一種烏司他丁治療三陰性乳腺癌的模型構建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種烏司他丁治療三陰性乳腺癌的模型構建方法，該模型構建方法包括：構建CCL22過表達和敲低的TNBC細胞模型；用CCL22過表達及敲低的4T1細胞構建小鼠荷瘤模型；采用4T1細胞構建小鼠移植瘤模型，本發(fā)明同時公開一種檢測烏司他丁治療三陰性乳腺癌的影響與機制的方法，檢測烏司他丁對TNBC細胞分泌的趨化因子CCL22量的抑制；檢測CCL22對腫瘤細胞周圍treg細胞的招募，檢測treg細胞表面GITR的表達。本發(fā)明針對烏司他丁在乳腺癌中的治療價值的研究在國內(nèi)外均屬首例，針對該藥物影響腫瘤微環(huán)境機制的研究將為該藥物應用于乳腺癌治療特別是三陰性乳腺癌治療的臨床使用提供應用基礎研究。
【專利說明】
-種烏司他τ治療Ξ陰性乳腺癌的模型構建方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于乳腺癌治療領域，尤其設及一種烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的模型構 建方法。
【背景技術】
[0002] 發(fā)明人通過前期研究工作發(fā)現(xiàn)：
[0003] 1)烏司他下抑制乳腺癌細胞增殖、促使細胞調(diào)亡，其機制可能與烏司他下降低免 疫/炎癥因子TNF-a、比-6和IL-10的表達和調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境有關。
[0004] 2)烏司他下和泰索帝均可顯著抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231侵襲、轉移，烏司他下 可增強泰索帝的抑制作用，機制可能與下調(diào)TGF-β的表達，抑制血管形成，上皮間皮轉化有 關，同時，也與烏司他下下調(diào)乳腺癌細胞CXCR4的表達水平相關。
[0005] 3)烏司他下聯(lián)合泰索帝抑制乳腺癌增殖及轉移，可能與調(diào)節(jié)乳腺癌微環(huán)境中CD4+ CD25+Foxp3巧/CD4 巧相關。
[0006] 研究表明，烏司他下具有抑制乳腺癌包括Ξ陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC)增殖轉移的作用，其中對腫瘤免疫微環(huán)境中化eg的影響可能起著關 鍵作用。
[0007] Treg促進腫瘤發(fā)生免疫逃逸是通過腫瘤細胞產(chǎn)生的大量趨化因子CCL22招募高表 達趨化因子受體CCR4的Treg到腫瘤周圍，一方面使腫瘤組織處于免疫抑制環(huán)境中，從而促 進腫瘤細胞的增殖；另一方面，Treg大量聚集在腫瘤組織周圍，形成富含Treg的細胞層，可 有效阻礙自然殺傷性細胞(natural killer cell，NK)和Tc等淋己細胞對腫瘤細胞的攻擊。 而腫瘤分泌趨化因子(XL22過程中存在著TGF-e-microRNA-34a-(XL22軸，活化的TGF-β可抑 審lJmicroRNA-34a基因的表達，從而使趨化因子CCL22產(chǎn)生增加，說明轉化生長因子TGF-β與 趨化因子C化22呈正相關，因此可W假設烏司他下通過TGF-曲iicroRNA-34a-C化22軸影響腫 瘤細胞產(chǎn)生的CCL22數(shù)量。而前期的研究W及文獻均提示烏司他下可降低腫瘤細胞及淋己 細胞分泌的TGF-β。因此前期工作中發(fā)現(xiàn)烏司他下降低腫瘤組織周圍及瘤內(nèi)的Treg,可能是 通過作用于TGF-f3microRNA-34a-(XL22軸，降低腫瘤細胞分泌(XL22的數(shù)量，從而減少腫瘤 組織周圍化eg的聚集，減少腫瘤發(fā)生免疫逃逸，抑制腫瘤增殖、侵襲及遠處轉移。另有研究 顯示，Treg表面抑制性免疫受體糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(旨111(3〇(3〇的;[(301(1- induced1:umor necrosis factorreceptor，GITR)，可與DC表面的GITR配體結合，促進Treg 的增殖，并抑制DC表面GITR配體的數(shù)量，使其與其他效應性T細胞的結合力下降，抑制效應 性T細胞的功能。由此可見，腫瘤細胞分泌的(XL22和Treg表面的GITR，是調(diào)節(jié)乳腺癌免疫微 環(huán)境的潛在祀點。
[000引目前，關于烏司他下可能是通過抑制腫瘤細胞分泌(XL22,并降低化eg表面GITR的 表達，抑制Ξ陰性乳腺癌微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量與功能，控制腫瘤生長及轉移的資料 尚未報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的模型構建方法，旨在研究關 于烏司他下可能是通過抑制腫瘤細胞分泌CCL22,并降低Treg表面GITR的表達，抑制Ξ陰性 乳腺癌微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量與功能，控制腫瘤生長及轉移，為Ξ陰性乳腺癌的有效 治療提供新方向的問題。
[0010]本發(fā)明是運樣實現(xiàn)的，
[0011] 一種烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的模型構建方法，所述的烏司他下治療Ξ陰性乳 腺癌的模型構建方法包括：
[001。構建CCL22過表達和敲低的TNBC細胞模型；
[0013] 用CCL22過表達及敲低的4T1細胞構建小鼠荷瘤模型；
[0014] 采用4T1細胞構建小鼠移植瘤模型。
[0015] 本發(fā)明另一目的在于提供一種檢測烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的影響與機制的 方法，所述檢測烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的影響與機制的方法包括W下步驟：
[0016] 步驟一、通過構建CCL22過表達和敲低的TNBC細胞模型，采用定量PCR與Western b 101檢測烏司他下對TNBC細胞分泌的趨化因子CCL22量的抑制；
[0017] 步驟二、通過用CCL22過表達及敲低的4T1細胞構建小鼠荷瘤模型，采用流式細胞 術與Western blot方法檢測CCL22對腫瘤細胞周圍treg細胞的招募，驗證CCL22對腫瘤免疫 微環(huán)境的影響；
[0018] 步驟Ξ、通過采用4T1細胞構建小鼠移植瘤模型，應用Western blot方法檢測treg 細胞表面GITR的表達，驗證烏司他下通過Treg細胞功能的改變對腫瘤細胞生物學行為的影 響。
[0019] 進一步，所述檢測烏司他下對TNBC細胞分泌的趨化因子CCL22量的抑制，采用的方 法為：
[0020] 通過TNBC細胞模型檢測驗證烏司他下對TNBC細胞中分泌的趨化因子CCL22的量的 改變；
[0021 ] 應用烏司他下處理TNBC細胞，提取細胞RNA，確認RNA質量；
[0022] 通過實時巧光定量PCR檢測CCL22在mRNA水平的表達改變；
[0023] 應用烏司他下處理TNBC細胞，提取細胞總蛋白，確認蛋白質量；
[0024] 通過Western blot檢測相應細胞中的蛋白表達情況，通過比較明確烏司他下對 (XL22在蛋白水平的表達影響；
[0025] 應用烏司他下處理TNBC細胞，收集培養(yǎng)基中蛋白質，確認蛋白質質量；
[00%] 通過化ISA檢測培養(yǎng)基中CCL22的水平，驗證烏司他下對TNBC細胞中分泌的CCL22 的量的改變。
[0027]進一步，所述檢測CCL22對腫瘤細胞周圍化eg細胞的招募，驗證CCL22對腫瘤免疫 微環(huán)境的影響的方法為：
[002引構建CCL22過表達和敲低的TNBC細胞模型，
[0029] 用CCL22過表達及敲低的4T1細胞構建小鼠荷瘤模型，
[0030] 取腫瘤組織，流式細胞術檢測腫瘤組織及腫瘤周圍淋己結中化eg的量，驗證檢測 (XL22對化eg的招募作用；檢測腫瘤體積大小，腫瘤組織中化eg表達的免疫因子比-10、TGF- 0的表達差異，W及腫瘤遠處轉移情況，通過分析檢測Treg的數(shù)量對腫瘤生長及轉移的影 響。
[0031] 進一步，所述檢測化eg細胞表面GITR的表達，驗證烏司他下通過化eg細胞功能的 改變對腫瘤細胞生物學行為的影響的方法為：
[0032] 通過采用4T1細胞構建小鼠移植瘤模型，用烏司他下處理，比較腫瘤生長轉移情 況，研究烏司他下對移植瘤的影響；
[0033] 取腫瘤組織，流式細胞術檢測腫瘤組織及腫瘤周圍淋己結中Treg的量，同時用 western blot法檢測Treg細胞中GITR的表達；
[0034] 通過分析檢測烏司他下對GITR的表達調(diào)節(jié)作用W及對化eg細胞招募的影響和腫 瘤生物學行為的影響。
[0035] 進一步，所述的分析采用SPSS. 19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)表示，采用 單因素方差分析進行多組間比較，組間兩兩比較采用LSD-t或Tamhane法，檢驗水準α = 0.05。
[0036] 本發(fā)明針對烏司他下在乳腺癌中的治療價值的研究在國內(nèi)外均屬首例，針對該藥 物影響腫瘤微環(huán)境機制的研究(如，最新有價值的發(fā)現(xiàn):烏司他下聯(lián)合化療藥物可降低乳腺 癌腫瘤微環(huán)境中CD4+CD25+FOXP3+/CD4巧細胞的比值)將為該藥物應用于乳腺癌治療特別 是Ξ陰性乳腺癌治療的臨床使用提供應用基礎研究。
【附圖說明】
[0037] 圖1是本發(fā)明提供的檢測烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的影響與機制的方法流程 圖。
【具體實施方式】
[0038] 為能進一步了解本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
、特點及功效，茲例舉W下實施例，并配合附圖 詳細說明如下。
[0039] 通過本發(fā)明：
[0040] 1)、烏司他下與環(huán)憐酷胺或泰索帝配伍，抑制乳腺癌細胞MCF-7/DA-MB-231增殖， 其機制可能與烏司他下降低免疫、炎癥因子了^-曰、化-6和化-10的表達和調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境 有關。
[0041] 2)、烏司他下和泰索帝均可顯著抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231侵襲、轉移，烏司他下 可增強泰索帝的抑制作用，機制可能與下調(diào)￥66。-(：、66。1?、41〇\了6。-0的表達，抑制血管形 成，上皮間皮轉化有關，也與烏司他下下調(diào)乳腺癌細胞CXCR4的表達水平相關。
[0042] 3)、烏司他下和泰索帝均可顯著抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231侵襲，機制可能與Ε服 受抑，uPA、uPAR、MMP-9表達下調(diào)有關。
[0043] 4)、烏司他下抑制乳腺癌細胞增殖、促使細胞調(diào)亡，可能與通過抑制JNk-2和NF-KB 通路減少IGF-1R、PDGFA生成有關。
[0044] 5)、烏司他下聯(lián)合多西他賽抑制對乳腺癌生長及轉移，與降低腫瘤微環(huán)境中CD4+ CD25+FOXP3+/CD4巧細胞的比值有關。
[0045] 下面結合附圖對本發(fā)明詳細描述。
[0046] 一種烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的模型構建方法，所述的烏司他下治療Ξ陰性乳 腺癌的模型構建方法包括：
[0047] 構建CCL22過表達和敲低的TNBC細胞模型；
[004引用CCL22過表達及敲低的4T1細胞構建小鼠荷瘤模型；
[0049] 采用4T1細胞構建小鼠移植瘤模型。
[0050] 如圖1所示:一種檢測烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的影響與機制的方法，所述檢測 烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的影響與機制的方法包括W下步驟：
[0化1] S101:通過構建(XL22過表達和敲低的TNBC細胞模型，采用定量PCR與Western b 1 ot檢測烏司他下對TNBC細胞分泌的趨化因子CCL22量的抑制；
[0052] S102:通過用CCL22過表達及敲低的4T1細胞構建小鼠荷瘤模型，采用流式細胞術 與Western blot方法檢測(XL22對腫瘤細胞周圍treg細胞的招募，驗證(XL22對腫瘤免疫微 環(huán)境的影響；
[0化3] S103:通過采用4T1細胞構建小鼠移植瘤模型，應用Western blot方法檢測treg細 胞表面GITR的表達，驗證烏司他下通過化eg細胞功能的改變對腫瘤細胞生物學行為的影 響。
[0054] 所述檢測烏司他下對TNBC細胞分泌的趨化因子CCL22量的抑制，采用的方法為:通 過構建CCL22過表達和敲低的TNBC細胞模型，
[0055] 應用烏司他下處理TNBC細胞，提取細胞RNA，確認RNA質量；
[0056] 通過實時巧光定量PCR檢測CCL22在mRNA水平的表達改變；
[0057] 應用烏司他下處理TNBC細胞，提取細胞總蛋白，確認蛋白質量；
[005引通過Western blot檢測相應細胞中的蛋白表達情況，通過比較明確烏司他下對 (XL22在蛋白水平的表達影響；
[0059] 應用烏司他下處理TNBC細胞，收集培養(yǎng)基中蛋白質，確認蛋白質質量；
[0060] 通過化ISA檢測培養(yǎng)基中CCL22的水平，驗證烏司他下對TNBC細胞中分泌的CCL22 的量的改變。
[0061] 所述檢測CCL22對腫瘤細胞周圍treg細胞的招募，驗證CCL22對腫瘤免疫微環(huán)境的 影響的方法為：
[0062] 構建CCL22過表達和敲低的TNBC細胞模型，
[0063] 通過用CCL22過表達及敲低的4T1細胞構建小鼠荷瘤模型，取腫瘤組織，流式細胞 術檢測腫瘤組織及腫瘤周圍淋己結中化eg的量，驗證檢測CCL22對化eg的招募作用;檢測腫 瘤體積大小，腫瘤組織中Treg表達的免疫因子IL-10、TGF-i3的表達差異，W及腫瘤遠處轉移 情況，通過分析檢測Treg的數(shù)量對腫瘤生長及轉移的影響。
[0064] 所述檢測化eg細胞表面GITR的表達，驗證烏司他下通過化eg細胞功能的改變對腫 瘤細胞生物學行為的影響的方法為：
[0065] 通過采用4T1細胞構建小鼠移植瘤模型，用烏司他下處理，比較腫瘤生長轉移情 況，研究烏司他下對移植瘤的影響；
[0066] 取腫瘤組織，流式細胞術檢測腫瘤組織及腫瘤周圍淋己結中Treg的量，同時用 western blot法檢測Treg細胞中GITR的表達；
[0067] 通過分析檢測烏司他下對GITR的表達調(diào)節(jié)作用W及對化eg細胞招募的影響和腫 瘤生物學行為的影響。
[0068] 所述的分析采用SPSS. 19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)WY±S表示，采用單因素 方差分析進行多組間比較，組間兩兩比較采用LSD-t或Tamhane法，檢驗水準α = 0.05。
[0069] 本發(fā)明針對烏司他下在乳腺癌中的治療價值的研究在國內(nèi)外均屬首例，針對該藥 物影響腫瘤微環(huán)境機制的研究將為該藥物應用于乳腺癌治療特別是Ξ陰性乳腺癌治療的 臨床使用提供應用基礎研究。
[0070] 結合實施例對本發(fā)明進一步說明。
[0071 ]驗證烏司他下在TNBC細胞中對CCL22表達的影響與機制的具體方法包括：
[0072] 步驟一、應用空白對照及烏司他下(分低濃度400UI/ml、中濃度800UI/ml、高濃度 1600UI/ml)處理TNBC細胞(4Tl及MDA-MB-231)，于第12、24、36、48小時提取細胞RNA，檢測 RNA濃度并確認RNA質量良好；
[0073] 步驟二、取上述RNA通過逆轉錄構建cDNA文庫，通過實時巧光定量PCR檢測CCL22在 mRNA水平的表達，比較烏司他下處理與空白對照組表達差異及不同濃度烏司他下分組間 (XL22表達的差異，明確烏司他下對CCL22mRNA表達的影響；
[0074] 步驟Ξ、應用空白對照及不同濃度的烏司他下處理TNBC細胞(4T1及MDA-MB-231)， 不同時間提取細胞總蛋白，應用BCA試劑盒檢測蛋白濃度并確認蛋白質量良好；
[0075] 步驟四、取上述蛋白進行Western blot分析，通過CCL22抗體識別，檢測CCL22在蛋 白水平的表達，比較烏司他下處理與空白對照組表達差異及不同濃度烏司他下分組間 (XL22表達的差異，明確烏司他下對CCL22蛋白表達的影響。
[0076] 步驟五、應用空白對照及烏司他下(分低濃度400UI/ml、中濃度800UI/ml、高濃度 1600UI/ml)處理TNBC細胞(4T1及MDA-MB-231)，于第24、48、72小時收集細胞培養(yǎng)基，富集培 養(yǎng)基中蛋白，應用BCA試劑盒檢測蛋白濃度并確認蛋白質量良好；
[0077] 步驟六、取上述蛋白進行化ISA分析，通過CCL22抗體識別，檢測(XL22的量，比較烏 司他下處理與空白對照組表達差異及不同濃度烏司他下分組間CCL22量的差異，明確烏司 他下對TNBC細胞外分泌CCL22蛋白量的影響。
[0078] 探討CCL22通過免疫誘導對腫瘤生物學行為的影響，具體方法為：
[0079] 步驟一、構建CCL22過表達質粒和siRNA干擾質粒，通過病毒載體包裝，感染TNBC細 胞(4T1細胞），通過篩選得到(XL22過表達及敲低的細胞株(4T1-(XL22和4T1-C化22-down細 胞），通過實時巧光定量PCR及Western blot在mRNA及蛋白水平驗證過表達及干擾效果；
[0080] 步驟二、培養(yǎng)4T1細胞、4T1-(XL22和4Tl-CCL22-down細胞，收集細胞，行皮下注射 構建小鼠荷瘤模型，每組動物為8-10只；
[0081] 步驟Ξ、每3天觀察，測量瘤體體積，繪制移植瘤生長曲線。至移植瘤直徑約1cm時 處死小鼠，取腫瘤組織，一半石蠟包埋用于皿染色及免疫組化檢測，半定量分析腫瘤組織周 圍化eg細胞的量;一半制作細胞懸液通過流式細胞術定量分析組織中化eg的量，通過上述 實驗驗證CCL22對Treg的招募作用。同時取小鼠內(nèi)臟組織，分析腫瘤遠處轉移情況；
[0082] 步驟四、用上述石蠟包埋組織切片，采用免疫組化法檢測腫瘤組織中化eg表達的 免疫因子IL-10、TGF-i3等的表達差異，通過與腫瘤大小及遠處轉移情況相關分析確認化eg 的數(shù)量對腫瘤生長及轉移的影響。
[0083] 進一步，探討烏司他下對化eg細胞中GITR表達的影響的具體方法為：
[0084] 步驟一、培養(yǎng)上述4T1細胞，收集細胞，行皮下注射構建小鼠荷瘤模型，計劃使用動 物24只；
[0085] 步驟二、分空白對照及不同濃度的烏司他下處理實驗動物，每組8-10只小鼠，共用 2周。每3天觀察，測量瘤體體積，繪制移植瘤生長曲線，比較腫瘤生長轉移情況，通過比較分 析明確烏司他下對移植瘤的影響；
[00化]步驟Ξ、至移植瘤直徑約1cm時處死小鼠，取腫瘤組織，一半石蠟包埋用于皿染色 及免疫組化檢測，半定量分析腫瘤組織周圍化eg細胞的量;一半制作細胞懸液通過流式細 胞術定量分析組織中化eg的量，通過上述實驗驗證CCL22對化eg的招募作用。同時取小鼠內(nèi) 臟組織，分析腫瘤遠處轉移情況；
[0087] 步驟四、用上述石蠟包埋組織切片，采用免疫組化法半定量分析腫瘤組織中化eg 細胞中GITR的表達，通過相關分析明確烏司他下對GITR表達的調(diào)節(jié)，同時與腫瘤生長情況 及轉移情況進行相關分析，探討烏司他下通過調(diào)節(jié)GITR對移植瘤生物學行為的影響。
[0088] 體內(nèi)驗證烏司他下的免疫調(diào)節(jié)作用的具體方法為：
[0089] 步驟一、在臨床中選擇TNBC乳腺癌患者80例，隨機分組，用安慰劑(n = 40)對照及 烏司他下（1600U/人/天）（n = 40)處理2周；
[0090] 步驟二、用藥3-4周后采患者靜脈血10ml，通過離屯、機濃聚血細胞，流式細胞儀患 者檢測血中化eg細胞的量；
[0091] 步驟四、比較不同處理對患者Treg細胞的影響，在體內(nèi)明確烏司他下對化eg細胞 的調(diào)節(jié)作用。
[0092] 本發(fā)明針對烏司他下在乳腺癌中的治療價值的研究在國內(nèi)外均屬首例，針對該藥 物影響腫瘤微環(huán)境機制的研究將為該藥物應用于乳腺癌治療特別是Ξ陰性乳腺癌治療的 臨床使用提供應用基礎研究。
[0093] W上所述僅是對本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制， 凡是依據(jù)本發(fā)明的技術實質對W上實施例所做的任何簡單修改，等同變化與修飾，均屬于 本發(fā)明技術方案的范圍內(nèi)。
【主權項】
1. 一種烏司他丁治療三陰性乳腺癌的模型構建方法，其特征在于，所述的烏司他丁治 療三陰性乳腺癌的模型構建方法包括： 構建CCL22過表達和敲低的TNBC細胞模型； 用CCL22過表達及敲低的4T1細胞構建小鼠荷瘤模型； 采用4T1細胞構建小鼠移植瘤模型。2. -種利用權利要求1所述方法檢測烏司他丁治療三陰性乳腺癌的影響與機制的方 法，其特征在于，所述檢測烏司他丁治療三陰性乳腺癌的影響與機制的方法包括以下步驟： 步驟一、通過構建CCL22過表達和敲低的TNBC細胞模型，采用定量PCR與Western blot 檢測烏司他丁對TNBC細胞分泌的趨化因子CCL22量的抑制； 步驟二、通過用CCL22過表達及敲低的4T1細胞構建小鼠荷瘤模型，采用流式細胞術與 Western blot方法檢測CCL22對腫瘤細胞周圍treg細胞的招募，驗證CCL22對腫瘤免疫微環(huán) 境的影響； 步驟三、通過采用4T1細胞構建小鼠移植瘤模型，應用Western blot方法檢測treg細胞 表面GITR的表達，驗證烏司他丁通過Treg細胞功能的改變對腫瘤細胞生物學行為的影響。3. 如權利要求2所述的檢測烏司他丁治療三陰性乳腺癌的影響與機制的方法，其特征 在于，所述檢測烏司他丁對TNBC細胞分泌的趨化因子CCL22量的抑制，采用的方法為:通過 構建CCL22過表達和敲低的TNBC細胞模型， 應用烏司他丁處理TNBC細胞，提取細胞RNA，確認RNA質量； 通過實時熒光定量PCR檢測CCL22在mRNA水平的表達改變； 應用烏司他丁處理TNBC細胞，提取細胞總蛋白，確認蛋白質量； 通過Western blot檢測相應細胞中的蛋白表達情況，通過比較明確烏司他丁對CCL22 在蛋白水平的表達影響； 應用烏司他丁處理TNBC細胞，收集培養(yǎng)基中蛋白質，確認蛋白質質量； 通過EL ISA檢測培養(yǎng)基中CCL22的水平，驗證烏司他丁對TNBC細胞中分泌的CCL22的量 的改變。4. 如權利要求2所述的檢測烏司他丁在三陰性乳腺癌的影響與機制的方法，其特征在 于，所述檢測CCL22對腫瘤細胞周圍treg細胞的招募，驗證CCL22對腫瘤免疫微環(huán)境的影響 的方法為： 構建CCL22過表達和敲低的TNBC細胞模型， 用CCL22過表達及敲低的4T1細胞構建小鼠荷瘤模型， 取腫瘤組織，流式細胞術檢測腫瘤組織及腫瘤周圍淋巴結中Treg的量，驗證檢測CCL22 對Treg的招募作用;檢測腫瘤體積大小，腫瘤組織中Treg表達的免疫因子IL-HKTGF-β的表 達差異，以及腫瘤遠處轉移情況，通過分析檢測Treg的數(shù)量對腫瘤生長及轉移的影響。5. 如權利要求2所述的檢測烏司他丁在三陰性乳腺癌的影響與機制的方法，其特征在 于，所述檢測treg細胞表面GITR的表達，驗證烏司他丁通過Treg細胞功能的改變對腫瘤細 胞生物學行為的影響的方法為： 通過采用4T1細胞構建小鼠移植瘤模型，用烏司他丁處理，比較腫瘤生長轉移情況，研 究烏司他丁對移植瘤的影響； 取腫瘤組織，流式細胞術檢測腫瘤組織及腫瘤周圍淋巴結中Treg的量，同時用western blot法檢測Treg細胞中GITR的表達； 通過分析檢測烏司他丁對GITR的表達調(diào)節(jié)作用以及對Treg細胞招募的影響和腫瘤生 物學行為的影響。6.如權利要求4-5任意一項所述的檢測烏司他丁在三陰性乳腺癌的影響與機制的方 法，其特征在于，所述的分析采用SPSS. 19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以Z土S表示，采用 單因素方差分析進行多組間比較，組間兩兩比較采用LSD-t或Tamhane法，檢驗水準α = 0.05〇
【文檔編號】C12Q1/02GK105920041SQ201610255982
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月22日
【發(fā)明人】孫治君, 陳建生, 高峰, 趙曉亮, 羅杰, 鐘彪, 王宏, 王寧, 孫昕
【申請人】孫治君