一種制備生物功能化殼聚糖水凝膠的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于組織工程生物材料領(lǐng)域，具體涉及一種制備生物功能化殼聚糖水凝膠的方法，包括如下步驟：不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)京尼平的配制：用75%酒精1ml,分別溶解0.005g、0.01g和0.02g的京尼平配置成0.5%、1.0％、2.0％的京尼平溶液；殼聚糖溶液的制備：1.5g的殼聚糖溶于100ml的3%的醋酸溶液中制備成1.5%的殼聚糖溶液，并加入含有氨基的生物分子，于瓶中攪拌過夜；將上述兩種溶液按照不同的比例混合，室溫靜置24?72h后即可得到功能化殼聚糖水凝膠；其中，京尼平和含有氨基的生物分子的摩爾比例保持在10:5至10:1之間，殼聚糖和京尼平的摩爾比例保持在300:1至30：10之間。本發(fā)明簡(jiǎn)單易操作，價(jià)格低廉，反應(yīng)條件溫和成熟，無細(xì)胞或低細(xì)胞毒性，方法具有普遍適用性。
【專利說明】
一種制備生物功能化殼聚糖水凝膠的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于組織工程生物材料領(lǐng)域，具體涉及一種制備生物功能化殼聚糖水凝膠的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]殼聚糖化學(xué)名稱為(I，4)-2_氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖，是一種含氨基的天然均態(tài)直鏈多糖，它是天然第二大高分子甲殼素脫乙酰基的產(chǎn)物。殼聚糖在體內(nèi)降解最終的產(chǎn)物是CO2和糖蛋白，這兩種物質(zhì)可以直接排出體外或被生物體吸收。此外，殼聚糖所含游離氨基使其反應(yīng)性和功能化大大加強(qiáng)。由于殼聚糖具有來源廣泛、生物相容性好和可降解等優(yōu)點(diǎn)，使殼聚糖基水凝膠成為目前研究最熱門的水凝膠材料之一，在生物醫(yī)用領(lǐng)域表現(xiàn)出極大的應(yīng)用價(jià)值。
[0003]作為生物醫(yī)用材料，殼聚糖的力學(xué)性能往往達(dá)不到要求，為了提高此類天然高分子材料的強(qiáng)度，人們常常通過交聯(lián)反應(yīng)而達(dá)到增強(qiáng)的目的。殼聚糖類水凝膠為物理或化學(xué)交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)。殼聚糖由于其分子間的氫鍵作用，其酸性水溶液具有一定粘度，而遇到堿性試劑，殼聚糖會(huì)立即形成凝膠，但該凝膠受環(huán)境PH影響較大，且凝膠強(qiáng)度不夠。通過化學(xué)交聯(lián)的方法，使線性的殼聚糖鏈通過共價(jià)鍵交聯(lián)變成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，或是殼聚糖鏈通過氫鍵、庫(kù)侖力等分子間的作用力或高分子鏈相互纏結(jié)等物理作用形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的超分子體系。這樣一方面可以使殼聚糖分子對(duì)酸性溶液的穩(wěn)定性增強(qiáng)，另一方面可使其對(duì)環(huán)境的刺激產(chǎn)生可逆響應(yīng)。常用的交聯(lián)方法有:化學(xué)交聯(lián)劑使其交聯(lián);光照或輻射與其他高分子形成半互穿或互穿網(wǎng)絡(luò);聚電解質(zhì)通過靜電作用或氫鍵鍵合使其交聯(lián)等。
[0004]作為組織工程生物材料是殼聚糖水凝膠的一大重要應(yīng)用，但是傳統(tǒng)交聯(lián)方法都使用化學(xué)合成類交聯(lián)劑，而這類交聯(lián)劑具有相對(duì)較高的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致所得生物材料在植入生物體后，會(huì)影響正常組織的生長(zhǎng)以及破壞大分子藥物的完整性，從而影響創(chuàng)口的愈合和功能恢復(fù)。京尼平是傳統(tǒng)中藥杜仲的活性成分之一，含有-0H、-C00-等多個(gè)活性官能團(tuán)，可自發(fā)與氨基反應(yīng)達(dá)到交聯(lián)殼聚糖的效果。與傳統(tǒng)交聯(lián)劑相比，天然生物交聯(lián)劑京尼平具有低毒性和良好的生物相容性。有研究表明在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)戊二醛交聯(lián)，明膠微球毒性較大，使細(xì)胞形態(tài)功能發(fā)生變化，甚至有死亡現(xiàn)象。而京尼平制作的微球幾乎無細(xì)胞毒性，在支架中其濃度低于0.5%時(shí)組織無明顯炎性反應(yīng)，各濃度細(xì)胞毒級(jí)均為I級(jí)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。因此，以京尼平交聯(lián)的殼聚糖水凝膠在生物材料領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。
[0005]殼聚糖水凝膠的實(shí)際應(yīng)用時(shí)，一般都需要對(duì)其進(jìn)行功能化改性，例如:對(duì)外界環(huán)境響應(yīng)、增加選擇性、增加細(xì)胞貼附性能、刺激細(xì)胞生長(zhǎng)分化等。但傳統(tǒng)功能化的方法仍然存在亟待解決的問題，例如，(I)步驟復(fù)雜，這種方法需要將殼聚糖提前進(jìn)行修飾或者對(duì)合成水凝膠進(jìn)行修飾，任何的化學(xué)修飾步驟都有可能引入對(duì)生物體不利的因素，Kim等將2-羧乙基丙烯酸酯截止到殼聚糖的伯氨基上，然后與PEO六硫醇混合得到殼聚糖-PEO原位水凝膠；
(2)反應(yīng)條件苛刻，通過紫外光或輻射等方法合成特殊功能化的殼聚糖共混水凝膠，但是對(duì)于生物功能化材料來說，該類方法可導(dǎo)致引入的生物功能分子(蛋白、DNA等)變性失活；(3)化學(xué)試劑種類多，化學(xué)試劑對(duì)生物功能分子以及殼聚糖水凝膠的生物應(yīng)用都會(huì)增加細(xì)胞毒性等，Kim等用2,2-二甲氧基-2-苯基乙酰苯(DM-PAP)和亞甲基二丙烯酰胺(MBAAm)作為引發(fā)劑和交聯(lián)劑反應(yīng)制備殼聚糖/聚丙烯酰胺互穿網(wǎng)絡(luò)(IPN)水凝膠。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)上述殼聚糖水凝膠功能化方法所面臨的各種問題，本發(fā)明提供一種制備生物功能化殼聚糖水凝膠的方法，采用一步法，通過中藥京尼平的橋接作用，制備生物功能化的殼聚糖水凝膠，簡(jiǎn)單易操作，價(jià)格低廉，反應(yīng)條件溫和成熟，無細(xì)胞或低細(xì)胞毒性，方法具有普遍適用性，所制備水凝膠可以作為生物界面材料和支架材料，用于控制細(xì)胞貼附生長(zhǎng)和分化，傷口愈合，可用于神經(jīng)修復(fù)、肌肉或皮膚組織修復(fù)、骨或軟骨等組織的修復(fù)等，在臨床醫(yī)學(xué)方面具有極大的應(yīng)用潛力。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的一個(gè)技術(shù)方案為:一種制備生物功能化殼聚糖水凝膠的方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0008](I)首先，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)京尼平的配制:用75%酒精lml，分別溶解0.005g、0.0lg和
0.028的京尼平配置成0.5%、1.0%、2.0%的京尼平溶液；
[0009](2)殼聚糖溶液的制備:1.5g的殼聚糖溶于10ml的3%的醋酸溶液中制備成1.5%的殼聚糖溶液，并加入含有氨基的生物分子，于瓶中攪拌過夜；
[0010](3)將上述兩種溶液按照不同的比例混合，室溫靜置24-72h后即可得到功能化殼聚糖水凝膠;其中，京尼平和含有氨基的生物分子的摩爾比例保持在10:5至10:1之間，殼聚糖和京尼平的摩爾比例保持在300:1至30:10之間。
[0011]在步驟(3)之后，還包括步驟(4)功能化殼聚糖水凝膠的性能判定。
[0012]在步驟(I)中，75%酒精是指酒精占酒精水溶液的體積比為75 % ; 0.5 %、1.0 %、2.0%是指京尼平占京尼平溶液的質(zhì)量體積比(g/ml)。
[0013]在步驟(2)中，3%的醋酸溶液是指醋酸占醋酸水溶液的體積比為3 %。1.5%的殼聚糖溶液是指殼聚糖占?xì)ぞ厶侨芤旱馁|(zhì)量體積比(g/ml)。
[0014]在步驟(2)中，含有氨基的生物分子為氨基化熒光分子、N端無修飾的生物活性多肽、生長(zhǎng)因子、具有生物功能的氨基化DNA或RNA分子的一種或幾種的混合物。
[0015]在步驟(2)中，氨基化熒光分子為香豆素類熒光分子、羅丹明類熒光分子、氟硼熒類分子、花菁類熒光分子或異硫氰酸熒光分子;N端無修飾的生物活性多肽為細(xì)胞粘附肽、細(xì)胞生長(zhǎng)肽、抗菌肽、神經(jīng)活性肽、激素調(diào)節(jié)肽、抗高血壓活性肽、抗氧化活性肽或免疫活性肽；生長(zhǎng)因子為成骨細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)分化因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子_β、血小板衍化生長(zhǎng)因子或角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子；具有生物功能的氨基化DNA RNA分子為抗腫瘤類核酸分子、腫瘤細(xì)胞表面受體類核酸分子。
[0016]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果:本發(fā)明方法簡(jiǎn)單易行，避免了繁復(fù)的修飾步驟，只需一步法即可制備生物功能化的殼聚糖水凝膠;反應(yīng)條件溫和，無需輻射的苛刻條件或加入引發(fā)劑等毒性化學(xué)物質(zhì)，只需中性條件即可，是一種完全親和生物體的方法；成本低、制備速度快、可量產(chǎn)，所得產(chǎn)品功能化水凝膠后處理方法簡(jiǎn)單，可滿足臨床等實(shí)際應(yīng)用。該方法制備功能化殼聚糖水凝膠效率高、污染低，適于推廣應(yīng)用。
【附圖說明】
[0017]圖1為京尼平交聯(lián)的殼聚糖水凝膠原理示意圖；
[0018]圖2為一步法制備生物功能化殼聚糖水凝膠示意圖；
[0019]圖3為熒光功能化的殼聚糖水凝膠的熒光顯微鏡照片；
[0020]圖4為細(xì)胞在RGD功能化水凝膠表面的貼附性能示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說明。
[0022]本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種簡(jiǎn)便制備生物功能化的殼聚糖水凝膠的新方法，即一步法制備含有特殊生物功能且無毒的京尼平交聯(lián)的殼聚糖水凝膠。本制備方法簡(jiǎn)單易操作、反應(yīng)條件溫和成熟、細(xì)胞毒性，價(jià)格低廉，適于推廣和臨床應(yīng)用。
[0023]京尼平作為殼聚糖水凝膠的交聯(lián)劑已有諸多報(bào)道。其交聯(lián)過程示意圖如圖1:京尼平與殼聚糖的反應(yīng)是自發(fā)的，其與氨基(H2N-R)的自發(fā)反應(yīng)可同時(shí)發(fā)生在兩個(gè)活性部位，即烯碳原子受氨基親核進(jìn)攻后形成雜環(huán)胺化合物，以及酯基與氨基發(fā)生親核取代反應(yīng)生成酰胺。通過控制反應(yīng)物的比例，可以制備不同交聯(lián)度的殼聚糖水凝膠，同時(shí)水凝膠中可能存在大量未參與交聯(lián)反應(yīng)的京尼平活性反應(yīng)點(diǎn)。這為本發(fā)明提供了簡(jiǎn)單易行的功能化方法，如圖2。
[0024]圖2顯示了在反應(yīng)同時(shí)加入含有氨基的生物功能化分子，可通過一步法直接引入殼聚糖水凝膠，并使其獲得特殊的生物功能，例如通過熒光分子、生長(zhǎng)因子、生物活性多肽和蛋白以及DNA或RNA核酸分子的引入，得到熒光標(biāo)記的、調(diào)控細(xì)胞貼附增值迀移以及定向分化等多種生物功能的殼聚糖水凝膠。
[0025]用于本發(fā)明的特殊生物功能的分子包括:
[0026](I)氨基化熒光分子，如:香豆素類熒光分子、羅丹明類熒光分子、氟硼熒類分子、花菁類熒光分子、異硫氰酸熒光分子等；
[0027](2)N端無修飾的生物活性多肽，如:細(xì)胞粘附肽、細(xì)胞生長(zhǎng)肽、抗菌肽、神經(jīng)活性肽、激素調(diào)節(jié)肽、抗高血壓活性肽、抗氧化活性肽、免疫活性肽等；
[0028](3)各種蛋白及生長(zhǎng)因子，如:成骨細(xì)胞生長(zhǎng)因子(BMP-2)、神經(jīng)分化因子(NGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1KTGF-β)、血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF)、角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、胰島蛋白(Insulin)、溶菌酶蛋白(Lysozyme)等
[0029](4)所有具有生物功能的氨基化DNA或RNA aptamer:抗腫瘤類核酸分子、腫瘤細(xì)胞表面受體類核酸分子。
[0030]—種制備生物功能化殼聚糖水凝膠的方法，包括以下具體步驟:
[0031](1)首先，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)京尼平的配制:用75%酒精11111，溶解0.0058、0.018、0.028的京尼平配置成0.5%、1.0%、2.0%的京尼平溶液；
[0032](2)殼聚糖溶液的制備:1.5g的殼聚糖溶于10ml的3%的醋酸溶液中制備成1.5%的殼聚糖溶液，并加入含有氨基的生物分子，于錐形瓶中攪拌過夜；
[0033](3)將上述兩種溶液按照不同的比例混合，室溫靜置24_72h后即可得到殼聚糖水凝膠。其中，京尼平和氨基生物分子的摩爾比例保持在10:5至10:1之間，殼聚糖和京尼平的摩爾比例保持在300:1至30:10之間。
[OO34 ] (4)功能化殼聚糖水凝膠的性能判定:
[0035]對(duì)不同功能化的殼聚糖水凝膠，我們可通過鑒定其生物功能進(jìn)行驗(yàn)證。最直接的驗(yàn)證方法是引入熒光分子的水凝膠檢測(cè)其熒光性能，若顯示明顯熒光，則本發(fā)明方法可行。我們還可以通過引入R⑶的水凝膠考察其對(duì)細(xì)胞的貼附性能，若細(xì)胞貼附性能明顯改善，則本發(fā)明方法可行。
[0036]實(shí)施例1:一步法制備熒光功能化的殼聚糖水凝膠
[0037]制備方法:
[0038]首先，用75 %酒精I(xiàn)ml，溶解0.02g的京尼平配置成2.0 %的京尼平溶液;與此同時(shí)，1.5g的殼聚糖溶于10ml的3%的醋酸溶液中制備成1.5%的殼聚糖溶液，并加入Img含有氨基的FITC熒光分子，于錐形瓶中攪拌過夜，得到殼聚糖和FITC的混合溶液;將上述兩種溶液I: I均勻混合，室溫靜置48h后即可得到熒光分子FITC功能化的殼聚糖水凝膠。
[0039]結(jié)果分析:
[0040]圖3顯不加入焚光分子的殼聚糖水凝膠在焚光顯微鏡下顯不出明顯的焚光，而未加入熒光分子的殼聚糖水凝膠不顯示熒光，結(jié)果充分說明本發(fā)明是一種簡(jiǎn)單高效的制備功能化殼聚糖水凝膠的新方法。
[0041 ]實(shí)施例2: —步法制備細(xì)胞粘附肽RGD功能化的殼聚糖水凝膠
[0042]制備方法:
[0043]首先，用75 %酒精I(xiàn)ml，溶解0.0lg的京尼平配置成1.0 %的京尼平溶液;與此同時(shí)，1.5g的殼聚糖溶于10ml的3%的醋酸溶液中制備成1.5%的殼聚糖溶液，并加入Img含有氨基的細(xì)胞粘附肽GGRGDS，于錐形瓶中攪拌過夜，得到殼聚糖和GGRGDS的混合溶液;將上述兩種溶液I: I均勻混合，室溫靜置72h后即可得到具有細(xì)胞粘附分子GGRGDS的殼聚糖水凝膠。
[0044]結(jié)果分析:
[0045]:圖4為殼聚糖水凝膠種植MC-3T3細(xì)胞，經(jīng)過24h培養(yǎng)后，其表面細(xì)胞的貼附形態(tài)。觀察前先將細(xì)胞和細(xì)胞核染色。加入GGRGD的殼聚糖水凝膠顯示出對(duì)細(xì)胞更強(qiáng)的貼附性能，其細(xì)胞形態(tài)為貼附的鋪展?fàn)睿珼API和鬼筆環(huán)肽染色后發(fā)現(xiàn)很明顯的粘著斑;而未加入GGRGD的水凝膠對(duì)細(xì)胞貼附性較差，其細(xì)胞形態(tài)為收縮球形。這一結(jié)果充分證明GGRGDS的成功引入可以有效改進(jìn)細(xì)胞在水凝膠表面的貼附性能。再次驗(yàn)證本發(fā)明是一種簡(jiǎn)單高效的制備功能化殼聚糖水凝膠的新方法，同時(shí)該方法具有普適性。
[0046]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出:對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和等同形式的替換，這些改進(jìn)和等同替換得到的技術(shù)方案也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種制備生物功能化殼聚糖水凝膠的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)首先，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)京尼平的配制:用75%酒精I(xiàn)ml，分別溶解0.005g、0.0lg和0.02g的京尼平配置成0.5%、1.0 %、2.0 %的京尼平溶液； (2)殼聚糖溶液的制備:1.5g的殼聚糖溶于10ml的3%的醋酸溶液中制備成1.5%的殼聚糖溶液，并加入含有氨基的生物分子，于瓶中攪拌過夜； (3)將上述兩種溶液按照不同的比例混合，室溫靜置24-72h后即可得到功能化殼聚糖水凝膠;其中，京尼平和含有氨基的生物分子的摩爾比例保持在10:5至10:1之間，殼聚糖和京尼平的摩爾比例保持在300:1至30:10之間。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備生物功能化殼聚糖水凝膠的方法，其特征在于，在步驟(3)之后，還包括步驟(4)功能化殼聚糖水凝膠的性能判定。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備生物功能化殼聚糖水凝膠的方法，其特征在于，在步驟(2)中，含有氨基的生物分子為氨基化熒光分子、N端無修飾的生物活性多肽、活性蛋白、生長(zhǎng)因子、具有生物功能的氨基化DNA或RNA分子的一種或幾種的混合物。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種制備生物功能化殼聚糖水凝膠的方法，其特征在于，在步驟(2)中，氨基化熒光分子為香豆素類熒光分子、羅丹明類熒光分子、氟硼熒類分子、花菁類熒光分子或異硫氰酸熒光分子;N端無修飾的生物活性多肽為細(xì)胞粘附肽、細(xì)胞生長(zhǎng)肽、抗菌肽、神經(jīng)活性肽、激素調(diào)節(jié)肽、抗高血壓活性肽、抗氧化活性肽或免疫活性肽;生長(zhǎng)因子為成骨細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)分化因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、血小板衍化生長(zhǎng)因子或角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子;具有生物功能的氨基化DNA /RNA分子為抗腫瘤類核酸分子、腫瘤細(xì)胞表面受體類核酸分子。
【文檔編號(hào)】A61L27/50GK105920675SQ201610230497
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月14日
【發(fā)明人】潘國(guó)慶, 周平輝, 張文, 過倩萍
【申請(qǐng)人】蘇州大學(xué)