一種青梅有效成分的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種青梅有效成分的提取方法，屬于中藥活性成分提取領(lǐng)域。為了克服現(xiàn)有技術(shù)中青梅提取物活性成分藥效較差的技術(shù)不足，本發(fā)明提供一種青梅有效成分的提取方法，該有效成分通過超臨界流體技術(shù)制備得到，其藥效活性強(qiáng)，特別是在抗腫瘤方面，其顯著優(yōu)于采用現(xiàn)有技術(shù)制備得到的青梅提取物，適合制備成相應(yīng)的藥物用于臨床。
【專利說明】
一種青梅有效成分的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種青梅有效成分的提取方法，屬于中藥活性成分提取領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 青梅為龍腦香科植物，多分布于我國福建、廣東、海南等省?！渡褶r(nóng)本草》記載，青梅 性味甘平，入肝、脾、肺、大腸經(jīng)，有收斂生津的作用。在民間長期用作殺菌消毒，治療肝炎及 提取中藥龍腦香。青梅是一種常見藥食兩用的植物?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，青梅具有消除疲 勞、抗腫瘤、改善腸胃功能、抗菌、抗過敏、保護(hù)肝臟等功效。
[0003] 海南青梅葉部分的80%乙醇提取物已證實(shí)具有良好抗氧化活性(尹文清，宋鑫明， 陳光英，等.青梅葉中多酚含量測定及抗氧化活性研究.食品安全與檢測，2009，34: 283-286)，但其活性成分是什么尚未確定；而其莖的粗提取物已經(jīng)被證實(shí)具有優(yōu)良抗HIVd-W 樸，陳光英，韓長日，等.藥用植物的提取物及其應(yīng)用CN102724990)、抗腫瘤(袁媛，王琳，田 麗美，等.MTT法篩選青梅對SPCA-I體外增殖抑制作用有效部位的研究，食品工業(yè)，2010，1: 10-11 )、抗炎(陳忠，楊燕，王天山，等.青梅和大葉魚骨木提取浸膏的抑菌活性.時(shí)珍國醫(yī)國 藥，2009，20:445-446)等活性。
[0004]中國專利申請201410412708.8公開了一種青梅提取物在卷煙中的應(yīng)用。將青梅洗 凈、去核后稱重，用5~10倍量的高粱酒浸泡，回流提取1~3小時(shí)后過濾，即得所需的青梅提 取物;將青梅提取物均勻地噴灑在煙絲上，并在恒溫恒濕條件下平衡24h;青梅中的有效成 分以及其特有的香氣在與煙絲復(fù)合后，能夠有效改善卷煙的品質(zhì)，提高卷煙的香氣質(zhì)。中國 專利申請200910014809.9公開了一種青梅花提取方法以及用途，其通過制備青梅花提取物 并將其與其他護(hù)膚成分復(fù)配，制得一種抗衰老護(hù)膚霜，并發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化并能促進(jìn)皮膚 細(xì)胞新陳代謝，延緩肌膚衰老的功效。中國專利申請201410210150.5公開了一種具有清除 自由基功能的海南青梅莖提取物及其制備方法，是在海南青梅莖的干燥粉末中加入有機(jī)溶 劑提取;提取液經(jīng)過濾、減壓濃縮得到總浸膏，加水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，減 壓回收分別得到石油醚部分、乙酸乙酯部分，所得乙酸乙酯部分經(jīng)氯仿與甲醇混合溶劑系 統(tǒng)梯度洗脫，其中體積比為100:30的氯仿與甲醇洗脫組分具有優(yōu)良的清除自由基活性，其 可應(yīng)用于抗氧化與清除自由基功能的保健食品、藥品和食品中。
[0005] 超臨界流體萃取(Supercritical Fluids Extraction，SFE)是利用超臨界狀態(tài)下 的流體作為萃取溶劑，從液體或固體物料中萃取出某種組分的一種新型分離技術(shù)。它克服 了傳統(tǒng)萃取法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、回收率低、污染嚴(yán)重、操作繁瑣等問題，特別是消除了有機(jī)溶劑對 人體和環(huán)境的危害，因此被喻為"綠色環(huán)保技術(shù)"，并已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品及香 料工業(yè)等領(lǐng)域。經(jīng)過20多年的發(fā)展，我國超臨界流體萃取技術(shù)取得了顯著成績，實(shí)現(xiàn)了從理 論研究、中小試水平向大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化的轉(zhuǎn)型，使其研究應(yīng)用同國際接軌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中青梅提取物活性成分藥效較差的技術(shù)不足，本發(fā)明提供一種 青梅有效成分的提取方法，該有效成分通過超臨界流體技術(shù)制備得到，其藥效活性強(qiáng)，特別 是在抗腫瘤方面，其顯著優(yōu)于采用現(xiàn)有技術(shù)制備得到的青梅提取物，適合制備成相應(yīng)的藥 物用于臨床。
[0007] 本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)效果：
[0008] -種青梅有效成分的提取方法，其具體包括如下步驟：
[0009] 1)預(yù)處理：將青梅葉洗凈曬干后粉碎成青梅粉后過20目篩，將青梅粉與夾帶劑 95%乙醇混合制備成提取溶液；
[0010] 2)超臨界萃取:將提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜內(nèi)輸入超臨界二氧化碳流 體，設(shè)置萃取釜壓力為20-25MPa，溫度為30-50°C，萃取時(shí)間為1.5-4h;
[0011] 3)有效成分分離:溶解有萃出物的超臨界二氧化碳流體經(jīng)減壓閥先后進(jìn)入分離釜 I和分離釜Π ，設(shè)置分離釜I壓力為7-8MPa，溫度為48-52°C，收集萃取液I;設(shè)置分離釜Π 壓 力為4-510^，溫度為34-36°(：，收集萃取液11;
[0012] 4)有效成分的濃縮與制備:合并萃取液I和萃取液Π 得到萃取液的混合液，采用旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至少量液體，50-60°C烘干成膏狀即可得到青梅有效成分。
[0013] 上述所述的青梅有效成分的提取方法中，所述的提取溶液中青梅粉與夾帶劑95% 乙醇的質(zhì)量比1:0.8-4,優(yōu)選為1:2.4。
[0014] 上述所述的青梅有效成分的提取方法中，所述的超臨界萃取工藝中二氧化碳的流 量為 30-35L/h。
[0015] 作為本發(fā)明所優(yōu)選的一種實(shí)施方式，所述的青梅有效成分的提取方法具體包括如 下步驟：
[0016] 將青梅葉洗凈曬干后粉碎成青梅粉后過20目篩，將青梅粉與夾帶劑95%乙醇混合 制備成提取溶液;將提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜內(nèi)輸入超臨界二氧化碳流體，設(shè)置 萃取釜壓力為23MPa，溫度為40°C，萃取時(shí)間為2.5h;溶解有萃出物的超臨界二氧化碳流體 經(jīng)減壓閥先后進(jìn)入分離釜I和分離釜Π ，設(shè)置分離釜I壓力為7.5MPa，溫度為50°C，收集萃取 液I;設(shè)置分離釜Π 壓力為4.5MPa，溫度為35°C，收集萃取液Π ;合并萃取液I和萃取液Π 得 到萃取液的混合液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至少量液體，55°C烘干成膏狀即可得到青梅有效 成分;其中所述的提取溶液中青梅粉與夾帶劑95%乙醇的質(zhì)量比1:2.4。
[0017] 本發(fā)明還請求保護(hù)按照上述提取工藝制備得到的青梅提取物。
[0018] 發(fā)明人將得到的青梅提取物進(jìn)行藥效動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)上述青梅提取物在藥效方面 均顯著優(yōu)于采用現(xiàn)有工藝制備得到的青梅提取物，尤其是在抗腫瘤方面，其藥效更為優(yōu)異。 基于此，本發(fā)明請求保護(hù)上述中藥提取物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
[0019] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益的技術(shù)效果：
[0020] 本發(fā)明青梅有效成分通過超流體萃取技術(shù)制備得到，其產(chǎn)品的純度高，產(chǎn)品的制 備工藝簡單，易于操作，具有很強(qiáng)的應(yīng)用前景。采用本發(fā)明所述的工藝制備得到的青梅提取 物的藥效活性強(qiáng)，特別是在抗腫瘤方面，顯著優(yōu)于采用現(xiàn)有技術(shù)制備得到的青梅提取物，適 合制備成相應(yīng)的藥物用于臨床。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面采用具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容。
[0022] 以下內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0023] 實(shí)施例1 一種青梅有效成分的提取方法
[0024] 所述的青梅有效成分的提取方法具體包括如下步驟：
[0025]將青梅葉洗凈曬干后粉碎成青梅粉后過20目篩，將青梅粉與夾帶劑95%乙醇混合 制備成提取溶液;將提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜內(nèi)輸入超臨界二氧化碳流體，設(shè)置 萃取釜壓力為20MPa，溫度為30°C，萃取時(shí)間為1.5h;溶解有萃出物的超臨界二氧化碳流體 經(jīng)減壓閥先后進(jìn)入分離釜I和分離釜Π ，設(shè)置分離釜I壓力為7MPa，溫度為48°C，收集萃取液 I;設(shè)置分離釜Π 壓力為4MPa，溫度為34°C，收集萃取液Π ;合并萃取液I和萃取液Π 得到萃 取液的混合液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至少量液體，50°C烘干成膏狀即可得到青梅有效成分； 其中所述的提取溶液中青梅粉與夾帶劑95%乙醇的質(zhì)量比1:0.8。
[0026] 實(shí)施例2-種青梅有效成分的提取方法
[0027] 所述的青梅有效成分的提取方法具體包括如下步驟：
[0028]將青梅葉洗凈曬干后粉碎成青梅粉后過20目篩，將青梅粉與夾帶劑95%乙醇混合 制備成提取溶液;將提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜內(nèi)輸入超臨界二氧化碳流體，設(shè)置 萃取釜壓力為25MPa，溫度為50°C，萃取時(shí)間為4h;溶解有萃出物的超臨界二氧化碳流體經(jīng) 減壓閥先后進(jìn)入分離釜I和分離釜Π ，設(shè)置分離釜I壓力為8MPa，溫度為52°C，收集萃取液I; 設(shè)置分離釜Π 壓力為5MPa，溫度為36°C，收集萃取液Π ;合并萃取液I和萃取液Π 得到萃取 液的混合液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至少量液體，60°C烘干成膏狀即可得到青梅有效成分;其 中所述的提取溶液中青梅粉與夾帶劑95%乙醇的質(zhì)量比1:4。
[0029] 實(shí)施例3-種青梅有效成分的提取方法
[0030] 所述的青梅有效成分的提取方法具體包括如下步驟：
[0031]將青梅葉洗凈曬干后粉碎成青梅粉后過20目篩，將青梅粉與夾帶劑95%乙醇混合 制備成提取溶液;將提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜內(nèi)輸入超臨界二氧化碳流體，設(shè)置 萃取釜壓力為23MPa，溫度為40°C，萃取時(shí)間為2.5h;溶解有萃出物的超臨界二氧化碳流體 經(jīng)減壓閥先后進(jìn)入分離釜I和分離釜Π ，設(shè)置分離釜I壓力為7.5MPa，溫度為50°C，收集萃取 液I;設(shè)置分離釜Π 壓力為4.5MPa，溫度為35°C，收集萃取液Π ;合并萃取液I和萃取液Π 得 到萃取液的混合液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至少量液體，55°C烘干成膏狀即可得到青梅有效 成分;其中所述的提取溶液中青梅粉與夾帶劑95%乙醇的質(zhì)量比1:2.4。
[0032] 實(shí)施例4 一種青梅有效成分的提取方法
[0033] 所述的青梅有效成分的提取方法具體包括如下步驟：
[0034]將青梅葉洗凈曬干后粉碎成青梅粉后過20目篩，將青梅粉與夾帶劑95%乙醇混合 制備成提取溶液;將提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜內(nèi)輸入超臨界二氧化碳流體，設(shè)置 萃取釜壓力為20MPa，溫度為50°C，萃取時(shí)間為2.5h;溶解有萃出物的超臨界二氧化碳流體 經(jīng)減壓閥先后進(jìn)入分離釜I和分離釜Π ，設(shè)置分離釜I壓力為7MPa，溫度為52°C，收集萃取液 I;設(shè)置分離釜Π 壓力為4MPa，溫度為36°C，收集萃取液Π ;合并萃取液I和萃取液Π 得到萃 取液的混合液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至少量液體，50°C烘干成膏狀即可得到青梅有效成分； 其中所述的提取溶液中青梅粉與夾帶劑95%乙醇的質(zhì)量比1:3。
[0035] 實(shí)施例5-種青梅有效成分的提取方法
[0036] 所述的青梅有效成分的提取方法具體包括如下步驟：
[0037]將青梅葉洗凈曬干后粉碎成青梅粉后過20目篩，將青梅粉與夾帶劑95%乙醇混合 制備成提取溶液;將提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜內(nèi)輸入超臨界二氧化碳流體，設(shè)置 萃取釜壓力為25MPa，溫度為30°C，萃取時(shí)間為3h;溶解有萃出物的超臨界二氧化碳流體經(jīng) 減壓閥先后進(jìn)入分離釜I和分離釜Π ，設(shè)置分離釜I壓力為8MPa，溫度為48°C，收集萃取液I; 設(shè)置分離釜Π 壓力為5MPa，溫度為34°C，收集萃取液Π ;合并萃取液I和萃取液Π 得到萃取 液的混合液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至少量液體，52°C烘干成膏狀即可得到青梅有效成分;其 中所述的提取溶液中青梅粉與夾帶劑95%乙醇的質(zhì)量比1:2。
[0038]對比實(shí)施例1按照CN 103961383A實(shí)施例所述的制備方法制備得到。
[0039] 海南青梅莖提取物的制備方法步驟如下：1)取海南青梅的莖于室溫陰干后粉碎， 過20-80目篩，然后加入甲醇、丙酮或50-95%的乙醇，室溫浸泡、加熱或超聲提取，提取時(shí)間 為60分鐘至7天，料液比為1:1~1:10;2)將提取液過濾、減壓回收得到總浸膏，加水混懸，依 次用石油醚、乙酸乙酯萃取，減壓回收分別得到石油醚部分和乙酸乙酯部分；乙酸乙酯部分 經(jīng)氯仿與甲醇混合溶劑體系(梯度為100:0、100:5、100:30、100:40、100:60和100:100，體積 比）進(jìn)行梯度洗脫，薄層色譜檢測合并相同組分，得6個(gè)組分A-F(A，100 :0;B，100:5;C，100: 30;D，100:40;E，100:60;F，100:100);
[0040] 對比實(shí)施例2按照CN 101536967B實(shí)施例1所述的制備工藝制備得到。
[0041] 1)青梅花提取物通過以下方法制備：1)C02超臨界提取青梅花的非極性成分:將含 水量彡1.5%干青梅花放入HA121-50-01型超臨界C02萃取釜中，通入35Mpa的C02,在60°C溫 度下循環(huán)動(dòng)態(tài)萃取2h;然后進(jìn)行減壓分離，分離溫度40°C，分離壓力4Mpa，得到青梅花中的 非極性成分;2)極性成分的提取:將1)步萃取殘?jiān)皿w積比為30%的乙醇，殘?jiān)c乙醇的重 量比為1:15,在80°C的溫度下熱回流提取2h;然后過濾得到濾液，在78°C溫度下蒸餾得青梅 花中的極性成分;3)將1)步和2)步所得非極性成分與極性成分混合。
[0042] 實(shí)施例6青梅活性成分的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究
[0043] 1、材料
[0044] 1.1 S18q小鼠腹水瘤細(xì)胞，由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供； RPMI-1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司；ICR小鼠4-6周，18-22g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù) 有限公司；
[0045] 1.2受試藥物及處理方法:實(shí)施例1-5、對比實(shí)施例1、對比實(shí)施例2所制備得到的青 梅提取物，采用生理鹽水溶解。
[0046] 2、方法
[0047] 2.1 S18q細(xì)胞株傳代培養(yǎng)方法
[0048]取體質(zhì)量(20±2)g健康ICR小鼠，將體外培養(yǎng)良好的S18q細(xì)胞用生理鹽水調(diào)節(jié)至濃 度為IX IO7個(gè)/mL，0.2mL/只注射入小鼠腹腔，每天攝取食、水。每日觀察，見腹部脹大，備 用。
[0049] 2.2腫瘤接種、給藥方法
[0050] 無菌條件下抽取生長良好傳代小鼠的腹水，生理鹽水清洗5遍，去除蛋白等雜質(zhì)， 用生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為I X IO7個(gè)/mL，0.2mL/只接種于常規(guī)皮膚消毒后的小鼠腋下。
[0051]將已成功接種的小鼠按體重隨機(jī)分組，將各組分按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量灌胃給藥，模型 組給予等劑量生理鹽水，1次/d。末次給藥24h后，小鼠稱重，處死小鼠剝?nèi)×鰤K，精密稱重。 [0052] 2.3數(shù)據(jù)處理方法
[0053]應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（X土 s)表示，P〈0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué) 差異。
[0054] 抑瘤率=(模型組平均瘤重一用藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重X 100%
[0055] 3、結(jié)果
[0056] 結(jié)果見表1。
[0057]表1抗腫瘤活性成分對S18q小鼠腋下實(shí)體瘤的抑瘤率（_γ±5)
[0059] 與模型組對照比較，*Ρ〈0.05,林？〈0.01;與對比實(shí)施例1組比較，卞〈0.05， #叩〈 0.01；
[0060] 與對比實(shí)施例2組比較，*P〈0.05，Mp〈0.01。
[0061] 本發(fā)明制備方法所得抗腫瘤活性部位能顯著降低S18q小鼠腋下實(shí)體瘤的瘤重，具 有顯著的抗腫瘤效果，與對比實(shí)施例相比較，其抗腫瘤效果更好。其中以實(shí)施例3所對應(yīng)的 的工藝的青梅提取物的抗腫瘤活性最強(qiáng)，為本發(fā)明的最優(yōu)實(shí)施例。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種青梅有效成分的提取方法，其具體包括如下步驟： 1) 預(yù)處理:將青梅葉洗凈曬干后粉碎成青梅粉后過20目篩，將青梅粉與夾帶劑95%乙 醇混合制備成提取溶液； 2) 超臨界萃取:將提取溶液置于萃取釜中，向萃取釜內(nèi)輸入超臨界二氧化碳流體，設(shè)置 萃取釜壓力為20-25MPa，溫度為30-50 °C，萃取時(shí)間為1 · 5-4h; 3) 有效成分分離:溶解有萃出物的超臨界二氧化碳流體經(jīng)減壓閥先后進(jìn)入分離釜I和 分離釜Π ，設(shè)置分離釜I壓力為7-8MPa，溫度為48-52°C，收集萃取液I;設(shè)置分離釜Π 壓力為 4-5MPa，溫度為34-36 °C，收集萃取液Π ; 4) 有效成分的濃縮與制備:合并萃取液I和萃取液Π 得到萃取液的混合液，采用旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀濃縮至少量液體，50-60°C烘干成膏狀即可得到青梅有效成分。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的青梅有效成分的提取方法，其特征在于，所述的提取溶液中青 梅粉與夾帶劑95%乙醇的質(zhì)量比1:0.8-4。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的青梅有效成分的提取方法，其特征在于，所述的提取溶液中青 梅粉與夾帶劑95 %乙醇的質(zhì)量比1:2.4。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的青梅有效成分的提取方法，其特征在于，所述的超臨界萃取工 藝中二氧化碳的流量為30_35L/h。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的青梅有效成分的提取方法，所述的青梅有效成分的提取方法 具體包括如下步驟： 將青梅葉洗凈曬干后粉碎成青梅粉后過20目篩，將青梅粉與夾帶劑95%乙醇混合制備 成提取溶液;將提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜內(nèi)輸入超臨界二氧化碳流體，設(shè)置萃取 釜壓力為23MPa，溫度為40°C，萃取時(shí)間為2.5h;溶解有萃出物的超臨界二氧化碳流體經(jīng)減 壓閥先后進(jìn)入分離釜I和分離釜Π ，設(shè)置分離釜I壓力為7.5MPa，溫度為50°C，收集萃取液I; 設(shè)置分離釜Π 壓力為4.5MPa，溫度為35°C，收集萃取液Π ;合并萃取液I和萃取液Π 得到萃 取液的混合液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至少量液體，55°C烘干成膏狀即可得到青梅有效成分。6. -種根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的青梅有效成分的提取方法制備得到青梅提取物。7. 權(quán)利要求6所述的青梅提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K36/185GK105943569SQ201610396795
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月6日
【發(fā)明人】錢書元, 鄒偉權(quán), 繆來耿
【申請人】惠州同富康生物科技有限公司