮抗劑的sP處理的小鼠（316)顯示出至少三分之二的致病性T細(xì)胞克隆的存活。因此，sP注 射促進(jìn)了辟田胞的存活、再生和再分化，同時(shí)在同一時(shí)間選擇性地消除了介導(dǎo)辟田胞死亡和 糖尿病的自身免疫性細(xì)胞池(Razavi等人，2006 9; Tsui等人，200812; Tsui等人，200715)。 [0057]在將sP動(dòng)脈內(nèi)（腹腔動(dòng)脈)注射進(jìn)新近發(fā)作的糖尿病小鼠的之前的研究中（Razavi 等人，20069)，未在0.01-250nM sP/kg的劑量范圍內(nèi)觀察到與胰腺炎一致的胰腺病理(標(biāo)準(zhǔn) 劑量為 l-l〇nM/kg)。
[0058] 圖4顯示了來(lái)自患有新近發(fā)作的1型糖尿病的小鼠的胰島。上部顯示了注射了sP的 小鼠 （lnM sP/kg)的干凈的、不再發(fā)炎的胰島。圖5顯示了來(lái)自注射了介質(zhì)（鹽水）的對(duì)照糖 尿病小鼠的浸潤(rùn)的胰島。兩個(gè)胰島均被正常的外分泌性胰腺組織包圍，而沒(méi)有對(duì)胰腺炎而 g典型的任何損傷。
[0059] 當(dāng)前正在進(jìn)行利用現(xiàn)代胰腺炎診斷法在狗中進(jìn)行胰腺sP注射的大型動(dòng)物研究 (Mansfield等人，201133)，以及用于檢測(cè)可能的胰腺炎損傷的組織病理學(xué)。預(yù)期在撰寫(xiě)該文 本的約兩周內(nèi)完成數(shù)據(jù)，以及時(shí)趕上期待的臨床測(cè)試申請(qǐng)案前置會(huì)議。狗是大型動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 模型的合理選擇，因?yàn)楣纷园l(fā)地發(fā)展胰腺炎，其已成功用于實(shí)驗(yàn)性胰腺炎的研究中，并且可 使用測(cè)試良好的診斷法(Trivedi等人，2011 34)。
[0060] 利用通常采用的伊文斯蘭染料示蹤策略，聚焦于sP的作用的胰腺炎誘導(dǎo)的典型 (主要是嚙齒動(dòng)物)研究證明了藥物的血管舒張效果，并且事實(shí)上，之前公開(kāi)的sP注射數(shù)據(jù) 記錄了相同的效果(Razavi等人，2006 9)，參見(jiàn)圖5。在圖5中，通過(guò)箭頭512指示胰腺組織。
[0061] 除sP注射之后短暫的、瞬時(shí)的（數(shù)分鐘）組織過(guò)度灌注之外，藥物不引起組織損傷 或胰腺炎樣疾病。對(duì)于疾病誘導(dǎo)，標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)胰腺炎模型采用多次高劑量注射毒性促分泌 素雨蛙肽(Koh等人，20117)。
[0062] 該方案重復(fù)了自發(fā)性胰腺炎的許多方面，包括胰腺腺泡細(xì)胞(胰腺炎發(fā)展的活性 部位）中內(nèi)源性sP和sP受體的表達(dá)的升高。在外分泌性胰腺中，sP/sP受體的升高是NFkB促 炎性轉(zhuǎn)錄通路的一部分，并且在用雨蛙肽誘導(dǎo)之后3-4天開(kāi)始在疾病進(jìn)程中發(fā)揮作用(Chan and Leung，201131;Hasel等人，20 0 536;Wan等人，20 0 835)。
[0063] 雖然sP是表征炎癥性胰腺炎損傷的許多元素之一，但是它不會(huì)引起腺泡細(xì)胞中該 轉(zhuǎn)錄通路的激活。雖然sP長(zhǎng)期以來(lái)一直是由組織損傷引起的多分子應(yīng)答程序的成員，但是 事實(shí)上sP與其受體NK1R的結(jié)合可以傳輸有效的抗炎網(wǎng)絡(luò)信號(hào)，這解釋了在NKlR nu11敲除的 小鼠中針對(duì)組織損傷的某些炎癥性應(yīng)答的增加的嚴(yán)重性(Dib等人，200932)。
[0064] 注射方案被描述為:在實(shí)時(shí)成像的控制下，將股動(dòng)脈導(dǎo)管放至于腹腔動(dòng)脈之后，在 3分鐘時(shí)間內(nèi)注射劑量探索的8?的量或者階段8的研究干預(yù)劑量（10、50、100或2501^#/1^ BW，溶于5或10mL鹽水中（參見(jiàn)上文））。理論基礎(chǔ):在所有小鼠研究中使用穩(wěn)定速率注射，在 犬類(lèi)研究中比較了定時(shí)交替速率注射，而未發(fā)現(xiàn)任何差別。
[0065]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，向患者施用的sP的量可以是ΙΟ-lOOnM sP/kg BW，溶 于5或10ml鹽水中。
[0066]在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，向患者施用的sP的量可以是100-250nM sP/kg BW， 溶于5或10ml鹽水中。
[0067]如圖6所示，整體研究計(jì)劃基于這樣的假設(shè)：如果干預(yù)具有與在N0D小鼠中觀察到 的效果相當(dāng)?shù)男Ч?，則這些應(yīng)當(dāng)至少在一定程度上與所述生物學(xué)類(lèi)似。因此，對(duì)T1D內(nèi)分泌 學(xué)的期望效果應(yīng)當(dāng)：（1)在注射短齡的sP之后迅速發(fā)生(612)，以及(2)c-肽(或其它度量(參 見(jiàn)圖6的圖注)應(yīng)當(dāng)遵循所顯示的一種或多種可能的結(jié)果(622、624、626和628)。
[0068] 在干預(yù)后第20天，通過(guò)混合餐耐受試驗(yàn)（MMTT)測(cè)量這些結(jié)果（632、634、636和 638)。將應(yīng)答者定義為遵循A線路（line)、B線路或C線路、無(wú)應(yīng)答者為D線路。然后所有患者 在標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理下進(jìn)入6個(gè)月的隨訪(階段C)-盡管可能必須改變對(duì)應(yīng)答者的監(jiān)督和療法，這取 決于他們的T1D狀態(tài)。
[0069] 該研究被描述為非盲的、隨機(jī)的交叉臨床試驗(yàn)。最短持續(xù)時(shí)間：最后的患者接受干 預(yù)后6個(gè)月；階段C的延長(zhǎng):如果鑒別出治療應(yīng)答者，則應(yīng)當(dāng)考慮隨訪至12個(gè)月。
[0070] 階段A為劑量探索和毒性研究。該階段確定10、50、100或250nM sP/kg BW的單一sP 劑量(1)是否能在合格的試驗(yàn)患者中產(chǎn)生胰腺炎或其它器官功能障礙的生化征象;或者(2) 是否能改善內(nèi)分泌/代謝的T1D參數(shù)。這些劑量在嚙齒動(dòng)物和犬類(lèi)研究中耐受良好（模塊 1.2.3.5)。在接受干預(yù)之前7-14天，這些患者中的每一位都經(jīng)受了MMTT。根據(jù)動(dòng)物經(jīng)驗(yàn)選擇 劑量范圍：50_250nmole/kg同等有效和持久劑量，略微少于lOnmole至lnmole也可以。四組 各三名患者待被注射各劑量組的臨床試驗(yàn)級(jí)8?。'\^11；[110丨(1661161：；[08 1110設(shè)計(jì)且外包了在 加拿大衛(wèi)生部批準(zhǔn)的商業(yè)cGMP設(shè)備中生產(chǎn)并驗(yàn)證臨床級(jí)可注射的兒科藥物制劑(sP-ped) 以及常規(guī)的/青少年可注射的藥物制劑(sP-R/A)。
[0071] 首先招募階段A的患者，并當(dāng)他們同意給定的sP劑量時(shí)將其隨機(jī)化(SASS程序)_不 存在安慰劑。從最低劑量開(kāi)始，三名患者接受1 Onmo 1 e sP/kg，接下來(lái)的三名患者接受 50nmole sP/kg，然后在最后兩組中各接受100和250nmole sP/kg〇
[0072] 將階段B患者隨機(jī)化為第一或第二治療組?；趧?dòng)物數(shù)據(jù)，預(yù)期在50-lOOnmole/kg 下觀察到最大應(yīng)答。如果患者接受5或lOmL鹽溶液中的干預(yù)，則研究醫(yī)師與IGT血管造影團(tuán) 隊(duì)一起確定臨床依據(jù)。計(jì)劃在組間進(jìn)行至少2至3天的觀察，但是隨著臨床經(jīng)驗(yàn)的增長(zhǎng)，可以 通過(guò)研究管理更改該周期。注射之后監(jiān)測(cè)與胰腺和肝臟以及腸功能相關(guān)的血液化學(xué)。監(jiān)測(cè) 患者的胰島素需求和血糖正常(參見(jiàn)下文，標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理）。
[0073]階段A背后的理論基礎(chǔ)是階段A產(chǎn)生了第一患者數(shù)據(jù)。新近發(fā)作的糖尿病小鼠中 T1D的逆轉(zhuǎn)在數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生，順著機(jī)理通路很好理解?？紤]到sP受體結(jié)合及它對(duì)辟田胞的陽(yáng) 性存活效應(yīng)以及它對(duì)胰腺自身免疫浸潤(rùn)的陰性存活效應(yīng)的快速動(dòng)力學(xué)，預(yù)期sP的效果在患 者中可能也很迅速。階段A策略涵蓋了合理的藥物劑量范圍，并且謹(jǐn)慎地進(jìn)行階段A-盡管不 存在預(yù)期任何藥物毒性的理由-并且其產(chǎn)生了階段B所需的經(jīng)驗(yàn)和使用的藥物劑量。討論了 階段A的策略和組的大小，并且將其并入了加拿大衛(wèi)生部CTA前置會(huì)議的最終會(huì)議記錄中 (研究者手冊(cè)，模塊1.2.3.1)。在該CTA前置會(huì)議中，還討論了如果在階段A中出現(xiàn)有效的sP 劑量，則在研究開(kāi)始后約4周且如計(jì)劃安排所允許的，在階段B結(jié)束時(shí)向接受較低劑量的階 段A患者提供最佳劑量的第二次注射是符合倫理的。這不會(huì)破壞來(lái)源于該研究階段或研究 整體的結(jié)論，因?yàn)橹委熓『蟮闹貜?fù)注射最終是隨訪計(jì)劃的一部分，盡管在數(shù)年的范圍內(nèi) 時(shí)不時(shí)地預(yù)期。
[0074] 研究的階段B是干預(yù)階段?？偣?0名患新近發(fā)作的T1D的合格的患者通過(guò)在影像引 導(dǎo)下的腹腔動(dòng)脈的套管插入術(shù)接受了階段A得到的選擇sP劑量。理論基礎(chǔ):T1D逆轉(zhuǎn)本質(zhì)上 是針對(duì)sP療法的二元(是/否)初始應(yīng)答。人T1D的發(fā)作與具有糖尿病傾向的小鼠的區(qū)別在于 開(kāi)始于發(fā)作后第1年的某一時(shí)間，并持續(xù)數(shù)周至(有時(shí))數(shù)月的短暫的緩解期（"蜜月"，參見(jiàn) 下文）的頻繁（~70%)出現(xiàn)(模塊1.2.3.3)。在本研究中，除了預(yù)期出現(xiàn)在密切接近注射后 之外，疾病的緩解(脫離胰島素的血糖正常)可能與自發(fā)的蜜月難以區(qū)分。雖然該1期研究不 能旨在產(chǎn)生有意義的功效數(shù)據(jù)，但是對(duì)照組使得以限定性方式闡明趨勢(shì)成為可能，特別是 如果患者的治療應(yīng)答也是二元的，以及如果sP引起的緩解無(wú)論在何處都接近鼠類(lèi)治療的壽 命(相當(dāng)于人類(lèi)的6-8年），則即使1年后的更常見(jiàn)的復(fù)發(fā)和再注射在臨床上依然可以代表令 人滿意的效果，特別是如果可以將目前處于開(kāi)發(fā)中的非侵入性藥物遞送策略發(fā)展進(jìn)行應(yīng)用 的話。
[0075] 研究的下一階段(階段C)是隨機(jī)的。在最初的干預(yù)期招募20名合格的患者用于隨 機(jī)干預(yù)，以及20名作為對(duì)照組，3周后用MMTT在各干預(yù)患者中終止干預(yù)。因此，第一干預(yù)組的 分析具有治療前和未治療的對(duì)照的數(shù)據(jù)。
[0076] 在最后一名干預(yù)患者注射后約1周，對(duì)照組轉(zhuǎn)為干預(yù)狀態(tài)，經(jīng)受干預(yù)前MMTT，以在 約1周之后接受干預(yù)：用注射后第20天的MMTT終止該第二干預(yù)期。該組的分析依賴(lài)于作為對(duì) 照的治療前數(shù)據(jù)。理論基礎(chǔ):T1D逆轉(zhuǎn)本質(zhì)上是針對(duì)sP療法的二元(是/否)初始應(yīng)答。
[0077]新近被診斷為1型糖尿?。═1D)的患者中大約70%在胰島素療法開(kāi)始之后暫時(shí)恢 復(fù)了不同程度的內(nèi)源性辟田胞功能(Bowden等人，20083)。臨床上已以多種方式定義了該時(shí) 期，但是最常見(jiàn)地其目前被稱(chēng)作"蜜月"期，特征為每天每kg體重〈0.5單位(U/kg/d)的每日 胰島素劑量以及HbAlc彡7.0% (Bowden等人，20083)。在蜜月期間，血糖水平時(shí)常正常且穩(wěn) 定-通常持續(xù)數(shù)周，有時(shí)持續(xù)數(shù)月-對(duì)于外源性胰島素需求很少或無(wú)需求以及具有接近正常 的HbAlc，盡管飲食和鍛煉有變動(dòng)。但是發(fā)作后6個(gè)月幾乎所有的患者將恢復(fù)至蜜月前的胰 島素需求和完全典型的臨床TID進(jìn)程和征象，以及在發(fā)作后12個(gè)月除極少患者外的所有患 者都將恢復(fù)至蜜月前的胰島素需求和完全典型的臨床T1D進(jìn)程和征象(Abdul-Rasoul等人， 20061)。
[0078] 調(diào)節(jié)該瞬時(shí)改善的細(xì)胞功能的機(jī)制仍未被充分理解。存在下述某些共識(shí):疾病發(fā) 作時(shí)的高血糖表示增加的β細(xì)胞壓力，其使許多依然存活的β細(xì)胞在功能上沉默，并且胰島 素療法應(yīng)當(dāng)將所述壓力減輕相當(dāng)大的程度，所述程度足以使細(xì)胞恢復(fù)（或者甚至可能再 生/再分化）（van Belle等人，201124)。疾病發(fā)作時(shí)提高的胰島素抗性的相當(dāng)?shù)恼；€將 有助于蜜月中的改善的代謝控制(Schober等人，19 8 425)，但是公認(rèn)自身攻擊性的免疫系統(tǒng) 如何能夠暫時(shí)"關(guān)閉"它的進(jìn)程依然不清楚:遺憾地是，存在很少的相關(guān)數(shù)據(jù)集合，并且沒(méi)有 用于蜜月的動(dòng)物模型。然而，蜜月是常見(jiàn)的這一事實(shí)已產(chǎn)生了這樣的共識(shí):其可代表干預(yù)療 法的最有前景的靶標(biāo)。約85%的新近發(fā)作的病例沒(méi)有T1D家族史，并且發(fā)作是第一次糖尿病 聲明自身:許多年糖尿病前期都沒(méi)有明顯的癥狀。
[0079] 不幸地是，如術(shù)語(yǔ)所適當(dāng)暗指的，蜜月在程度和持續(xù)時(shí)間方面具有極大的可變性， 無(wú)論在何處持續(xù)數(shù)周至數(shù)月。研究者觀察到一例極其罕見(jiàn)的蜜月樣復(fù)發(fā)-緩解型T1D病例， 其在T1D穩(wěn)定前很好地持續(xù)了超過(guò)三十年，其中來(lái)自該患者的三個(gè)后代中的兩個(gè)很早發(fā)展 為完全T1D且無(wú)蜜月(Dosch等人，未發(fā)表）。盡管非常罕見(jiàn)，但是此類(lèi)病例說(shuō)明存在能夠控制 自身免疫進(jìn)程的生理機(jī)制，這使得成功干預(yù)策略成為最終可實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)。
[0080] 由于蜜月緩解期是穩(wěn)定的代謝控制時(shí)期，因而鑒定控制T1D的臨床緩解的持續(xù)時(shí) 間的因素重要且有前景。包括下述因素的一些因素均已被確認(rèn)影響新近發(fā)作的糖尿病兒童 中部分或完全緩解的可能性:年齡、性別、青春期狀態(tài)、發(fā)作時(shí)的代謝異常、HLA基因型、糖尿 病相關(guān)自身抗體的存在(BUyUkgebiz等人，2001 21)。根據(jù)公開(kāi)研究的討論，明顯存在年齡分 組和定義的差異，成為當(dāng)時(shí)確切結(jié)論的阻礙。
[0081] 蜜月期通常開(kāi)始于胰島素療法開(kāi)始的數(shù)天或數(shù)周內(nèi)，通常持續(xù)數(shù)周，很少持續(xù)數(shù) 月。為了確定新近被確診的患者中胰島素療法起始之后蜜月期的頻率和持續(xù)時(shí)間，預(yù)期地 對(duì)一組小于12歲的103名糖尿病兒童進(jìn)行監(jiān)測(cè)。69%的糖尿病兒童發(fā)生部分緩解，三名糖尿 病兒童發(fā)生完全緩解。直至緩解的時(shí)長(zhǎng)為28.6 ±12天，蜜月持續(xù)時(shí)間為7.2±4.8個(gè)月 (Abdul-Rasoul等人，20061)。
[0082]回顧性研究涉及1991年-1998年期間在18歲以下被確診為患有T1D的62名患者 (Bowden等人，20083)。35名患者（56.5% )進(jìn)入部分緩解期。直至緩解的時(shí)長(zhǎng)為1.36± 1.03 個(gè)月，并且與出院時(shí)的胰島素需求正相關(guān)。
[0083] 為了確定患有T1D的學(xué)齡前兒童、學(xué)齡兒童以及青少年中是否存在不同的部分緩 解率，在2004年對(duì)新近被確診為T(mén)1D的152名連續(xù)患者進(jìn)行研究(Bowden等人，2008 3)。將患 者分為三個(gè)年齡組(組_1(〈5歲）、組-2(5-12歲）和組_3(>12歲））。在一年多中，每三個(gè)月在 各年齡組中分析診斷時(shí)的臨床特征，血紅蛋白AlC(HbAlC)和總的每日胰島素劑量(TDD)。將 部分緩解定義為T(mén)DD彡0.5單位/kg/d，其中HbAlC〈8%。與學(xué)齡兒童(組-2,56%，p = 0.002) 相比，幼兒(組-1，26.8 % )和青少年(組-3，29 % )具有低部分緩解率。在12個(gè)月時(shí)，組的差異 消失:組-1的13% (5/38)、組-2的20% (11/56)和組-3的18% (8/44)仍處于部分緩解。
[0084] 對(duì)于患有T1D的每一個(gè)體，蜜月期是不同的，控制各進(jìn)程的變量仍不明確，并且不 同的較小規(guī)模的研究可具有顯著不同的結(jié)果。數(shù)據(jù)集合獲自在157個(gè)兒科中心進(jìn)行治療并 在同一中心從診斷開(kāi)始觀察了36個(gè)月的6,123名兒科T1D患者(〈18歲）（Dost等人，20 0 7 22)。 來(lái)自該糖尿病兒童的大型多中心研究的分析包括年齡、性別以及疾病發(fā)作時(shí)的青春期狀態(tài) 在調(diào)整所需的胰島素的量及臨床疾病緩解中的作用，在該研究中，所述臨床的疾病緩解在 疾病前三年期間發(fā)生。
[0085]進(jìn)行多種統(tǒng)計(jì)分析以鑒定影響蜜月持續(xù)時(shí)間的因素。結(jié)果顯示在1992名兒童 (32.5% )中發(fā)生部分緩解(胰島素〈0.5U/kg/d和HbAlc〈7.0% )，大部分在診斷后的前3個(gè)月 內(nèi)發(fā)生。在該1992名兒童中，21 %進(jìn)入緩解的在疾病發(fā)作時(shí)小于5歲，37%為5-10歲，37%的 患者為1 〇-15歲以及5 %為15-17歲的青少年。這些分析鞏固了部分緩解率在更年輕的患者 中更高的早前報(bào)道。
[0087]如在上表中所示，緩解平均持續(xù)0.74± 0.77年(8.8個(gè)月），并且與較晚發(fā)作的患者 相比，其在T1D發(fā)作時(shí)〈10歲的兒童中顯著更短。年紀(jì)較小的兒童中的較短的蜜月期可能與 糖尿病發(fā)作時(shí)更高的酮癥酸中毒率和/或更異常的代謝情形有關(guān)。青春期糖尿病發(fā)作的兒 童具有更長(zhǎng)的緩解期，由于在蜜月持續(xù)時(shí)間方面存在性別差異，其中在男孩中具有更長(zhǎng)的 緩解期(雌性激素更具有促炎性），故可以想象其反映了抗炎性激素睪酮的效應(yīng)。然而，該性 別效應(yīng)主要在〈10歲的兒童中觀察到(P = 〇.0039)，其中性激素水平低，并且在青春期期間 或之后糖尿病發(fā)作的患者中未發(fā)現(xiàn)顯著的性別差異。因此，激素效應(yīng)在發(fā)作和發(fā)作后的緩 解中的作用依然不清楚。
[0088] 疾病發(fā)作時(shí)的代謝不平衡的程度似乎是確定緩解的流行和時(shí)長(zhǎng)的要素(Abdul-Rasoul等人，20061)。在患有T1D的兒童中，在診斷時(shí)候代謝異常的嚴(yán)重性（即治療之前相對(duì) 長(zhǎng)的疾病的持續(xù)時(shí)間、血糖的大大升高、高HbAlC值、糖尿的持續(xù)時(shí)間以及高胰島素需求以 建立血糖正常（由于胰島素抗性））與較短的臨床緩解相關(guān)(Vetter等人，1982 23)。
[0089] 診斷時(shí)的糖尿病酮癥酸中毒(DKA)降低了蜜月的流行，可能反映了胰島素療法開(kāi) 始之后，細(xì)胞恢復(fù)的能力降低。DKA是胰島素缺乏的結(jié)果，相應(yīng)地隨著脂肪酸燃燒，全身酮 體累積，血糖升高，因此可能產(chǎn)生致命的代謝性酸中毒。小于5歲或大于12歲的兒童比5-12 歲之間的兒童更可能發(fā)展DKA，原因難以捉摸(Bowden等人，2008 3)
[0090] 通過(guò)測(cè)量C-肽評(píng)估內(nèi)源性胰島素的分泌。由胰島素基因編碼的31個(gè)氨基酸的C-肽 剪切自胰島素原，并且兩者以1比1的摩爾比共同分泌。將患有新近發(fā)作的T1D的患者中基線 C-肽和被刺激的C-肽(胰高血糖素或混合餐之后）的測(cè)量用作剩余的總體細(xì)胞功能或β細(xì) 胞團(tuán)的度量。數(shù)項(xiàng)研究已表明，較高的C-肽水平與T1D前六個(gè)月期間的蜜月正相關(guān)，并且C-肽水平是T1D第一年期間的蜜月的良好的預(yù)測(cè)因子(Zmyslowska等人2007 26)。
[0091] 在一項(xiàng)新近被診斷為T(mén)1D的268名患者的研究中，通過(guò)性別、年齡以及糖尿病發(fā)作 時(shí)的季節(jié)將患者分級(jí)(Agner等人，1987 27)。在疾病的前36個(gè)月期間，對(duì)基礎(chǔ)C-肽、HbAlc和每 千克胰島素劑量進(jìn)行評(píng)估。將完全的疾病緩解設(shè)定為胰島素療法完全停止至少1周，而具有 穩(wěn)定的代謝控制，同時(shí)將部分緩解設(shè)定為胰島素需求< 出院時(shí)胰島素劑量的50%。在疾病 的前18個(gè)月期間，12.3%的患者發(fā)生平均6個(gè)月的完全緩解，以及18.3%的患者發(fā)生平均也 為6個(gè)月的部分緩解。與未進(jìn)入蜜月的患者相比，進(jìn)入蜜月的患者具有顯著更高的基礎(chǔ)C-肽 水平。從這些遺憾地不太一致的研究中可以得到這樣的總結(jié)論:預(yù)測(cè)蜜月和蜜月持續(xù)時(shí)間 的已知因素包括青春期前發(fā)作、男性、輕微的初始代謝擾亂以及不存在明顯的酮癥酸中毒。
[0092]總的來(lái)說(shuō)，仍未充分理解T1D蜜月，特別是關(guān)于自身免疫進(jìn)程及其幾乎確定但未經(jīng) 證明的短暫抑制。然而，可用的數(shù)據(jù)和廣泛共識(shí)確定蜜月期為旨在其治療擴(kuò)展的干預(yù)療法 的天然且有前景的靶標(biāo)。如通過(guò)T1D相關(guān)的自身抗體所鑒定的，胰島的自身免疫在蜜月期間 未消失，，但明顯缺乏進(jìn)展，因?yàn)榇嬖谧銐虻膬?nèi)源性辟田胞來(lái)源的胰島素(和c-肽)的產(chǎn)生。因 此，蜜月的過(guò)程必然反映下調(diào)自身免疫效應(yīng)器功能的調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞的急性出現(xiàn)-無(wú)數(shù)據(jù)， 甚至提示了其為什么發(fā)生以及如何發(fā)生。新近發(fā)作的T1D患者中毒性免疫抑制試驗(yàn)的一貫 失敗強(qiáng)調(diào)了這樣的總結(jié)論:免疫抑制殺死了調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞池以及效應(yīng)器細(xì)胞。
[0093]共同地，在大比例新近發(fā)作的T1D患者中觀察到蜜月暗示，破壞疾病進(jìn)程的生理機(jī) 制確實(shí)存在，并且如果所述機(jī)制支持從蜜月中明顯的疾病進(jìn)程的生理逃逸，則在該期間的 有效干預(yù)具有前景。此類(lèi)干預(yù)必須放慢或者阻止自身免疫細(xì)胞破壞/去分化的進(jìn)程。物質(zhì)P 的胰腺注射試驗(yàn)首次在T1D中采用無(wú)毒的生理治療策略(其在動(dòng)物模型中有效）以恰好實(shí)現(xiàn) 所述靶標(biāo)特性。其減輕了慢性神經(jīng)肽缺乏，所述慢性神經(jīng)肽缺乏在TRPV1突變的嚙齒動(dòng)物中 具有關(guān)鍵的遺傳 T1D易感性特征，以及在T1D易感的人中具有低功能TRPV1等位基因選擇的 特征。該策略有希望促進(jìn)并延長(zhǎng)蜜月數(shù)年，并且重復(fù)注射在相同的動(dòng)物模型中是有效的。標(biāo) 志性T1D試驗(yàn)(DCCT/EDIC)確定，即使有限（數(shù)月）時(shí)期的（接近)正常的血糖代謝對(duì)20-40年 后的毀滅性T1D并發(fā)癥具有重大影響:雖然物質(zhì)Ρ療法不會(huì)治愈T1D的遺傳基礎(chǔ)，但是它有希 望對(duì)患有T1D的生活的嚴(yán)酷現(xiàn)實(shí)及其長(zhǎng)期并發(fā)癥的龐大的數(shù)十億的年費(fèi)用產(chǎn)生重要、積極 的長(zhǎng)期影響。
[0094]在一個(gè)實(shí)施方案中，向個(gè)體施用的sP的量的范圍為50-100nM/kg。 實(shí)施例
[0095] 實(shí)施例1
[0096] 研究組-樣本大小N=52
[0097] 視情況，在父母知情同意和患者知情同意的情況下，招募52名年齡10-18歲的合格 的同意的兒童或青少年。這些患者在<30個(gè)月內(nèi)已被確診患有的T1D，并且在招募時(shí)具有多 0 · 2pmole/mL的基礎(chǔ)c-肽水平。
[0098] 患有新近發(fā)作的 T1D的患者（CDA指南 http://www.diabetes.ca/for-professionals/resources/2008-cpg/，參見(jiàn)下文），具有典型的代謝功能障礙、胰島素替代 需求的陽(yáng)性度量;增加 T1D相關(guān)的B細(xì)胞&T細(xì)胞自身免疫，因?yàn)樵揟1D元素是直接療法的靶標(biāo) 之一。在0N多倫多病童醫(yī)院對(duì)患者進(jìn)行診斷或者將患者送至0N多倫多病童醫(yī)院，例如多倫 多較大地區(qū)的相關(guān)病童衛(wèi)星糖尿病中心（SickKids Satellite Diabetes Center)之一。對(duì) 于所述試驗(yàn)，患者合格的條件是：1.他們?cè)?0-18歲之間；2.患者距離診斷<30個(gè)月，并且除 被治療的甲狀腺功能減退外無(wú)其它慢性疾病-在T1D中很常見(jiàn);3.父母/護(hù)理者以及患者（當(dāng) 他們同意時(shí)）已接收所述試驗(yàn)的口頭解釋并且已觀看了加拿大衛(wèi)生部批準(zhǔn)的描述糖尿病的 sP療法的教育視頻。在提供用于研究和程序性血管造影的書(shū)面知情同意書(shū)之前，解釋包括 熟悉與內(nèi)臟血管造影、sP的注射、麻醉相關(guān)的潛在風(fēng)險(xiǎn)以及干預(yù)失敗(在人中）的未經(jīng)測(cè)試 的可能性。
[0099] sP治療可能不會(huì)使具有由TRPV1基因型控制的正常sP分泌活性的患者受益。為了 最可能的應(yīng)答者，將該小型初步研究中的組進(jìn)行分級(jí)，以及為了降低不太可能是應(yīng)答者的 可能的風(fēng)險(xiǎn)，如果患者攜帶T1D患者/家族中流行的多態(tài)、T1D相關(guān)的TRPV1等位基因中的至 少一種，則其對(duì)于干預(yù)而言是合格的。由于歐洲和北美的大型TRPV1測(cè)序計(jì)劃在未來(lái)數(shù)年可 能依然不完整，所以遇到迄今為止未分類(lèi)的序列是可能的。因此，開(kāi)發(fā)了測(cè)量淋巴細(xì)胞NK1R (主要的sP受體，其在sP-結(jié)合后迅速內(nèi)化)的占用狀態(tài)的生物分析。大多數(shù)T1D患者具有異 常提高的未占用的表面NK1R的水平，反映了低穩(wěn)定狀態(tài)的sP水平，并且該分析可被用于確 認(rèn)干預(yù)合格性。在HC研究者手冊(cè)中描述并討論了這些數(shù)據(jù)。
[0100] 基于序列和功能數(shù)據(jù)，預(yù)期多達(dá)20%的合適的招募者在該最后的雙包含集合 (dual inclusion set)中可能會(huì)失敗，設(shè)計(jì)所述集合以將研究聚焦于理論上最可能的sP-應(yīng)答群體上。較大的隨訪研究可具有區(qū)分患者亞群，并強(qiáng)調(diào)或不再?gòu)?qiáng)調(diào)這些納入準(zhǔn)則的能 力。理論基礎(chǔ):T1D逆轉(zhuǎn)針對(duì)sP療法是基本上二元(是/否）的初始應(yīng)答。人T1D發(fā)作與具有糖 尿病傾向的小鼠的區(qū)別在于發(fā)病后第一年的某一時(shí)間開(kāi)始并持續(xù)數(shù)周至數(shù)月的短暫的緩 解期（"蜜月"）的頻繁(~70%)出現(xiàn)(模塊1.2.3.3)。在本研究中，除預(yù)期在注射后數(shù)小時(shí)-數(shù)天內(nèi)而不是一段時(shí)間后迅速顯示出之外，預(yù)期被誘導(dǎo)的疾病緩解(脫離胰島素的血糖正 常）與自發(fā)的蜜月難以區(qū)分。雖然該1期研究不能旨在產(chǎn)生有意義的功效數(shù)據(jù)，但是對(duì)照組 使得以限定性方式闡明趨勢(shì)成為可能，特別是如果患者的治療應(yīng)答也是二元的，以及如果 sP引起的緩解無(wú)論在何處都接近鼠類(lèi)治療的壽命(相當(dāng)于人類(lèi)的~6年），則即使1年后更常 見(jiàn)的復(fù)發(fā)和再注射在臨床上依然可以代表令人滿意的效果，特別是如果可以開(kāi)發(fā)出處于研 發(fā)中的非侵入性藥物遞送策略的話。
[0101] -些永久的、后天的或先天的以及短暫的情況排除參與在該研究中：1.在具有常 見(jiàn)的短暫的緩解（"蜜月"，〈0.5U胰島素/kg)的患者中，不存在藥物效應(yīng)的急性測(cè)量，并且可 將sP干預(yù)治療延遲直到疾病復(fù)發(fā)，利用上升至彡lU/kg的胰島素需求作為復(fù)發(fā)的度量。2.患 者患有影響一個(gè)或多個(gè)器官系統(tǒng)的已知并存病，包括ACE抑制劑治療的高血壓以及染色體 異常。發(fā)燒多38°C的常見(jiàn)的童年期傳染性疾病將導(dǎo)致重定計(jì)劃。3.懷孕。4.具有已知的射線 照射造影劑過(guò)敏的患者。5.具有對(duì)于年齡而言BMI >第90個(gè)百分位數(shù)的超重(BMI第85-95個(gè) 百分位數(shù))或肥胖(對(duì)于年齡而言BMI>第95個(gè)百分位數(shù))患者不符合該初步研究，因?yàn)閏-肽 水平會(huì)被升高的體重改變。6.父母迫切地計(jì)劃離開(kāi)多倫多并且不能保證隨訪。
[0102] 因?yàn)榕R床前數(shù)據(jù)和動(dòng)物數(shù)據(jù)(Razavi等人，20069)指示治療最可能使具有降低的 TRPV1通道功能的患者受益。因此，潛在的候選者必須是TRPV1基因中的至少一種T1D相關(guān)等 位基因的攜帶者：rs8065080c · 1753A>C/T/G(p · I le585Leu/p · Ile585Phe/p · Ile585Val)或； rs224534c · 1406C>T(p·Thr469Ile)或；rs222749c·271C>T(p·Pro91Ser)或； rs222747c.945G>C(p.Met315Ile)。提供了用于特異性TRPV1錯(cuò)義變體的擴(kuò)增和測(cè)序的PCR 引物的序列表（SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO :8)。從提取自口腔拭子樣本的基因組DNA擴(kuò)增500-688bp長(zhǎng)的所有PCR產(chǎn)物。通過(guò)有保證的Genomics Quebec設(shè)備，從兩端對(duì)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn) 行重測(cè)序，并且測(cè)定共有的基因型?；颊叩幕蛐蛢H傳達(dá)至主治醫(yī)師，該醫(yī)師與他的指導(dǎo)者 基于患者的基因型確定對(duì)于所述試驗(yàn)的合格性。
[0103] 在治療之前，利用〇ragene?DNA采集試劑盒，所有同意的患者均提供了口腔拭子樣 本用于DNA分析。將DNA用于擴(kuò)增，并對(duì)TRPV1基因特異的外顯子進(jìn)行測(cè)序以鑒定患者的基因 型，所述基因型將被用于確定對(duì)于研究而言的合格性。具有野生型TRPV1基因型的患者不符 合該試驗(yàn)，因?yàn)樗麄儾惶赡軓乃鲋委熤蝎@益，并且他們的T1D疾病可能是由于其它致病 機(jī)制發(fā)展而來(lái)。圖7示出了可被用于本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中以采集DNA樣本的DNA采集試 劑盒702 ANA采集試劑盒702包括拭子712、管714、用螺釘固定在管714上的漏斗716、通過(guò)靈 活的帶720與漏斗716連接的漏斗蓋718,以及用于管714的小蓋722。盡管圖7中示出了特定 的DNA采集試劑盒，但是在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中可以使用其它類(lèi)型的DNA采集試劑盒以 采集DNA樣本。
[0104] 實(shí)施例2
[0105] 藥物制劑
[0106] 注射用的液體，物質(zhì)P溶于用于注射的0.9%氯化鈉(USP)中。Sp-R/A?: 2mg sP/mL， 以及sP-Ped?: 0 · 5mg sP/mL，小瓶:各lmL。cGMP級(jí)活性藥物成分，API (Polypeptide Inc，San Diego，CA，98%的純度），cGMP無(wú)菌藥物生產(chǎn)外包給多倫多的醫(yī)藥服務(wù)公司（Dal ton PharmaServices)。生產(chǎn)程序和檢驗(yàn)是完整的并且遵循工業(yè)標(biāo)準(zhǔn);制造信息。
[0107] 實(shí)施例3 [0108] 劑量方案
[0109] 劑量探索和毒性研究-階段A，12名患者隨機(jī)接受動(dòng)脈注射10-50-100或250nmole/ kg，每個(gè)劑量組3名患者。從每mg小鼠胰腺組織細(xì)胞表面表達(dá)的sP受體(NK1R)計(jì)數(shù)初步計(jì)算 治療劑量，所述計(jì)數(shù)獲自連續(xù)切片并外推至整個(gè)器官-該方案不能在T1D患者中重復(fù)。計(jì)算 sP劑量以得到每表面受體100倍的飽和，外推至2nM/20g小鼠，針對(duì)組織內(nèi)停留時(shí)間和藥物 半衰期進(jìn)行調(diào)整。該劑量的確有效。新近發(fā)作的小鼠 T1D具有大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并且胰 腺表面的NK1R受體中的許多受體實(shí)際上由這些浸潤(rùn)細(xì)胞攜帶，事實(shí)上，這些細(xì)胞中的大多 數(shù)是sP療法的合理且?guī)缀醮_定的首要靶標(biāo)，因?yàn)樗谛陆せ畹牧馨图?xì)胞中引起迅速的淋 巴細(xì)胞死亡(模塊1.2.3.6)。這顯著減少了胰腺及其相關(guān)淋巴結(jié)組織中的自身免疫效應(yīng)器 細(xì)胞。人T1D的新近發(fā)作的胰腺炎性損傷可以是較低密度的，但是可用的數(shù)據(jù)不足以用于精 確比較，產(chǎn)生此類(lèi)數(shù)據(jù)目前不可行。小鼠實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)sP劑量是2nM/小鼠（即100nm sP/kg BW)，其中0.2nM/小鼠的劑量?jī)H具有部分效果。在該背景下，預(yù)計(jì)100nM/kg BW的劑量可提供 與在sP療法應(yīng)答的新近發(fā)作的T1D小鼠中所實(shí)現(xiàn)的類(lèi)似程度的急性NK1R原位結(jié)合。
[0110] 實(shí)施例4
[0111] 清除期
[0112] 基于CTA前置會(huì)議(2012年5月）期間的協(xié)議，未使用安慰劑，并且最后，所有患者均 接受sP注射。然而，如果由顯著的糖尿病逆轉(zhuǎn)率所保證，則可在干預(yù)期結(jié)束前，向接受無(wú)效 低sP劑量的階段A劑量探索組的患者提供第二次注射。由于低至〈30秒的血管半衰期，在某 些部位高至1分鐘，sP的清除期將非常短。
[0113] 實(shí)施例5
[0114] 研究前的篩選和基線評(píng)估
[01 ?5]醫(yī)院的S0P標(biāo)準(zhǔn)患者護(hù)理，包括初步以及重復(fù)測(cè)量許多代謝變量，但除此之外，sP 干預(yù)之前1-5周，需要對(duì)T1D相關(guān)的B細(xì)胞和T細(xì)胞自身反應(yīng)性進(jìn)行至少一次測(cè)量，以及一次 MMTT。在上文的排除標(biāo)準(zhǔn)中描述并討論了增加的測(cè)試，如TRPV1等位基因序列多樣性的測(cè)序 和NKlR(sP受體）占用率。
[0116] 實(shí)施例6 [0117]治療/評(píng)估訪問(wèn)
[0118] 提供了干預(yù)和干預(yù)后過(guò)程的詳細(xì)描述。如所描述的，所述過(guò)程可能過(guò)于謹(jǐn)慎，并且 表現(xiàn)了可遠(yuǎn)超過(guò)干預(yù)本身的壓力的患者壓力:通常基于門(mén)診患者進(jìn)行日常的股動(dòng)脈注射程 序。在階段A的毒性和劑量探索期結(jié)束前，確定是否可在DSMB同意的情況下安全地減少觀察 期和強(qiáng)化監(jiān)督。
[0119] 研究相關(guān)的基線數(shù)據(jù)很重要。作為規(guī)則，新的發(fā)作數(shù)據(jù)可用于患者圖表中。研究要 求在招募和隨機(jī)化之前1-5周得到下述血液測(cè)試:HbAlc、TlD相關(guān)的B細(xì)胞和T細(xì)胞的自身反 應(yīng)性、胰腺和肝臟功能測(cè)試以及關(guān)鍵地，產(chǎn)生關(guān)于c-肽數(shù)據(jù)（（基礎(chǔ)的，峰值，AUC)、空腹和刺 激的胰島素&葡萄糖水平的MMTT。本研究旨在當(dāng)12名患者正在或即將簽署知情同意書(shū)時(shí)開(kāi) 始階段A(劑量、毒性）。階段B(干預(yù))的招募從階段A繼續(xù)。
[0120] 通過(guò)試驗(yàn)醫(yī)師與試驗(yàn)監(jiān)測(cè)者的常規(guī)緊密協(xié)調(diào)避免標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理采樣的重復(fù)采樣。通知 研究藥房(Research Pharmacy)患者一覽表，包括姓名、HSC ID、排定的干預(yù)之前1-3周的體 重(kg)〇
[0121 ]常規(guī)(青少年的）sP制劑，sP-R/A?(藍(lán)色標(biāo)簽），含有溶于鹽水中的2mg sP/mL，兒科 制劑，sP-Ped?(黃色標(biāo)簽），0.5mg sP/mL。兩種制劑都于-20°C以下冷凍儲(chǔ)存。
[0122] 研究藥房從研究工作人員處收到患者ID、體重和一覽表以重新計(jì)算和確認(rèn)或改正 干預(yù)劑量以及適當(dāng)數(shù)量的藍(lán)色或黃色小瓶，這在兩天前與試驗(yàn)醫(yī)師郵件溝通。 VanilloidGeneticsInc已開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了基于Exeel?的自動(dòng)計(jì)算器，并且將其提供給了研 究團(tuán)隊(duì)。書(shū)面處方醫(yī)囑，陳述了患者的姓名、ID、BW和最終劑量以及將在10mL無(wú)菌注射器中 進(jìn)行組合的來(lái)自藍(lán)色編碼的sP-R/A和/或黃色編碼的sP-Ped的體積。在干預(yù)的早晨，將所需 的藥物小瓶從其安全冷藏庫(kù)取出，簽字離開(kāi)儲(chǔ)藏庫(kù)，將其置于密封的無(wú)菌塑料袋，在室溫下 解凍并儲(chǔ)存于冰水上，直到簽字交于試驗(yàn)人員，在該情況下，所述試驗(yàn)人員是主治醫(yī)師和試 驗(yàn)監(jiān)測(cè)者。將即用型小瓶運(yùn)輸至干預(yù)0R并交付給進(jìn)行注射的IGT團(tuán)隊(duì)。
[0123] 在進(jìn)入研究（第一天）的早晨，同意的T1D患者進(jìn)行排定的空腹血糖測(cè)量。在近期 MMTT數(shù)據(jù)集不可用的罕見(jiàn)情況下，此類(lèi)患者經(jīng)受MMTMTT之后，如果需要的話可以開(kāi)修改 的胰島素劑量處方，并且在觀看麻醉以及進(jìn)行IGT咨詢(xún)以討論第二天的干預(yù)之后，讓患者回 家，除非這些會(huì)議在之前已經(jīng)結(jié)束。
[0124] 第二天早晨，空腹的干預(yù)患者在上午8-9點(diǎn)住院。條件是已確認(rèn)干預(yù)藥物是藥房現(xiàn) 有的。讓患者準(zhǔn)備并接受短暫的標(biāo)準(zhǔn)麻醉，用于經(jīng)腹腔動(dòng)脈遞送sPdGT成像團(tuán)隊(duì)在其的臨 床實(shí)踐常規(guī)進(jìn)行股動(dòng)脈血管造影，以及在整個(gè)犬類(lèi)研究中進(jìn)行sP腹腔注射而無(wú)不良事件。 將階段4患者隨機(jī)化為4組中的一組，每組3名患者，以接受10、50、100或25011111〇16 8?/1^。注 射給定的劑量并使患者進(jìn)入監(jiān)測(cè)期，如通過(guò)0R可用性和調(diào)度限制所允許的，最初組間留出 兩天。階段A中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，特別是提高的空腹葡萄糖水平和胰島素需求的減少被用于鑒定 可能的sP劑量應(yīng)答。將所有的每日血糖儀讀數(shù)頻繁地上傳至研究站點(diǎn)。如由PI根據(jù)臨床基 礎(chǔ)所決定的，將3-4例最初(階段A)的患者收留過(guò)夜，然后至少前2天在醫(yī)院附近暫住。階段A 的結(jié)論預(yù)期將確定單次階段B干預(yù)劑量，該過(guò)程涉及工作人員和研究委員會(huì)。理論基礎(chǔ):階 段A產(chǎn)生了第一手患者數(shù)據(jù)。新近發(fā)作的糖尿病小鼠中的T1D逆轉(zhuǎn)在數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生，順著機(jī) 理通路很好理解?？紤]到sP-受體結(jié)合與其在辟田胞中的陽(yáng)性存活效應(yīng)以及其對(duì)胰腺自身免 疫浸潤(rùn)的陰性存活效應(yīng)的快速動(dòng)力學(xué)，預(yù)期sP的作用在患者中可能也相當(dāng)迅速。階段-A策 略涵蓋了合理的藥物劑量范圍，并且謹(jǐn)慎地進(jìn)行階段A，盡管不存在預(yù)期任何藥物毒性的理 由-并且其產(chǎn)生了階段B所需的經(jīng)驗(yàn)和使用的藥物劑量。討論、批準(zhǔn)階段A的策略和組大小并 將其并入加拿大衛(wèi)生部CTA前置會(huì)議的最后會(huì)議記錄(研究者手冊(cè)，模塊1.2.3.1)中。在該 CTA前置會(huì)議中，還討論了如果階段A出現(xiàn)了有效的sP劑量，則在研究開(kāi)始后約4周且如計(jì)劃 安排所允許的，在階段B結(jié)束時(shí)向接受較低劑量的階段A患者提供最佳劑量的第二次注射是 符合倫理的。這不會(huì)破壞來(lái)源于該研究階段或研究整體的結(jié)論，因?yàn)橹委熓『蟮闹貜?fù)注 射最終是隨訪計(jì)劃的一部分，盡管在數(shù)年的范圍內(nèi)時(shí)不時(shí)地預(yù)期。
[0125] 階段A完成之后，這些患者進(jìn)入階段C(隨訪），除非決定向接受次優(yōu)劑量的那些患 者提供階段B劑量的第二次注射，否則?？蓪⒋祟?lèi)患者加入階段B的干預(yù)組中。在完成階段A 的注射期間，繼續(xù)用于階段B的招募:在每組5名患者的組中進(jìn)行預(yù)先設(shè)定的隨機(jī)化，以隨機(jī) 化為干預(yù)組和對(duì)照組。當(dāng)?shù)谝唤M10名患者(5名對(duì)照，5名干預(yù)）已經(jīng)同意時(shí)開(kāi)始階段B干預(yù)， 并且其繼續(xù)直至40名患者同意-除非意外的不良事件引起研究暫?；駾SMB認(rèn)可的方案改 變。DSMB由三名資深的學(xué)術(shù)上備受尊敬的T1D醫(yī)師組成(兩名來(lái)自美國(guó)以及一名來(lái)自歐洲）： DSMB將通過(guò)Skype與研究團(tuán)隊(duì)頻繁交流并作為一個(gè)委員會(huì)。將階段B的毒性和劑量探索研究 中進(jìn)行的所有觀察，以及任何歸于干預(yù)的不良事件立即與DSMB/咨詢(xún)委員會(huì)（電子郵件，電 話)聯(lián)系，并且將不良事件，特別是sP相關(guān)的事件與REB聯(lián)系：目前存在向加拿大衛(wèi)生部報(bào)告 不良事件在線報(bào)告途徑。在面對(duì)意外的不良事件時(shí)，DSMB具有停止或改進(jìn)試驗(yàn)的權(quán)利和義 務(wù)。在不存在歸于干預(yù)的不良事件時(shí)，40名征募的且合格的患者然后接受改進(jìn)的交叉研究 設(shè)計(jì)中的研究劑量:20例干預(yù)患者的對(duì)照為20例在當(dāng)時(shí)未被注射的對(duì)照患者，所述對(duì)照患 者轉(zhuǎn)而交叉成為干預(yù)患者，其對(duì)照為它們自己的干預(yù)前3周的數(shù)據(jù)。
[0126] 注射方案被描述為:將導(dǎo)管置于腹腔動(dòng)脈后，在3分鐘時(shí)間內(nèi)注射劑量探索的sP量 或階段8的研究干預(yù)劑量（10、50、100或2501^8?/1^81，溶于5或101^鹽水（參見(jiàn)上文））。理 論基礎(chǔ):在所有的小鼠研究中使用穩(wěn)定速率注射，在犬類(lèi)研究中比較了定時(shí)交替速率注射 (alternative rate injection timing)，而未發(fā)現(xiàn)任何差別。
[0127] 向患者和父母介紹研究之后，并且如果對(duì)參與干預(yù)組和/或?qū)φ战M感興趣，則在程 序之前，在醫(yī)院的IGT門(mén)診部接見(jiàn)父母和孩子，這時(shí)詳細(xì)地解釋腹腔血管造影。概風(fēng)險(xiǎn)。這些 風(fēng)險(xiǎn)包括局部的腹股溝問(wèn)題（出血&血腫、假動(dòng)脈瘤、動(dòng)脈夾層、動(dòng)脈血栓形成/狹窄、AV-痿、 疼痛）；腹腔區(qū)域局部問(wèn)題(血栓形成、痙攣、動(dòng)脈夾層、出血）；全身性問(wèn)題(造影劑過(guò)敏、X射 線照射、空氣栓塞、中風(fēng)）；注射相關(guān)的問(wèn)題(胰腺炎、肝臟功能障礙、膽囊炎）；創(chuàng)新藥物情況 (標(biāo)示外）。由父母簽訂知情同意書(shū)，并且若適當(dāng)時(shí)，患者同意。
[0128] 在程序之前的當(dāng)天安排血液檢查(work)，包括CBC、凝血（INR，PTT)以及0個(gè)單位 (Ounit)的分型和篩選，這些測(cè)試為除上文列出的那些之外的測(cè)試，但是分型和篩選可在干 預(yù)之前的數(shù)周進(jìn)行。對(duì)于>12歲的女孩，檢查最近一次月經(jīng)期的日期，并根據(jù)當(dāng)前的醫(yī)院政 策進(jìn)行妊娠測(cè)試。安排基礎(chǔ)的診斷性腹部超聲以具體檢查胰腺、肝臟、膽囊和脾臟。在干預(yù) 之前安排麻醉咨詢(xún)。
[0129] 實(shí)施例7
[0130] 伴隨用藥
[0131] 腹腔的血管造影和sP注射期間的短暫麻醉，標(biāo)準(zhǔn)恢復(fù)，局部疼痛管理注射部位，基 于頻繁的血糖測(cè)量的胰島素處方。
[0132] 實(shí)施例8
[0133] 療效變量和分析
[0134] 主要度量是干預(yù)之前和干預(yù)期后三周之后源于MMTT的糖尿病相關(guān)變量，用于分析 的核心變量是c-肽(基礎(chǔ)的、峰值以及AUC)。二級(jí)分析包括胰島素需求和胰島素抗性的估 計(jì)，空腹和刺激的血糖-除非根據(jù)臨床需求改變，所有的值均來(lái)源于干預(yù)之前、干預(yù)結(jié)束前 以及此后的第6個(gè)月以及可能第12個(gè)月的MMTT。
[0135] 實(shí)施例9
[0136] 安全性變量和分析
[0137] 在研究的階段A期間，日常的血液化學(xué)包括胰腺、肝臟和腸的標(biāo)志物的兩項(xiàng)測(cè)量。 如果未觀察到異常數(shù)值，則在干預(yù)后4-7天，將該數(shù)量減少至一項(xiàng)測(cè)量。
[0138] 研究遵循加拿大衛(wèi)生部ICH E2A報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)。由試驗(yàn)人員&監(jiān)測(cè)者監(jiān)測(cè)并記錄可能的 不良事件。兩名合格的醫(yī)師（不是該研究團(tuán)隊(duì)的一部分)組成備用的AE團(tuán)隊(duì)，一名醫(yī)師始終 進(jìn)行基于家庭的呼叫，將他們的呼叫時(shí)間表郵寄給試驗(yàn)工作人員。較小的AE在24小時(shí)內(nèi)溝 通以進(jìn)行討論和分析，對(duì)于危急的/嚴(yán)重的AE，至多3個(gè)小時(shí)。描述所有的AE，將其登記進(jìn)研 究和患者記錄中，利用病童醫(yī)院的不良事件表格將其鑒定為研究相關(guān)的/不相關(guān)的、藥物治 療相關(guān)的/不相關(guān)的(研究方案，頁(yè)碼:22)。以書(shū)面形式與REB、HC和DSMB溝通危急的/嚴(yán)重的 AE〇
[0139] 實(shí)施例10
[0140] 統(tǒng)計(jì)分析
[0141] 該研究實(shí)行了近來(lái)的NIH-試驗(yàn)網(wǎng)絡(luò)T1D元研究關(guān)于臨床分析策略、統(tǒng)計(jì)方法和解 釋的建議(Greenbaum等人，Diabetes: 20125 ;Lachin等人，PLoS One: 20118)。對(duì)于階段A(毒 性&劑量探索），將招募的前12名患者隨機(jī)化(SAS程序），各自進(jìn)入四個(gè)sP劑量（10-50-100-250nmole/kg)之一。在干預(yù)之前，所有患者經(jīng)受干預(yù)前MMTT，低劑量組首先經(jīng)受、最高劑量 組最后經(jīng)受，這組成了毒性研究。如果在該劑量遞增過(guò)程期間，存在藥物相關(guān)的意外的不良 事件，則立即咨詢(xún)DSMB以確定是否應(yīng)當(dāng)繼續(xù)進(jìn)一步的劑量遞增。將在最后一名階段A患者注 射之后3周，用MMTT完成階段A，并且在階段B(干預(yù))開(kāi)始之前，盡管招募，但將較早地獲得同 意和干預(yù)前MMTT。階段B(功效趨勢(shì)，n = 40):在該兩個(gè)順序、兩個(gè)時(shí)期、單一治療的修改的交 叉研究中，將40名患者隨機(jī)化(SAS程序)為初始治療組或?qū)φ战M(每組n = 20)。治療組中的 患者在干預(yù)前7-30天經(jīng)受基線MMTT。
[0142] 然后這些患者接受用階段A中選擇的sP劑量進(jìn)行的單一注射研究干預(yù)；3周之后， 各治療患者經(jīng)受MMTT。這結(jié)束了指定患者的階段B，并出于初步研究目標(biāo)提供了所有他的/ 她的數(shù)據(jù)。將最后的MMTT數(shù)據(jù)與干預(yù)前數(shù)據(jù)以及來(lái)自對(duì)照組的相關(guān)數(shù)據(jù)集合進(jìn)行比較，基 于c-肽數(shù)值和減少的胰島素需求，這些數(shù)據(jù)將患者分為應(yīng)答者或無(wú)應(yīng)答者。然后被治療的 患者交叉進(jìn)入階段C(隨訪），其中將在家進(jìn)行的葡萄糖測(cè)量和胰島素劑量以電子方式定期 地上傳至安全的研究網(wǎng)站，并且所述數(shù)據(jù)包含于分析中。葡萄糖測(cè)量的頻率可以由PI決定， 如研究團(tuán)隊(duì)和家庭之間每周-每月電話聯(lián)系的頻率(例如每周一次、每月一次）。
[0143] 在初始干預(yù)I期的后半期期間，（目前為止未被治療的)對(duì)照組經(jīng)受初步的MMTT。完 成該I期之后，對(duì)照患者從對(duì)照狀態(tài)轉(zhuǎn)為治療狀態(tài)，并且排定接受研究干預(yù)（II期），其中對(duì) 于各個(gè)患者，所述研究干預(yù)在最后的患者注射之后3周結(jié)束，并且用MMTT完成：如上文將干 預(yù)前和干預(yù)后的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，然后患者轉(zhuǎn)而進(jìn)入階段C(隨訪）。因?yàn)槊恳换颊邇H接受單次 注射，所以關(guān)于2個(gè)時(shí)期之間的"清除"期的通常關(guān)注不適用。此外，干預(yù)(sP)具有極短的組 織半衰期(〈1分鐘）。利用GEE(廣義估計(jì)方程)方法進(jìn)行正式的數(shù)據(jù)分析以建立總體-平均邊 際模型。該模型說(shuō)明了同一患者與依時(shí)協(xié)變量的相關(guān)性(治療效果）。主要度量在MMTT中測(cè) 量的基礎(chǔ)或刺激的c-肽和/或胰島素需求的較大減少或不存在。次要度量包括胰島素水平、 血糖過(guò)多。對(duì)不同的相關(guān)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，并且選擇最合適的相關(guān)矩陣。
[0144] 最終的模型對(duì)治療、時(shí)期、順序效應(yīng)，以及治療應(yīng)答、年齡、發(fā)作時(shí)的年齡、過(guò)去發(fā) 作的干預(yù)時(shí)間與性別之間的關(guān)系進(jìn)行了評(píng)估。分析確定了任何單個(gè)或組合的標(biāo)志物是否預(yù) 測(cè)sP的應(yīng)答性/無(wú)應(yīng)答性。通過(guò)干預(yù)前以及在研究的3個(gè)月和6個(gè)月（并且，如果延長(zhǎng)的話，12 個(gè)月）時(shí)重復(fù)測(cè)量的AN0VA比較HblAC和自身免疫標(biāo)志物，因?yàn)樗鶞y(cè)量的全身性變化的出現(xiàn) 晚于即時(shí)的代謝影響。如果臨床團(tuán)隊(duì)、咨詢(xún)委員會(huì)和DSMB-致同意，利用基于所產(chǎn)生的研究 經(jīng)驗(yàn)的監(jiān)測(cè)算法，可延長(zhǎng)隨訪期。應(yīng)當(dāng)用MMTT終止研究，用于最后數(shù)據(jù)分析。在整個(gè)分析中， 使用具有重復(fù)語(yǔ)句的SAS 9.3和PROC GEM0D。
[0145] 該小型初步轉(zhuǎn)化研究的統(tǒng)計(jì)功效使得能夠以多種方式進(jìn)行分析。，在適當(dāng)?shù)那闆r 下，對(duì)監(jiān)測(cè)幾種關(guān)鍵的疾病標(biāo)志物的科學(xué)和臨床需求增強(qiáng)了在用邦弗朗尼校正進(jìn)行組合比 較中的功效。在6個(gè)月的研究終點(diǎn)最好很少，如果任何對(duì)照處于蜜月中，則三名sP應(yīng)答者將 產(chǎn)生顯著的結(jié)果。事實(shí)上，如果sP療法產(chǎn)生了蜜月形式，其中完全緩解被定義為〈0.5U胰島 素/kg/d，則將成比例地應(yīng)用大約相同的功效。根據(jù)本領(lǐng)域中的早先經(jīng)驗(yàn)（Herold等人， N. Engl. J.Med. : 20026)，次要結(jié)果的分析，特別是HbAlc、c-肽(AUC，峰值，空腹）可能最敏 感，并且各患者中的幾個(gè)連續(xù)測(cè)量增加了統(tǒng)計(jì)分析的相當(dāng)大的功效和置信度，盡管其是小 型的（Greenbaum等人，Diabetes: 20125 ;Lachin等人，PLoS One: 20II8)。
[0146] 給藥和干預(yù)階段的短暫性(3周），以及隨訪(階段C，上傳血糖儀和胰島素?cái)?shù)據(jù)，2次 醫(yī)院訪問(wèn)，最初兩周一次電話）的非侵入性特性不大可能促進(jìn)失訪(LTF)。然而，預(yù)期LTF可 能傾向于無(wú)應(yīng)答者。如果該情形開(kāi)始出現(xiàn)可能(盡管研究團(tuán)隊(duì)額外努力），并且為了提高該 研究的統(tǒng)計(jì)功效，，則收集來(lái)自多至30名T1D患者的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理的住院圖表數(shù)據(jù)，所述多至30 例T1D患者與研究無(wú)關(guān)但是在過(guò)去的30個(gè)月中自診斷以來(lái)隨后在醫(yī)院進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理。關(guān) 于胰島素使用、發(fā)作時(shí)的年齡、空腹葡萄糖以及一些口服葡萄糖耐受測(cè)試(若可獲得的話） 的匿名數(shù)據(jù)集合由小型學(xué)生團(tuán)隊(duì)制成表，所述學(xué)生團(tuán)隊(duì)在其它方面與研究無(wú)關(guān)。
[0147] 參考文獻(xiàn)
[0148] 下述參考文獻(xiàn)被引用至上文和/或描述可與本發(fā)明一起使用的技術(shù)，并且將下述 參考文獻(xiàn)的內(nèi)容和公開(kāi)通過(guò)引用并入本文：
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[0185]雖然已結(jié)合某些實(shí)施方案公開(kāi)了本發(fā)明，但是在不脫離如所附的權(quán)利要求中所限 定的本發(fā)明的領(lǐng)域和范圍的情況下，對(duì)所描述的實(shí)施方案進(jìn)行多種修改、改變和變化是可 能的。因此，意圖是，本發(fā)明不限于所描述的實(shí)施方案，但是它具有通過(guò)下述權(quán)利要求書(shū)的 語(yǔ)言及其等同物所限定的全部范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 方法，其包括下述步驟： (a)向個(gè)體的腹腔動(dòng)脈注射治療有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物至少部分 逆轉(zhuǎn)新近發(fā)作的1型糖尿病(TlD)。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述治療有效量的藥物組合物以所述藥物組合物 的單一劑量注射至個(gè)體的腹腔動(dòng)脈。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述藥物組合物完全逆轉(zhuǎn)新近發(fā)作的T1D。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述藥物組合物暫時(shí)逆轉(zhuǎn)新近發(fā)作的TlD數(shù)月至數(shù) 年。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述藥物組合物有助于胰腺中的辟田胞儲(chǔ)存、產(chǎn)生和 釋放胰島素。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中將步驟(a)進(jìn)行至少三分鐘。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述藥物組合物包含神經(jīng)肽。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述藥物組合物包含物質(zhì)P。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中將物質(zhì)P溶于所述藥物組合物的鹽水中。10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個(gè)體被診斷為患有1型糖尿病(T1D)。11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中基于來(lái)自利用DNA采集試劑盒獲得的唾液樣本的 DNA，所述個(gè)體被診斷為患有TID。12. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個(gè)體為人。13. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述治療有效量的藥物組合物為至少10nM/kg。14. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述治療有效量的藥物組合物為至少50nM/kg。15. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述治療有效量的藥物組合物為至少100nM/kg。16. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述治療有效量的藥物組合物為至少250nM/kg。17. 用于向個(gè)體的腹腔動(dòng)脈注射藥物組合物的裝置，其中所述裝置包含治療有效量的 所述藥物組合物，并且其中所述藥物組合物至少部分逆轉(zhuǎn)新近發(fā)作的1型糖尿病(T1D)。18. 如權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述裝置包括導(dǎo)管，并且其中所述導(dǎo)管包含所述治 療有效量的藥物組合物。19. 如權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述藥物組合物完全逆轉(zhuǎn)新近發(fā)作的T1D。20. 如權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述藥物組合物暫時(shí)逆轉(zhuǎn)新近發(fā)作的TlD數(shù)月至數(shù) 年。21. 如權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述藥物組合物有助于胰腺中的辟田胞儲(chǔ)存、產(chǎn)生 和釋放胰島素。22. 如權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述藥物組合物包含神經(jīng)肽。23. 如權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述藥物組合物包含物質(zhì)P。24. 如權(quán)利要求23所述的裝置，其中將物質(zhì)P溶于所述藥物組合物的鹽水中。25. 如權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述個(gè)體被診斷為患有1型糖尿病(T1D)。26. 如權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述個(gè)體為人。27. 如權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述治療有效量的藥物組合物為至少10nM/kg。28. 如權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述治療有效量的藥物組合物為至少50nM/kg。29. 如權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述治療有效量的藥物組合物為至少100nM/kg。30. 如權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述治療有效量的藥物組合物為至少250nM/kg。31. 如權(quán)利要求17所述的裝置，其中將所述裝置插入所述個(gè)體的腹腔動(dòng)脈。32. 方法，其包括下述步驟： (a)鑒定患有新近發(fā)作的1型糖尿病(TlD)的個(gè)體，所述個(gè)體將積極響應(yīng)向所述個(gè)體的 腹腔動(dòng)脈注射治療有效量的藥物組合物， 其中所述藥物組合物至少部分逆轉(zhuǎn)所述個(gè)體中新近發(fā)作的1型糖尿病(T1D)。33. 如權(quán)利要求32所述的方法，其中基于來(lái)自利用DNA采集試劑盒獲得的所述個(gè)體的唾 液樣本中的DNA來(lái)鑒定步驟(a)中的所述的個(gè)體。
【文檔編號(hào)】A61K31/165GK105916496SQ201480064277
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2014年4月7日
【發(fā)明人】漢斯-邁克爾·多施
【申請(qǐng)人】漢斯-邁克爾·多施