一種可在腫瘤部位特異性釋藥的載藥系統(tǒng)及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可在腫瘤部位特異性釋藥的載藥系統(tǒng)及其制備方法。所述載藥系統(tǒng)是指在包載有抗腫瘤藥物的含有二硫鍵且親水端羧基化的載藥聚合物膠束的親水端具有一層酸敏感無機鹽納米外殼。實驗表明：本發(fā)明所述的載藥系統(tǒng)可同時實現(xiàn)還原和酸的雙重響應性，只在腫瘤部位進行特異性釋藥，靶向性明顯，不僅解決了抗腫瘤藥物的溶解性，而且明顯提高了抗腫瘤藥物的生物利用度，對腫瘤細胞的毒性作用明顯、而對其它正常組織器官的毒副作用低，對腫瘤疾病的治療具有顯著價值。
【專利說明】
一種可在腫瘤部位特異性釋藥的載藥系統(tǒng)及其制備方法
技術領域
[0001]本發(fā)明是涉及一種可在腫瘤部位特異性釋藥的載藥系統(tǒng)及其制備方法，屬于靶向給藥技術領域。【背景技術】
[0002]腫瘤已經成為最重要的威脅人類生命健康的疾病之一。目前，治療腫瘤的方法主要有放射療法、手術切除法以及藥物化療。其中，藥物化療是治療腫瘤最為常用方法，但是傳統(tǒng)的給藥方式存在著很多不足。比如:大多數(shù)抗癌藥物在體內的半衰期短，在腫瘤部位的藥物濃度不足，導致治療效果不顯著;給予達到治療效果的劑量會對正常組織器官產生嚴重的毒副作用;抗癌藥具有水不溶性特點，血管給藥困難，生物利用度低。因此，抗癌藥物在臨床上的使用非常局限，有必要制備合適的載藥系統(tǒng)進行抗癌藥物的有效遞送。
[0003]聚合物膠束是目前常用的一種藥用納米載體，是由兩親性的嵌段共聚物在水中自組裝形成，具有粒徑小，載藥量高，可提高水難溶性藥物溶解度等優(yōu)點。但聚合物膠束經稀釋后穩(wěn)定性較差，尤其是經過血液的高度稀釋，在體循環(huán)中會提前釋藥，以致藥物生物利用度低。為了解決膠束穩(wěn)定性問題，有學者在膠束的表面進行化學交聯(lián)，此方法雖然能增加膠束的穩(wěn)定性，但會降低膠束在腫瘤部位的藥物釋放，導致腫瘤對藥物產生多藥耐藥問題。
[0004]另外，眾所周知，腫瘤部位組織有明顯的病理特征，例如:腫瘤部位血管豐富，血管壁間隙較寬，結構完整性差，淋巴回流缺失等，以致造成納米級粒子具有選擇性的高通透性和滯留性，這種現(xiàn)象也被稱作實體瘤組織的高通透性和滯留效應(EPR效應)；同時，腫瘤部位的血液供氧嚴重不足，細胞無氧呼吸使得乳酸和碳酸聚集造成微酸性環(huán)境，此外，缺氧會造成腫瘤內部谷胱甘肽等還原性物質的集聚產生較強的還原性微環(huán)境。因此，合理利用腫瘤部位的特定微環(huán)境，研發(fā)一種可以解決聚合物膠束在體內的穩(wěn)定性及其與腫瘤部位藥物釋放之間的矛盾問題的載藥系統(tǒng)，將對抗癌藥物的有效遞送具有重要意義。
【發(fā)明內容】
[0005]針對現(xiàn)有技術存在的上述問題和需求，本發(fā)明的目的是提供一種可在腫瘤部位特異性釋藥的載藥系統(tǒng)及其制備方法，為抗癌藥物提供一種有效遞送途徑。
[0006]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下:
[0007]—種可在腫瘤部位特異性釋藥的載藥系統(tǒng)，是指在包載有抗腫瘤藥物的含有二硫鍵且親水端羧基化的載藥聚合物膠束的親水端具有一層酸敏感無機鹽納米外殼。
[0008]所述的含有二硫鍵且親水端羧基化的載藥聚合物膠束，是由含有二硫鍵且親水端羧基化的聚合物膠束對抗腫瘤藥物進行包載得到;所述的含有二硫鍵且親水端羧基化的聚合物膠束是由含有二硫鍵且親水端羧基化的聚合物在去離子水中自組裝形成得到;所述的含有二硫鍵且親水端羧基化的聚合物是由具有羧基端基或可羧基化改性端基的親水聚合物與疏水有機物及含有二硫鍵的小分子化合物通過酰胺鍵或者酯鍵共聚形成的接枝共聚物。
[0009]所述的抗腫瘤藥物為疏水性抗腫瘤藥物，包括但不限于:紫杉烷類、環(huán)孢素類、黃酮類、喜樹堿類、長春堿類、蒽醌類、小檗堿類和鬼白毒素類抗腫瘤藥物。
[0010]所述的具有羧基端基或可羧基化改性端基的親水聚合物為多糖或氨基酸聚合物， 所述多糖包括但不限于:透明質酸、肝素、低分子肝素、脫硫酸化肝素、軟骨素、硫酸軟骨素、 海藻酸、葡萄糖、殼聚糖和真菌多糖;所述氨基酸聚合物包括但不限于:聚組氨酸和聚賴氨酸。
[0011]所述的疏水有機物包括但不限于:去氧膽酸、膽酸、膽醇、羧基化的膽醇、含2?18 個C的脂肪酸、含2?18個C的烷基胺和含2?18個C的烷基醇。
[0012]所述的含有二硫鍵的小分子化合物包括但不限于:胱胺、3,3’_二硫代二丙酸、2， 2’-二硫二乙醇、N，N’_雙(丙稀酰)胱胺、3,3’_二硫代雙(磺酸琥珀酰亞氨基丙酸酯)、3-(2_ 吡啶基二硫基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯、2-吡啶基二硫基乙基胺、胱胺酸丙烯酰胺、N，N’_ 雙(叔丁氧羰基)-L_胱氨酸、3,3’_二硫代丙亞氨酸二甲酯二鹽酸鹽、雙(2-甲基丙烯)乙氧基二硫和N-[ 2-(2-吡啶二硫)]乙基甲基酰胺。
[0013]所述的酸敏感無機鹽包括但不限于:磷酸鈣和碳酸鈣。
[0014]作為優(yōu)選方案，所述的含有二硫鍵且親水端羧基化的聚合物為去氧膽酸-胱胺-透明質酸接枝共聚物、辛酸_胱胺-透明質酸接枝共聚物、膽酸_胱胺-透明質酸接枝共聚物、膽酸-2，2 二硫二乙醇-透明質酸接枝共聚物或去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素接枝共聚物。 [0〇15]作為優(yōu)選方案，所述的酸敏感無機鹽納米外殼的厚度為5?15nm。
[0016]本發(fā)明所述的可在腫瘤部位特異性釋藥的載藥系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟:
[0017]a)制備含有二硫鍵且親水端羧基化的聚合物膠束；[〇〇18] b)制備包載抗腫瘤藥物的含有二硫鍵且親水端羧基化的載藥聚合物膠束；
[0019]C)調節(jié)步驟b)所得到的載藥聚合物膠束的pH值至7.0?7.4,然后以該載藥聚合物膠束為軟模板，利用離子間作用力，采用順序滴加法(sequential addit1n approach)在所述載藥聚合物膠束的親水端生成一層酸敏感無機鹽納米外殼。
[0020]進一步說，步驟a)所述聚合物膠束的制備是使含有二硫鍵且親水端羧基化的聚合物與去離子水在室溫下攪拌至形成膠束。[〇〇21]進一步說，步驟b)所述的載藥聚合物膠束的制備是先將抗腫瘤藥物用藥學上可接受溶劑進行溶解，然后與含有二硫鍵且親水端可羧基化的聚合物膠束進行超聲混合，再采用透析法除去有機溶劑，最后分離除去游離藥物。
[0022]進一步說，步驟c)所述的順序滴加法包括如下步驟:
[0023]①根據(jù)載藥聚合物膠束表面的羧基摩爾量，滴加適量以形成酸敏感無機鹽的陽離子源；
[0024]②根據(jù)所滴加的陽離子源的摩爾量，滴加適量以形成酸敏感無機鹽的陰離子源；
[0025]③反復交替滴加，以形成所需厚度的酸敏感無機鹽納米外殼。
[0026]作為優(yōu)選方案，所述酸敏感無機鹽為磷酸鈣或碳酸鈣，所述形成酸敏感無機鹽的陽離子源為鈣離子源，所述形成酸敏感無機鹽的陰離子源為磷酸根離子源或碳酸根離子源。
[0027]作為進一步優(yōu)選方案，所述鈣離子源選用硝酸鈣、氯化鈣或硫酸鈣，所述磷酸根離子源選用磷酸氫二鈉或磷酸氫二銨，所述碳酸根離子源選用碳酸鈉。
[0028]作為優(yōu)選方案，反復交替滴加的次數(shù)控制在6?18次。[〇〇29]實驗表明:本發(fā)明所述的載藥系統(tǒng)進入體內后，在正常生理pH下，保持穩(wěn)定，不釋放藥物，但到達腫瘤部位后，其親水端的酸敏感無機鹽納米外殼和內部的還原敏感鍵(二硫鍵)會被腫瘤部位的弱酸性和高還原性環(huán)境特異性裂解，致使藥物從所述載藥系統(tǒng)中釋放出來而作用于腫瘤部位，從而實現(xiàn)對腫瘤的靶向治療。
[0030]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下顯著性有益效果:
[0031]本發(fā)明通過先構建含有二硫鍵且親水端可羧基化的聚合物膠束，利用聚合物膠束對抗腫瘤藥物進行包載，然后在載藥聚合物膠束的親水端生成一層酸敏感無機鹽納米外殼，不僅可利用聚合物膠束所具有的粒徑小、載藥量高等優(yōu)點，而且可解決聚合物膠束所存在的穩(wěn)定性差、在體循環(huán)中會提前釋藥以致藥物生物利用度低等缺陷問題，尤其還可同時實現(xiàn)還原和酸的雙重響應性，使所述的載藥系統(tǒng)只在腫瘤部位進行特異性釋藥，靶向性明顯，不僅解決了抗腫瘤藥物的溶解性，而且明顯提高了抗腫瘤藥物的生物利用度，對腫瘤細胞的毒性作用明顯、而對其它正常組織器官的毒副作用低，對腫瘤疾病的治療具有顯著價值?！靖綀D說明】
[0032]圖1為實施例1所制備的載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)的動態(tài)光散射圖；
[0033]圖2為實施例1所制備的載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)在不同倍鏡下的透射電鏡圖(A、B);
[0034]圖3為實施例1所制備的載藥系統(tǒng)在不同倍鏡下的透射電鏡圖(A、B);[〇〇35]圖4為實施例1所制備的載藥系統(tǒng)的能譜圖；
[0036]圖5為實施例1所制備的載藥聚合物膠束和載藥系統(tǒng)的粒徑隨放置時間的變化曲線對比圖；
[0037]圖6為實施例1所制備的載藥聚合物膠束和載藥系統(tǒng)的光散射強度隨放置時間的變化曲線對比圖；
[0038]圖7為實施例1所制備的載藥系統(tǒng)的體外藥物釋放曲線；
[0039]圖8為實施例1所制備的載藥聚合物膠束和載藥系統(tǒng)在不同載藥濃度下的體外抗腫瘤作用對比圖；
[0040]圖9為實施例9所制備的載藥聚合物膠束和載藥系統(tǒng)在不同載藥濃度下的體外抗腫瘤作用對比圖?！揪唧w實施方式】
[0041]下面結合具體實施例和附圖進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0042]實施例1[〇〇43]1、胱胺改性透明質酸的制備:[〇〇44] 將0 ? 5mmo 1透明質酸(HA)溶于50mL、0 ? 01M、pH 7 ? 4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，然后加入2mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和0.4mmol N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)，在室溫下反應15分鐘；再加入5mmol胱胺(CYS)，在室溫下繼續(xù)反應4小時；將反應液密封于3500截留分子量透析袋內，在0.1M的氯化鈉溶液和去離子水中分別透析1天和2天， 并通過冷凍干燥，即得到胱胺改性透明質酸中間體。
[0045]2、去氧膽酸活化酯的制備:[〇〇46] 將lmmol去氧膽酸、1.2_〇1的二環(huán)己基碳化二亞胺(DDC)、1.2mmol N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶解在四氫呋喃(THF)中，在冰浴下反應30分鐘，然后在室溫下反應12小時；抽濾除去沉淀，用過量的冰正己烷沉淀，過濾，即得去氧膽酸活化酯。[〇〇47]3、去氧膽酸-胱胺-透明質酸接枝共聚物的制備:[〇〇48]按照去氧膽酸活化酯與胱胺透明質酸的摩爾比為0.08?0.25:1投料于甲酰胺中， 在室溫下反應24小時，結束反應，分別在體積比為1:1的乙醇與水的混合溶液中、去離子水中各透析1天和2天，并通過冷凍干燥，即得到去氧膽酸-胱胺-透明質酸接枝共聚物。
[0049]4、載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)的制備:
[0050]取36mg去氧膽酸-胱胺-透明質酸接枝共聚物溶解在10mL去離子水中，在室溫下攪拌15分鐘，得到聚合物膠束(去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)；[〇〇511另取抗腫瘤藥物紫杉醇(PTX)20mg溶解在600yL無水乙醇中，將所得藥物溶液與上述聚合物膠束(去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)進行混合，在室溫下攪拌30分鐘后進行超聲處理，超聲條件為冰浴下間歇式超聲(超聲3s停2s)、合計超聲30分鐘，然后用截留分子量為 3500的透析袋在去離子水中透析12小時，以除去乙醇，并在3500rpm下離心10分鐘，再過 〇.45wii濾膜以除去游離藥物，即得到載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)。
[0052]5、載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-PTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)的制備:
[0053]量取10mL載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)，調節(jié)載藥膠束的pH值至7.0，然后在室溫下以400rpm的轉速攪拌；
[0054]根據(jù)該膠束表面羧基的摩爾量(由所用透明質酸上的總羧基摩爾量減去被去氧膽酸所取代的羧基摩爾量)，按照鈣離子與羧基的摩爾比為1: 2滴加鈣離子源(0.1M的硝酸鈣水溶液)，攪拌30分鐘后再按照鈣離子與磷酸根離子的摩爾比為1.6:1滴加磷酸根離子源 (0.1M磷酸氫二鈉水溶液)，繼續(xù)攪拌30分鐘；反復交替滴加6?18次(根據(jù)所需生成的納米外殼的厚度進行控制)；[〇〇55]交替滴加結束，以400rpm的轉速攪拌30分鐘后，在室溫下靜置2小時，再進行透析、 過濾，即得到本發(fā)明所述的一種載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-PTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)。
[0056]對上述制備的載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)和載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-PTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)進行如下性能測試:[〇〇57] a)載藥量和包封率的測定:[〇〇58]用HPLC方法進行藥物含量測定，測定條件為:[0〇59]流動相為乙腈:水=55:45(>八)，色譜柱為1〇'〇11^8；[1(]18柱，流速為111117111；[11，檢測波長為227nm，柱溫為30°C，進樣量為20yL;分別以公式(1)、(2)計算載藥量和包封率:
[0060]載藥量(％ )=載藥聚合物膠束中的藥物量/載藥聚合物膠束的總量X100公式(1)
[0061]包封率(％ )=載藥聚合物膠束中的藥物量/投藥量X 100公式(2)[〇〇62]經測定:所制備的載藥聚合物膠束的包封率為87.69%，載藥量為30.15%，說明本發(fā)明所述的聚合物膠束可以很好的包載疏水性抗腫瘤活性藥物，可顯著增加疏水性抗腫瘤藥物的溶解度，進而有望提高其生物利用度。
[0063]b)粒徑測定:
[0064]將載藥聚合物膠束(PTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)用水稀釋5倍后，用 Zetasizer Nanoseries (Malvern，UK)在633nm、25 °C、He_Ne激光測定其粒徑，圖 1為本實施例所制備的載藥聚合物膠束(PTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)的動態(tài)光散射圖，由圖1 可見:本實施例所制備的載藥聚合物膠束(PTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)的粒徑在 129 ± 0.86nm，H) I (多分散性指數(shù))為:0.08 ± 0.014，H) I較小，表明載藥聚合物膠束的粒徑為納米級別且分布均勻;載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-PTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束) Zeta電位為-29 ? 9 ± 0 ? 42mV，呈電負性。[〇〇65]同法測定的粒徑及分布，結果顯示:所制備的載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-PTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)的粒徑為134.8 ± 0.5nm，PDI為0.11 ± 0.008，Zeta電位為-16.9 ± 1.17mV，相對于載藥聚合物膠束(PTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)，雖然粒徑有所增大，但仍為納米級別且分布均勻；另外，根據(jù)所制備的載藥系統(tǒng)的Zeta電位絕對值的明顯下降(由29.9降至16.9)，說明鈣離子與載藥聚合物膠束表面的負電位發(fā)生了結合。[〇〇66] c)透射電鏡觀察:[〇〇67]用分析型透射電鏡(JEM-2010，Japan)測試，測試條件為:加速電壓200kv、光源 La86、最小束斑1.5nm、放到倍率為50?120萬、點分辨率為0.25nm、樣品傾斜角度±40°、能譜分辨率136ev。
[0068]圖2為本實施例所制備的載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)在不同倍鏡下的透射電鏡圖(A、B)，由圖2可見:所制備的載藥聚合物膠束呈規(guī)則的圓球形，且大小均勻，形貌結構好；
[0069]圖3為本實施例所制備的載藥系統(tǒng)在不同倍鏡下的透射電鏡圖(A、B)，由圖3可見: 在沒有負染的情況下也能清晰看出粒子形態(tài)，表明在載藥聚合物膠束的表面含有無機物， 進而說明生成了無機鹽(磷酸鈣)納米外殼；
[0070]圖4為本實施例所制備的載藥系統(tǒng)的能譜圖，由圖4可見;在載藥系統(tǒng)表面的非晶體無機物的主要元素是鈣和磷，進而說明在載藥聚合物膠束的表面生成了無機鹽(磷酸鈣) 納米外殼。
[0071]d)穩(wěn)定性實驗:
[0072]分別將制備的載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)和載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-PTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)置于10%血清溶液中，置于37 °C恒溫水浴振搖箱內以120rpm振搖，分別在1、2、4、8、12、24、48、72、96、120h取樣，然后按步驟b)測定粒徑，觀察載藥聚合物膠束和載藥系統(tǒng)的粒徑及光散射強度的變化。
[0073]圖5為本實施例所制備的載藥聚合物膠束和載藥系統(tǒng)的粒徑隨放置時間的變化曲線對比圖；由圖5可見:隨著放置時間的延長，載藥聚合物膠束的粒徑由145.5nm增加至 215.2nm(增大了32.4%)，而載藥系統(tǒng)的粒徑由155.2nm增加至173.4nm(僅增加了 10.5%)， 說明本發(fā)明所述的載藥系統(tǒng)相對于載藥聚合物膠束，具有明顯的穩(wěn)定性。
[0074]圖6為本實施例所制備的載藥聚合物膠束和載藥系統(tǒng)的光散射強度隨放置時間的變化曲線對比圖；由圖6可見:隨著放置時間的延長，載藥聚合物膠束的光散射強度顯著降低(下降比率達64.2%)，而載藥系統(tǒng)的光散射強度沒有明顯降低(下降比率只有15.6%)， 這也說明本發(fā)明所述的載藥系統(tǒng)具有顯著的穩(wěn)定性。[〇〇75] e)體外藥物釋放實驗:[〇〇76]分別取lmL(0.2mg/mL)載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-PTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)密封于透析袋內(截留分子量為3500)，然后分別置于60mL如下4種釋放介質中:①還原釋放介質:含0.5 %吐溫-80和40mmol谷胱甘肽(GSH)的pH = 7.4的roS;②非還原釋放介質:含0.5 %吐溫-80的pH= 7.4的roS;③酸釋放介質:含0.5 %吐溫-80的pH= 5.0的roS;④ 還原和酸釋放介質:含0.5%吐溫-80和40mmol谷胱甘肽(GSH)的pH=5.0的PBS;再分別在37 °C條件下，以 120rpm 恒溫水浴振搖，在1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168、21611分別取樣，測定釋放出的PTX含量，然后計算藥物釋放比例，繪制各自的藥物釋放曲線。
[0077]圖7為本實施例所制備的載藥系統(tǒng)的體外藥物釋放曲線，由圖7可見:經過216小時，在pH=7.4的PBS中，所述載藥系統(tǒng)中的PTX的釋放量僅為34.08%，表明在生理環(huán)境下非常穩(wěn)定；而在pH = 5.0的PBS中，在24小時，載藥系統(tǒng)中的PTX的釋放量就達到36.1 %，在216 小時內，累積釋放量達到78.61%，表明該載藥系統(tǒng)具有明顯的酸敏感性釋藥行為，這是因為在酸性環(huán)境下，無機鹽(磷酸鈣)納米外殼發(fā)生溶蝕，以致載藥聚合物膠束暴露在外，從而發(fā)生了藥物較快釋放;在含40mmol GSH的pH=7.4的roS中，在216小時載藥系統(tǒng)中的PTX的累積釋放量約為67.7%，高于不含GSH的累積釋放量，表明該載藥系統(tǒng)還具有明顯的還原敏感性釋藥行為;并且，在酸和還原環(huán)境下(pH = 5.0的roS+40mmol GSH)，在216小時所述載藥系統(tǒng)中的PTX的累積釋放量達91.9%，釋放藥物最多，表明本發(fā)明所述載藥系統(tǒng)同時具有酸和還原雙敏感性釋藥行為。[〇〇78] f)對MDA-MB-231乳腺癌細胞的毒性試驗:[〇〇79] 將MDA-MB-231乳腺癌細胞接種在96孔板上，每孔約8000個細胞，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，加入指定濃度的載藥聚合物膠束和載藥系統(tǒng)，每組復6孔。于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48小時，棄去含藥培養(yǎng)基，PBS清洗，加MTS繼續(xù)孵育1小時，測定490nm的0D值。
[0080]癌細胞生存率按照公式(3)計算:
[0081] 癌細胞生存率(％)=實驗組0D值/對照組0D值X100公式(3)
[0082]圖8為本實施例所制備的載藥聚合物膠束和載藥系統(tǒng)在不同載藥濃度下的體外抗腫瘤作用對比圖，由圖8可見:在相同條件下，相較于載藥聚合物膠束，本發(fā)明所述的載藥系統(tǒng)可使癌細胞的存活率明顯降低，說明抗癌效果明顯。
[0083]實施例2[〇〇84] 1、胱胺改性透明質酸的制備:[〇〇85] 同實施例1中所述。
[0086] 2、去氧膽酸活化酯的制備:[〇〇87]同實施例1中所述。
[0088] 3、去氧膽酸-胱胺-透明質酸接枝共聚物的制備:[〇〇89]同實施例1中所述。
[0090] 4、載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)的制備:
[0091]同實施例1中所述。
[0092]5、載藥系統(tǒng)(碳酸鈣納米外殼-PTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)的制備:
[0093]量取10mL載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)，調節(jié)載藥膠束的pH值至7.0，然后在室溫下以400rpm的轉速攪拌；
[0094]根據(jù)該膠束表面羧基的摩爾量(由所用透明質酸上的總羧基摩爾量減去被去氧膽酸所取代的羧基摩爾量)，按照鈣離子與羧基的摩爾比為1:2滴加鈣離子源(0.045M的硝酸鈣水溶液)，攪拌1小時后再按照鈣離子與碳酸根離子的摩爾比為2:1滴加碳酸根離子源 (0.045M碳酸鈉水溶液)，繼續(xù)攪拌1小時;反復交替滴加6?18次(根據(jù)所需生成的納米外殼的厚度進行控制)；[〇〇95]交替滴加結束，以400rpm的轉速攪拌10小時后，在室溫下靜置2小時，再進行透析、 過濾，即得到本發(fā)明所述的又一種載藥系統(tǒng)(碳酸鈣納米外殼-PTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)。
[0096] 實施例3[〇〇97]1、胱胺改性透明質酸的制備:[〇〇98]同實施例1中所述。
[0099]2、辛酸-胱胺-透明質酸接枝共聚物的制備:
[0100]按照辛酸與1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺、胱胺改性的透明質酸的摩爾比為5:5:1投料于甲酰胺中，在室溫下反應24小時，結束反應，分別在體積比為1:1的乙醇與水的混合溶液中、去離子水中各透析1天和2天，并通過冷凍干燥，即得到辛酸-胱胺-透明質酸接枝共聚物。
[0101]3、載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-辛酸-胱胺-透明質酸膠束)的制備:
[0102]取60mg辛酸-胱胺-透明質酸接枝共聚物溶解在10mL去離子水中，在室溫下攪拌15 分鐘，得到聚合物膠束(辛酸-胱胺-透明質酸膠束)；
[0103]另取抗腫瘤藥物紫杉醇(PTX)20mg溶解在600yL無水乙醇中，將所得藥物溶液與上述聚合物膠束(辛酸_胱胺-透明質酸膠束)進行混合，在室溫下攪拌30分鐘后進行超聲處理，超聲條件為冰浴下間歇式超聲(超聲3s停2s)、合計超聲30分鐘，然后用截留分子量為 3500的透析袋在去離子水中透析12小時，以除去乙醇，并在3500rpm下離心10分鐘，再過 〇.45wii濾膜以除去游離藥物，即得到載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-辛酸-胱胺-透明質酸膠束)。
[0104]4、載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-PTX-辛酸-胱胺-透明質酸膠束)的制備:
[0105]量取10mL載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-辛酸-胱胺-透明質酸膠束)，調節(jié)載藥膠束的pH值至7.0，然后在室溫下以400rpm的轉速攪拌；
[0106]根據(jù)該膠束表面羧基的摩爾量(由所用透明質酸上的總羧基摩爾量減去被辛酸所取代的羧基摩爾量)，按照鈣離子與羧基的摩爾比為1: 2滴加鈣離子源(0.1M的硝酸鈣水溶液)，攪拌30分鐘后再按照鈣離子與磷酸根離子的摩爾比為1.6:1滴加磷酸根離子源(0.1M 磷酸氫二鈉水溶液)，繼續(xù)攪拌30分鐘;反復交替滴加6?18次(根據(jù)所需生成的納米外殼的厚度進行控制)；[〇1〇7]交替滴加結束，以400rpm的轉速攪拌1小時后，在室溫下靜置2小時，再進行透析、 過濾，即得到本發(fā)明所述的又一種載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-PTX-辛酸-胱胺-透明質酸膠束)。
[0108]實施例4
[0109]1、載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-辛酸-胱胺-透明質酸膠束)的制備:
[0110]同實施例3中所述。
[0111]2、載藥系統(tǒng)(碳酸鈣納米外殼-PTX-辛酸-胱胺-透明質酸膠束)的制備:
[0112]量取10mL載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-辛酸-胱胺-透明質酸膠束)，調節(jié)載藥膠束的pH值至7.0，然后在室溫下以400rpm的轉速攪拌；[〇113]根據(jù)該膠束表面羧基的摩爾量(由所用透明質酸上的總羧基摩爾量減去被辛酸所取代的羧基摩爾量)，按照鈣離子與羧基的摩爾比為1:2滴加鈣離子源(0.045M的硝酸鈣水溶液)，攪拌5小時后再按照鈣離子與碳酸根離子的摩爾比為2:1滴加碳酸根離子源(0.045M 碳酸鈉水溶液)，繼續(xù)攪拌5小時;反復交替滴加6?18次(根據(jù)所需生成的納米外殼的厚度進行控制)；
[0114]交替滴加結束，以400rpm的轉速攪拌10小時后，在室溫下靜置2小時，再進行透析、 過濾，即得到本發(fā)明所述的又一種載藥系統(tǒng)(碳酸鈣納米外殼-PTX-辛酸-胱胺-透明質酸膠束)。
[0115]實施例5
[0116]1、2，2 二硫二乙醇改性透明質酸的制備:
[0117]將0.5mmol透明質酸(HA)溶于50mL、0.01M、pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，然后加入2mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和0.4mmol N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)，在室溫下反應15分鐘;再加入5mmol 2,2’_二硫二乙醇，在室溫下繼續(xù)反應24小時； 結束反應，用丙酮將2,2’_二硫二乙醇改性透明質酸中間體沉淀出來，抽濾并密封于截留分子量為3500的透析袋內，在去離子水中透析2天，并冷凍干燥透析好的反應液，即得到2，2 ’-二硫二乙醇改性透明質酸中間體。
[0118]2、膽酸_2,2’_二硫二乙醇-透明質酸接枝共聚物的制備:
[0119]按照膽酸與1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺、2,2’_二硫二乙醇改性透明質酸的摩爾比為5:5:1溶于甲酰胺中，室溫反應24小時，結束反應，分別在乙醇:水(體積比1: 1)的混合溶液和去離子水中各透析1天和2天，冷凍干燥，即得到膽酸_2,2’_二硫二乙醇-透明質酸接枝共聚物。
[0120]3、載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-膽酸-2，2’_二硫二乙醇-透明質酸膠束)的制備:
[0121]取45mg膽酸-2，2’-二硫二乙醇-透明質酸接枝共聚物溶解在10mL去離子水中，在室溫下攪拌15分鐘，得到聚合物膠束(膽酸_2,2’_二硫二乙醇-透明質酸膠束)；
[0122]另取抗腫瘤藥物紫杉醇(PTX)20mg溶解在600此無水乙醇中，將所得藥物溶液與上述聚合物膠束(膽酸_2,2’_二硫二乙醇-透明質酸膠束)進行混合，在室溫下攪拌30分鐘后進行超聲處理，超聲條件為冰浴下間歇式超聲(超聲3s停2s)、合計超聲30分鐘，然后用截留分子量為3500的透析袋在去離子水中透析12小時，以除去乙醇，并在3500rpm下離心10分鐘，再過〇.45wii濾膜以除去游離藥物，即得到載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-膽酸_2,2’_二硫二乙醇-透明質酸膠束)。
[0123]4、載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-PTX-膽酸-2，2 二硫二乙醇-透明質酸膠束)的制備:
[0124]量取1mL載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-膽酸-2，2’_二硫二乙醇-透明質酸膠束)，調節(jié)載藥膠束的pH值至7.0，然后在室溫下以400rpm的轉速攪拌；
[0125]根據(jù)該膠束表面羧基的摩爾量(由所用透明質酸上的總羧基摩爾量減去被膽酸所取代的羧基摩爾量)，按照鈣離子與羧基的摩爾比為1: 2滴加鈣離子源(0.1M的硝酸鈣水溶液)，攪拌30分鐘后再按照鈣離子與磷酸根離子的摩爾比為1.6:1滴加磷酸根離子源(0.1M磷酸氫二鈉水溶液)，繼續(xù)攪拌30分鐘;反復交替滴加6?18次(根據(jù)所需生成的納米外殼的厚度進行控制)；
[0126]交替滴加結束，以400rpm的轉速攪拌30分鐘后，在室溫下靜置2小時，再進行透析、過濾，即得到本發(fā)明所述的又一種載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-PTX-膽酸-2，2’_二硫二乙醇-透明質酸膠束)。
[0127]實施例6
[0128]1、載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-膽酸-2，2’_二硫二乙醇-透明質酸膠束)的制備:
[0129]同實施例5中所述。
[0130]2、載藥系統(tǒng)(碳酸鈣納米外殼-PTX-膽酸-2，2’_二硫二乙醇-透明質酸膠束)的制備:
[0131]量取1mL載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-膽酸-2，2’_二硫二乙醇-透明質酸膠束)，調節(jié)載藥膠束的pH值至7.0，然后在室溫下以400rpm的轉速攪拌；
[0132]根據(jù)該膠束表面羧基的摩爾量(由所用透明質酸上的總羧基摩爾量減去被膽酸所取代的羧基摩爾量)，按照鈣離子與羧基的摩爾比為1:2滴加鈣離子源(0.045M的硝酸鈣水溶液)，攪拌5小時后再按照鈣離子與碳酸根離子的摩爾比為2:1滴加碳酸根離子源(0.045M碳酸鈉水溶液)，繼續(xù)攪拌5小時;反復交替滴加6?18次(根據(jù)所需生成的納米外殼的厚度進行控制)；
[0133]交替滴加結束，以400rpm的轉速攪拌10小時后，在室溫下靜置2小時，再進行透析、過濾，即得到本發(fā)明所述的又一種載藥系統(tǒng)(碳酸鈣納米外殼-PTX-膽酸-2，2’_二硫二乙醇-透明質酸膠束)。
[0134]實施例7
[0135]1、胱胺改性硫酸軟骨素的制備:
[0136]將0.171g硫酸軟骨素(CS)溶于150mL去離子水中，然后加入0.575g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和0.07g N-羥基琥珀酰亞胺，在室溫條件下反應30分鐘，再加入1.65g胱胺(CYS)，在室溫下繼續(xù)反應8小時;將反應液密封于截留分子量為3500的透析袋內，分別在0.1M的氯化鈉溶液和去離子水中各透析I天和2天，并冷凍干燥，即得到胱胺改性硫酸軟骨素中間體。
[0137]2、去氧膽酸活化酯的制備:
[0138]同實施例1中所述。
[0139]3、去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素接枝共聚物的制備:
[0140]按照去氧膽酸活化酯與胱胺改性硫酸軟骨素的摩爾比為0.08?0.25:1投料于甲酰胺中，在室溫下反應24小時，結束反應，分別在體積比為1:1的乙醇與水的混合溶液中、去離子水中各透析I天和2天，并通過冷凍干燥，即得到去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素接枝共聚物。
[0141]4、載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)的制備:
[0142]取36mg去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素接枝共聚物溶解在1mL去離子水中，在室溫下攪拌15分鐘，得到聚合物膠束(去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)；
[0143]另取抗腫瘤藥物紫杉醇(PTX)20mg溶解在600yL無水乙醇中，將所得藥物溶液與上述聚合物膠束(去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)進行混合，在室溫下攪拌30分鐘后進行超聲處理，超聲條件為冰浴下間歇式超聲(超聲3s停2s)、合計超聲30分鐘，然后用截留分子量為3500的透析袋在去離子水中透析12小時，以除去乙醇，并在3500rpm下離心10分鐘，再過
0.45μπι濾膜以除去游離藥物，即得到載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)。
[0144]5、載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-PTX-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)的制備:
[0145]量取1mL載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)，調節(jié)載藥膠束的pH值至7.0，然后在室溫下以400rpm的轉速攪拌；
[0146]根據(jù)該膠束表面羧基的摩爾量(由所用硫酸軟骨素上的總羧基摩爾量減去被去氧膽酸所取代的羧基摩爾量)，按照鈣離子與羧基的摩爾比為1: 2滴加鈣離子源(0.1M的硝酸鈣水溶液)，攪拌30分鐘后再按照鈣離子與磷酸根離子的摩爾比為1.6:1滴加磷酸根離子源(0.1M磷酸氫二鈉水溶液)，繼續(xù)攪拌30分鐘；反復交替滴加6?18次(根據(jù)所需生成的納米外殼的厚度進行控制)；
[0147]交替滴加結束，以400rpm的轉速攪拌30分鐘后，在室溫下靜置2小時，再進行透析、過濾，即得到本發(fā)明所述的一種載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-PTX-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)。
[0148]實施例8
[0149]1、載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)的制備:
[0150]同實施例7中所述。
[0151]2、載藥系統(tǒng)(碳酸鈣納米外殼-PTX-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)的制備:
[0152]量取1mL載藥聚合物膠束(紫杉醇(PTX)-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)，調節(jié)載藥膠束的pH值至7.0，然后在室溫下以400rpm的轉速攪拌；
[0153]根據(jù)該膠束表面羧基的摩爾量(由所用硫酸軟骨素上的總羧基摩爾量減去被去氧膽酸所取代的羧基摩爾量)，按照鈣離子與羧基的摩爾比為1:2滴加鈣離子源(0.045M的硝酸鈣水溶液)，攪拌3小時后再按照鈣離子與碳酸根離子的摩爾比為1.9:1滴加碳酸根離子源(0.045M碳酸鈉水溶液)，繼續(xù)攪拌5小時;反復交替滴加6?18次(根據(jù)所需生成的納米外殼的厚度進行控制)；
[0154]交替滴加結束，以400rpm的轉速攪拌8小時后，在室溫下靜置2小時，再進行透析、過濾，即得到本發(fā)明所述的一種載藥系統(tǒng)(碳酸鈣納米外殼-PTX-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)。
[0155]實施例9
[0156]1、胱胺改性透明質酸的制備:
[0157]同實施例1中所述。
[0158]2、去氧膽酸活化酯的制備:
[0159]同實施例1中所述。
[0160]3、去氧膽酸-胱胺-透明質酸接枝共聚物的制備:
[0161]同實施例1中所述。
[0162]4、載藥聚合物膠束(多烯紫杉醇(DTX)-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)的制備:
[0163]取36mg去氧膽酸-胱胺-透明質酸接枝共聚物溶解在1mL去離子水中，在室溫下攪拌15分鐘，得到聚合物膠束(去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)；
[0164]另取抗腫瘤藥物多烯紫杉醇(DTX)20mg溶解在600yL無水乙醇中，將所得藥物溶液與上述聚合物膠束(去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)進行混合，在室溫下攪拌30分鐘后進行超聲處理，超聲條件為冰浴下間歇式超聲(超聲3s停2s)、合計超聲30分鐘，然后用截留分子量為3500的透析袋在去離子水中透析12小時，以除去乙醇，并在3500rpm下離心10分鐘，再過0.45μπι濾膜以除去游離藥物，即得到載藥聚合物膠束(多烯紫杉醇(DTX)-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)。
[0165]5、載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-DTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)的制備:
[0166]量取1mL載藥聚合物膠束(多烯紫杉醇(DTX)-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)，調節(jié)載藥膠束的pH值至7.0，然后在室溫下以400rpm的轉速攪拌；
[0167]根據(jù)該膠束表面羧基的摩爾量(由所用透明質酸上的總羧基摩爾量減去被去氧膽酸所取代的羧基摩爾量)，按照鈣離子與羧基的摩爾比為1: 2滴加鈣離子源(0.1M的硝酸鈣水溶液)，攪拌30分鐘后再按照鈣離子與磷酸根離子的摩爾比為1.6:1滴加磷酸根離子源(0.1M磷酸氫二鈉水溶液)，繼續(xù)攪拌30分鐘；反復交替滴加6?18次(根據(jù)所需生成的納米外殼的厚度進行控制)；
[0168]交替滴加結束，以400rpm的轉速攪拌30分鐘后，在室溫下靜置2小時，再進行透析、過濾，即得到本發(fā)明所述的一種載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-DTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)。
[0169 ] 6)所制備的載藥聚合物膠束和載藥系統(tǒng)對MDA-MB-231乳腺癌細胞的毒性試驗:
[0170]將MDA-MB-231乳腺癌細胞接種在96孔板上，每孔約8000個細胞，使用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，加入指定濃度的載藥聚合物膠束和載藥系統(tǒng)，每組復6孔。于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48小時，棄去含藥培養(yǎng)基，PBS清洗，加MTS繼續(xù)孵育I小時，測定490nm的OD值。
[0171]癌細胞生存率按照公式(3)計算:
[0172]癌細胞生存率(% )=實驗組OD值/對照組OD值X 100公式(3)
[0173]圖9為本實施例所制備的載藥聚合物膠束和載藥系統(tǒng)在不同載藥濃度下的體外抗腫瘤作用對比圖，由圖9可見:在相同條件下，相較于載藥聚合物膠束，本發(fā)明所述的載藥系統(tǒng)可使癌細胞的存活率明顯降低，說明抗癌效果明顯。
[0174]實施例10
[0175]1、載藥聚合物膠束(多烯紫杉醇(DTX)-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)的制備:
[0176]同實施例9中所述。
[0177]2、載藥系統(tǒng)(碳酸鈣納米外殼-DTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)的制備:
[0178]量取1mL載藥聚合物膠束(多烯紫杉醇(DTX)-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)，調節(jié)載藥膠束的pH值至7.0，然后在室溫下以400rpm的轉速攪拌；
[0179]根據(jù)該膠束表面羧基的摩爾量(由所用透明質酸上的總羧基摩爾量減去被去氧膽酸所取代的羧基摩爾量)，按照鈣離子與羧基的摩爾比為1:2滴加鈣離子源(0.045M的硝酸鈣水溶液)，攪拌5小時后再按照鈣離子與碳酸根離子的摩爾比為2:1滴加碳酸根離子源(0.045M的碳酸鈉水溶液)，繼續(xù)攪拌5小時;反復交替滴加6?18次(根據(jù)所需生成的納米外殼的厚度進行控制)；
[0180]交替滴加結束，以400rpm的轉速攪拌10小時后，在室溫下靜置2小時，再進行透析、過濾，即得到本發(fā)明所述的一種載藥系統(tǒng)(碳酸鈣納米外殼-DTX-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)。
[0181]實施例11
[0182]1、去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素接枝共聚物的制備:
[0183]同實施例7中所述。
[0184]2、載藥聚合物膠束(多烯紫杉醇(DTX)-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)的制備:
[0185]取36mg去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素接枝共聚物溶解在1mL去離子水中，在室溫下攪拌15分鐘，得到聚合物膠束(去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)；
[0186]另取抗腫瘤藥物多烯紫杉醇(DTX)20mg溶解在600yL無水乙醇中，將所得藥物溶液與上述聚合物膠束(去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)進行混合，在室溫下攪拌30分鐘后進行超聲處理，超聲條件為冰浴下間歇式超聲(超聲3s停2s)、合計超聲30分鐘，然后用截留分子量為3500的透析袋在去離子水中透析12小時，以除去乙醇，并在3500rpm下離心10分鐘，再過0.45μπι濾膜以除去游離藥物，即得到載藥聚合物膠束(多烯紫杉醇(DTX)-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)。
[0187]3、載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-DTX-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)的制備:
[0188]量取1mL載藥聚合物膠束(多烯紫杉醇(DTX)-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)，調節(jié)載藥膠束的pH值至7.0，然后在室溫下以400rpm的轉速攪拌；
[0189]根據(jù)該膠束表面羧基的摩爾量(由所用硫酸軟骨素上的總羧基摩爾量減去被去氧膽酸所取代的羧基摩爾量)，按照鈣離子與羧基的摩爾比為1: 2滴加鈣離子源(0.1M的硝酸鈣水溶液)，攪拌30分鐘后再按照鈣離子與磷酸根離子的摩爾比為1.6:1滴加磷酸根離子源(0.1M磷酸氫二鈉水溶液)，繼續(xù)攪拌30分鐘；反復交替滴加6?18次(根據(jù)所需生成的納米外殼的厚度進行控制)；
[0190]交替滴加結束，以400rpm的轉速攪拌30分鐘后，在室溫下靜置2小時，再進行透析、過濾，即得到本發(fā)明所述的一種載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-DTX-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)。
[0191]實施例12
[0192]1、載藥聚合物膠束(多烯紫杉醇(DTX)-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)的制備:
[0193]同實施例11中所述。
[0194]2、載藥系統(tǒng)(碳酸鈣納米外殼-DTX-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)的制備:
[0195]量取1mL載藥聚合物膠束(多烯紫杉醇(DTX)-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)，調節(jié)載藥膠束的pH值至7.0，然后在室溫下以400rpm的轉速攪拌；
[0196]根據(jù)該膠束表面羧基的摩爾量(由所用硫酸軟骨素上的總羧基摩爾量減去被去氧膽酸所取代的羧基摩爾量)，按照鈣離子與羧基的摩爾比為1:2滴加鈣離子源(0.045M的硝酸鈣水溶液)，攪拌3小時后再按照鈣離子與碳酸根離子的摩爾比為2:1滴加碳酸根離子源(0.045M的碳酸鈉水溶液)，繼續(xù)攪拌3小時;反復交替滴加6?18次(根據(jù)所需生成的納米外殼的厚度進行控制)；
[0197]交替滴加結束，以400rpm的轉速攪拌8小時后，在室溫下靜置2小時，再進行透析、過濾，即得到本發(fā)明所述的一種載藥系統(tǒng)(碳酸鈣納米外殼-DTX-去氧膽酸-胱胺-硫酸軟骨素膠束)。
[0198]實施例13
[0199]1、去氧膽酸-胱胺-透明質酸接枝共聚物的制備:
[0200]同實施例1中所述。
[0201]2、載藥聚合物膠束(環(huán)孢素A-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)的制備:
[0202]取36mg去氧膽酸-胱胺-透明質酸接枝共聚物溶解在1mL去離子水中，在室溫下攪拌15分鐘，得到聚合物膠束(去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)；
[0203]另取抗腫瘤藥物環(huán)孢素A20mg溶解在600yL無水乙醇中，將所得藥物溶液與上述聚合物膠束(去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)進行混合，在室溫下攪拌30分鐘后進行超聲處理，超聲條件為冰浴下間歇式超聲(超聲3s停2s)、合計超聲30分鐘，然后用截留分子量為3500的透析袋在去離子水中透析12小時，以除去乙醇，并在3500rpm下離心10分鐘，再過
0.45μπι濾膜以除去游離藥物，即得到載藥聚合物膠束(環(huán)孢素A-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)。
[0204]3、載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-環(huán)孢素A-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)的制備:
[0205]量取1mL載藥聚合物膠束(環(huán)孢素A-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)，調節(jié)載藥膠束的pH值至7.0，然后在室溫下以400rpm的轉速攪拌；
[0206]根據(jù)該膠束表面羧基的摩爾量(由所用透明質酸上的總羧基摩爾量減去被去氧膽酸所取代的羧基摩爾量)，按照鈣離子與羧基的摩爾比為1: 2滴加鈣離子源(0.1M的硝酸鈣水溶液)，攪拌30分鐘后再按照鈣離子與磷酸根離子的摩爾比為1.6:1滴加磷酸根離子源(0.1M磷酸氫二鈉水溶液)，繼續(xù)攪拌30分鐘；反復交替滴加6?18次(根據(jù)所需生成的納米外殼的厚度進行控制)；
[0207]交替滴加結束，以400rpm的轉速攪拌30分鐘后，在室溫下靜置2小時，再進行透析、過濾，即得到本發(fā)明所述的一種載藥系統(tǒng)(磷酸鈣納米外殼-環(huán)孢素A-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)。
[0208]實施例14
[0209]1、載藥聚合物膠束(環(huán)孢素A-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)的制備:
[0210]同實施例13中所述。
[0211]2、載藥系統(tǒng)(碳酸鈣納米外殼-環(huán)孢素A-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)的制備:
[0212]量取1mL載藥聚合物膠束(環(huán)孢素A-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)，調節(jié)載藥膠束的pH值至7.0，然后在室溫下以400rpm的轉速攪拌；
[0213]根據(jù)該膠束表面羧基的摩爾量(由所用透明質酸上的總羧基摩爾量減去被去氧膽酸所取代的羧基摩爾量)，按照鈣離子與羧基的摩爾比為1:2滴加鈣離子源(0.045M的硝酸鈣水溶液)，攪拌6小時后再按照鈣離子與碳酸根離子的摩爾比為2:1滴加碳酸根離子源(0.045M的碳酸鈉水溶液)，繼續(xù)攪拌6小時;反復交替滴加6?18次(根據(jù)所需生成的納米外殼的厚度進行控制)；
[0214]交替滴加結束，以400rpm的轉速攪拌5小時后，在室溫下靜置2小時，再進行透析、過濾，即得到本發(fā)明所述的一種載藥系統(tǒng)(碳酸鈣納米外殼-環(huán)孢素A-去氧膽酸-胱胺-透明質酸膠束)。
[0215]最后需要在此指出的是:以上僅是本發(fā)明的部分優(yōu)選實施例，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領域的技術人員根據(jù)本發(fā)明的上述內容做出的一些非本質的改進和調整均屬于本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1.一種可在腫瘤部位特異性釋藥的載藥系統(tǒng)，其特征在于:在包載有抗腫瘤藥物的含 有二硫鍵且親水端羧基化的載藥聚合物膠束的親水端具有一層酸敏感無機鹽納米外殼。2.根據(jù)權利要求1所述的載藥系統(tǒng)，其特征在于:所述的含有二硫鍵且親水端羧基化的 載藥聚合物膠束是由含有二硫鍵且親水端羧基化的聚合物膠束對抗腫瘤藥物進行包載得 至IJ;所述的含有二硫鍵且親水端羧基化的聚合物膠束是由含有二硫鍵且親水端羧基化的聚 合物在去離子水中自組裝形成得到;所述的含有二硫鍵且親水端羧基化的聚合物是由具有 羧基端基或可羧基化改性端基的親水聚合物與疏水有機物及含有二硫鍵的小分子化合物 通過酰胺鍵或者酯鍵共聚形成的接枝共聚物。3.根據(jù)權利要求2所述的載藥系統(tǒng)，其特征在于:所述的具有羧基端基或可羧基化改性 端基的親水聚合物為多糖或氨基酸聚合物;所述多糖包括但不限于:透明質酸、肝素、低分 子肝素、脫硫酸化肝素、軟骨素、硫酸軟骨素、海藻酸、葡萄糖、殼聚糖和真菌多糖;所述氨基 酸聚合物包括但不限于:聚組氨酸和聚賴氨酸。4.根據(jù)權利要求2所述的載藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的疏水有機物包括但不限于:去 氧膽酸、膽酸、膽醇、羧基化的膽醇、含2?18個C的脂肪酸、含2?18個C的烷基胺和含2?18 個C的烷基醇。5.根據(jù)權利要求2所述的載藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的含有二硫鍵的小分子化合物包 括但不限于:胱胺、3,3’_二硫代二丙酸、2,2’_二硫二乙醇、N，N’_雙(丙稀酰)胱胺、3,3’_二 硫代雙(磺酸琥珀酰亞氨基丙酸酯)、3-(2_吡啶基二硫基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯、2-吡 啶基二硫基乙基胺、胱胺酸丙烯酰胺、N，N’_雙(叔丁氧羰基)-L-胱氨酸、3,3’_二硫代丙亞 氨酸二甲酯二鹽酸鹽、雙(2-甲基丙烯)乙氧基二硫和N-[2-(2-吡啶二硫)]乙基甲基酰胺。6.根據(jù)權利要求1所述的載藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的酸敏感無機鹽包括但不限于: 磷酸鈣和碳酸鈣。7.—種制備權利要求1或2所述載藥系統(tǒng)的方法，其特征在于，包括如下步驟:a)制備含有二硫鍵且親水端羧基化的聚合物膠束；b)制備包載抗腫瘤藥物的含有二硫鍵且親水端羧基化的載藥聚合物膠束；c)調節(jié)步驟b)所得到的載藥聚合物膠束的pH值至7.0?7.4,然后以該載藥聚合物膠束 為軟模板，利用離子間作用力，采用順序滴加法在所述載藥聚合物膠束的親水端生成一層 酸敏感無機鹽納米外殼。8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于:步驟a)所述聚合物膠束的制備是使含有二 硫鍵且親水端羧基化的聚合物與去離子水在室溫下攪拌至形成膠束。9.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于:步驟b)所述的載藥聚合物膠束的制備是先 將抗腫瘤藥物用藥學上可接受溶劑進行溶解，然后與含有二硫鍵且親水端可羧基化的聚合 物膠束進行超聲混合，再采用透析法除去有機溶劑，最后分離除去游離藥物。10.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟c)所述順序滴加法包括如下步驟:①根據(jù)載藥聚合物膠束表面的羧基摩爾量，滴加適量以形成酸敏感無機鹽的陽離子 源；②根據(jù)所滴加的陽離子源的摩爾量，滴加適量以形成酸敏感無機鹽的陰離子源；③反復交替滴加，以形成所需厚度的酸敏感無機鹽納米外殼。
【文檔編號】A61K47/02GK105943499SQ201610477917
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月27日
【發(fā)明人】謝燕, 鄧冰, 夏夢欣, 李 瑞, 李國文, 劉名玉, 辛雷, 李璐佳, 韓曉樂, 任淑珍
【申請人】上海中醫(yī)藥大學