一種自組裝納米止血?jiǎng)⑵渲苽浞椒皯?yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種自組裝納米止血?jiǎng)?、其制備方法及?yīng)用，該納米止血?jiǎng)┯捎H水性陽離子聚合物和含羧基的疏水化合物組成，其中所述親水性陽離子聚合物與含羧基的疏水化合物的質(zhì)量比為1：0.1～1：5，所述納米止血?jiǎng)┑牧綖?0nm～800nm。制備時(shí)，將親水性陽離子聚合物溶于強(qiáng)極性溶劑中，含羧基的疏水化合物溶于與水互溶的有機(jī)溶劑中，然后將溶有羧基化合物的有機(jī)溶液在超聲作用下緩慢加入聚合物溶液中，將混合液置于透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析去除有機(jī)溶劑。本納米止血?jiǎng)┘瓤梢酝ㄟ^滴于或涂抹于組織局部止血，也可以通過注射預(yù)防出血。該納米止血?jiǎng)┖铣珊?jiǎn)單，價(jià)格低廉，自組裝法簡(jiǎn)單易行，有機(jī)溶劑容易去除，穩(wěn)定性較好、無免疫原性。
【專利說明】
一種自組裝納米止血?jiǎng)⑵渲苽浞椒皯?yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及納米止血材料領(lǐng)域，具體是一種自組裝納米止血?jiǎng)?、該止血?jiǎng)┑闹苽?方法及其在防治機(jī)體出血中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在外傷和臨床手術(shù)中，機(jī)體的大量出血是造成死亡的主要因素之一。血液凝集是 創(chuàng)傷后傷口愈合的第一步。在損傷不嚴(yán)重情況下，如一些小血管的破壞會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生生 理性止血。但如果是較為嚴(yán)重的機(jī)體損傷，就必須采取一系列措施以達(dá)到快速、有效的止 血。目前臨床手術(shù)和外傷處理中普遍應(yīng)用的止血方法主要包括化學(xué)止血法、熱止血法和機(jī) 械止血法。
[0003] 化學(xué)法主要通過化學(xué)試劑改變血液的凝血活性，例如血管收縮劑(血栓素 A2)可以 導(dǎo)致血管收縮，減少血液流動(dòng)，從而促進(jìn)凝血。熱凝止血法包括灼燒止血和激光止血。機(jī)械 止血法主要是通過按壓、結(jié)扎以及使用繃帶止血。目前多采用化學(xué)和機(jī)械方法聯(lián)合止血，常 用纖維蛋白原、凝血酶和鈣離子形成纖維蛋白膠作為血小板替代物。盡管如此，該方法仍受 到很多限制，例如有些試劑是固體的，不能到達(dá)創(chuàng)口起到止血的效果;一些液體止血?jiǎng)?如 氰丙烯酸鹽類)需要在干燥的環(huán)境中才能發(fā)揮止血作用；而部分止血材料易產(chǎn)生免疫原性 或移植物抗宿主病，從而對(duì)機(jī)體造成二次傷害，或是本身存活時(shí)間短，需要臨用現(xiàn)配。
[0004] 為了克服上述問題，近年來逐步發(fā)展了一些新型止血技術(shù)，包括使用功能性脂質(zhì) 體、嵌段共聚物、合成血小板和納米材料等。其中，納米止血?jiǎng)┮蚱淞己玫闹寡Ч褪褂?的靈活多樣性，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值，備受研究人員的關(guān)注。比如一些多肽自組裝的納 米纖維，可以形成類似細(xì)胞外基質(zhì)的屏障，同時(shí)分解成天然的氨基酸，從而促進(jìn)傷口的恢 復(fù)，提高了止血效率。并且有研究表明碳納米粒以及Clottocytes納米粒可以激活血小板， 減少機(jī)體出血時(shí)間。聚(乳酸-乙醇酸)和聚賴氨酸的嵌段共聚物(PLGA-PLL)，通過在其中引 入的聚乙二醇(PEG)的遠(yuǎn)端鍵合RGD短肽，由其自組裝形成納米粒，該類納米粒可以激活血 小板從而促進(jìn)凝血，故被稱之為"人造血小板"。R⑶和血小板受體糖蛋白Π b-ma以及整聯(lián) 素 ανβ3結(jié)合，激活血小板從而促進(jìn)血小板凝集。
[0005] 盡管上述有關(guān)納米止血?jiǎng)┑难芯咳〉昧艘欢ǖ倪M(jìn)展，但是通過納米粒止血仍然受 到很多限制，諸如在體循環(huán)時(shí)間短、本身具有納米毒性、對(duì)機(jī)體造成不可逆的損傷、使血栓 相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加等。另外目前研究的止血?jiǎng)┥写嬖趦?chǔ)存穩(wěn)定性差、合成工藝復(fù)雜、制備 成本高等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種自組裝納米止血?jiǎng)┑慕M成、制備方法，同時(shí)還驗(yàn)證該納 米止血?jiǎng)┰诓煌鲅Ｐ椭械淖饔谩?br>[0007] 本發(fā)明通過親水性陽離子聚合物和含羧基的疏水化合物間的多重非共價(jià)鍵力(包 括靜電作用、氫鍵作用及疏水作用)介導(dǎo)的自組裝來構(gòu)建新型納米止血?jiǎng)ㄟ^促進(jìn)小血管 的收縮，促進(jìn)血小板凝集和凝血系統(tǒng)的啟動(dòng)，與血紅細(xì)胞中鐵離子結(jié)合形成凝塊減少機(jī)體 出血時(shí)間。并且由于該納米粒表面帶有正電荷，其可以與血液中帶有負(fù)電荷的白細(xì)胞、紅細(xì) 胞及血小板等物質(zhì)相互作用、結(jié)合、形成凝血栓，最終發(fā)揮其止血效應(yīng)，極大地提高了止血 效率。相對(duì)于其他止血?jiǎng)?，本發(fā)明通過自組裝制備的納米止血?jiǎng)┚哂兄T多優(yōu)勢(shì)，因而有較廣 闊的應(yīng)用前景。
[0008] 鑒于此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種自組裝納米止血?jiǎng)┯捎H水性陽離子聚 合物和含羧基的疏水化合物組成，其中所述親水性陽離子聚合物與含羧基的疏水化合物的 質(zhì)量比在1 :〇· 1至1:5之間，所述納米止血?jiǎng)┑牧皆?0nm至800nm之間。其中親水性陽離子 聚合物選自聚乙烯亞胺(包括支化聚乙烯亞胺和線性聚乙烯亞胺）、聚(L-賴氨酸)氫溴酸鹽 和聚（L-精氨酸）鹽酸鹽，分子量在500Da至50000Da之間；含羧基的疏水化合物選自膽酸 (Cholic acid)、熊去氧膽酸(Ursodeoxycholic acid)、鶴去氧膽酸（Chenodeoxycholic acid)、豬去氧膽酸（Hyodeoxycholic acid)、石膽酸（Lithocholic acid)、脫氧膽酸 (Deodeoxycholic acid)、去氛膽酸(Dehydrocholic acid)、布洛芬（Ibuprofen)、酬洛芬 (Ketoprofen)、非諾洛芬(Fenoprofen)、氣比洛芬(Flurbiprofen)、奧沙普秦(Oxaprozin)、 萘普生(Naproxen)、吲噪美辛（Indomethacin)、舒林酸（Sulindac)、依托度酸(Etodolac)、 甲滅酸（Mefenamic acid)、甲氯芬那酸（Meclofenamic acid)、氣芬那酸（Flufenamic acid)、托滅酸(Tolfenamic acid)、羅美昔布(Lumiracoxib)、利克飛龍(Licofelone)、二氣 尼柳（Diflunisal)、阿司匹林（Aspirin)、吉非貝齊（Gemfibrozil )、環(huán)丙沙星 (Ciprof Ioxacin)、諾氣沙星(Norf Ioxacin)及氧氣沙星(Of Ioxacin)。
[0009] 本發(fā)明還提供一種自組裝納米止血?jiǎng)┑闹苽浞椒?，包括以下步驟:首先將親水性 陽離子聚合物溶于一定量的強(qiáng)極性溶劑中，得到聚合物溶液，將含羧基的疏水化合物溶于 水溶性有機(jī)溶劑中，然后將溶有含羧基的疏水化合物的有機(jī)溶液在超聲作用下緩慢加入聚 合物溶液中，之后將上述混合液置于透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析去除有機(jī)溶 劑，即可得到自組裝納米止血?jiǎng)?br>[0010] 其中，上述強(qiáng)極性溶劑選自去離子水、二甲基亞砜、N，N_二甲基甲酰胺、N，N_二甲 基乙酰胺。水溶性有機(jī)溶劑選自丙酮、乙腈、乙醇、二甲基亞砜、N，N_二甲基甲酰胺、N，N_二 甲基乙酰胺、醋酸。
[0011] 以上聚合物溶液的濃度在lmg/mL至100mg/mL之間，含羧基的疏水化合物的有機(jī)溶 液的濃度在lmg/mL至100mg/mL之間。
[0012] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了自組裝納米止血?jiǎng)┑膽?yīng)用，包括將所述納米止血?jiǎng)┩庥糜诮M 織局部(包括噴灑、涂抹或外敷于組織局部），或?qū)⒓{米止血?jiǎng)┯糜陟o脈注射，達(dá)到止血或預(yù) 防出血的目的。
[0013]本發(fā)明具有以下的優(yōu)點(diǎn)：
[0014] 1)本發(fā)明所使用的親水性陽離子聚合物均有商品化產(chǎn)品，其合成簡(jiǎn)單，價(jià)格相對(duì) 低廉，故易于實(shí)現(xiàn)相應(yīng)制劑的產(chǎn)業(yè)化。
[0015] 2)本發(fā)明采用的自組裝法簡(jiǎn)單易行，且使用的有機(jī)溶劑容易去除，保證了最終納 米止血?jiǎng)?yīng)用的可行性和安全性。
[0016] 3)本發(fā)明所制備的納米止血?jiǎng)┑牧酱笮】梢酝ㄟ^制備工藝參數(shù)來調(diào)控。
[0017] 4)本發(fā)明所制備的納米止血?jiǎng)橐后w，使用靈活方便。
[0018] 5)本發(fā)明所制備的納米止血?jiǎng)┑姆€(wěn)定性較好、無免疫原性，保證了體內(nèi)安全性。
[0019] 6)本發(fā)明所制備的納米止血?jiǎng)┘瓤梢跃植客磕ㄊ褂茫部梢造o脈注射使用。
【附圖說明】
[0020] 圖1為分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺和熊去氧膽酸通過自組裝制備得到的 質(zhì)量比在1:1至1:4之間的納米粒的透射電鏡圖。
[0021] 圖2為空白對(duì)照組(0.9%生理鹽水)和治療組（納米止血?jiǎng)?促進(jìn)血小板凝集的相 差顯微鏡圖，其中標(biāo)尺為l〇ym。
[0022] 圖3為空白對(duì)照組(0.9%生理鹽水)和治療組（納米止血?jiǎng)?促進(jìn)血小板凝集的共 聚焦圖，其中標(biāo)尺為5μηι。
[0023] 圖4為大鼠股動(dòng)脈靜脈注射Α(0.9%生理鹽水）、B(Cy5標(biāo)記熊去氧膽酸/聚乙烯亞 胺納米粒，不做處理的一段股動(dòng)脈)和C(Cy5標(biāo)記熊去氧膽酸/聚乙烯亞胺納米粒，局部刺破 的一段股動(dòng)脈)溶液后，活體成像觀察血液凝集情況。
[0024]圖5為分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺和熊去氧膽酸以1:1至1:4的質(zhì)量比制 備的納米止血?jiǎng)?duì)小鼠尾部、大鼠股動(dòng)脈、肝臟以及靜脈注射納米止血?jiǎng)┖蠊蓜?dòng)脈的出血 時(shí)間的影響。
[0025]圖6為不同濃度（1、2及4mg/mL)的納米止血?jiǎng)?duì)小鼠尾部、大鼠股動(dòng)脈、肝臟以及 靜脈注射納米止血?jiǎng)┖蠊蓜?dòng)脈的出血時(shí)間的影響。
[0026] 圖7為不同聚乙烯亞胺（分子量為1800Da的枝化聚乙烯亞胺PEI1800和分子量為 1000 ODa的線性聚乙烯亞胺PEI10000)和熊去氧膽酸制備的納米止血?jiǎng)?duì)小鼠尾部、大鼠股 動(dòng)脈、肝臟以及靜脈注射納米止血?jiǎng)┖蠊蓜?dòng)脈的出血時(shí)間的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。應(yīng)理解，本發(fā) 明的實(shí)施例只用于說明本發(fā)明而非限制本發(fā)明，在不脫離本發(fā)明技術(shù)思想的情況下，根據(jù) 本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，做出的各種替換和變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0028] 下面結(jié)合非限定性的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明。在自組裝過程中，可以控制納 米止血?jiǎng)┑牧皆?0nm至800nm之間。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 將5mg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于5mL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為lmg/mL;將25mg熊去氧膽酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中熊去氧膽酸的濃度為25mg/mL; 超聲波作用下，將ImL熊去氧膽酸的丙酮溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截 留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換 去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止血?jiǎng)┑牧?在200~500nm之間。
[0031] 實(shí)施例2
[0032] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL二甲基亞砜中，聚合物溶液的 濃度為10mg/mL;將Img膽酸溶于ImL乙腈中，其中膽酸的濃度為lmg/mL;超聲波作用下，將 ImL膽酸的乙腈溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分子量為7000Da的透 析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離子水;24h后收集透 析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤海{米止血?jiǎng)┑牧皆?00_400nm之間。 [0033] 實(shí)施例3
[0034] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL N，N-二甲基甲酰胺中，聚合 物溶液的濃度為10mg/mL;將2mg鵝去氧膽酸溶于ImL乙醇中，其中鵝去氧膽酸的濃度為2mg/ mL;超聲波作用下，將ImL鵝去氧膽酸的乙醇溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置 于截留分子量為1000 ODa的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min 更換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止血?jiǎng)┑?粒徑在150-300nm之間。
[0035] 實(shí)施例4
[0036] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL N，N-二甲基乙酰胺中，聚合 物溶液的濃度為10mg/mL;將5mg豬去氧膽酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中豬去氧膽酸的濃度 為5mg/mL;超聲波作用下，將ImL豬去氧膽酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將 上述混合液置于截留分子量為SOOODa的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20 tC，每隔30min更換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤海?納米止血?jiǎng)┑牧皆?00-300nm之間。
[0037] 實(shí)施例5
[0038] 將IOmg分子量為ISOODa的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL N，N-二甲基乙酰胺中，聚合物 溶液的濃度為IOmg/mL;將IOmg石膽酸溶于ImL N，N-二甲基甲酰胺中，其中石膽酸的濃度為 10mg/mL;超聲波作用下，將ImL石膽酸的N，N-二甲基甲酰胺溶液緩慢加入聚合物溶液中；將 上述混合液置于截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20 tC，每隔30min更換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤海?納米止血?jiǎng)┑牧皆?00-200nm之間。
[0039] 實(shí)施例6
[0040] 將IOmg分子量為SOODa的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL二甲基亞砜中，聚合物溶液的濃 度為10mg/mL;將20mg脫氧膽酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中脫氧膽酸的濃度為20mg/mL;超 聲波作用下，將ImL脫氧膽酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于 截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更 換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止血?jiǎng)┑牧?徑在200-300nm之間。
[0041 ] 實(shí)施例7
[0042] 將IOmg分子量為500Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL二甲基亞砜中，聚合物溶液的濃 度為10mg/mL;將30mg去氫膽酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中去氫膽酸的濃度為30mg/mL;超 聲波作用下，將ImL去氫膽酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于 截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更 換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤海{米止血?jiǎng)┑牧?徑在150-250nm之間。
[0043] 實(shí)施例8
[0044] 將IOmg分子量為2500Da的線性聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為lOmg/mL;將20mg布洛芬溶于ImL丙酮中，其中布洛芬的濃度為20mg/mL;超聲波作用下， 將ImL布洛芬的丙酮溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分子量為3500Da 的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離子水;24h后收 集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止血?jiǎng)┑牧皆?00-300nm之間。 [0045] 實(shí)施例9
[0046] 將IOmg分子量為5000Da的線性聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為10mg/mL;將20mg酮洛芬溶于ImL乙腈中，其中酮洛芬的濃度為20mg/mL;超聲波作用下， 將ImL酮洛芬的乙腈溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分子量為3500Da 的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離子水;24h后收 集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤海{米止血?jiǎng)┑牧皆?00-200nm之 間。O
[0047] 實(shí)施例10
[0048] 將20mg分子量為5000Da的線性聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為20mg/mL;將60mg非諾洛芬溶于ImL二甲基亞砜中，其中非諾洛芬的濃度為60mg/mL;超 聲波作用下，將ImL非諾洛芬的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于 截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更 換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止血?jiǎng)┑牧?徑在200-350nm之間。
[0049] 實(shí)施例11
[0050] 將20mg分子量為20000Da的線性聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為20mg/mL;將IOOmg氟比洛芬溶于ImL二甲基亞砜中，其中氟比洛芬的濃度為100mg/mL; 超聲波作用下，將ImL氟比洛芬的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置 于截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min 更換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤海{米止血?jiǎng)┑?粒徑在300-450nm之間。
[0051 ] 實(shí)施例12
[0052] 將20mg分子量為1000 ODa的線性聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為20mg/mL;將80mg奧沙普秦溶于ImL二甲基亞砜中，其中奧沙普秦的濃度為80mg/mL;超 聲波作用下，將ImL奧沙普秦的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于 截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更 換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止血?jiǎng)┑牧?徑在300-480nm之間。
[0053] 實(shí)施例13
[0054] 將50mg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為50mg/mL;將50mg萘普生溶于ImL二甲基亞砜中，其中萘普生的濃度為50mg/mL;超聲波 作用下，將ImL萘普生的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分 子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離 子水；24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止血?jiǎng)┑牧皆?100-200nm之間。
[0055] 實(shí)施例14
[0056] 將80mg分子量為1800Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為80mg/mL;將40mg吲哚美辛溶于ImL N，N-二甲基乙酰胺中，其中吲哚美辛的濃度為 40mg/mL;超聲波作用下，將ImL吲哚美辛的N，N-二甲基乙酰胺溶液緩慢加入聚合物溶液中； 將上述混合液置于截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度 20°C，每隔30min更換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃?液，納米止血?jiǎng)┑牧皆?50-250nm之間。
[0057] 實(shí)施例15
[0058] 將IOOmg分子量為50000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的 濃度為l〇〇mg/mL;將IOOmg舒林酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中舒林酸的濃度為100mg/mL;超 聲波作用下，將ImL舒林酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截 留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換 去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤海{米止血?jiǎng)┑牧?在 100-200nm之間。
[0059] 實(shí)施例16
[0060] 將IOmg分子量為ISOODa的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL二甲基亞砜中，聚合物溶液的 濃度為lOmg/mL;將30mg依托度酸溶于ImL丙酮中，其中依托度酸的濃度為30mg/mL;超聲波 作用下，將ImL依托度酸的丙酮溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分子量 為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離子水； 24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤海{米止血?jiǎng)┑牧皆?50-250nm之間。
[0061 ] 實(shí)施例17
[0062] 將IOmg分子量為ISOODa的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL二甲基亞砜中，聚合物溶液的 濃度為10mg/mL;將25mg甲滅酸溶于ImL乙腈中，其中甲滅酸的濃度為25mg/mL;超聲波作用 下，將ImL甲滅酸的乙腈溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分子量為 3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離子水； 24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止血?jiǎng)┑牧皆?50-250nm之間。
[0063] 實(shí)施例18
[0064] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL二甲基亞砜中，聚合物溶液的 濃度為10mg/mL;將25mg甲氯芬那酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中甲氯芬那酸的濃度為25mg/ mL;超聲波作用下，將ImL甲氯芬那酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混 合液置于截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔 30min更換去離子水；24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止 血?jiǎng)┑牧皆?40_200nm之間。
[0065] 實(shí)施例19
[0066] 將IOmg分子量為2000Da的聚（L-賴氨酸)氫溴酸鹽溶于ImL去離子水中，聚合物溶 液的濃度為10mg/mL;將20mg氟芬那酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中氟芬那酸的濃度為20mg/ mL;超聲波作用下，將ImL氟芬那酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合 液置于截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔 30min更換去離子水；24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止 血?jiǎng)┑牧皆?70_230nm之間。
[0067] 實(shí)施例20
[0068] 將IOmg分子量為5000Da的聚（L-賴氨酸)氫溴酸鹽溶于ImL去離子水中，聚合物溶 液的濃度為10mg/mL;將I Omg托滅酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中托滅酸的濃度為I Omg/mL; 超聲波作用下，將ImL托滅酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于 截留分子量為7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更 換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤海{米止血?jiǎng)┑牧?徑在200-400nm之間。
[0069] 實(shí)施例21
[0070] 將IOmg分子量為15000Da的聚(L-賴氨酸)氫溴酸鹽溶于ImL去離子水中，聚合物溶 液的濃度為10mg/mL;將15mg羅美昔布溶于ImL二甲基亞砜中，其中羅美昔布的濃度為15mg/ mL;超聲波作用下，將ImL羅美昔布的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合 液置于截留分子量為7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔 30min更換去離子水；24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止 血?jiǎng)┑牧皆?80_230nm之間。
[0071] 實(shí)施例22
[0072] 將IOmg分子量為15000Da的聚(L-精氨酸)鹽酸鹽溶于ImL去離子水中，聚合物溶液 的濃度為10mg/mL;將15mg利克飛龍溶于ImL二甲基亞砜中，其中利克飛龍的濃度為15mg/ mL;超聲波作用下，將ImL利克飛龍的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合 液置于截留分子量為7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔 30min更換去離子水；24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止 血?jiǎng)┑牧皆?30-300nm之間。
[0073] 實(shí)施例23
[0074] 將20mg分子量為15000Da的聚(L-精氨酸)鹽酸鹽溶于ImL去離子水中，聚合物溶液 的濃度為20mg/mL;將20mg二氟尼柳溶于ImL二甲基亞砜中，其中二氟尼柳的濃度為20mg/ mL;超聲波作用下，將ImL二氟尼柳的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合 液置于截留分子量為7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔 30min更換去離子水；24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止 血?jiǎng)┑牧皆?00_400nm之間。
[0075] 實(shí)施例24
[0076] 將IOmg分子量為15000Da的聚(L-精氨酸)鹽酸鹽溶于ImL去離子水中，聚合物溶液 的濃度為10mg/mL;將50mg阿司匹林溶于ImL二甲基亞砜中，其中阿司匹林的濃度為50mg/ mL;超聲波作用下，將ImL阿司匹林的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合 液置于截留分子量為7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔 30min更換去離子水；24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止 血?jiǎng)┑牧皆?00_300nm之間。
[0077] 實(shí)施例25
[0078] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為10mg/mL ;將20mg吉非貝齊溶于ImL二甲基亞砜中，其中吉非貝齊的濃度為20mg/mL;超 聲波作用下，將ImL吉非貝齊的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于 截留分子量為7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更 換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止血?jiǎng)┑牧?徑在180-220nm之間。
[0079] 實(shí)施例26
[0080] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為I Omg/mL;將I Omg環(huán)丙沙星溶于ImL醋酸中，其中環(huán)丙沙星的濃度為I Omg/mL;超聲波作 用下，將ImL環(huán)丙沙星的醋酸溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分子量為 7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離子水； 24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止血?jiǎng)┑牧皆?80-250nm之間。
[0081 ] 實(shí)施例27
[0082] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為I Omg/mL;將15mg諾氟沙星溶于ImL醋酸中，其中諾氟沙星的濃度為15mg/mL;超聲波作 用下，將ImL諾氟沙星的醋酸溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分子量為 7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離子水； 24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止血?jiǎng)┑牧皆?00-260nm之間。
[0083] 實(shí)施例28
[0084] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為10mg/mL;將20mg氧氟沙星溶于ImL醋酸中，其中氧氟沙星的濃度為20mg/mL;超聲波作 用下，將ImL氧氟沙星的醋酸溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分子量為 7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離子水； 24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止血?jiǎng)┑牧皆?80-160nm之間。
[0085] 實(shí)施例29
[0086] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL二甲基亞砜中，聚合物溶液的 濃度為10mg/mL;將15mg吲哚美辛溶于ImL二甲基亞砜中，其中吲哚美辛的濃度為15mg/mL; 超聲波作用下，將ImL吲哚美辛的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置 于截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min 更換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止血?jiǎng)┑?粒徑在20-60nm之間。
[0087] 實(shí)施例30
[0088] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為10mg/mL;將20mg去氫膽酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中去氫膽酸的濃度為20mg/mL;超 聲波作用下，將ImL去氫膽酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于 截留分子量為7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更 換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤海{米止血?jiǎng)┑牧?徑在500-600nm之間。
[0089] 實(shí)施例31
[0090] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為10mg/mL;將30mg石膽酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中石膽酸的濃度為30mg/mL;超聲波 作用下，將ImL石膽酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分 子量為7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離 子水；24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血?jiǎng)┑乃芤?，納米止血?jiǎng)┑牧皆?700-800nm之間。
[0091 ]按照以上方法制備的納米止血?jiǎng)┲屑{米粒的透射電鏡圖如圖1所示。
[0092]圖2為空白對(duì)照組(0.9%生理鹽水)和治療組（納米止血?jiǎng)?促進(jìn)血小板凝集的相 差顯微鏡圖，其中標(biāo)尺為IOymt3Sprague-Dawley雄性大鼠（230-250g)麻醉后取血，室溫下 1000 rpm離心10min，取上清可獲得富血小板血漿(PRP)，取IOOyL PRP置96孔板內(nèi)，加入IOyL 熊去氧膽酸(UDCA)和分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺自組裝（質(zhì)量比為2:1)納米粒溶 液作為凝血前刺激（圖2實(shí)驗(yàn)組)或加入生理鹽水作為空白對(duì)照（圖2空白對(duì)照組）。樣品加入 同等體積的2%戊二醛固定lh，室溫下孵育IOmin后于相差顯微鏡下觀察血小板的聚集狀態(tài) (圖 2)。
[0093]圖3為空白對(duì)照組(0.9%生理鹽水)和治療組（納米止血?jiǎng)?促進(jìn)血小板凝集的共 聚焦圖，其中標(biāo)尺為5μπι。精密量取ImL 20mg/mL的枝化聚乙烯亞胺PEI(MW = 25000)的DMSO 溶液，加入ImL 2.36mg/mL Cy5NHS ester的DMSO溶液，于40°C避光反應(yīng)12h，即得PEI-Cy5溶 液。然后，吸取PEI-Cy5溶液ImL與ImL的20mg/mL UDCA的DMSO溶液混合，置于分子量3500的 透析袋中，純水透析24h，即得Cy5標(biāo)記的納米粒。取500yL的PRP加入3mL的THB (臺(tái)式液），用 50yL CD61/FITC標(biāo)記，室溫下共孵育40min后，1600g離心5min，用1.5mL PPP稀釋即得重建 血小板。取150yL重建血小板加入15yL Cy5修飾的PEI/UDCA(10:20)納米粒溶液或15yL THB 作為空白對(duì)照后加15yL甲醛固定;共聚焦觀察血小板的聚集狀態(tài)（圖3)。
[0094]圖4為大鼠股動(dòng)脈靜脈注射A(0.9%生理鹽水）、B(Cy5標(biāo)記熊去氧膽酸/聚乙烯亞 胺納米粒，不做處理的一段股動(dòng)脈)和C(Cy5標(biāo)記熊去氧膽酸/聚乙烯亞胺納米粒，局部刺破 的一段股動(dòng)脈)溶液后，活體成像觀察血液凝集情況。Sprague-Dawley雄性大鼠（230-250g) 麻醉后，尾靜脈注射〇. 5mL Cy5-PEI-UDCA納米?；蛏睇}水，5min之后暴露出大鼠股動(dòng)脈， 用0.45_的針頭刺穿股動(dòng)脈，待止血后，剪下股動(dòng)脈觀察熒光分布。
[0095]圖5為分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺和熊去氧膽酸以1:1至1:4的質(zhì)量比制 備的納米止血?jiǎng)?duì)小鼠尾部、大鼠股動(dòng)脈、肝臟以及靜脈注射納米止血?jiǎng)┖蠊蓜?dòng)脈的出血 時(shí)間的影響。
[0096]圖6為不同濃度（1、2及4mg/mL)的納米止血?jiǎng)?duì)小鼠尾部、大鼠股動(dòng)脈、肝臟以及 靜脈注射納米止血?jiǎng)┖蠊蓜?dòng)脈的出血時(shí)間的影響。
[0097] 圖7為不同聚乙烯亞胺（分子量為1800Da的枝化聚乙烯亞胺PEI1800和分子量為 1000 ODa的線性聚乙烯亞胺PEI10000)和熊去氧膽酸制備的納米止血?jiǎng)?duì)小鼠尾部、大鼠股 動(dòng)脈、肝臟以及靜脈注射納米止血?jiǎng)┖蠊蓜?dòng)脈的出血時(shí)間的影響。
[0098]圖5-7中所述不同出血模型的建立和評(píng)價(jià)方法如下：
[0099] 1)小鼠尾部出血模型及評(píng)價(jià)
[0100] 20~25g C57BL小鼠，麻醉后，用利剪在麻醉小鼠尾尖0.5cm處橫向切斷，當(dāng)血液自 動(dòng)流出第一滴后用濾紙吸去，將小鼠尾尖分別置于生理鹽水、PEI25000、PEI1800、PEI10000 水溶液和不同比例（10:10、10:20、10:30和10:40)，不同濃度（1、2和4mg/mL)與不同分子量 的聚乙烯亞胺(bPEI 1800和bPEI 10000)納米粒懸液，小鼠尾部與納米?；鞈乙撼浞纸佑|后， 取出并開始計(jì)時(shí)，每隔15秒用濾紙吸去血液，直至完全停止流血，記錄出血時(shí)間。
[0101] 2)大鼠股動(dòng)脈出血模型及評(píng)價(jià)
[0102]取250~300g Sprague-Dawley大鼠，麻醉后，使后肢展開暴露出大腿內(nèi)側(cè)，切開皮 膚，切開上覆肌肉，暴露出股動(dòng)脈和坐骨神經(jīng)，股動(dòng)脈損傷產(chǎn)生高壓使老鼠大量出血，股動(dòng) 脈損傷后分別在動(dòng)脈損傷處加入生理鹽水、PEI25000、PEI1800和PEI10000水溶液，不同比 例（10:10、10: 20、10: 30和10:40)，不同濃度（1、2和4mg/mL)與不同分子量的聚乙烯亞胺 (bPE 11800、bPE 110000)納米粒懸液300yL，記錄出血時(shí)間。
[0103] 3)肝臟出血模型及評(píng)價(jià)
[0104] 取250~300g Sprague-Dawley大鼠，麻醉后，用手術(shù)刀切開腹部后暴露出肝臟，并 從喙尾方向在肝臟中葉橫向切開，使肝臟形成一個(gè)約4_的創(chuàng)口，在肝臟損傷處分別加入生 理鹽水、PEI25000、PEI1800和PEI10000水溶液，不同比例（10:10、10:20、10:30和10:40)，不 同濃度（1、2和4mg/mL)與不同分子量的聚乙烯亞胺(bPEI1800和bPEIlOOOO)納米?；鞈乙?300yL，記錄出血時(shí)間。
[0105] 4)靜脈注射納米止血?jiǎng)┖蠊蓜?dòng)脈的出血
[0106] 取250~300g Sprague-Dawley大鼠，麻醉后，尾靜脈注射0 · 5mL生理鹽水， PEI25000、PEI1800和PEI10000水溶液，不同比例（10:10、10:20、10:30和10:40)，不同濃度 (1、2和4mg/mL)與不同分子量的聚乙烯亞胺(bPEI1800和bPEIlOOOO)納米?；鞈乙骸?min之 后暴露出大鼠股動(dòng)脈，用〇.45_的針頭刺穿股動(dòng)脈，記錄出血時(shí)間。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種自組裝納米止血?jiǎng)?，其特征?所述納米止血?jiǎng)┯捎H水性陽離子聚合物和含羧 基的疏水化合物組成，其中所述親水性陽離子聚合物與含羧基的疏水化合物的質(zhì)量比在1: O· 1至1:5之間，所述納米止血?jiǎng)┑牧皆?0nm至800nm之間。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種自組裝納米止血?jiǎng)?，其特征?所述親水性陽離子聚合物選 自枝化或線性聚乙烯亞胺、聚(L-賴氨酸)氫溴酸鹽和聚(L-精氨酸)鹽酸鹽，所述親水性陽 離子聚合物的分子量在500Da至50000Da之間。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種自組裝納米止血?jiǎng)?，其特征?所述含羧基的疏水化合物選 自膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸、石膽酸、脫氧膽酸、去氫膽酸、布洛芬、酮洛 芬、非諾洛芬、氟比洛芬、奧沙普秦、萘普生、吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、甲滅酸、甲氯芬那 酸、氟芬那酸、托滅酸、羅美昔布、利克飛龍、二氟尼柳、阿司匹林、吉非貝齊、環(huán)丙沙星、諾氟 沙星及氧氟沙星。4. 權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)所述自組裝納米止血?jiǎng)┑闹苽浞椒ǎ涮卣魇?，包括以下步驟： 首先將親水性陽離子聚合物溶于一定量的強(qiáng)極性溶劑中，得到聚合物溶液，將含羧基的疏 水化合物溶于水溶性有機(jī)溶劑中，然后將溶有含羧基的疏水化合物的有機(jī)溶液在超聲作用 下緩慢加入聚合物溶液中，之后將上述混合液置于透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透 析去除有機(jī)溶劑，即可得到自組裝納米止血?jiǎng)?. 根據(jù)權(quán)利要求4所述自組裝納米止血?jiǎng)┑闹苽浞椒?，其特征?所述強(qiáng)極性溶劑選自 去離子水、二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述自組裝納米止血?jiǎng)┑闹苽浞椒?，其特征?所述水溶性有機(jī)溶劑 選自丙酮、乙腈、乙醇、二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、醋酸。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述自組裝納米止血?jiǎng)┑闹苽浞椒?，其特征?所述聚合物溶液的濃 度在lmg/mL至IOOmg/mL之間，所述含羧基的疏水化合物的有機(jī)溶液的濃度在lmg/mL至 100mg/mL之間。8. 權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)所述自組裝納米止血?jiǎng)┑膽?yīng)用，其特征是:將所述納米止血?jiǎng)?外用于組織局部，或?qū)⒓{米止血?jiǎng)┯糜陟o脈注射。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述自組裝納米止血?jiǎng)┑膽?yīng)用，其特征是:所述外用包括噴灑、涂抹 或外敷。
【文檔編號(hào)】A61K31/421GK105943497SQ201610316487
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月11日
【發(fā)明人】張建祥, 成娟, 張相軍, 周興
【申請(qǐng)人】中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)