一種瑪咖提取物及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種瑪咖提取物及其制備方法和應用。所述提取物按質量分數主要包括28%~50%的總瑪咖酰胺、25%~40%的芳香族芥子油苷、4%~12%的總皂苷、1%~8%的腺苷，其中總瑪咖酰胺中N?芐基亞油酰胺含量占總瑪咖酰胺含量的35%~60%。本發(fā)明所述的瑪咖提取物穩(wěn)定性高，雜質少，富含多種生物活性成分，對提高抗運動性疲勞和抗中樞疲勞均有著良好的效果，顯著提高了抗疲勞作用。
【專利說明】
-種瑪咖提取物及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，特別設及一種瑪咖提取物及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 瑪咖化epdium meyenii Walpers，Maca)是十字花科（Brassicaceae)獨行菜屬 (Lepidium)-年生或兩年生草本植物，原產于秘魯安第斯山區(qū)，我國云南、西藏、新疆和四 川等地方相繼成功完成了瑪咖的引種栽培，實現(xiàn)了規(guī)?；N植。由于瑪咖不僅有著豐富的 蛋白質、獨特的氨基酸組成、多種不飽和脂肪酸、礦物質元素和維生素等，而且含有芳香族 芥子油巧、瑪咖酷胺、瑪咖締、醬醇、腺巧、皂巧、咪挫生物堿等次生代謝產物，具有多種保健 功能和治療作用，如增強精力、抗疲勞、提高生育力、緩解壓力、改善性功能、改善睡眠、神經 保護、增強免疫力和抗腫瘤等多方面作用。
[0003] 隨著生活節(jié)奏的加快，勞動和社會生活使人們身體日益疲急不堪，人們在精神上 也面臨很大的壓力，很容易產生疲勞感，運種狀態(tài)嚴重影響人們的生活質量，因此人們將對 疲勞的預防與治療產生急迫的需求。
[0004] 傳統(tǒng)的瑪咖提取物制備方法有水提法、醇提法、醇-水提法、水提醇沉法、醇提水沉 法，難W充分獲得瑪咖抗疲勞活性成分鑒于瑪咖生物活性成分復雜，現(xiàn)有瑪咖提取物存在 有效成分含量低、使用效價低等缺點，因此急需一種瑪咖提取物有效成分含量高，利用率高 的提取方法。

【發(fā)明內容】

[0005] 針對目前瑪咖提取物制備過程中存在的問題，為了保持瑪咖提取物中功效成分的 生物活性需要，實現(xiàn)充分提取瑪咖中的功效性成分，本發(fā)明的目的在于提供一種瑪咖提取 物及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述瑪咖提取物的應用。
[0007] 一種瑪咖提取物，其按質量分數主要包括28%~50%的總瑪咖酷胺、25%~40%的芳香 族芥子油巧、4%~12%的總皂巧、1%~8%的腺巧，其中總瑪咖酷胺中N-芐基亞油酷胺含量占總 瑪咖酷胺含量的35%~60%。
[000引相對于現(xiàn)有技術，所述提取物中的活性成分總瑪咖酷胺、芳香族芥子油巧、總皂 巧、腺巧，特別是N-芐基亞油酷胺顯著提高，該提取物對提高抗運動性疲勞和抗中樞疲勞均 有著良好的效果。
[0009]本發(fā)明還提供所述瑪咖提取物的制備方法，包括如下步驟： I.將瑪咖鮮根切片后干燥，粉碎，在料液比1:5~20條件下用低極性溶劑浸提，過濾得 提取液ai和濾渣bi，提取液ai減壓濃縮，濃縮液上樣進行柱層析，溶劑洗脫，收集WN-芐基亞 油酷胺為主體的總瑪咖酷胺組分洗脫液，洗脫液減壓濃縮，干燥，得到提取物A; Π .將步驟I中過濾得到的濾渣bi在105°C滅酶15~40 min,用乙醇水溶液在料液比1:5 ~20條件下浸提，過濾得提取液曰2，提取液曰2減壓濃縮，濃縮液上樣進行柱層析，溶劑洗脫，收 集芳香族芥子油巧、總皂巧、腺巧組分洗脫液，洗脫液減壓濃縮，干燥，粉碎，得到提取物B; 虹.將提取物A和提取物B按重量比1:0.5~2的比例均勻混合，即得到所述瑪咖提取物。
[0010] 所述制備方法使總瑪咖酷胺溶于低極性溶劑，芥子油巧等溶于乙醇水溶液，發(fā)明 人對于提取物的不同溶解性質，有針對性地設計了瑪咖提取物的制備方法。所述方法通過 對提取液和濾渣的分別處理，使得提取物總瑪咖酷胺組分中的N-芐基亞油酷胺含量增高， 同時，通過對提取物A、B混合比例的優(yōu)化使得所述瑪咖提取物相較于現(xiàn)有技術的同類產品 具有顯著優(yōu)勢。
[0011] 按照所述方法制備得到上述 優(yōu)選地，步驟I中所述低極性溶劑為乙酸乙醋、乙酸、環(huán)己燒、正己燒或石油酸中的一種 或多種。
[0012] 優(yōu)選地，步驟I中所述柱層析采用硅膠柱或中性氧化侶柱。
[0013] 優(yōu)選地，步驟I中所述溶劑洗脫采用的溶劑為甲醇、無水乙醇、乙酸乙醋或石油酸 中的一種或多種，洗脫溶劑極性由小到大進行等度、多段等度或梯度洗脫。
[0014] 優(yōu)選地，步驟Π 中所述柱層析采用0201、0301、0315、5-8、48-8型大孔樹脂柱或酸 性氧化侶柱中的一種。
[0015] 優(yōu)選地，步驟Π 中所述溶劑洗脫采用的溶劑為水-無水乙醇-氯化錠、水-無水乙 醇-硫酸錠、水-無水乙醇-碳酸氨鋼、水-無水乙醇-氨氧化鋼、水-無水乙醇-氯化鋼或水-無 水乙醇-硫酸鐘中的任意一組或者至少兩組等度、多段等度或梯度洗脫。優(yōu)選地，其中所述 氯化錠、硫酸錠、碳酸氨鋼、氨氧化鋼、氯化鋼或硫酸鐘的濃度為0.01~5 mol/L，所述無水乙 醇與鹽溶液(氯化錠、硫酸錠、碳酸氨鋼、氨氧化鋼、氯化鋼或硫酸鐘)的比例(V/V)為0~80%。
[0016] 優(yōu)選地，獲得所述提取物A或B的干燥方式為真空干燥、冷凍干燥或噴霧干燥。
[0017] 更優(yōu)選地，所述制備方法包括如下步驟： I.將瑪咖鮮根切片后55°C下干燥，粉碎至10~20目，在料液比1:5~20、溫度50°C~80°C 條件下用低極性溶劑浸提2~3次，每次時間2 h~3 h，過濾得提取液ai和濾渣bi，提取液ai減 壓濃縮，濃縮液上樣進行柱層析，溶劑洗脫，收集WN-芐基亞油酷胺為主體的瑪咖酷胺組分 洗脫液，洗脫液減壓濃縮，干燥，得到提取物A; Π .將步驟I中過濾得到的濾渣bi在105°C滅酶15~40 min,用50%~98%濃度乙醇水溶液 在料液比1:5~20、溫度50°C~90°C條件下浸提2~3次，每次時間1 h~2 h，過濾得提取液曰2,提 取液32減壓濃縮，濃縮液上樣進行柱層析，溶劑洗脫，收集芳香族芥子油巧、總皂巧、腺巧組 分洗脫液，洗脫液減壓濃縮，干燥，粉碎，得到提取物B; 虹.將提取物A和提取物B按重量比1:0.5~2的比例均勻混合，即得到本發(fā)明瑪咖提取 物。
[0018] 本發(fā)明還提供所述瑪咖提取物在提高抗運動性疲勞和抗中樞疲勞中的應用。優(yōu)選 地，所述瑪咖提取物的使用劑量為1.0 g/kg. bw. d。
[0019] 經動物實驗表明，本發(fā)明所提供的瑪咖提取物能夠顯著提高抗運動性疲勞和抗中 樞疲勞作用。
[0020] 本發(fā)明具有如下有益效果：（1)本發(fā)明所述的瑪咖提取物具有高度穩(wěn)定性，富含多 種生物活性成分，同時包含脂溶性和水溶性兩個有效部位，有效成分含量高；（2)瑪咖提取 物的制備方法可去除大量雜質，顯著提高有效成分含量，充分獲取瑪咖活性成分，同時重復 性和穩(wěn)定性好，并且原料利用率和活性成分得率高，對生產設備適應強，適合工業(yè)化生產； (3 )通過抗運動性疲勞和抗中樞疲勞藥理實驗評價，本發(fā)明瑪咖提取物對提高抗運動性疲 勞和抗中樞疲勞均有著良好的效果，克服了無法同時達到抗運動性疲勞和抗中樞疲勞的問 題，顯著提高了抗疲勞作用。
【具體實施方式】
[0021] 為了更好的理解本發(fā)明的技術方案，下面結合實施例詳細描述本發(fā)明提供的技術 方案。
[0022] 實施例1 本實施例所述瑪咖提取物通過下述制備方法獲得，其步驟包括： I.稱取12 kg瑪咖鮮根，切片后55°C下干燥，粉碎過10目，用石油酸(60~90°C)浸提，料 液比1:10，提取溫度70°C，過濾得提取液，提取2次，每次時間化，合并兩次提取液，減壓濃 縮，濃縮液上硅膠柱層析，用乙酸乙醋-石油酸體系梯度洗脫（10:90、25:75、35:65、50:50)， 收集WN-芐基亞油酷胺為主體的瑪咖酷胺組分洗脫液，洗脫液減壓濃縮，真空干燥，得到提 取物A; Π .上述的瑪咖提取殘渣，自然揮干，105°C滅酶30 min,用80%乙醇水溶液浸提，料液比 1:10，提取溫度70°C，過濾得提取液，提取2次，每次時間2 h，合并兩次提取液，減壓濃縮，濃 縮液進行D201大孔樹脂柱層析，用水-無水乙醇-硫酸鐘體系梯度（1 mol/L硫酸鐘濃度不 變，無水乙醇與鹽水溶液體積比例依次0%、20%、40%、60%、80%)，收集芳香族芥子油巧、總皂 巧、腺巧組分洗脫液，洗脫液減壓濃縮，真空干燥，粉碎，得到提取物B; 虹.將提取物A和提取物B按重量比1:2的比例均勻混合，即得到本實施例瑪咖提取物。
[0023] 所述瑪咖提取物經過分光光度計法和高速液相色譜法檢測，按質量分數主要包括 30.7%的總瑪咖酷胺、38.9%的芳香族芥子油巧、9.1%的總皂巧、5.8%的腺巧，其中總瑪咖酷 胺中N-芐基亞油酷胺含量占總瑪咖酷胺含量的44.3%。
[0024] 實施例2 本實施例瑪咖提取物通過下述制備方法獲得，其步驟包括： I.稱取12 kg瑪咖鮮根，切片后55°C下干燥，粉碎過10目，用正己燒浸提，料液比1:10， 提取溫度60°C，過濾得提取液，提取2次，每次時間2 h，合并兩次提取液，減壓濃縮，濃縮液 上硅膠柱層析，用乙酸乙醋-石油酸體系梯度洗脫（10:90、25:75、35:65、50:50)，收集WN- 芐基亞油酷胺為主體的瑪咖酷胺組分洗脫液，洗脫液減壓濃縮，真空干燥，得到提取物A; Π .上述的瑪咖提取殘渣，自然揮干，105°C滅酶30 min,用65%乙醇水溶液浸提，料液比 1:10，提取溫度70°C，過濾得提取液，提取2次，每次時間化，合并兩次提取液，減壓濃縮，濃 縮液進行酸性氧化侶柱層析，用水-無水乙醇-硫酸鐘體系梯度(0.05 mol/L硫酸鐘濃度不 變，無水乙醇與鹽水溶液體積比例依次0%、20%、40%、60%、80%)，收集芳香族芥子油巧、總皂 巧、腺巧組分洗脫液，洗脫液減壓濃縮，真空干燥，粉碎，得到提取物B; 虹.將提取物A和提取物B按重量比1:1的比例均勻混合，即得到本實施例瑪咖提取物。
[0025] 所述瑪咖提取物經過分光光度計法和高速液相色譜法檢測，按質量分數主要包括 46.1%的總瑪咖酷胺、34.6%的芳香族芥子油巧、8.4%的總皂巧、5.0%的腺巧，其中總瑪咖酷 胺中N-芐基亞油酷胺含量占總瑪咖酷胺含量的45.4%。
[00%] 實施例3 本發(fā)明瑪咖提取物通過下述制備方法獲得，其步驟包括： I.稱取12 kg瑪咖鮮根，切片后55°C下干燥，粉碎過10目，用正己燒浸提，料液比1:5,提 取溫度60°C，過濾得提取液，提取2次，每次時間化，合并兩次提取液，減壓濃縮，濃縮液上中 性氧化侶柱層析，用乙酸乙醋-甲醇體系梯度洗脫(40:60、30:70、20:80、10:90)，收集WN- 芐基亞油酷胺為主體的瑪咖酷胺組分洗脫液，洗脫液減壓濃縮，真空干燥，得到提取物A; Π .上述的瑪咖提取殘渣，自然揮干，105°C滅酶30 min,用65%乙醇水溶液浸提，料液比 1:10，提取溫度70°C，過濾得提取液，提取2次，每次時間化，合并兩次提取液，減壓濃縮，濃 縮液進行酸性氧化侶柱層析，用水-無水乙醇-硫酸鐘體系梯度(0.05 mol/L硫酸鐘濃度不 變，無水乙醇與鹽水溶液體積比例依次0%、20%、40%、60%、80%)，收集芳香族芥子油巧、總皂 巧、腺巧組分洗脫液，洗脫液減壓濃縮，真空干燥，粉碎，得到提取物B; 虹.將提取物A和提取物B按重量比1:2的比例均勻混合，即得到本實施例瑪咖提取物。
[0027] 所述瑪咖提取物經過分光光度計法和高速液相色譜法檢測，按質量分數主要包括 29.3%的總瑪咖酷胺、35.4%的芳香族芥子油巧、8.5%的總皂巧、5.3%的腺巧，其中總瑪咖酷 胺中N-芐基亞油酷胺含量占總瑪咖酷胺含量的41.9%。
[0028] 實施例4 本實施例瑪咖提取物通過下述制備方法獲得，其步驟包括： I.稱取12 kg瑪咖鮮根，切片后55°C下干燥，粉碎過10目，用正己燒浸提，料液比1:10， 提取溫度60°C，過濾得提取液，提取3次，每次時間化，合并兩次提取液，減壓濃縮，濃縮液上 中性氧化侶柱層析，用乙酸乙醋-甲醇體系梯度洗脫(40:60、30:70、20:80、10:90)，收集^ N-芐基亞油酷胺為主體的瑪咖酷胺組分洗脫液，洗脫液減壓濃縮，真空干燥，得到提取物A; Π .上述的瑪咖提取殘渣，自然揮干，105°C滅酶30 min,用65%乙醇水溶液浸提，料液比 1:15，提取溫度70°C，過濾得提取液，提取3次，每次時間化，合并兩次提取液，減壓濃縮，濃 縮液進行AB-8型大孔樹脂柱柱層析，用水-無水乙醇-硫酸鐘體系梯度(1 mol/L硫酸鐘濃度 不變，無水乙醇與鹽水溶液體積比例依次〇%、20%、40%、60%、80%)，收集芳香族芥子油巧、總 皂巧、腺巧組分洗脫液，洗脫液減壓濃縮，真空干燥，粉碎，得到提取物B; 虹.將提取物A和提取物B按重量比2:1的比例均勻混合，即得到本實施例瑪咖提取物。
[0029] 所述瑪咖提取物經過分光光度計法和高速液相色譜法檢測，按質量分數主要包括 48.9%的總瑪咖酷胺、26.2%的芳香族芥子油巧、5.1%的總皂巧、1.3%的腺巧，其中總瑪咖酷 胺中N-芐基亞油酷胺含量占總瑪咖酷胺含量的57.2%。
[0030] 實施例^4還包含未檢測的其它植物成分。
[0031 ]應用例1對小鼠抗運動性疲勞的藥理作用實驗 1.1實驗樣品 選用實施例2制備得到的瑪咖提取物作為受試樣品，另選瑪咖脂溶性提取物(正己燒浸 提，料液比1:10,60°C提取2次，每次2 h，提取濃縮得到的浸膏）、瑪咖醇溶性提取物(無水乙 醇浸提，料液比1:10，70°C提取2次，每次2 h，提取濃縮得到的浸膏）、瑪咖水溶性提取物(水 浸提，料液比1:10,70°C提取2次，每次2 h，提取濃縮得到的浸膏）、提取物C(實施例2中提取 物A和提取物B按重量比1: 3比例均勻混合得到）、提取物D(實施例2中提取物A和提取物B按 重量比3:1比例均勻混合得到）。
[0032] 1.2實驗動物 8周齡雄性昆明種小鼠，體重18g-22g。
[0033] 1.3實驗方法 將昆明種雄性小鼠隨機分成9組，分別是對照組(生理鹽水）、瑪咖脂溶性提取物組（1.0 g/kg . bw . d)、瑪咖醇溶性提取物組（1.0 g/kg . bw . d)、瑪咖水溶性提取物組（1.0 g/ kg.bw.d)、提取物C組（1.0g/kg.bw.d)、提取物D組（1.0g/kg.bw.d)、低劑量組(本發(fā)明瑪 咖提取物，0.2 g/kg. bw. d)、中劑量組(本發(fā)明瑪咖提取物，0.5 g/kg. bw. d)、高劑量組(本 發(fā)明瑪咖提取物，1.0 g/kg. bw. d)，每組16只。小鼠常規(guī)光照、飲水，22-26°C飼養(yǎng)，小鼠試驗 前在動物房環(huán)境中適應5天。每天灌胃1次，灌胃量為小鼠體重的1%，連續(xù)給予時間30天后， 分別進行負重游泳實驗W及血清尿素、肝糖原和血乳酸測定實驗，參照國家《保健食品檢驗 與評價技術規(guī)范》中的"抗疲勞功能檢驗方法"。
[0034] 1.3.1負重游泳實驗 末次給予受試樣品30 min后，將尾根部負荷5%體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水 深不少于30 cm,水溫25°C ± rC，記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間，即小鼠負重游泳時 間，結果如表1所示。
[0035] 表1不同瑪咖提取物對小鼠負重游泳力竭時間的影響
注:與空白對照組比較，*P < 〇.〇5，*中< 0.01;與脂溶性提取物組，Zp < 0.05;與醇溶 性提取物組，中< 0.05;與水溶性提取物組，中< 0.05;與提取物C組，中< 0.05;與提取物 D組，Dp < 0.05 1.3.2對小鼠血清尿素氮、肝糖原和血乳酸的影響 (1) 血清尿素測定：末次給受試樣品30 min后，在溫度為30°C的水中不負重游泳90 min，休息60 min后，摘眼球采血，血液樣品室溫靜置半小時后，用冷凍離屯、機2000巧m離屯、 10 min，取血清備用，用尿素氮測定試劑盒測定血清尿素氮，結果如表2所示； (2) 肝糖原測定:末次給受試樣品后30 min處死動物，取肝臟經生理鹽水漂洗后用濾紙 吸干，用糖原測定試劑盒測定肝糖原，結果如表2所示； (3) 血乳酸測定:末次給受試樣品后30 min后，然后不負重在溫度為30°C的水中游泳10 min后停止，摘眼球采血，血液樣品室溫靜置半小時后，用冷凍離屯、機2000 rpm離屯、10 min, 取血清備用，用乳酸測定試劑盒測定血血乳酸，結果如表2所示。
[0036] 表2不同瑪咖提取物對小鼠血清尿素氮、肝糖原和血乳酸的影響
注：與空白對照組比較，吁< 0.05;;與脂溶性提取物組，zp < 0.05;與醇溶性提取物 組，中< 0.05;與水溶性提取物組，中< 0.05;與提取物C組，中< 0.05;與提取物D組，Dp < 0.05 1.4實驗結論 本發(fā)明所述的瑪咖提取物，在負重游泳實驗中的結果為陽性，血清尿素氮、肝糖原、血 乳酸Ξ項生化指標結果也均為陽性，并且實驗中負重時間、肝糖原含量顯著高于簡單的進 行提取獲得的瑪咖脂溶性提取物組、瑪咖醇溶性提取物組、瑪咖水溶性提取物組、提取物C 組和提取物D組，表明本發(fā)明的瑪咖提取物具有更加有效的的抗運動性疲勞效果。
[0037] 應用實例2對小鼠抗中樞疲勞的藥理作用實驗 2.1實驗樣品 選用實施例2制備得到的瑪咖提取物作為受試樣品 2.2實驗動物 8周齡雄性昆明種小鼠，體重18g-22g。
[003引 2.3實驗方法 將昆明種雄性小鼠隨機分成4組，分別是空白對照組、睡眠剝奪致中樞疲勞模型（SD) 組、①組（本發(fā)明瑪咖提取物，0.5 g/kg.bw.d)和②組（本發(fā)明瑪咖提取物，1.0 g/ kg.bw.d)，每組16只，灌胃給藥20天誼白組和睡眠剝奪組灌胃相同體積的溶媒。
[0039] 2.3.1建立睡眠剝奪動物模型 采用改良的"多平臺水環(huán)境"方法制備睡眠剝奪致小鼠中樞疲勞(SD)模型，睡眠剝奪箱 尺寸為45 cmX30 cmX20 cm,小平臺尺寸為3 cmX5 cm。每個睡眠剝奪箱內安置12個小平 臺，放入6只小鼠于其中6個小平臺上;大平臺尺寸為15 cmX5 cm,放入3只小鼠于1個大平 臺上，小鼠在平臺上可自由攝水攝食。睡眠剝奪箱體中的水面較平臺低1 cm左右，水溫控制 在25°C±rC，每天更換箱中的水。
[0040] 2.3.2通道式水迷宮訓練及測試 采用黑色橡膠板制成（70 cmX40 cm X30 cm),水深22 cm,水溫25°C。自制的通道式 水迷宮設有i、n、m等3處盲端，終點處設有臺階安全區(qū)，小鼠到達終點后可爬上平臺安全 區(qū)W避免溺水。實驗第9天灌胃藥品后，對四組小鼠分別進行水迷宮訓練，具體訓練方法如 下：將小鼠放于終點處10 S，讓其感受并了解到運里是安全的；然后在A點處放置隔板，WA 點為起點開始訓練，讓小鼠自由游泳，記錄其通道式水迷宮實驗的潛伏期，即從放入水中到 爬上臺階所用的時間；如果在120 S內未找到終點臺階者，將被引導至該處，并記錄其潛伏 期為120 S，每天每只小鼠連續(xù)訓練2次。實驗第10、11天分別將隔板置于B點和C點，小鼠分 別從運兩處出發(fā)進行通道式水迷宮訓練。實驗第12天讓小鼠從C點出發(fā)，繼續(xù)鞏固訓練1天。 第13天灌胃后進行小鼠睡眠剝奪72 h實驗，同時每天進行通道式水迷宮的測試，記錄小鼠 在水迷宮中的潛伏期和進入盲端i、n、m的總次數。各組小鼠在通道式水迷宮實驗中游出 潛伏期和盲端錯誤數的數據見表3和表4。
[0041] 表3瑪咖提取物對小鼠水迷宮游出潛伏期的影響
注:#P < 0.05與空白對照對照組比較，*P < 0.05與睡眠剝奪致中樞疲勞模型組（SD 組)比較 睡眠對記憶的存儲有著非常重要的影響，已有研究顯示一定時間的睡眠剝奪可導致記 憶力和認知功能減退，造成腦組織損傷，采用通道式水迷宮實驗可測試睡眠剝奪前后小鼠 學習和記憶能力的變化。由表3和表4結果可知，本發(fā)明的瑪咖提取物②組相較于睡眠剝奪 模型組，水迷宮游出潛伏期顯著減少，盲端錯誤次數減少，表明本發(fā)明的瑪咖提取物能改善 睡眠剝奪引起的小鼠學習和記憶力能力的下降。
[0042] 表4瑪咖提取物對小鼠盲端錯誤數的影響
注:#P < 0.05與空白對照對照組比較，*P < 0.05與睡眠剝奪致中樞疲勞模型組（SD 組)比較 2.3.3小鼠端腦組織生化指標的測定 睡眠剝奪實驗結束后，用20%烏拉坦麻醉小鼠后頸椎脫白處死小鼠，每組10只，于冰浴 中快速取出端腦組織，并轉移到液氮中，然后保存在-80°C超低溫冰箱備用。取小鼠端腦組 織稱重，并放入小燒杯中，按照質量體積1:9加入9倍體積預冷的生理鹽水，快速剪碎組織并 將組織液倒入勻漿器中進行充分研磨勻漿，所有操作均在冰浴上快速進行;將制備好的組 織勻漿用冷凍離屯、機于3000巧m低溫離屯、10 min，取上清即可得10%組織勻漿，檢測谷脫甘 膚過氧化物酶(G細-Px)活力、超氧化物歧化酶（SOD)活力、丙二醒(MDA)含量W及單胺類神 經遞質5-徑色胺巧-?。⒍嗉喊?DA)和去甲腎上腺素(肥），方法均參照相應的試劑盒說明 書，測定數據見表5和表6。
[0043] 表5瑪咖提取物對小鼠端腦組織抗氧化能力的影響
注:#P < 0.05與空白對照對照組比較，*P < 0.05與睡眠剝奪致中樞疲勞模型組（SD 組)比較 睡眠剝奪會導致能量消耗增加，耗氧量增大，產生大量的氧自由基，對神經細胞造成了 損傷，如超氧陰離子自由基(CT2·)、過氧化氨(此〇2)可W氧化細胞膜上的脂肪酸，破壞細胞 膜脂結構和細胞內的蛋白質結構，并產生丙二醒(MDA)等脂質過氧化物，導致機體疲勞的發(fā) 生，并且隨著氧氣的消耗和自由基的生成，還將導致腦神經細胞突觸的傳遞功能受損，引起 中樞疲勞的發(fā)生。機體中廣泛存在的清除自由基的活性酶，如超氧化物歧化酶(SOD)主要清 除超氧陰離子自由基(〇-2·)，而谷脫甘膚過氧化物酶(G細-Px)主要催化此化等過氧化物的 分解，起到細胞保護的作用。由表5結果可知，補充本發(fā)明的瑪咖提取物的小鼠，可顯著降低 腦組織中MDA含量，并使抗氧化酶SOD和GSH-Px的活力恢復正常，表明瑪咖提取物可W減輕 小鼠睡眠剝奪過程中產生的自由基和脂質過氧化物對腦組織的損傷，恢復正常的抗氧化酶 活力，降低中樞疲勞的發(fā)生。
[0044] 表6瑪咖提取物對對小鼠端腦中單胺類神經遞質的影響
注:#P < 0.05與空白對照對照組比較，*P < 0.05與睡眠剝奪致中樞疲勞模型組（SD 組)比較 長期腦力或體力勞動使大腦神經細胞過度興奮、血糖等能源物質消耗過多，為了保護 神經細胞的能量供應，大腦皮層會產生保護性抑制作用，引起中樞神經系統(tǒng)的功能失調，影 響腦組織中興奮性神經遞質的合理釋放，導致中樞疲勞的發(fā)生。5-HT作為腦內一種重要的 中樞單胺類抑制性神經遞質，其含量增加會對神經元的興奮性產生抑制作用，從而降低機 體的運動能力，引起疲勞的發(fā)生;DA作為一種單胺類中樞興奮性神經遞質，可影響垂體某些 激素的分泌，維持機體的運動平衡和耐力，DA含量下降會導致機體的運動能力降低;肥作為 腦內一種重要的中樞單胺類神經遞質，可通過β受體使腦組織中的海馬神經元興奮，發(fā)揮其 促進睡眠的作用。由表6結果可知，補充本發(fā)明的瑪咖提取物的小鼠，與睡眠剝奪致中樞疲 勞模型組(SD組）比較，可顯著降低5-ΗΤ的含量，顯著提升DA和肥的含量，恢復正常水平，調 節(jié)腦組織中興奮性神經遞質的釋放。
[0045] 2.4實驗結論 本發(fā)明所述的瑪咖提取物，可W有效緩解睡眠剝奪導致的學習和記憶力的降低W及自 由基和脂質過氧化物對端腦組織損傷、腦組織中興奮性神經遞質釋放失調等中樞疲勞癥 狀，表明本發(fā)明的瑪咖提取物具有抗中疲勞效果。
[0046] 顯然，上面描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其 他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0047] W上所述，僅為本發(fā)明的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何 屬于本技術領域的技術人員在本發(fā)明掲露的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換，都應 涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種瑪咖提取物，其特征在于，其按質量分數主要包括28%~50%的總瑪咖酰胺、25%~ 40%的芳香族芥子油苷、4%~12%的總皂苷、1%~8%的腺苷，其中總瑪咖酰胺中N-芐基亞油酰胺 含量占總瑪咖酰胺含量的35%~60%。2. 權利要求1所述瑪咖提取物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： I.將瑪咖鮮根切片后干燥，粉碎，在料液比1:5~20條件下用低極性溶劑浸提，過濾得 提取液ai和濾渣h，提取液&1減壓濃縮，濃縮液上樣進行柱層析，溶劑洗脫，收集以N-芐基亞 油酰胺為主體的總瑪咖酰胺組分洗脫液，洗脫液減壓濃縮，干燥，得到提取物A; Π .將步驟I中過濾得到的濾渣匕在105°(：滅酶15~40 min，用乙醇水溶液在料液比1:5~ 20條件下浸提，過濾得提取液a2，提取液&2減壓濃縮，濃縮液上樣進行柱層析，溶劑洗脫，收 集芳香族芥子油苷、總皂苷、腺苷組分洗脫液，洗脫液減壓濃縮，干燥，粉碎，得到提取物B; ΙΠ .將提取物A和提取物B按重量比1:0.5~2的比例均勻混合，即得到所述瑪咖提取物。3. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟I中所述低極性溶劑為乙酸乙酯、 乙醚、環(huán)己烷、正己烷或石油醚中的一種或多種。4. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟I中所述柱層析采用硅膠柱或中 性氧化鋁柱。5. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟I中所述溶劑洗脫采用的溶劑為 甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯或石油醚中的一種或多種，洗脫溶劑極性由小到大進行等度、多 段等度或梯度洗脫。6. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟Π 中所述柱層析采用D201、D301、 D315、S-8、AB-8型大孔樹脂柱或酸性氧化鋁柱中的一種。7. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟Π 中所述溶劑洗脫采用的溶劑為 水-無水乙醇-氯化銨、水-無水乙醇-硫酸銨、水-無水乙醇-碳酸氫鈉、水-無水乙醇-氫氧化 鈉、水-無水乙醇-氯化鈉或水-無水乙醇-硫酸鉀中的任意一組或者至少兩組等度、多段等 度或梯度洗脫。8. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，獲得所述提取物A或B的干燥方式為真 空干燥、冷凍干燥或噴霧干燥。9. 根據權利要求2~8任一項所述的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： I.將瑪咖鮮根切片后55°C下干燥，粉碎至10~20目，在料液比1: 5~20、溫度50°〇80°C 條件下用低極性溶劑浸提2~3次，每次時間2 h~3 h，過濾得提取液ai和濾渣h，提取液&1減 壓濃縮，濃縮液上樣進行柱層析，溶劑洗脫，收集以N-芐基亞油酰胺為主體的瑪咖酰胺組分 洗脫液，洗脫液減壓濃縮，干燥，得到提取物A; Π ·將步驟I中過濾得到的濾渣匕在105°(：滅酶15~40 min，用50%~98%濃度乙醇水溶液 在料液比1:5~20、溫度50°090°C條件下浸提2~3次，每次時間I h~2 h，過濾得提取液a2，提 取液&2減壓濃縮，濃縮液上樣進行柱層析，溶劑洗脫，收集芳香族芥子油苷、總皂苷、腺苷組 分洗脫液，洗脫液減壓濃縮，干燥，粉碎，得到提取物B; ΙΠ .將提取物A和提取物B按重量比1:0.5~2的比例均勻混合，即得到本發(fā)明瑪咖提取 物。10. 權利要求1所述瑪咖提取物在提高抗運動性疲勞和抗中樞疲勞中的應用。
【文檔編號】A61P39/00GK105920074SQ201610288140
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月4日
【發(fā)明人】代鵬飛, 余元濤, 金文聞, 余金龍
【申請人】武漢華士特工業(yè)生物技術開發(fā)有限公司