Carher1-nkt細胞在制備用于治療進展期her1陽性肺癌的制劑中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了CARHER1-NKT細胞在制備用于治療進展期HER1陽性肺癌的制劑中的應用，其中，CARHER1-NKT細胞是由嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細胞，嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ包括串聯(lián)的大鼠生長激素信號肽、HER1ScFv、CD8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域。采用本發(fā)明的CARHER1-NKT細胞治療進展期HER1陽性肺癌時，能夠有效避免采用現(xiàn)有靶向HER1的藥物時引起的耐藥性，對肺癌細胞具有一定的特異殺傷活性，且對進展期HER1陽性肺癌患者有一定的治療效果。
【專利說明】
CARHER1-NKT細胞在制備用于治療進展期HER1陽性肺癌的 制劑中的應用
技術(shù)領域
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤生物制品領域，具體地，設及過繼免疫治療中CARHER1-NKT細胞 在制備用于治療進展期HER1陽性肺癌的制劑中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] EGFR(巧ithelial growth factor rec巧tor,表皮生長因子受體）即肥R1，是原癌 基因 c-erbBl的表達產(chǎn)物，屬于人類表皮生長因子受體（肥時家族，其本身具有酪氨酶激酶 活性，一旦與表皮生長因子巧G巧組合可啟動細胞核內(nèi)的有關(guān)基因，從而促進細胞分裂增 殖。肥R1在多種惡性腫瘤中高表達，研究發(fā)現(xiàn)肥R1表達于大多數(shù)肺癌患者，表達水平達到 80 %，其表達水平與肺癌疾病的進展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。盡管最近肺癌的治療已經(jīng)獲得一定的進 展，但是仍然未提高患者的生存率，因此亟需探討新的療法來克服運一困擾。 陽00引 目前，在治療進展期肥R1陽性肺癌患者時，抗肥R1的藥物（如肥R1酪氨酸激酶 抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs))已經(jīng)處于臨床研究階段，但是，臨床結(jié)果表 明，僅部分肺癌患者采用肥R1酪氨酸激酶抑制劑治療有效，并且患者最終會產(chǎn)生一定的耐 藥性，從而影響藥物的療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中采用抗肥R1的藥物治療進展期肥R1陽性肺 癌患者時引起的耐藥性的缺陷，提供CARHER1-NKT細胞在制備用于治療進展期肥R1陽性 肺癌的制劑中的應用，采用本發(fā)明的CARHER1-NKT細胞治療進展期肥R1陽性肺癌時，能夠 有效避免采用現(xiàn)有抗肥R1藥物時引起的耐藥性，對肺癌細胞具有一定的特異祀向殺傷活 性，且對已經(jīng)過多次治療（如放療、化療及其他藥物對癥治療等）但均無明顯療效的進展期 肥R1陽性肺癌患者有一定的治療效果。 W05] 因此，為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了 CARHER1-NKT細胞在制備用于 治療進展期HER1陽性肺癌的制劑中的應用，所述CAR肥R1-NKT細胞是由嵌合抗 原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修飾的NKT細胞，其中，所述嵌合抗原受體 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3C包括串聯(lián)的大鼠生長激素信號膚、肥RlScFv、CD8的較鏈區(qū) 化inge區(qū)）和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3 ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域。 陽006] 在治療進展期肥R1陽性肺癌時，本發(fā)明的CAR肥R1-NKT細胞能夠特異性結(jié)合 肥R1抗原，明顯延長免疫細胞在患者體內(nèi)的存活時間，增強免疫細胞祀向識別肺癌細胞表 面肥R1抗原的能力，加強對肺癌細胞的特異殺傷活性，而且確實能夠有效避免采用現(xiàn)有抗 肥R1的藥物治療時引起的耐藥性，對已經(jīng)過多次治療（如放療、化療及其他藥物對癥治療 等）但均無明顯療效的進展期肥R1陽性肺癌患者有一定的治療效果。本發(fā)明的工程化肥R1 祀向性的NKT細胞（即CAR肥R1-NKT細胞）為治療進展期肥R1陽性肺癌提供了一種新的 選擇，具有良好的產(chǎn)業(yè)應用前景。
[0007] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予W詳細說明。
【附圖說明】
[0008] 圖1為流式細胞術(shù)對分離培養(yǎng)的NKT細胞表型分析的結(jié)果。
[0009] 圖2為本發(fā)明的慢病毒表達載體pWP化-CD8-CD137-CD3 ζ的限制性內(nèi)切酶Mlul/ Ndel雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0010] 圖3為本發(fā)明的慢病毒表達載體pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的限制性內(nèi) 切酶Mlul/Ndel雙酶切片段的電泳鑒定圖。 1] 圖4為本發(fā)明的慢病毒表達載體pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的結(jié)構(gòu)示意 圖，其中，逆時針序列為正向基因片度，順時針為反向基因片段。
[0012] 圖5為流式細胞術(shù)檢測含有嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的病毒濃 縮液對ΝΚΤ細胞的感染效率。
[0013] 圖6為流式細胞術(shù)檢測嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細 胞（CARHER1-NKT細胞）表型鑒定的結(jié)果。
[0014] 圖7為本發(fā)明的CARHER1-NKT細胞對人肺癌細胞殺傷作用的細胞毒性分析圖。
[0015] 圖8為本發(fā)明的CAR肥R1-NKT細胞對11例進展期肥R1陽性的肺癌患者的治療過 程中，CARHER1-NKT細胞在患者外周血中的持續(xù)存在時間曲線圖。
[0016] 圖9為本發(fā)明的CAR肥R1-NKT細胞對兩例進展期肥R1陽性的肺癌患者的治療過 程中，不同時間段患者的肺病灶及胸膜浸出物變化圖。
【具體實施方式】
[0017] W下對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[001引本發(fā)明提供了 CAR肥R1-NKT細胞在制備用于治療進展期肥R1陽性肺癌的制劑中 的應用，所述CAR肥R1-NKT細胞是由嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修飾的NKT 細胞，其中，所述嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ包括串聯(lián)的大鼠生長激素信號 膚、肥RlScFv、CD8的較鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3 ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu) 域。
[0019] 本發(fā)明的應用中，優(yōu)選情況下，所述嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ由 大鼠生長激素信號膚、肥RlScFv、CD8的較鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3 ζ 的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。進一步優(yōu)選地，嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列，更進一步優(yōu)選地，嵌合抗原受體 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的氨基酸序列如沈Q ID NO. 1所示。
[0020] 本發(fā)明的應用中，優(yōu)選情況下，編碼所述嵌合抗原受體 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3C的基因具有如SEQ ID NO. 2所示的核巧酸序列，進一步優(yōu)選地， 編碼嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的基因的核巧酸序列如SEQID NO. 2所示。
[0021] 本發(fā)明的應用中，優(yōu)選情況下，CARHER1-NKT細胞的制備方法包括：包裝攜帶 pWP化-肥R1 ScFv-CD8-CD 137-CD3 ζ的慢病毒，得到病毒濃縮液；利用得到的病毒濃縮液 感染ΝΚΤ細胞，使ΝΚΤ細胞表達嵌合抗原受體肥R1 ScFv-CD8-CD 137-CD3 C，其中，所述 pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 為含有編碼嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 的基因的慢病毒表達載體。
[0022] 本發(fā)明的應用中，慢病毒表達載體pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137 - CD3 ζ能夠與輔 助載體共轉(zhuǎn)染包裝細胞如293Τ包裝細胞，獲得病毒濃縮液及CARHER1-NKT細胞。
[0023] 對于慢病毒表達載體pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制備方法沒有特 別的限定，可W為本領域技術(shù)人員能夠想到的各種方法，優(yōu)選情況下，慢病毒表達載體 pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3C的制備方法包括W下步驟：
[0024] (1)從NKT細胞cDNA中分別擴增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞 內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3 ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域，并克隆至載體pWP化-GFP中，構(gòu)建得到 pWP化-CD8-CD137-CD3C ;
[0025] 似合成編碼大鼠生長激素信號膚和肥RlScFv的核巧酸序列， 并克隆至pWP化-CD8-CD137-CD3C中，經(jīng)測序驗證后得到序列正確的 pWP)a^ERlScFv-CD8-CD137-CD3C。 陽0%] 步驟（1)中，對于從NKT細胞cDNA中分別擴增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的 胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3 ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域的方法沒有特別的限定，可W為本領域常用的 各種方法，例如可W為RT-PCR法。其中，ΝΚΤ細胞可W通過分離人靜脈血中的單個核細胞， 然后進行培養(yǎng)獲得。
[0027] 具體地，得到pWP化-CD8-CD137-CD3 ζ的方法可W包括：提取ΝΚΤ細胞的總RNA， 逆轉(zhuǎn)錄獲得ΝΚΤ細胞cDNA，W得到的ΝΚΤ細胞cDNA為模板，利用引物Ρ1 (SEQID NO. 11)和 P2(SEQID NO. 12)進行PCR擴增獲得CD8基因的hinge區(qū)和跨膜區(qū)（SEQID NO. 3);利用引 物P3(SEQID NO. 13)和P4(SEQID NO. 14)進行PCR擴增獲得CD137基因的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域 (SEQID NO. 4);利用引物 P5(SEQID NO. 15)和 P6(SEQID NO. 16)進行 PCR擴增獲得 CD3 ζ 基 因的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域（SEQID NO. 5)，將獲得的PCR產(chǎn)物分別進行雙酶切，然后與Mlul/Ndel 雙酶切后的慢病毒表達載體pWP化-GFP連接。
[0028] 步驟（2)中，對于合成編碼大鼠生長激素信號膚和肥RlScFv的核巧酸序列的方法 沒有特別的限定，可W為本領域常用的各種方法，例如可W通過全基因合成技術(shù)合成。
[0029] 具體地，得到序列正確的pWP化-肥R1 ScFv-CD8-CD 137-CD3 ζ的方法可W包括： 通過全基因合成技術(shù)合成編碼大鼠生長激素信號膚和肥RlScFv融合基因的核巧酸序列 (沈QID NO. 8)，克隆至載體pGSI中，得到pGSI-肥RlScFv ;然后將pGSI-肥RlScFv進行Mlul 單酶切，與經(jīng)限制性內(nèi)切酶Mlul單酶切得到的重組質(zhì)粒pWP化-CD8-CD137-CD3 ζ連接，經(jīng) 測序鑒定，得到序列正確的pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。其中，大鼠生長激素信號膚 的核巧酸序列如SEQID NO. 6所示，肥RlScFv核巧酸序列如SEQID NO. 7所示。 W30] 對于包裝攜帶pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的慢病毒的方法沒有特 別的限定，可W為本領域技術(shù)人員常用的各種方法，優(yōu)選情況下，將慢病毒表達載體 pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 與輔助質(zhì)粒（如 PSPAX2、pMD2. G)共轉(zhuǎn)染 293T 包裝細 胞，轉(zhuǎn)染48-7化時收集病毒上清，離屯、、過濾，在濾液中添加5 XPEG6000-NaCl進行混勻，離 屯、后棄上清，沉淀用0-4°C預冷的無菌PBS溶解，獲得病毒濃縮液。 陽03U 本發(fā)明的應用中，CAR肥R1-NKT細胞的制備方法還包括通過如下方法制備NKT細 胞： 陽0巧 （1)在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將單個核細胞進行第一階 段培養(yǎng)；
[0033] (2)在白介素-2存在下，將所述第一階段培養(yǎng)的細胞進行第二階段培養(yǎng)。
[0034] 優(yōu)選情況下，所述第一階段培養(yǎng)的實施方式包括：將單個核細胞培養(yǎng)于第一 NKT 細胞培養(yǎng)液中，所述第一 NKT細胞培養(yǎng)液含有NKT細胞培養(yǎng)基、CD3單克隆抗體、白介 素-2和白介素-15 ;進一步優(yōu)選地，第一 NKT細胞培養(yǎng)液中，所述CD3單克隆抗體的濃度為 30-70ng/mU和/或所述白介素-2的濃度為300-700U/mU和/或所述白介素-15的濃度為 30-70ng/mL。
[0035] 優(yōu)選情況下，所述第二階段培養(yǎng)的實施方式包括：將所述第一階段培養(yǎng)的細胞培 養(yǎng)于第二NKT細胞培養(yǎng)液中，所述第二NKT細胞培養(yǎng)液中含有NKT細胞培養(yǎng)基和白介素-2 ; 進一步優(yōu)選地，第二NKT細胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。
[0036] 對于NKT細胞培養(yǎng)基沒有特別的限定，可W為本領域常用的各種用于培養(yǎng)NKT細 胞的培養(yǎng)基，例如可W為GT-T551培養(yǎng)基。
[0037] 在制備NKT細胞時，對于第一階段培養(yǎng)和第二階段培養(yǎng)的條件沒有特別的限定， 可W為本領域常用的各種條件，例如可W在30-37°C、飽和濕度為3-6%的C〇2培養(yǎng)箱中進 行培養(yǎng)。本領域技術(shù)人員可W對培養(yǎng)的時間進行適應性調(diào)整，此為本領域技術(shù)人員所公知， 在此不再寶述。
[0038] 本發(fā)明制備得到的NKT細胞中，CD3+細胞平均比率〉90%，CD3 +CD8+細胞占總CD3 + 細胞的平均比率〉7〇%仰3+〔056+細胞占總〔03+細胞的平均比率〉15%。
[0039] 本發(fā)明的應用中，對于感染NKT細胞的方法沒有特別限定，可W為本領域常用的 各種方法，優(yōu)選情況下，該方法包括：
[0040] (1)在病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2存在下，將NKT細胞進行第一階段感染培 養(yǎng)；
[0041] (2)在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將所述第一階段感染培養(yǎng) 的細胞進行第二階段感染培養(yǎng)。
[0042] 優(yōu)選地，所述第一階段感染培養(yǎng)的實施方式包括：將NKT細胞培養(yǎng)于第Ξ NKT細 胞培養(yǎng)液中，所述第Ξ NKT細胞培養(yǎng)液含有NKT細胞培養(yǎng)基、病毒濃縮液、魚精蛋白和白介 素-2 ;進一步優(yōu)選地，第Ξ NKT細胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。
[0043] 優(yōu)選地，所述第二階段感染培養(yǎng)的實施方式包括：將所述第一階段感染培養(yǎng)的細 胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細胞培養(yǎng)液中。第一 NKT細胞培養(yǎng)液的具體組成可參見前述相應內(nèi) 容，在此不再寶述。
[0044] 在感染NKT細胞時，對于第一階段感染培養(yǎng)和第二階段感染培養(yǎng)的條件沒有特別 的限定，可W為本領域常用的各種條件，例如可W在30-37°C、飽和濕度為3-6%的C〇2培養(yǎng) 箱中進行培養(yǎng)。本領域技術(shù)人員可W對培養(yǎng)的時間進行適應性調(diào)整，此為本領域技術(shù)人員 所公知，在此不再寶述。 W45] 具體地，感染NKT細胞的方法包括：取1X107-5X107個NKT細胞，棄掉舊的培養(yǎng) 液，加入2-4血新鮮GT-T551培養(yǎng)液，再加入200-400 μ L病毒濃縮液、2-4 μ L 1 X 10 6mg/ 血魚精蛋白和終濃度為300-70011/血的比-2，置于30-37°(：、飽和濕度為3-6%的〇)2培養(yǎng) 箱中感染12-1化后，棄培養(yǎng)液，將細胞轉(zhuǎn)至未包被的培養(yǎng)瓶中，加入20-50mL的GT-T551培 養(yǎng)基，再加入終濃度為300-700U/mL的IL-2、終濃度為30-7化g/ml的CD3單克隆抗體和終 濃度為30-7化g/mL的白細胞介素15,于30-37°C、飽和濕度為3-6%的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12-1她，獲得嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修飾的NKT細胞。
[0046] 進一步優(yōu)選地，感染ΝΚΤ細胞的方法還包括：
[0047] (3)先在白介素-2存在下，將所述第二階段感染培養(yǎng)的細胞進行體外誘導，待細 胞的密度為80-90%時，再在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將細胞進行 擴增培養(yǎng)。
[0048] 優(yōu)選情況下，所述體外誘導的實施方式包括：將所述第二階段感染培養(yǎng)的細胞培 養(yǎng)于所述第二ΝΚΤ細胞培養(yǎng)液中，所述擴增培養(yǎng)的實施方式包括：將細胞培養(yǎng)于所述第一 ΝΚΤ細胞培養(yǎng)液中。第一 ΝΚΤ細胞培養(yǎng)液和第二ΝΚΤ細胞培養(yǎng)液的具體組成可參見前述相 應內(nèi)容，在此不再寶述。
[0049] 具體地，感染ΝΚΤ細胞的方法還包括：將第二階段感染培養(yǎng)后獲得的慢病毒感染 的ΝΚΤ細胞用IL-2的終濃度為300-700U/mL的GT-T551培養(yǎng)液進行體外誘導，待細胞的密 度為80-90%時將細胞轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋中，隔1.5-2.5天加入比-2的終濃度為300-70011/ mL、CD3單克隆抗體的終濃度為30-7化g/ml、白細胞介素-15的終濃度為30-7化g/mL的 新鮮GT-T551培養(yǎng)液進行擴增培養(yǎng)并將細胞擴增至總量為1 X 109-2X 109個細胞。經(jīng) 過本發(fā)明的慢病毒對祀向肥R1抗原的嵌合抗原受體進行NKT細胞感染，其感染效率高 達30 % -60 %，而獲得的CARHER1-NKT細胞，其CD3+CD56+細胞占總CD3 +細胞的比率在 15% -40%范圍之內(nèi)。
[0050] 嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修飾的NKT細胞表達的嵌合抗原受體 的蛋白氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。其中，本領域技術(shù)人員應該理解的是，嵌合抗原受 體前體蛋白由大鼠生長激素信號膚、肥RlScFv、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信 號結(jié)構(gòu)域和CD3C的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成，蛋白質(zhì)翻譯后在細胞內(nèi)粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)切除 信號膚后成為成熟嵌合抗原受體蛋白，分泌輸出后并定位于NKT細胞的細胞膜上。該嵌合 抗原受體的蛋白氨基酸序列對應的基因編碼序列如SEQID NO. 2所示。該嵌合抗原受體W 基因 CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3 ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號 傳導結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列如SEQID NO. 9所示，對應的基因編碼序列如SEQID NO. 10所示。
[0051] 本發(fā)明的應用中，本領域技術(shù)人員應該理解的是，進展期肥R1陽性肺癌是指局部 晚期無法進行手術(shù)切除、轉(zhuǎn)移性或復發(fā)性階段的肺癌，癥狀表現(xiàn)為咳嗽、咳疲、胸悶、氣促。 本發(fā)明的進展期肥R1陽性肺癌尤其為復發(fā)難治的進展期肥R1陽性肺癌。
[0052] 本發(fā)明的應用中，對于用于治療進展期肥R1陽性肺癌的制劑的組成沒有特別的 限定，只要含有本發(fā)明所述CARHER1-NKT細胞或是由CARHER1-NKT細胞制備而成即可，制劑 的具體組成和制備方法為本領域技術(shù)人員所公知，在此不再寶述。 陽〇5引 實施例
[0054] W下的實施例將對本發(fā)明作進一步的說明，但并不因此限制本發(fā)明。
[0055] W下實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為本領域常規(guī)方法。下述實施例中所 用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到，其中：
[0056] NKT細胞培養(yǎng)基GT-T551購自TaKaRa公司。
[0057] 淋己細胞分離液購自T抓公司。
[0058] CD3單克隆抗體、重組纖維連接蛋白（retronectin)均購自TaKaRa公司。
[0059] 重組人蛋白干擾素-丫、重組人白介素2、重組人白介素15均購自protech公司。 柳6〇] 總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent、高保真DNA聚合酶（PrimeSTA民K服dm Polymerase)、T4DNA 連接酶購自 TaKaRa 公司。
[0061] Reve;rtAid? First Strand cDNA Synthesis Kit 購自 F'ermentas 公司。
[0062] Bgl II、EcoRI、Mlul、BamHI、Ndel、EcoR V購自 F'ermentas 公司。
[0063] 修飾酶 Klenow Rra卵ent 購自 F'ermentas 公司。
[0064] 瓊脂糖凝膠DM回收試劑盒、普通DM產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自天 根生化科技有限公司。 陽0化]pWP化-GFP、PSPAX2、pMD2. G 均購自 Addgene 公司。
[0066] pGSI購自北京天一輝遠生物科技有限公司。
[0067] Transl-Tl Phage Resistant化學感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公 司。
[0068] LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑購自 Invitrogen 公司。
[0069] 293T包裝細胞購自美國ATCC。
[0070] 陽G6000-NaCl中陽G6000終濃度為25. 5質(zhì)量％，化C1終濃度為1. 2M，PEG6000和 化C1均購自上海索萊寶生物科技有限公司。
[0071] 胎牛血清購自德國PAA公司。 陽07引高表達肥R1的人肺癌A549細胞購自美國ATCC公司。 陽07；3] Cell Counting Kit-8 (CCK8)試劑盒購自北京沃比森科技有限公司。
[0074] 所有引物均由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。 陽07引實施例1NKT細胞的制備
[0076] (1)取人靜脈血于含肝素的真空管中。采用淋己細胞分離液，通過密度梯度離屯、方 法分離獲得單個核細胞（PBMCs)。 W77] 似PBMCs洗；次后，采用含有0. 6體積％的人自體血清的NKT細胞培養(yǎng)基 GT-巧51調(diào)整細胞終濃度為2X 106個細胞/mL ;將細胞接種于預先經(jīng)過終濃度為10 μ g/mL 的retronectin包被的75cm2細胞培養(yǎng)瓶中。然后在培養(yǎng)基里加入終濃度為500U/mL的重 組人白介素2、50ng/ml CD3單克隆抗體和50ng/mL的重組人白介素-15,在37°C、飽和濕度 為5%的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0078] (3)培養(yǎng)第4天，將細胞轉(zhuǎn)移至未包被的培養(yǎng)瓶中，每2天按照細胞生長數(shù)量加入 NKT細胞培養(yǎng)基GT-T551，控制細胞濃度為1 X 108個細胞/mU并加入終濃度為500U/ml的 重組人白介素2 ;培養(yǎng)至第12天，得到NKT細胞，流式細胞術(shù)對NKT細胞表型進行分析。結(jié) 果見圖 1，其中 CD3+:95. 04% ;CD3+CD8+:90. 99% ;CD3+CD56+:24. 12% ;CD8+CD56+:24. 63%。 陽0巧]實施例2慢病毒表達載體pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的構(gòu)建
[0080] (1) NKT 細胞 cDNA 的制備
[0081] 離屯、沉淀實施例1培養(yǎng)得到的NKT細胞，用總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent提 取細胞的總RNA，-80°C保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉目俁NA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevedAid? First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄得NKT細胞cDNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0082] (2)慢病毒質(zhì)粒pWP化-CD8-CD137-CD3 ζ的制備
[0083] 設計并合成如下引物序列（其中，下劃線標記為保護堿基，方框為酶切位點）：
[0084]
陽0財 W步驟（1)中NKT細胞cDNA為模板，用引物P1和P2進行PCR擴增，得到長28化P 的CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，核巧酸序列如SEQID NO. 3所示，兩端分別含有Mlul和Bgl II 酶切位點和保護堿基；用引物P3和P4進行PCR擴增，得到長146bp的CD137胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu) 域，核巧酸序列如SEQID NO. 4所示，兩端分別含有Bgl II和EcoRI酶切位點及保護堿基；用 引物P5和P6進行PCR擴增，得到長359bp的CD3 ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域，核巧酸序列如SEQID NO. 5所示，兩端分別含有EcoRI和Ndel酶切位點及保護堿基。各步PCR擴增反應體系相 同，W擴增CD137胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域為例，進行PCR擴增，PCR反應條件參照frimeSTA民 服DNA Polymerase的說明書，反應體系巧0 μ L)如下：
[0086] 雙蒸水：32. 5 μL
[0087] 5 X 反應 buffer : 10 μ L
[0088] dNTP 混合物（每種 2. 5mM) :4 μ L
[0089] P3(10mM) :1 μL
[0090] P4(10mM) :1 μL
[0091] ΝΚΤ 細胞 cDNA (200ng/ul) : 1 μ L
[0092] primeSTA民"：HS DM Polymerase :0. 5 μ L
[009引將上述PCR產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠進行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進 行DNA片段回收。得到片段后分別進行雙酶切反應，酶切產(chǎn)物用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒 回收備用。
[0094] 慢病毒表達載體pWP化-GFP用Mlul/Ndel雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠進 行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收大的載體片段，然后與之前回收的CD8、CD137、 CD3C片段通過T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化ansl-Tl Phage Resistant化學感受 態(tài)細胞，37°C培養(yǎng)1化后挑取單克隆，37°C，250巧m培養(yǎng)1化后用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì) 粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Mlul和Ndel雙酶切鑒定，鑒定電泳圖見圖2,其中，Ml : DNA分子量標記D15000 ;1泳道：質(zhì)粒pWP化-CD8-CD137-CD3 ζ的未酶切片段；2泳道：質(zhì)粒 pWP化-CD8-CD137-CD3C的酶切片段（75化Ρ) ;Μ2 :DNA分子量標記D2000。將鑒定正確的質(zhì) 粒送北京天一輝遠生物科技有限公司對插入的融合基因片段進行測序。將測序結(jié)果正確的 重組質(zhì)粒命名為pWP化-CD8-CD137-CD3C，其中，CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)的核巧酸序列如 SEQID NO. 3所示，CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域的核巧酸序列如SEQID NO. 4所示，CD3 ζ的胞 內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域的核巧酸序列如SEQID NO. 5所示。 陽0巧](3)慢病毒質(zhì)粒pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的制備
[0096] 全基因合成編碼大鼠生長激素信號膚和肥RlScFv融合基因的核巧酸序列，序列 如SEQID NO. 8所示，由北京天一輝遠生物科技有限公司合成，其5'端含有Mlul酶切位 點、kozak序列，3'端含有Mlul酶切位點，將前述融合基因克隆在質(zhì)粒pGSI中，命名為 pGSI-HERlScFv。質(zhì)粒經(jīng)Mlul單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進行分離，用瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒回收目的片段備用。
[0097] pWP化-CD8-CD137-CD3 ζ質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Mlul單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊 脂糖凝膠進行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體片段備用。然后與回收有大 鼠生長激素信號膚和肥RlScFv的DNA片段通過T4DNA連接酶進行連接，具體方法見說明 書。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化ansl-Tl Phage Resistant化學感受態(tài)細胞，37°C培養(yǎng)1化后挑 取單克隆，37°C，250巧m培養(yǎng)1化后，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)限制性 內(nèi)切酶Mlul/Ndel雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖3所示，其中，Ml :DNA分子量標記D2000 ;1 泳道：質(zhì)粒pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的酶切片段（82化p，75化P) ;2泳道：質(zhì)粒 pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的未酶切片段；M2 :DNA分子量標記D15000。將鑒定正確 的質(zhì)粒送北京天一輝遠生物科技有限公司對插入的融合基因片段進行測序。將測序結(jié)果正 確的重組質(zhì)粒命名為pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示，其中 包括大鼠生長激素信號膚（核巧酸序列如SEQID N0.6所示）、抗肥R1單鏈抗體（核巧酸序 列如SEQID NO. 7所示）、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3 ζ的 胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域，其中，該嵌合抗原受體W基因 CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3 ζ 的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號傳導結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列如SEQID NO. 9所示， 對應的基因編碼序列如SEQID NO. 10所示。
[0098] 實施例3嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修飾的NKT細胞的制備
[0099] (1)慢病毒的包裝和濃縮
[0100] 用分光光度計分別測定慢病毒表達質(zhì)粒pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ和 輔助質(zhì)粒psPAX2、pMD2. G的濃度，Ξ種質(zhì)粒W 4:2:1的質(zhì)量比用Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293T包裝細胞。分別在轉(zhuǎn)染4她、7化時收集病毒 上清于50血EP管中，4°C，2000g離屯、lOmin，轉(zhuǎn)移兩次得到的上清至新EP管中，用4. 5 μηι 濾器過濾病毒上清；過濾的病毒上清與5Χ陽G6000-NaCl按照4:1的體積比混勻，4°C靜置 2h，然后4°C，lOOOOg離屯、20min，棄上清，沉淀用1血的4°C預冷的無菌PBS溶解，即得嵌合 抗原受體的病毒濃縮液，按每管100 μ L進行分裝，-80°C保存?zhèn)溆谩?陽1〇U 按照上述方法，利用慢病毒表達質(zhì)粒pWP化-GFP和輔助質(zhì)粒PSPAX2、pMD2. G共轉(zhuǎn) 染293T包裝細胞，收集病毒上清，濃縮，獲得表達GFP綠色巧光蛋白的慢病毒濃縮液。
[0102] (2)慢病毒感染NKT細胞及感染后細胞的擴增培養(yǎng) 陽103] 取實施例1的在75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的IX 10 7個NKT細胞，棄掉舊的培養(yǎng)液，加入 2血新鮮NKT細胞培養(yǎng)基GT-T551、200 μ L步驟（1)得到的病毒濃縮液、2 μ L 1 X 10 6mg/mL 魚精蛋白，終濃度為500U/mL的重組人白介素2,置于37°C、飽和濕度為5 %的C〇2培養(yǎng)箱中 感染12小時后，棄培養(yǎng)液。同時用表達GFP綠色巧光蛋白的慢病毒濃縮液對NKT細胞進行 同步感染（得到的NKT細胞稱為CART-GFP細胞），用于計算該病毒的感染效率。將感染后 的細胞轉(zhuǎn)至未經(jīng)CD3和retronectin包被的75cm2培養(yǎng)瓶中，加入20血的NKT細胞培養(yǎng)基 GT-T551，再加入終濃度為500U/mL的重組人白介素2、終濃度為50ng/ml的CD3單克隆抗體 和終濃度為50ng/mL的重組人白介素15,于37°C、飽和濕度為5%的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1她， 得到的NKT細胞稱為CARHER1-NKT細胞。用相同的方法制備CARHER1-T細胞燈細胞的制備 方'法參貝胥文南犬：Yajin邑 Zhan邑，et al. Autologous CIK Cell Immunotherapy in Patients with Renal Cell Carcinoma after Radical Nephrectomy. Clinical Study, 2013 中 2. 4 部分CIK細胞的制備方法）。用流式細胞術(shù)檢測該病毒的感染效率，結(jié)果如圖5所示， CARHER1-NKT細胞的感染效率為46. 52%。
[0104] (3)體外誘導擴增CARHER1-NKT細胞群 陽1化]將上述培養(yǎng)后的NKT細胞用重組人白介素2的終濃度為500U/mL的NKT細胞培 養(yǎng)基GT-T551進行體外誘導，待細胞的密度為85%時將細胞轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋中，隔2天加 入重組人白介素2的終濃度為500U/mL、CD3單克隆抗體的終濃度為50ng/ml、重組人白介 素15的終濃度為50ng/mL的新鮮NKT細胞培養(yǎng)基GT-T551進行擴增培養(yǎng)，待細胞擴增到總 量為1. 5 X 1〇9個細胞左右后，采用流式細胞儀對感染的細胞群體進行鑒定，細胞表型一般 達到CD3陽性細胞比例> 90% ;CD3CD8雙陽性細胞比例〉70% ;CD3CD56雙陽性細胞比例 〉15%，結(jié)果見圖 6，CD3+:90. 83%;CD3+CD4+:14. 48%;CD3+CD8+:80. 90%;CD3+CD56+:：M. 48%; CD8+CD56+:：M. 25%。 陽106] 實施例4 CARHERl-NKT細胞對人肺癌細胞殺傷作用的細胞毒性分析 陽107] 取高表達肥R1的人肺癌細胞A549接種于96孔板，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后，分別 取實施例3中制備的CARHER1-NKT細胞、CARHER1-T細胞和實施例1中培養(yǎng)的NKT細胞，W 效祀比（殺傷細胞：祀細胞）5:1,10:1，20:1,40:1與A549細胞進行共培養(yǎng)，經(jīng)過4h的共 培養(yǎng)后，每個孔加入10 μ L的CCK8進行染色。同時設置殺傷細胞對照組分別為實施例3中 審IJ備的CARHER1-NKT細胞、CARHER1-T細胞和實施例1中培養(yǎng)的ΝΚΤ細胞，并加入相同量的 CCK8進行染色；W及設置祀細胞對照組為未加入免疫細胞殺傷處理的Α549細胞，并加入相 同量的CCK8進行染色。酶標儀對細胞調(diào)亡情況進行檢測，細胞調(diào)亡的量根據(jù)下面的公式計 算：調(diào)亡率=(1-[(實驗組-殺傷細胞對照組-祀細胞對照組）/實驗組]} X 100 %，該公 式中，殺傷細胞對照組為只有殺傷細胞而未加祀細胞測得的吸光值，祀細胞對照組為只有 祀細胞而未加殺傷細胞測得的吸光值；實驗組為加入相對應的效祀比（殺傷細胞：祀細胞） 的免疫細胞殺傷處理后測得的吸光值，見圖7。嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 修飾的NKT細胞對高表達肥R1的肺癌細胞具有特異殺傷活性，且CAR肥Rl-NKT細胞的特異 殺傷活性明顯優(yōu)于CARHER1-T細胞和NKT細胞。
[0108] 實施例5 CARHER1-NKT細胞對進展期肥R1陽性的肺癌患者的治療效果
[0109] 取 5X 108個肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 修飾的 NKT 細胞（即 CAR 肥R1-NKT 細 胞），經(jīng)過100ml生理鹽水稀釋后，連續(xù)Ξ天靜脈回輸?shù)竭M展期肥R1陽性的肺癌患者（在利 用本發(fā)明的CARHER1-NKT細胞進行祀向免疫治療前，已經(jīng)過多次治療（如放療、化療及其他 藥物對癥治療等），但均無明顯療效）體內(nèi)，回輸后對患者的治療狀況進行評估。
[0110] 圖8為本發(fā)明的CARHER1-NKT細胞對11例進展期肥R1陽性的肺癌患者的治療 過程中，CARHER1-NKT細胞在患者外周血中的持續(xù)存在時間曲線圖。圖8結(jié)果顯示，經(jīng)過 CARHER1-NKT細胞治療后，11例進展期肥R1陽性的肺癌患者外周血中CARHER1-NKT細胞拷 貝數(shù)持續(xù)長久的存在，說明本發(fā)明的CARHER1-NKT細胞能夠在進展期肥R1陽性的肺癌患者 體內(nèi)持續(xù)大量的增殖來發(fā)揮殺傷活性。 陽111] 本發(fā)明的CARHER1-NKT細胞對11例進展期肥R1陽性的肺癌患者的治療過程中， 患者的臨床毒副反應見表1。如表1所示，經(jīng)過本發(fā)明的CARHER1-NKT細胞治療后，患者呈 現(xiàn)的大多數(shù)反應為1-2級的毒副反應，說明患者能夠很好的耐受CARHER1-NKT細胞的治療， 即本發(fā)明的CARHER1-NKT細胞用于進展期肥R1陽性的肺癌患者的治療，是安全可行的。 [0112]表 1 陽11引
[0114] 圖9為本發(fā)明的CARHER1-NKT細胞對兩例進展期肥R1陽性的肺癌患者的治療過 程中，不同時間段患者的肺病灶及胸膜浸出物變化圖。如圖9所示，兩例進展期肥R1陽性 的肺癌患者在經(jīng)過CARHER1-NKT細胞治療兩個療程后，胸膜浸出物明顯減少，同時腫瘤病 灶大小也顯著縮小，臨床診斷為PR。說明本發(fā)明的CARHER1-NKT細胞對進展期肥R1陽性的 肺癌患者具有很好的治療療效。
[0115] W上詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中 的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可W對本發(fā)明的技術(shù)方案進行多種簡單變型，運 些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0116] 另外需要說明的是，在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛 盾的情況下，可W通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發(fā)明對各種可 能的組合方式不再另行說明。
[0117] 此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可W進行任意組合，只要其不違背本 發(fā)明的思想，其同樣應當視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
【主權(quán)項】
1. CARHER1-NKT細胞在制備用于治療進展期HERl陽性肺癌的制劑中的應用，其特征 在于，所述CARHER1-NKT細胞是由嵌合抗原受體HERlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修飾的NKT 細胞，其中，所述嵌合抗原受體HERlScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ包括串聯(lián)的大鼠生長激素信號 肽、HERlScFv、⑶8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、⑶137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和⑶3 ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu) 域。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其中，所述嵌合抗原受體HERlScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ 具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列，優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體 HERlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其中，編碼所述嵌合抗原受體 HERlScFv-CD8-CD137-CD3G的基因具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，優(yōu)選地，所述基 因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的應用，其中，所述CARHER1-NKT細胞 的制備方法包括：包裝攜帶pWPXL-HERlScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ的慢病毒，得到病 毒濃縮液；利用得到的病毒濃縮液感染NKT細胞，使NKT細胞表達嵌合抗原受體 HERlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ，其中，所述 pWPXL-HERlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 為含有編碼嵌 合抗原受體HERlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的基因的慢病毒表達載體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其中，所述CARHER1-NKT細胞的制備方法還包括通過如 下方法制備NKT細胞： (1) 在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將單個核細胞進行第一階段 培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述第一階段培養(yǎng)的實施方式包括：將單個核細胞培養(yǎng)于第一 NKT細胞培養(yǎng) 液中，所述第一 NKT細胞培養(yǎng)液含有NKT細胞培養(yǎng)基、CD3單克隆抗體、白介素-2和白介 素-15 ;進一步優(yōu)選地，第一 NKT細胞培養(yǎng)液中，所述⑶3單克隆抗體的濃度為30-70ng/mL， 和/或所述白介素-2的濃度為300-700U/mL，和/或所述白介素-15的濃度為30-70ng/ mL ； (2) 在白介素-2存在下，將所述第一階段培養(yǎng)的細胞進行第二階段培養(yǎng)；優(yōu)選地，所 述第二階段培養(yǎng)的實施方式包括：將所述第一階段培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)于第二NKT細胞培養(yǎng)液 中，所述第二NKT細胞培養(yǎng)液中含有NKT細胞培養(yǎng)基和白介素-2 ;進一步優(yōu)選地，第二NKT 細胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其中，所述感染NKT細胞的方法包括： (1) 在病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2存在下，將NKT細胞進行第一階段感染培養(yǎng)； 優(yōu)選地，所述第一階段感染培養(yǎng)的實施方式包括：將NKT細胞培養(yǎng)于第三NKT細胞培養(yǎng)液 中，所述第三NKT細胞培養(yǎng)液含有NKT細胞培養(yǎng)基、病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2 ;進 一步優(yōu)選地，第三NKT細胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL ; (2) 在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將所述第一階段感染培養(yǎng)的細 胞進行第二階段感染培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述第二階段感染培養(yǎng)的實施方式包括：將所述第一 階段感染培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細胞培養(yǎng)液中。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其中，所述感染NKT細胞的方法還包括： (3) 先在白介素-2存在下，將所述第二階段感染培養(yǎng)的細胞進行體外誘導，待細胞的 密度為80-90%時，再在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將細胞進行擴增 培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述體外誘導的實施方式包括：將所述第二階段感染培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)于所 述第二NKT細胞培養(yǎng)液中，所述擴增培養(yǎng)的實施方式包括：將細胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細胞 培養(yǎng)液中。
【文檔編號】A61P35/00GK105920592SQ201510580469
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2015年9月11日
【發(fā)明人】伍志強, 王曉慧, 韓為東, 郭業(yè)磊, 王瑤, 代漢仁, 豐愷超
【申請人】中國人民解放軍總醫(yī)院