用于治療哮喘腎氣虛證藥物、動物模型及構(gòu)建使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于治療哮喘腎氣虛證藥物、動物模型及構(gòu)建使用方法,用于治療哮喘腎氣虛證的藥物的中藥組分由熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、苦參、天漿殼、牡丹皮、茯苓各12g、五味子5g、沉香片8g、旋覆花、黛蛤散、生黃芪各15g組成。本發(fā)明前期建立腎氣虛哮喘病證結(jié)合大鼠模型，并觀察到益腎喘寧湯聯(lián)合糖皮質(zhì)激素可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達來糾正Th1/Th2失衡；本發(fā)明以T細胞亞群的特異性轉(zhuǎn)錄因子、關(guān)鍵細胞因子和微小RNA為指標，證明腎氣虛哮喘發(fā)病與Treg/Th平衡的內(nèi)在機制，揭示中藥復(fù)方治療哮喘可能存在的多靶點多層次的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控機制。
【專利說明】
用于治療哮喘腎氣虛證藥物、動物模型及構(gòu)建使用方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于治療哮喘腎氣虛證藥物、動物模型 及構(gòu)建使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 支氣管哮喘（Bronchial asthma，簡稱哮喘）是全球最常見的慢性疾病之一，在西 方國家約有高達10%的成人和30%的兒童受此影響。全世界目前約有3億哮喘患者，患病率 以每年1 %左右的速度遞增，嚴重影響患者的日常生活和工作，給家庭和社會帶來沉重負 擔(dān)，因此對哮喘進行深入研究成為當(dāng)今全球性的重要課題。
[0003] 支氣管哮喘作為一種異質(zhì)性疾病，發(fā)病機制復(fù)雜多樣。近年來調(diào)節(jié)性T細胞(Treg) 和輔助性T細胞17(Thl7)的發(fā)現(xiàn)，修正了傳統(tǒng)的Thl/Th2失衡引起哮喘免疫應(yīng)答的致病理 論，揭示Treg與Th之間復(fù)雜關(guān)系是探索哮喘發(fā)病機制和治療方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。鑒于糖 皮質(zhì)激素治療哮喘的有效性和安全性等問題，探索中西醫(yī)聯(lián)合治療哮喘的方法有望獲得更 增效低毒的治療手段。
[0004] 支氣管哮喘發(fā)病中功能失調(diào)的T淋巴細胞亞群
[0005] 支氣管哮喘作為一種異質(zhì)性疾病，發(fā)病機制復(fù)雜多樣，目前認為與外周免疫耐受 機制存在缺陷有關(guān)，T淋巴細胞在哮喘免疫應(yīng)答中發(fā)揮著核心作用。
[0006] 傳統(tǒng)理論認為輔助性T淋巴細胞亞群(Th)功能失調(diào)，即Thl/Th2失衡一一Th2型優(yōu) 勢應(yīng)答，是支氣管哮喘病理過程形成的始動因素和維持因素。近年來發(fā)現(xiàn)Thl/Th2細胞失衡 機制并不能完全闡明哮喘的發(fā)生，調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)和Thl7的發(fā)現(xiàn)修正了上述觀念，認為 Treg與Thl7可能參與了哮喘的發(fā)病進程。Thl7關(guān)鍵分泌因子IL-17在哮喘患者肺組織、痰 液、肺泡灌洗液和血清中均增高，且和氣道高反應(yīng)性呈正相關(guān)。過敏性哮喘患兒痰液Treg低 于正常兒童;⑶4+⑶25+Treg可以抑制哮喘模型動物氣道嗜酸粒細胞的增多，減輕氣道炎癥。 Treg是機體對T細胞活化的一種負反饋調(diào)節(jié)機制，它既能影響Thl細胞，也能作用于Th2細 胞，還與Thl7細胞之間存在復(fù)雜的相互關(guān)系，揭示Treg和Th之間復(fù)雜關(guān)系是探索哮喘發(fā)病 機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，因此近年來成為研究的熱點。
[0007] 中醫(yī)對哮喘病認識很早，《內(nèi)經(jīng)》中雖無哮病，但有"喘鳴"的記載，此與哮喘相似。 中醫(yī)學(xué)認為："肺為氣之主，腎為氣之根"、"咳嗽在肺，其根在腎"，正是由于肺氣虛弱，衛(wèi)外 不固，或自身抵抗力下降，引發(fā)哮喘。臟腑虛損，精氣不足，迀延累及于腎。虛則肺不主氣，腎 不納氣，呼吸攝納無權(quán)而發(fā)喘息。所以，哮喘是正虛邪實、虛實夾雜的復(fù)雜病證。元代朱丹溪 首創(chuàng)"哮喘"病名，提出著名的"未發(fā)以扶正氣為主，既發(fā)以攻邪氣為急"的治療原則，一直被 后世作為治療哮喘的指導(dǎo)方針。根據(jù)多年臨床經(jīng)驗在七味都氣丸的基礎(chǔ)上，運用益腎喘寧 湯(熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、苦參、天漿殼、牡丹皮、茯苓、五味子、沉香片、旋覆花、黛蛤 散、生黃芪），以補肺腎治本，兼以化痰、行氣、活血，配合西藥治療哮喘，取得較好療效，減少 了患者對激素等的使用，加強了對哮喘的療效，體現(xiàn)了中醫(yī)"審證求因，治病求本"的理論， 是有效治療哮喘的根本所在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于治療哮喘腎氣虛證藥物、動物模型及構(gòu)建使用方 法，旨在解決目前缺少中西醫(yī)聯(lián)合治療哮喘藥物，及驗證該藥物在增效低毒的治療手段的 方法和使用方法的問題。
[0009] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種用于治療哮喘腎氣虛證的藥物，所述用于治療哮喘腎 氣虛證的藥物的中藥組分由熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、苦參、天漿殼、牡丹皮、茯苓各12g、 五味子5g、沉香片8g、旋覆花、黛蛤散、生黃苗各15g組成；西藥米用必可酮氣霧劑，每撳50μ 區(qū)，200欺/瓶。
[0010]本發(fā)明另一目的在于提供一種用于驗證用于治療哮喘腎氣虛證的藥物療效的哮 喘腎氣虛證動物模型的構(gòu)建方法，該哮喘腎氣虛證動物模型的構(gòu)建方法為：清潔級雄性 Wistar大鼠540只，體重200~250g。動物隨機分為正常對照組，哮喘模型對照組，腎氣虛哮 喘模型組，西藥組，中藥組，中西藥聯(lián)合組；
[0011]哮喘造模:除正常對照組外，各組大鼠采用卵清蛋白致敏法進行哮喘造模；
[0012]腎氣虛造模:除正常對照組、B孝喘模型對照組外，各組大鼠復(fù)合腎氣虛證造模。
[0013] 進一步，所述哮喘造模方法為：實驗第1天，用含有卵清蛋白lmg、氫氧化鋁凝膠 IOmg及滅活百日咳桿菌疫苗5 X IO8個的混合液Iml注入腹腔內(nèi)，令其致敏。正常組以生理鹽 水腹腔內(nèi)注射，2周后備用；第15天開始，將上述造模大鼠置于65cm X 45cm X 45cm大小的玻 璃罩內(nèi)，以1%的卵清蛋白超聲霧化吸入30min，激發(fā)哮喘，日1次，連續(xù)激發(fā)直至處死;正常 對照組用生理鹽水替代霧化吸入。
[0014] 進一步，所述腎氣虛造模：除正常對照組、哮喘模型對照組外，各組大鼠復(fù)合腎氣 虛證造模，具體方法:①實驗第1天開始，每日上午于同一時間置一安靜房間進行驚恐刺激， 每次lOmin，即放送有貓叫聲的磁帶，同時用梅花針叩擊大鼠20次/min，模擬貓抓拿攻擊大 鼠的情景，同時振動鼠籠;②每日下午將動物負重游泳:于大鼠尾根部纏繞重量為該大鼠體 重10%的保險絲，放入水深50cm、水溫20°C的水槽中游泳，以力竭為度一一大鼠鼻尖沒入水 面10s。日1次，共14天，即激發(fā)前一天。
[0015] 本發(fā)明另一目的在于提供一種利用哮喘腎氣虛證動物模型的構(gòu)建方法建立的動 物模型。
[0016] 本發(fā)明另一目的在于提供一種利用哮喘腎氣虛證動物模型的構(gòu)建方法建立的動 物模型的使用方法，所述使用方法包括：
[0017] 給藥及處理:西藥組、中藥組和中西藥聯(lián)合組大鼠于實驗第15天開始給藥；日給藥 劑量為：西藥組給必可酮50yg/只；中藥組給中藥2.0g/kg;中西藥組給相應(yīng)中藥2.0g/kg、必 可酮50yg/;正常對照組、哮喘模型組、腎虛哮喘模型組給生理鹽水灌胃；各組大鼠分別干預(yù) 15天處理，稱體重，眼球取血;腎氣虛哮喘模型組進行四診計量化指標進行氣虛程度評判；
[0018] 癥狀、體征觀察:觀察各組大鼠食量、皮毛、體重、活動量、懸尾抵抗力、游泳時間、 雙肺表現(xiàn)；
[0019]血清檢測:檢測甲狀腺素(T4)、皮質(zhì)醇(Cor)、睪酮⑴水平。
[0020] 病理學(xué)觀察:取部分肺組織行蘇木精--伊紅(HE)染色觀察。
[0021]支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢測白細胞分類和計數(shù):并采用EL ISA法檢測MLF離心 后上清液中細胞因子11-4、幾-5、11^-6、幾-1〇、幾-13、幾-17、正^丫、了6?-0等的含量。
[0022]肺組織檢測：取出肺臟組織的1/3,采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定法檢 測肺組織中T-bet、GATA-3、ROR γ t、Foxp3、IL-6、TGF-β等因子mRNA的表達水平；用免疫印跡 法(Western blot)檢測肺組織T-bet、GATA-3、ROR γ t、Foxp3、IL-6、TGF-β蛋白的表達水平。 取出另外肺組織的1/3，用于miRNA相關(guān)檢測；
[0023]脾組織檢測：分離脾臟中單個核細胞，固定，染FITC-CD4，然后破膜，分別加 Thl、 1112、11117和1'代8細胞的特異性抗體11^-4、正^丫、幾-174和?(《?3。孵育后重懸、上機檢測。
[0024] microRNA微陣列基因檢測:大鼠處死，肺臟被迅速分離置于凍存管，直接放入液氮 中冷凍，短時間內(nèi)完成整個操作。用MirVana microRNAisoIation kit按照說明書收集總 RNA。取適量RNA溶液，經(jīng)紫外分光光度計定量測定RNA樣品0D260和0D280值，計算RNA濃度。 1 %瓊脂糖電泳觀察總RNA，取2_5yg用Microcon centrifugal filter微離心過濾柱過濾， 得到片段小于300個核苷酸的小RNA。應(yīng)用Poly(A)聚合酶將小RNA的3'端加上poly(A)尾巴， 再連接一個寡聚核苷酸標記，用于后續(xù)的熒光標記。完成yParafloTM microRNA微陣列基因 表達實驗和分析:通過微循環(huán)栗雜交儀器在yParaf IoTM微流體芯片上過夜，使用含甲酸胺 SSPE緩沖液進行雜交，漂洗甩干，用激光掃描儀采集雜交圖象，Array-Pro軟件對雜交圖像 進行數(shù)字化轉(zhuǎn)換、數(shù)據(jù)處理和分析。計算兩組檢測到信號的比值和t檢驗的p值，以p〈0.01定 義為信號有顯著差異性，分析差異表達的位點。大鼠微陣列芯片包括目前報道的所有454個 microRNA，包含數(shù)據(jù)庫中所有的成熟microRNA和部分成熟microRNA的互補鏈;芯片上的檢 測探針均進行9個重復(fù)，實驗進行2次。
[0025] 實時焚光定量PCR檢測：用MirVana microRNAisolation kit按照說明書收集總 RNA，計算RNA濃度。特異逆轉(zhuǎn)錄引物從Taqman Mi croRNAAssays獲得，并用Taqman MicroRNAReverseTranscription Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行實時焚光定量PCR檢測，反應(yīng) 結(jié)束后用ABI Prism7900軟件分析結(jié)果。PCR實驗進行3次，用比較閾值循環(huán)方法分析數(shù)據(jù)， 得到Ct值，即熒光達到閾值所需的PCR循環(huán)數(shù)，并分析基因相對表達量。
[0026] 生物信息學(xué)預(yù)測:應(yīng)用miRanda、TargetScan和PicTar 3個生物信息學(xué)祀基因預(yù)測 軟件，對microRNA芯片結(jié)果中挑選出來的microRNA的革El基因做出預(yù)測；
[0027]統(tǒng)計學(xué)處理:根據(jù)資料的性質(zhì)、分布和設(shè)計特點，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進 行分析。
[0028]進一步，microRNA芯片的數(shù)據(jù)分析方法：
[0029] 使用GenePix Pro 6.0讀取芯片掃描圖像，并提取探針的信號值；
[0030] 相同的探針取中值合并，保留在所有樣品中均> = 30.0的探針，對全部芯片進行中 值標準化，篩選差異表達探針；
[0031 ] 使用Fold change和P-value篩選兩組樣品間的差異表達miRNA;
[0032] 使用Fold change篩選兩個樣品間的差異表達miRNAs;
[0033] 最后，對差異表達miRNAs進行聚類并繪制聚類圖。
[0034] 使用Fold change和P-value篩選兩組樣品間的差異表達miRNA中兩組樣品間有重 復(fù);使用Fold change篩選兩個樣品間的差異表達miRNAs中兩個樣品間沒有重復(fù)。
[0035] 本發(fā)明另一目的在于提供一種1111、1112、11117、1'代8測定方法，所述1111、1112、11117、 Treg測定方法為：
[0036] 采用流式細胞儀測定脾組織中的1111、1112、11117、1^叫的含量，對各用藥組1111/1112 和Thl7/Treg均值統(tǒng)計學(xué)分析。
[0037] 本發(fā)明前期建立腎氣虛哮喘病證結(jié)合大鼠模型，并觀察到益腎喘寧湯聯(lián)合糖皮質(zhì) 激素可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達來糾正Thl/Th2失衡，本發(fā)明在前期工作基礎(chǔ)上，以T細胞 亞群(1111、1112、11117、1>叩）的特異性轉(zhuǎn)錄因子、關(guān)鍵細胞因子和微小1?^為指標，證明腎氣 虛哮喘發(fā)病與Treg/Th平衡的內(nèi)在機制，揭示中藥復(fù)方治療哮喘可能存在的多靶點多層次 的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控機制。
[0038] 本發(fā)明通過篩選、預(yù)測腎氣虛哮喘模型組與哮喘模型對照組肺部差異化表達miRs 和靶因子及其相互關(guān)系，揭示了分子水平上腎氣虛證本質(zhì)的部分科學(xué)內(nèi)涵。證明了證候的 宏觀表型與微觀生物分子之間的復(fù)雜關(guān)系。
[0039]目前尚未見在哮喘發(fā)病分析中對1111、1112、11117、1>叩進行多角度通盤考慮。因此 本發(fā)明從Treg/Th失衡分析了哮喘發(fā)病機制。
[0040] 模型上:成功的哮喘動物模型對哮喘病因及發(fā)病機理研究中有十分重要的意義。 在中醫(yī)理論指導(dǎo)下建立了接近臨床癥候的腎氣虛哮喘病證結(jié)合模型，比目前單純哮喘模型 更符合中醫(yī)理論，也更利于在腎氣虛哮喘模型上探索方證相對的益腎喘寧湯治療哮喘的機 理；
[0041] 探索方法上:microRNA廣泛參與祀mRNA的沉默調(diào)控，并且是多靶點多層次網(wǎng)絡(luò)式 調(diào)控，常在生長發(fā)育和疾病過程中呈現(xiàn)時空式表達。適合對中醫(yī)證型的研究。本發(fā)明應(yīng)用 miR技術(shù)對腎氣虛證本質(zhì)的科學(xué)內(nèi)涵作一些有益的探索，為多種疾病的診斷和治療提供新 的思路。
【附圖說明】
[0042] 圖1是本發(fā)明實施例提供的哮喘腎氣虛證動物模型的構(gòu)建方法流程圖。
[0043]圖2是本發(fā)明實施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果正常組圖。
[0044] 圖3是本發(fā)明實施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果哮喘模型組圖。
[0045] 圖4是本發(fā)明實施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果腎氣虛哮喘模型組圖。
[0046] 圖5是本發(fā)明實施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果中西藥組圖。
[0047]圖6是本發(fā)明實施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果西藥組圖。
[0048]圖7是本發(fā)明實施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果中藥組圖。
【具體實施方式】
[0049] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明 進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0050] 下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步描述。
[0051 ] 一種用于治療哮喘腎氣虛證的藥物，所述用于治療哮喘腎氣虛證的藥物的中藥組 分由熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、苦參、天衆(zhòng)殼、牡丹皮、茯苳各12g、五味子5g、沉香片8g、旋 覆花、黛蛤散、生黃芪各15g組成;西藥采用必可酮氣霧劑，每撳50yg，200撳/瓶。
[0052]本發(fā)明另一目的在于提供一種用于驗證用于治療哮喘腎氣虛證的藥物療效的哮 喘腎氣虛證動物模型的構(gòu)建方法，如圖1所示，該哮喘腎氣虛證動物模型的構(gòu)建方法為：
[0053] S101:清潔級雄性Wistar大鼠540只，體重200~250g，動物隨機分為正常對照組， 哮喘模型對照組，腎氣虛哮喘模型組，西藥組，中藥組，中西藥聯(lián)合組；
[0054] S102:哮喘造模:除正常對照組外，各組大鼠采用卵清蛋白致敏法進行哮喘造模；
[0055] S103:腎氣虛造模：除正常對照組、哮喘模型對照組外，各組大鼠復(fù)合腎氣虛證造 模。
[0056] 進一步，所述哮喘造模方法為：實驗第1天，用含有卵清蛋白lmg、氫氧化鋁凝膠 IOmg及滅活百日咳桿菌疫苗5 X IO8個的混合液Iml注入腹腔內(nèi)，令其致敏。正常組以生理鹽 水腹腔內(nèi)注射，2周后備用；第15天開始，將上述造模大鼠置于65cm X 45cm X 45cm大小的玻 璃罩內(nèi)，以1%的卵清蛋白超聲霧化吸入30min，激發(fā)哮喘，日1次，連續(xù)激發(fā)直至處死;正常 對照組用生理鹽水替代霧化吸入。
[0057]進一步，所述腎氣虛造模：除正常對照組、哮喘模型對照組外，各組大鼠復(fù)合腎氣 虛證造模，具體方法:①實驗第1天開始，每日上午于同一時間置一安靜房間進行驚恐刺激， 每次lOmin，即放送有貓叫聲的磁帶，同時用梅花針叩擊大鼠20次/min，模擬貓抓拿攻擊大 鼠的情景，同時振動鼠籠;②每日下午將動物負重游泳:于大鼠尾根部纏繞重量為該大鼠體 重10%的保險絲，放入水深50cm、水溫20°C的水槽中游泳，以力竭為度一一大鼠鼻尖沒入水 面10s。日1次，共14天，即激發(fā)前一天。
[0058]本發(fā)明另一目的在于提供一種利用哮喘腎氣虛證動物模型的構(gòu)建方法建立的動 物模型。
[0059]本發(fā)明另一目的在于提供一種利用哮喘腎氣虛證動物模型的構(gòu)建方法建立的動 物模型的使用方法，所述使用方法包括：
[0060] 給藥及處理:西藥組、中藥組和中西藥聯(lián)合組大鼠于實驗第15天開始給藥；日給藥 劑量為：西藥組給必可酮50yg/只；中藥組給中藥2.0g/kg;中西藥組給相應(yīng)中藥2.0g/kg、必 可酮50yg/;正常對照組、哮喘模型組、腎虛哮喘模型組給生理鹽水灌胃；各組大鼠分別干預(yù) 15天處理，稱體重，眼球取血;腎氣虛哮喘模型組進行四診計量化指標進行氣虛程度評判；
[0061] 癥狀、體征觀察:觀察各組大鼠食量、皮毛、體重、活動量、懸尾抵抗力、游泳時間、 雙肺表現(xiàn)；
[0062] 指標檢測：四診計量化所觀察的指標及氣虛判定：用電腦播放曠場錄像，記錄各個 動物水平跨格數(shù)和前肢離地站立次數(shù)。用YLS-13A型大、小鼠抓力測定儀檢測抓力。氣虛程 度=各動物水平移動實測值/正常組均數(shù)X 〇. 3+各動物直立次數(shù)/正常組均數(shù)X 0.2+各動 物抓力實測值/正常組均數(shù)X 〇 . 5。辨證標準：與正常組比較，大于1.25為氣盛，小于0.75為 氣虛。
[0063] 血清檢測:檢測甲狀腺素(T4)、皮質(zhì)醇(Cor)、睪酮(T)水平。
[0064]病理學(xué)觀察:取部分肺組織行蘇木精一伊紅(HE)染色觀察。
[0065]支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢測白細胞分類和計數(shù):并采用EL ISA法檢測MLF離心 后上清液中細胞因子11-4、幾-5、11^-6、幾-1〇、幾-13、幾-17、正^丫、了6?-0等的含量。
[0066]肺組織檢測：取出肺臟組織的1/3,采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定法檢 測肺組織中T-bet、GATA-3、ROR γ t、Foxp3、IL-6、TGF-β等因子mRNA的表達水平；用免疫印跡 法(Western blot)檢測肺組織T-bet、GATA-3、ROR γ t、Foxp3、IL-6、TGF-β蛋白的表達水平。 取出另外肺組織的1/3，用于miRNA相關(guān)檢測；
[0067]脾組織檢測：分離脾臟中單個核細胞，固定，染FITC-CD4，然后破膜，分別加 Thl、 1112、11117和1'代8細胞的特異性抗體11^-4、正^丫、幾-174和?(《?3。孵育后重懸、上機檢測。
[0068] microRNA微陣列基因檢測:大鼠處死，肺臟被迅速分離置于凍存管，直接放入液氮 中冷凍，短時間內(nèi)完成整個操作。用MirVana microRNAisoIation kit按照說明書收集總 RNA。取適量RNA溶液，經(jīng)紫外分光光度計定量測定RNA樣品0D260和0D280值，計算RNA濃度。 1 %瓊脂糖電泳觀察總RNA，取2_5yg用Microcon centrifugal filter微離心過濾柱過濾， 得到片段小于300個核苷酸的小RNA。應(yīng)用Poly(A)聚合酶將小RNA的3'端加上poly(A)尾巴， 再連接一個寡聚核苷酸標記，用于后續(xù)的熒光標記。完成yParafloTM microRNA微陣列基因 表達實驗和分析:通過微循環(huán)栗雜交儀器在yParaf IoTM微流體芯片上過夜，使用含甲酸胺 SSPE緩沖液進行雜交，漂洗甩干，用激光掃描儀采集雜交圖象，Array-Pro軟件對雜交圖像 進行數(shù)字化轉(zhuǎn)換、數(shù)據(jù)處理和分析。計算兩組檢測到信號的比值和t檢驗的p值，以p〈0.01定 義為信號有顯著差異性，分析差異表達的位點。大鼠微陣列芯片包括目前報道的所有454個 microRNA，包含數(shù)據(jù)庫中所有的成熟microRNA和部分成熟microRNA的互補鏈;芯片上的檢 測探針均進行9個重復(fù)，實驗進行2次。
[0069] 實時焚光定量PCR檢測：用MirVana microRNAisolation kit按照說明書收集總 RNA，計算RNA濃度。特異逆轉(zhuǎn)錄引物從Taqman Mi croRNAAssays獲得，并用Taqman MicroRNAReverseTranscription Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行實時焚光定量PCR檢測，反應(yīng) 結(jié)束后用ABI Prism7900軟件分析結(jié)果。PCR實驗進行3次，用比較閾值循環(huán)方法分析數(shù)據(jù)， 得到Ct值，即熒光達到閾值所需的PCR循環(huán)數(shù)，并分析基因相對表達量。
[0070] 生物信息學(xué)預(yù)測：應(yīng)用miRanda、TargetScan和PicTar 3個生物信息學(xué)革E基因預(yù)測 軟件，對microRNA芯片結(jié)果中挑選出來的microRNA的革El基因做出預(yù)測；
[0071] 統(tǒng)計學(xué)處理:根據(jù)資料的性質(zhì)、分布和設(shè)計特點，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進 行分析。
[0072] microRNA芯片的數(shù)據(jù)分析方法：
[0073]使用GenePix Pro 6.0讀取芯片掃描圖像，并提取探針的信號值；
[0074] 相同的探針取中值合并，保留在所有樣品中均> = 30.0的探針，對全部芯片進行中 值標準化，篩選差異表達探針；
[0075] 使用Fold change和P-value篩選兩組樣品間（有重復(fù)）的差異表達miRNA;
[0076] 使用Fold change篩選兩個樣品間（沒有重復(fù))的差異表達miRNAs;
[0077] 最后，對差異表達miRNAs進行聚類并繪制聚類圖。
[0078] 本發(fā)明前期建立腎氣虛哮喘病證結(jié)合大鼠模型，并觀察到益腎喘寧湯聯(lián)合糖皮質(zhì) 激素可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達來糾正Thl/Th2失衡，本發(fā)明在前期工作基礎(chǔ)上，以T細胞 亞群(1111、1112、11117、1>叩）的特異性轉(zhuǎn)錄因子、關(guān)鍵細胞因子和微小1?^為指標，證明腎氣 虛哮喘發(fā)病與Treg/Th平衡的內(nèi)在機制，揭示中藥復(fù)方治療哮喘可能存在的多靶點多層次 的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控機制。
[0079] 本發(fā)明通過篩選、預(yù)測腎氣虛哮喘模型組與哮喘模型對照組肺部差異化表達miRs 和靶因子及其相互關(guān)系，揭示了分子水平上腎氣虛證本質(zhì)的部分科學(xué)內(nèi)涵。證明了證候的 宏觀表型與微觀生物分子之間的復(fù)雜關(guān)系。
[0080] 本發(fā)明理論上:近年來發(fā)現(xiàn)Thl/Th2細胞失衡機制并不能完全闡明哮喘的發(fā)生，自 從發(fā)現(xiàn)Treg和Thl7后，提示Treg/Thl7細胞失衡可能在其中扮演了重要角色，但目前尚未見 在哮喘發(fā)病研究中對!111、1112、11117、1^叫進行多角度通盤考慮。因此本發(fā)明從1^叩/111失衡 探討了哮喘發(fā)病機制；
[0081] 模型上:成功的哮喘動物模型對哮喘病因及發(fā)病機理研究中有十分重要的意義。 在中醫(yī)理論指導(dǎo)下建立了接近臨床癥候的腎氣虛哮喘病證結(jié)合模型，比目前單純哮喘模型 更符合中醫(yī)理論，也更利于在腎氣虛哮喘模型上探索方證相對的益腎喘寧湯治療哮喘的機 理；
[0082] 探索方法上:microRNA廣泛參與祀mRNA的沉默調(diào)控，并且是多靶點多層次
[0083]網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控，常在生長發(fā)育和疾病過程中呈現(xiàn)時空式表達。適合對中醫(yī)證型的發(fā) 明。本發(fā)明應(yīng)用HliR技術(shù)對腎氣虛證本質(zhì)的科學(xué)內(nèi)涵作一些有益的探索，為多種疾病的診斷 和治療提供新的思路。
[0084] 本發(fā)明提供一種1111、1112、11117、1^8測定方法，所述1111、1112、11117、1^8測定方法 為：
[0085] 采用流式細胞儀測定脾組織中的1111、1112、11117、1^叫的含量，對各用藥組1111/1112 和Thl7/Treg均值統(tǒng)計學(xué)分析。
[0086]下面結(jié)合具體分析對本發(fā)明進一步說明。
[0087] 一、篩選micRNA的結(jié)果
[0088] 1.哮喘模型組、腎哮組、正常組之間的miRNA篩查結(jié)果
[0089] 1.1哮喘組與正常組比較，F(xiàn)old chang大于3倍或小于0.33倍，且P-value
[0090] 小于0 · 05的micRNA有13項，見下表1，3個上調(diào)，10個下調(diào)，其中rn〇-miR-370-3p下 調(diào)達7倍以上。
[0091] 表1哮喘組與正常組比較
[0092] Name Fold change P-value
[0093] rn〇-miR-450a-5p 3.672907474 0.030700678
[0094] rn〇-miR-181c-5p 3.180354232 0.008559343
[0095] rn〇-let-7a-1-3p/rn〇-let-7c-2-3p 3.263503027 0.018867658
[0096] rn〇-miR-291a-5p 0.253366323 0.001651507
[0097] rn〇-miR-652-5p 0.276631295 0.002304921
[0098] rn〇-miR-370-3p 0.129882271 0.029640336
[0099] rn〇-miR-292-5p 0.302037645 0.007247725
[0100] rn〇-miR-465-3p 0.278758669 0.008775467
[0101] rn〇-miR-667-3p 0.276021935 0.045812777
[0102] rn〇-miR-331-5p 0.276273909 0.006955694
[0103] rn〇-miR-487b-5p 0.319087445 0.039504933
[0104] rno-miR-2985 0.223001768 0.000262881
[0105] rn〇-miR-3573-3p 0.292860106 0.037137704
[0106] 1.2腎哮組與正常組比較，F(xiàn)old chang大于3倍或小于0.33倍，且P-value小于0.05 的micRNA有2項，見下表2，2個上調(diào)，其中rn〇-miR-450a-5p與哮喘組相似，均上調(diào)。
[0107] 表2腎哮組與正常組比較
[0108] Name Fold change P-value
[0109] rn〇-miR-27b-3p 2.195809383 0.013101224
[0110] rn〇-miR-450a-5p 3.339141265 0.012433015
[0111] 3.腎哮組與哮喘組比較，F(xiàn)old chang大于3倍或小于0.33倍的micRNA有8項，見下 表3,6個上調(diào)，2個下調(diào)，其中111〇-111丨1?-488-5口上調(diào)13倍以上，1'11〇-111丨1?-1-3口下調(diào)達28倍。
[0112] 表3腎哮組與哮喘組比較
[0113] Name Fold change P-value
[0114] rn〇-miR-3596d 3.372381099 0.329809835
[0115] rn〇-miR-653-3p 6.099956147 0.343530206
[0116] rn〇-miR-370-3p 3.732235481 0.403736101
[0117] rn〇-miR-3557-5p 4.210096767 0.307129158
[0118] rn〇-miR-344a-5p 3.646240471 0.292299088
[0119] rn〇-miR-488-5p 13.2511768 0.298227266
[0120] rn〇-miR-133a-3p 0.35730468 0.346101851
[0121] rn〇-miR-1-3p 0.035765059 0.367075199
[0122] 由于樣本含量較少，腎哮組與哮喘組盡管P值均大于0.05，但生物學(xué)差異明顯，可 做進一步分析。
[0123] 2.西藥組、中藥組、中西藥組之間miRNA篩查結(jié)果：
[0124] 2 · 1中藥組與西藥組比較，F(xiàn)old chang大于3倍或小于0 · 33倍，且P-value小于0 · 05 的micRNA中有23個上調(diào)，19個下調(diào)（略），其中rn〇-miR-487b-3p高達300多倍，rno-miR-376b-3p高達60倍，還有7個miRNA差異表達高達10倍以上。
[0125] 2.2中西藥組與西藥組比較，F(xiàn)old chang大于3倍或小于0.3倍，且P-value小于 0 · 05的micRNA有3項，見表4，其中rn〇-miR-487b-3p上調(diào)達42倍。
[0126] 表4中西藥組與西藥組比較
[0127] Name Fold change P-value
[0128] rn〇-miR-487b-3p 41.99498626 0.000343931
[0129] rn〇-miR-450a-5p 0.19895338 0.000388542
[0130] rn〇-miR-181c-5p 0.186421241 0.001652361
[0131 ] 2.3中西藥與中藥比較，F(xiàn)old chang大于3倍或小于0.33倍，且P-value小于0.05的 micRNA 有20項（略），6項上調(diào)，12 項下調(diào)，其中rn〇-miR-376b-3p 下調(diào)達 40倍，rno-miR-138- 2-3p下調(diào)達10倍。
[0132] 3.由上可知，在此基礎(chǔ)上，可進一步：
[0133] 3.1擴大樣本含量，篩選腎哮組與哮喘組micRAN表達的差異；
[0134] 3.2驗證:中藥與西藥在作用與哮喘和腎哮模型中micRNA表達的差異。
[0135] 3.3了解差異表達強的miRNA位點的功能。
[0136] 二、測定 Thl、Th2、Thl7、Treg
[0137] 采用流式細胞儀測定脾組織中的1111、1112、11117、1^叫的含量，從六個組1111/1112和 Thl7/Treg均值的柱狀看出，趨勢較為理想，但樣本含量較少，各用藥組之間尚未見統(tǒng)計學(xué) 意義。下一步可繼續(xù)擴大樣本含量，重復(fù)上述實驗。分組Thl/Th2(均數(shù)±標準差）Thl7/ Treg (均數(shù)土標準差） 正常組 2.97士0.44 2.263士0.96 哮喘組 0.53土0.36 3.975士 1.12 腎哮組 0.44士0_31 3.705士 1.24
[0138] 中藥組 0.84士0J2 3,093士2.01 西藥組 0.7U0.62 2.917士0.66 中醫(yī)藥姐 l、41i〇.68. 2.82:0士.1.33:。
[0139] 三、模型中肺泡灌洗液各相關(guān)因子的ELI SA檢測結(jié)果：
[0140] 各組大鼠各指標水平比較(jc±S)
[0142] 注：*與正常組比較Ρ〈0.05，Λ與腎氣虛哮喘模型組比較P〈0.05。
[0144] 注：*與正常組比較Ρ〈0.05，Λ與腎氣虛哮喘模型組比較P〈0.05。
[0145] 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果：
[0146] 圖2是本發(fā)明實施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果正常組圖；
[0147] 圖3是本發(fā)明實施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果哮喘模型組圖；
[0148] 圖4是本發(fā)明實施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果腎氣虛哮喘模型組圖；
[0149] 圖5是本發(fā)明實施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果中西藥組圖；
[0150] 圖6是本發(fā)明實施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果西藥組圖；
[0151] 圖7是本發(fā)明實施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果中藥組圖。
[0152] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種用于治療哮喘腎氣虛證的藥物，其特征在于，所述用于治療哮喘腎氣虛證的藥 物的中藥組分由熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、苦參、天漿殼、牡丹皮、茯苓各12g、五味子5g、 沉香片8g、旋覆花、黛蛤散、生黃芪各15g組成；西藥采用必可酮氣霧劑，每撳50yg，200撳/ 瓶。2. -種用于驗證權(quán)利要求1所述藥物療效的哮喘腎氣虛證動物模型的構(gòu)建方法，其特 征在于，該哮喘腎氣虛證動物模型的構(gòu)建方法為： 清潔級雄性Wistar大鼠540只，體重200~250g;動物隨機分為正常對照組，哮喘模型對 照組，腎氣虛哮喘模型組，西藥組，中藥組，中西藥聯(lián)合組； 哮喘造模:除正常對照組外，各組大鼠采用卵清蛋白致敏法進行哮喘造模； 腎氣虛造模:除正常對照組、哮喘模型對照組外，各組大鼠復(fù)合腎氣虛證造模。3. 如權(quán)利要求2所述的哮喘腎氣虛證動物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述哮喘造模 方法為:實驗第1天，用含有卵清蛋白lmg、氫氧化鋁凝膠IOmg及滅活百日咳桿菌疫苗5 X IO8 個的混合液Iml注入腹腔內(nèi)，令其致敏； 正常組以生理鹽水腹腔內(nèi)注射，2周后備用；第15天開始，將上述造模大鼠置于65cmX 45cm X 45cm大小的玻璃罩內(nèi)，以1 %的卵清蛋白超聲霧化吸入30min，激發(fā)哮喘，日1次，連續(xù) 激發(fā)直至處死； 正常對照組用生理鹽水替代霧化吸入。4. 如權(quán)利要求2所述的哮喘腎氣虛證動物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述腎氣虛造 模:除正常對照組、哮喘模型對照組外，各組大鼠復(fù)合腎氣虛證造模，具體方法： 實驗第1天開始，每日上午于同一時間置一安靜房間進行驚恐刺激，每次lOmin，即放送 有貓叫聲的磁帶，同時用梅花針叩擊大鼠20次/min，模擬貓抓拿攻擊大鼠的情景，同時振動 鼠籠； 每日下午將動物負重游泳:于大鼠尾根部纏繞重量為該大鼠體重10%的保險絲，放入 水深50cm、水溫20°C的水槽中游泳，以力竭為度一一大鼠鼻尖沒入水面10s，每日1次，共14 天。5. -種如權(quán)利要求2~4任意一項權(quán)利要求所述的構(gòu)建方法建立的動物模型。6. -種如權(quán)利要求5所述的動物模型的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括： 給藥及處理:西藥組、中藥組和中西藥聯(lián)合組大鼠于實驗第15天開始給藥；日給藥劑量 為：西藥組給必可酮50yg/只；中藥組給中藥2.0g/kg;中西藥組給相應(yīng)中藥2.0g/kg、必可酮 50yg/； 正常對照組、哮喘模型組、腎虛哮喘模型組給生理鹽水灌胃；各組大鼠分別干預(yù)15天處 理，稱體重，眼球取血;腎氣虛哮喘模型組進行四診計量化指標進行氣虛程度評判； 癥狀、體征觀察:觀察各組大鼠食量、皮毛、體重、活動量、懸尾抵抗力、游泳時間、雙肺 表現(xiàn)； 血清檢測:檢測甲狀腺素、皮質(zhì)醇、睪酮水平； 病理學(xué)觀察:取部分肺組織行蘇木精一伊紅染色觀察； 支氣管肺泡灌洗液檢測白細胞分類和計數(shù):并采用ELISA法檢測MLF離心后上清液中 細胞因子11^-4、幾-5、11^-6、幾-10、幾-13、幾-17、正^丫、丁6卩-邱勺含量； 肺組織檢測：取出肺臟組織的1/3,采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)測定法檢測肺組織中T- 匕6伙64了六-3、1?〇1?丫扒？(《?3、11^6、了6?-0因子11^祖的表達水平；用免疫印跡法檢測肺組織1'-bet、GATA-3、R0Ry t、Foxp3、IL-6、TGF-0蛋白的表達水平，取出另外肺組織的1/3,用于 miRNA相關(guān)檢測； 脾組織檢測：分離脾臟中單個核細胞，固定，染FITC-CD4，然后破膜，分別加 Thl、Th2、 11117和1'代8細胞的特異性抗體11^-4、正^丫、幾-174和?(《?3，孵育后重懸、上機檢測； microRNA微陣列基因檢測:大鼠處死，肺臟被迅速分離置于凍存管，直接放入液氮中冷 凍，短時間內(nèi)完成整個操作；用MirVana microRNA isolation kit按照說明書收集總RNA; 取適量RNA溶液，經(jīng)紫外分光光度計定量測定RNA樣品0D260和0D280值，計算RNA濃度，1 %瓊 脂糖電泳觀察總RNA，取2_5yg用Microcon centrifugal filter微離心過濾柱過濾，得到片 段小于300個核苷酸的小RNA;應(yīng)用Poly聚合酶將小RNA的3'端加上poly(A)尾巴，再連接一 個寡聚核苷酸標記，用于后續(xù)的熒光標記，完成yParafIoTM microRNA微陣列基因； 表達實驗和分析:通過微循環(huán)栗雜交儀器在yParaf IoTM微流體芯片上過夜，使用含甲 酸胺SSPE緩沖液進行雜交，漂洗甩干，用激光掃描儀采集雜交圖象，Array--Pro軟件對雜交 圖像進行數(shù)字化轉(zhuǎn)換、數(shù)據(jù)處理和分析，計算兩組檢測到信號的比值和t檢驗的p值，以p〈 0.01定義為信號有顯著差異性，分析差異表達的位點，大鼠微陣列芯片包括454個 microRNA，包含數(shù)據(jù)庫中成熟的microRNA和部分成熟microRNA的互補鏈;芯片上的檢測探 針均進行9個重復(fù)，實驗進行2次； 實時焚光定量PCR檢測：用MirVana microRNA isolation kit按照說明書收集總RNA， 計算RNA濃度；特異逆轉(zhuǎn)錄引物從Taqman MicroRNA Assays獲得，并用Taqman MicroRNA ReverseTranscription Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行實時焚光定量PCR檢測，反應(yīng)結(jié)束后用 ABI Prism7900軟件分析結(jié)果，PCR實驗進行3次，用比較閾值循環(huán)方法分析數(shù)據(jù)，得到Ct值， 即熒光達到閾值所需的PCR循環(huán)數(shù)，并分析基因相對表達量； 生物信息學(xué)預(yù)測：應(yīng)用miRanda、Target Scan和PicTar 3個生物信息學(xué)祀基因預(yù)測軟 件，對microRNA芯片結(jié)果中挑選出來的microRNA的革El基因做出預(yù)測； 統(tǒng)計學(xué)處理:根據(jù)資料的性質(zhì)、分布和設(shè)計特點，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分 析。7. 如權(quán)利要求6所述的動物模型的使用方法，其特征在于，microRNA芯片的數(shù)據(jù)分析方 法： 使用GenePix Pro 6.0讀取芯片掃描圖像，并提取探針的信號值； 相同的探針取中值合并，保留在所有樣品中均> = 30.0的探針，對全部芯片進行中值標 準化，篩選差異表達探針； 使用Fold change和P-value篩選兩組樣品間的差異表達miRNA; 使用Fold change篩選兩個樣品間的差異表達miRNAs; 最后，對差異表達miRNAs進行聚類并繪制聚類圖。8. 如權(quán)利要求7所述的動物模型的使用方法，其特征在于，使用Fold change和P-value 篩選兩組樣品間的差異表達miRNA中兩組樣品間有重復(fù);使用Fold change篩選兩個樣品間 的差異表達miRNAs中兩個樣品間沒有重復(fù)。
【文檔編號】A61K35/618GK105943787SQ201610420083
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月15日
【發(fā)明人】鄭小偉, 孔麗婭, 余王琴, 劉曉谷
【申請人】浙江中醫(yī)藥大學(xué)