Il-8單獨或與其他細胞因子聯(lián)合在治療肝纖維化中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及白介素?8(IL?8)單獨或與其他細胞因子聯(lián)合在治療肝纖維化中的用途。白介素?8(IL?8)單獨或與其他細胞因子聯(lián)合能夠改善肝纖維化狀況。本發(fā)明更好地治愈肝纖維化或為治療肝纖維化提供另一種可行的選擇，提高患者的預后或者生活質(zhì)量。
【專利說明】
IL-8單獨或與其他細胞因子聯(lián)合在治療肝纖維化中的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及白介素-8(IL-8)單獨或與其他細胞因子聯(lián)合 在治療肝纖維化中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝臟疾病嚴重影響人類的健康和生活質(zhì)量，是人類面臨的重大傳染性疾病之一。 每年中國有數(shù)以萬計的患者死于各類肝病，因其并發(fā)癥較多且死亡率較高，肝病的治療引 起了全世界的廣泛關(guān)注和研究。肝病主要包括肝損傷，爆發(fā)性肝衰竭，肝纖維化，肝硬化，肝 細胞癌，膽汁淤積性肝，自身免疫性肝病，酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝等。肝纖維化是 一種應對各種各樣急/慢性刺激物(包括酒精，病毒感染，藥物，毒素，膽汁和代謝物等)的傷 口損傷反應，其是各種各樣慢性肝損傷的必經(jīng)之路和共同結(jié)果。伴隨著刺激物的持續(xù)損傷， 導致重新構(gòu)建肝功能的速度跟不上膠原纖維合成和積累的速度，引起了細胞外基質(zhì)(ECM， extracellular matrix)的積累，因過度地積累而產(chǎn)生持續(xù)的生理和病理變化。這些變化主 要包括炎癥細胞的募集，肝細胞的壞死，內(nèi)皮屏障的損傷，肌成纖維細胞的激活和最終疤痕 的形成。持續(xù)的肝纖維化將破壞正常的肝臟結(jié)構(gòu)，形成許多的肝小結(jié)，改變血液循環(huán)，最終 引發(fā)肝硬化甚至演變成肝細胞癌。
[0003] 正常的肝實質(zhì)包含上皮細胞(肝細胞)和非實質(zhì)細胞（網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞，肝星狀細胞 和Kupffer細胞）。正常的肝臟結(jié)構(gòu)：血竇從肝細胞中以低密度的基底膜樣的基質(zhì)固定于 Disse內(nèi)，這樣可以增加新陳代謝的物質(zhì)和營養(yǎng)交換。當發(fā)生損傷時，肝星狀細胞被激活，并 分泌大量的ECM，導致隔膜明顯增厚。纖維化的肝臟結(jié)構(gòu)：損傷達到一定的程度，ECM大量聚 集在Disse內(nèi)，導致內(nèi)皮細胞窗孔樣結(jié)構(gòu)和肝臟微絨毛損失，而且門靜脈血流量和肝細胞新 陳代謝交換發(fā)生損害，并引起門靜脈血壓過高。
[0004] 當前治療肝纖維化最有效的方法是原位肝移植（0LT，orthotopic liver transplantation)，但是因肝臟捐獻者的嚴重不足，使得OLT的應用受到了極大的限制，因 此新的治療手段是迫切解決肝臟供體短缺的一種方式。
[0005] 干細胞生物學已經(jīng)變成了最熱門的生物醫(yī)學研究領(lǐng)域之一。MSCs作為一類主要的 成體干細胞，許多的臨床前實驗和臨床試驗關(guān)注MSCs在疾病方面的研究價值和應用前景。 MSCs最初發(fā)現(xiàn)于骨髓，隨后在許多組織與器官中均發(fā)現(xiàn)相似特性的MSCs，包括脂肪，肌肉， 結(jié)締組織，臍帶血，月經(jīng)血，子宮內(nèi)膜，羊膜，脾臟，心，牙齒，肺，胰腺，肝，腦，腎臟和外周血。
[0006] 目前，人們利用MSCs治療肝纖維化的研究越來越深入，而且臨床應用也正在進行 中。例如，中國專利申請201010551722.8公開了人臍帶間充質(zhì)干細胞抗肝纖維化注射液及 其制備方法，該注射液由1 〇 % -50 %人血白蛋白原液和49.5 % -89.5 %的勃脈力A液、0.5 % 肝素鈣組成，其中人血白蛋白原液的濃度為10%，lml注射液中含有人臍帶間充質(zhì)干細胞6 X 105-7 X IO5個;其制備方法包括:提供間充質(zhì)干細胞保存液，預冷、備用，該間充質(zhì)干細胞 保存液包括人血白蛋白原液和勃脈力A液、肝素鈣;提供人臍帶間充質(zhì)干細胞并將其加入到 間充質(zhì)干細胞保存液中；通過重懸的方式，調(diào)整加入到間充質(zhì)干細胞保存液中的人臍帶間 充質(zhì)干細胞數(shù)量為6 X 105-7 X IO5個細胞/lml。中國專利申請201510024090.2公開了一種用 于治療肝纖維化的干細胞制劑及其制備方法，所述的治療肝纖維化的干細胞制劑，是由人 經(jīng)血間充質(zhì)干細胞與趨化因子CXCL8和生理鹽水配制而成。
[0007] 但是，人們關(guān)于MSCs的易感性有些擔憂，因為有研究已經(jīng)提出MSCs自發(fā)地發(fā)生惡 變。雖然MSCs向惡性轉(zhuǎn)變的風險較低，最近公布的數(shù)據(jù)表明，人MSCs可能會顯示基因組的突 變，并表現(xiàn)基因水平的不穩(wěn)定，在高通道端粒缺失(>170)，微衛(wèi)星不穩(wěn)定，參與DNA修復基因 表達下調(diào)和異質(zhì)性點突變等。雖然人MSC的惡性變換沒有在臨床試驗中報道，也可能是后續(xù) 跟蹤時間相對較短，而腫瘤的發(fā)生可能需要較長時間才能出現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了更好地治愈肝纖維化或為治療肝纖維化提供另一種可行的選擇，提高患者的 預后或者生活質(zhì)量，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量、堅持不懈的篩選，發(fā)現(xiàn)白介素-8(IL-8)單獨 或者與其他細胞因子聯(lián)合能夠用于治療肝纖維化。而且，與其他細胞因子的聯(lián)合具有顯著 較優(yōu)或者協(xié)同作用。
[0009] 本發(fā)明的一個方面涉及一種用于治療肝纖維化的藥物，其含有白介素-8(IL-8)。 任選地，本發(fā)明的藥物還含有藥學上可接受的載體。
[0010] 優(yōu)選地，本發(fā)明的用于治療肝纖維化的藥物還含有其他細胞因子，例如選自由骨 保護素（OPG)、單核細胞趨化蛋白l(MCP-l)、HGF(肝細胞生長因子，hepatocyte growth factor)、GR0(growth-regulated oncogene，腫瘤生長相關(guān)因子)和白介素-6(IL-6)的細胞 因子組成的組的細胞因子中的1個、2個、3個、4個或5個。
[0011] 本發(fā)明的第二方面提供了白介素-8(IL-8)在制備用于治療肝纖維化的藥物中的 用途。任選地，用于治療肝纖維化的藥物還含有藥學上可接受的載體。優(yōu)選地，用于治療肝 纖維化的藥物還含有其他細胞因子，例如選自由骨保護素(OPG)、單核細胞趨化蛋白I (MCP-1 )、HGF(肝細胞生長因子，hepatocyte growth factor)、GRO(growth-regulated oncogene，腫瘤生長相關(guān)因子）和白介素-6(IL-6)的細胞因子組成的組的細胞因子中的I 個、2個、3個、4個或5個。
[0012] 本發(fā)明的第三方面提供了治療受試者中肝纖維化的方法，其包括向所述受試者中 施用有效量的白介素-8(IL-8)或者將白介素-8(IL-8)聯(lián)合選自由骨保護素(OPG)、單核細 胞趨化蛋白 l(MCP-l)、HGF(肝細胞生長因子，hepatocyte growth factor)、GR0(growth_ regulated oncogene，腫瘤生長相關(guān)因子)和白介素-6(IL-6)的細胞因子組成的組的細胞 因子中的1個、2個、3個、4個或5個施用于所述受試者。
[0013] 對于本發(fā)明所述的受試者，其優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選為人。
[0014] 白細胞介素-8( interleukin-8，IL-8)，又稱趨化因子CXCL8(CXCL8)，是一種炎性 趨化性因子。IL-8通過受體CXCRl和CXCR2等產(chǎn)生多種生物學功能，包括促炎性細胞趨化、促 血管生成、促有絲分裂和誘導細胞增殖等。研究發(fā)現(xiàn)IL-8與多種疾病尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā) 展關(guān)系密切，特異性地阻斷IL-8及其受體CXCR1/2有望成為多種疾病的潛在治療策略。也有 很多報道稱IL-8能夠誘導促炎癥與促進纖維化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對白介素-8作出任何 修飾，前提是所述修飾不負面影響其活性。例如，可以對細胞因子進行修飾或裝載在其他載 體上，以提高其在體內(nèi)的半衰期;或者可以與已知的穿透肽連接，以促進本發(fā)明化合物的透 皮吸收或者越過血腦屏障等?？傊?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對本發(fā)明的所述的細胞因子進行各 種修飾以提高遞送效率或用于其他目的并保持其活性。這類修飾也是在本發(fā)明的范圍之內(nèi) 的。
[0015] 在本發(fā)明中，除各種細胞因子的活性成分外，本發(fā)明的方法、用途和產(chǎn)品還可以包 含合適的藥學上可接受的載體，包括促進活性成分加工成制劑(例如適于注射或輸注的制 劑)的賦形劑和助劑。
[0016] 適于注射或輸注的制劑可包括水性和非水性無菌注射液和水性和非水性無菌混 懸劑，所述無菌注射液可任選地包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和能使制劑與目的接收者的 血液等壓的溶質(zhì)，所述無菌混懸劑可包括懸浮劑和增稠劑。所述制劑可存在于單位劑量或 多劑量容器中，例如密封的安瓿，并且可以保存在凍結(jié)干燥的（凍干)條件，在立即使用前僅 需要加入無菌液體載體，例如注射用水。
[0017] 本發(fā)明的各種細胞因子活性成分任選地可與固體賦形劑相組合，且任選地磨碎所 得到的混合物，并且需要時，在加入合適的助劑后，加工顆粒的混合物，以獲得所需劑型。合 適的賦形劑特別是填充劑例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇;纖維素或淀粉制劑、 明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)。需要時，可以加入崩解劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽例如海藻 酸鈉。
[0018] 在本發(fā)明中，施用各細胞因子的量可為能治療或者協(xié)同治療受試者中肝纖維化或 抑制肝纖維化細胞增殖的任何量，其可以是相當于約0.01-15. Omg白介素-8(IL-8)，優(yōu)選 0.2-2. Omg白介素-8(IL-8)和0.01-20.0 mg選自由骨保護素（OPG)、單核細胞趨化蛋白1 (MCP-1)、HGF(肝細胞生長因子，hepatocyte growth factor)、GRO(growth_regulated oncogene，腫瘤生長相關(guān)因子)和白介素-6( IL-6)的細胞因子組成的組的細胞因子。
[0019]更優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物的劑量單位包括約1-41^白介素-8(幾-8)和0.01-20.011^ 選自由骨保護素（OPG)、單核細胞趨化蛋白I (MCP-I)、HGF(肝細胞生長因子，hepatocyte growth factor)、GR0(growth_regulated oncogene，腫瘤生長相關(guān)因子）和白介素_6(IL-6)的細胞因子組成的組的細胞因子。最優(yōu)選地，劑量單位包括約2-3mg的白介素-8 (I L-8)和 2.0-6. Omg選自由骨保護素、單核細胞趨化蛋白I (MCP-I)、HGF(肝細胞生長因子， hepatocyte growth factor)、GR0(growth_regulated oncogene，腫瘤生長相關(guān)因子）和白 介素-6(IL-6)的細胞因子組成的組的細胞因子。
[0020] 在本發(fā)明中，施用的有效量以及合適的單位劑量的測定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力 內(nèi)，特別是根據(jù)本文提供的公開內(nèi)容的啟示下。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的藥學藥物可以以任意有效劑量施用給藥受試者。優(yōu)選地，本 發(fā)明的藥物可以以多次劑量給藥，例如從約2至約15次劑量，更優(yōu)選約4-10次劑量，最優(yōu)選 約6次劑量。在特別優(yōu)選的實施方案，在給藥過程中，以每三周給藥約一次的頻率將本發(fā)明 的藥物給藥至受試者，例如注射、輸注或口服。在特別優(yōu)選的實施方案，給藥為通過靜脈注 射施用。
[0022]應當理解本發(fā)明的藥物可以按用于通過任意適宜的途徑給藥的任意適宜的方式 配制。
[0023]本發(fā)明的藥物的劑量單位是基于常規(guī)進行給藥受試者。例如，劑量單位可以基于 給藥頻率為每日一次、每周一次、每月一次等確定。劑量單位也可基于以兩次/周、三次/周 等確定。
[0024] 如本文所使用的，"包含"與"包括"、"含有"或"特征在于"同義，并且是包括在內(nèi)的 或開放性的，并且不排除另外的未陳述的元件或方法步驟。術(shù)語"包含"在本文中的任何表 述，特別是在描述本發(fā)明的方法、用途或產(chǎn)品時，應理解為包括基本上由所述組分或元件或 步驟組成和由所述組分或元件或步驟組成的那些產(chǎn)品、方法和用途。本文示例性描述的本 發(fā)明適當?shù)乜梢栽诓淮嬖诒疚奈淳唧w公開的任何一種或多種元件、一種或多種限制的情況 下進行實踐。
[0025] 本發(fā)明的藥物中可包含涉及該藥學產(chǎn)品的說明書，且該說明書可以含有如下內(nèi) 容:適應癥(例如肝纖維化）、施用劑量(例如上述所示例性說明的）以及可能產(chǎn)生的副作用 等等。
[0026] 本文已采用的術(shù)語和表述用作描述性而不是限制性術(shù)語，并且在此種術(shù)語和表述 的使用中不預期排除所示和所述特征或其部分的任何等價物，但應認識到各種修飾在請求 保護的本發(fā)明的范圍內(nèi)是可能的。因此，應當理解盡管本發(fā)明已通過優(yōu)選實施方案和任選 特征具體公開，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用本文公開的概念的修飾和變化，并且此類修飾 和變化被視為在如由附加權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0027] 為更清楚地說明本發(fā)明，現(xiàn)結(jié)合如下實施例進行詳細說明，但這些實施例僅僅是 對本發(fā)明的示例性描述，并不能解釋為對本申請的限制。
【附圖說明】
[0028] 圖1:細胞上清和細胞ELISA定量檢測MCP-1，IL-6，HGF，GR0，IL-8和0PG。ELISA定量 檢測LX-2組，MenSC組和共培養(yǎng)組(co-culture組)培養(yǎng)72h后細胞上清液以及細胞的蛋白表 達量。(A)，細胞上清液蛋白量。（B)，細胞的蛋白表達量。分析及作圖采用GraphPad Prism 5 軟件。數(shù)值代表平均值土 SD(η = 4)。
【具體實施方式】
[0029]本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進一步的說明。
[0030] 實施例1:肝纖維化小鼠模型的建立及鑒定
[0031] 本發(fā)明使用本領(lǐng)域常用的通過CCl4損傷小鼠肝臟而建立的肝纖維化小鼠模型。 [0032]將6-8周ICR小鼠（購自上海斯萊克(SLAC)實驗動物有限責任公司）腹腔注射CC14， 按照ImL CClVkg小鼠體重注射。CC14以10%的比例溶解于橄欖油(olive oil)中，用ImL微 型注射器(BD Biosciences)每周注射兩次并持續(xù)注射4周，這樣就建立了小鼠的早期肝纖 維化模型。通過摘取小鼠肝臟，對其進行sirius red染色，檢驗肝臟組織病理情況；同時檢 測小鼠的血清肝功能指標，包括ALT，AST，ALB，ALP和TBIL。通過以上指標，驗證小鼠纖維化 模型是否構(gòu)建成功。
[0033] 實施例2 =MenSCs的分離和體外培養(yǎng)
[0034] 在經(jīng)期健康女性自愿者月經(jīng)周期時，利用Divacup(Kitchener，ON)收集女性經(jīng)血 樣品。在獲取樣品后的2天之內(nèi)，將樣品小心存于4°C。取出這些樣品之后，后續(xù)操作程序均 在細胞房中進行處理。將收集到的經(jīng)血進行離心（l〇〇〇rpm，10min，4°C)，利用Ficoll-Paque 分離得到液體中的單核細胞(混合型），隨后將細胞樣品進行檢測，檢測上清液中細菌數(shù)量， 待各項指標達標后進行細胞體外增殖培養(yǎng)。細胞分離之后用PBS洗滌3-5次(盡可能棄去雜 質(zhì)），然后將分離純化的細胞轉(zhuǎn)到加有DMEM/F12培養(yǎng)基（添加了 l^penicillin/ streptomycin、I %amphotericin B和15%FBS)的細胞培養(yǎng)瓶(Corning)中繼續(xù)貼壁培養(yǎng)。 將分離后的細胞培養(yǎng)一周左右，每隔2天換1次液，同時吸棄未能正常貼壁的懸浮細胞/死細 胞。隨后，每隔3天更換新鮮Chang培養(yǎng)基，選取形態(tài)分布均一、生長狀態(tài)良好的MenSCs進行 擴大培養(yǎng)。當細胞密度達到80%左右時，用PBS洗滌3次，而后加入0.25%Trypsin-EDTA(5-IOmin)進行細胞消化，將消化后的細胞進行離心并按照1:3的比例進行細胞擴大培養(yǎng)(加入 新鮮培養(yǎng)基）。所有培養(yǎng)的細胞均放置于3 7 °C恒溫和5 % C 0 2的飽和濕度培養(yǎng)箱 (ThermoFisher)中。經(jīng)過約5代的擴大培養(yǎng)，其形態(tài)已經(jīng)基本趨于穩(wěn)定和均一，并可以見到 細胞呈現(xiàn)典型的梭形并呈旋渦狀排列。
[0035] 為了進一步驗證MenSCs的特性，利用流式細胞儀對MenSCs進行細胞表面標記分子 的鑒定，檢測的分子包括 〇)29,0034,0)45,0073,0)90,00105,00117和!11^-〇1?。結(jié)果顯示 MenSCs能夠高表達CD29，CD73，CD90和CD105(均>90%)，低表達CD45,幾乎不表達CD34， CD117 和 HLA-DR(均〈1%)。
[0036]本文實施例中所使用的MenSCs為第5到第8代次的細胞(P5-P8)，除非特別指出。 [0037] 實施例3:表達綠色熒光蛋白（GFP)的MenSCs(GFP+MenSCs)的構(gòu)建和篩選
[0038] P2-P3的MenSCs培養(yǎng)于T75培養(yǎng)瓶(Corning)中，當細胞貼壁生長到大約50%時吸 棄培養(yǎng)基，用I3BS洗滌3次，添加含有6yg/mL的polybrene (漢恒生物科技有限公司）以及GFP-PURO(漢恒生物科技有限公司）病毒液(MOI = 50;MOI ,multiplicity of infection)的 IOmLChang氏完全培養(yǎng)基(杭州易文賽生物科技有限公司）。1天后更換新鮮培養(yǎng)基，待細胞 培養(yǎng)2-3天后再次更換新鮮培養(yǎng)基，并用2yg/mL的puromycin(Sigma)進行細胞篩選。對篩選 后的細胞(GFP+MenSCs)進行GFP陽性檢測以及細胞表面標記分子（包括CD29，CD34，CD45， 0)73,0)90,0)105,0)117和!11^-〇1〇的表達與鑒定。
[0039] 取篩選兩周后的部分細胞進行鑒定，可以看出，與正常MenSCs相比，GFP+MenSCs并 沒有發(fā)生明顯的形態(tài)變化，而通過GFP熒光直觀觀察，發(fā)現(xiàn)幾乎全部的細胞(>99%)已經(jīng)感 染上了慢病毒，這樣的結(jié)果通過流式細胞進行了進一步確認。
[0040] 為了驗證GFP+MenSCs的表面標志物是否發(fā)生變化，檢測了和MenSCs相對應的表面 分子。結(jié)果顯示與正常MenSCs相比，GFP+MenSCs并沒有發(fā)生明顯的表面標記分子改變，而且 表面標記分子特性和MenSCs-致。這進一步表明Puro-GFP慢病毒對于經(jīng)血干細胞的形態(tài)及 表面標記分子并無明顯的影響。
[0041 ] 實施例4:活體成像檢測GFP+MenSCs移植小鼠后的組織分布
[0042]為了驗證MenSCs具有向肝損傷部位趨化的功能，將穩(wěn)定篩選的GFP+MenSCs移植到 小鼠體內(nèi)，一共分為5個組別：
[0043] (1)正常對照組(normal control):對小鼠不做任何處理；
[0044] (2)GFP+MenSCs移植到正常小鼠 （normal mice) 1 周組(命名為GFP+IW in NM);
[0045] (3)GFP+MenSCs移植到肝纖維化模型小鼠 （liver fibrosismice)l周組（命名為 GFP+Iff in LFM)；
[0046] (4)GFP+MenSCs移植到正常小鼠2周組(命名為GFP+2W in NM);
[0047] (5)GFP+MenSCs移植到肝纖維化模型小鼠2周組(命名為GFP+2W in LFM)。
[0048] 上述各組別的小鼠均采用麻醉處死，然后利用手術(shù)剪刀和眼科鑷子將主要的幾個 器官進行分離，這些臟器包括肝（liver)，肺(lung)，脾(spleen)，腎(kidney)和心(heart) 〇 分離得到的器官用PBS清洗3次(每次3min)，這樣就能完全的去除殘留的血塊和雜貨(減少 或去除活體成像產(chǎn)生的干擾）。每個組平行處理6只小鼠 （n = 6)。這些分離得到的器官在 IVIS SPECTRUM小鼠活體成像系統(tǒng)（Caliper Life Sciences)下拍照，并用相關(guān)軟件 (Living Image 4.3.Isoftware)對焚光強度進行統(tǒng)計分析。
[0049] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對照組幾乎不表達GFP蛋白，GFP+1W/2W in匪組和GFP+1W/2W in LFM組能夠在肝臟中表達GFP蛋白。GFP+IW/2W in LFM組的熒光強度明顯高于對應時間點的 GFP+1W/2W in NM組。更重要的是，GFP+1W/2W in LFM組中大部分MenSCs迀移到了肝臟部位。 這些結(jié)果顯示MenSCs能夠定向迀移到損傷部位。此外，熒光強度分析軟件進一步確認了該 結(jié)果。
[0050] 實施例5:肝組織CK-18免疫熒光檢測
[0051 ] 在干細胞移植后的1周和2周，分別取MenSCs組(MenSCs 2W)和GFP+MenSCs組(GFP+ MenSCs IW和GFP+MenSCs 2W)小鼠的肝臟，每個組別有6個樣品（n = 6)。將收集的肝組織用 錫箱紙包起來，快速凍存于-80 °C冰箱。具體的免疫熒光操作步驟如下：
[0052] (1)迅速從-80 °C冰箱取出冰凍組織并用Tissue-Tek OCT包埋劑（Sakura)將樣品 進行包埋；
[0053] (2)將樣品放置于冰凍切片機(CryoStar NX50，Thermo)切片，厚度為4-6μπι;
[0054] (3)在室溫放置30min，然后加入4°C預冷的丙酮（固定樣品lOmin)，接著用PBS清洗 3次(每次5min);
[0055] (4)阻斷內(nèi)源性過過氧化氫(H2O2)酶:加入3%的H2〇2(約lOmin)，然后用蒸餾水進 行水洗3min，之后再用PBS(0.01M PH=7.5)清洗切片三次(每次約5min);
[0056] (5)封閉：用5%的正常山羊血清（用PBS進行稀釋），然后在室溫孵育20min，接著再 用PBS清洗切片三次(每次約5min);
[0057] (6)滴加適當比例稀釋的特異性抗人CK-18-抗，4°C孵育過夜，接著再用PBS清洗 切片三次(每次約5min);
[0058] (7)滴加適當比例稀釋的Cy3標記的羊抗鼠二抗（稀釋比例1:400)，室溫孵育 60min；
[0059] (8)用DAPI復染20min以標記細胞核，然后用PBS清洗切片三次(每次約5min);
[0060] (9)封片，用熒光顯微鏡(U-HGLGPS光源，Olympus)觀察并拍照。
[0061 ] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MenSCs 2W組幾乎不表達GFP;相比于MenSCs 2W組，GFP+MenSCs組能夠 明顯的表達GFP，并且GFP+MenSCs 2W的熒光強度高于GFP+MenSCs IW組。400倍放大的圖片更 加清晰的展示了這一結(jié)果（圖略）。這些進一步驗證了 MenSCs具有向損傷部位趨化的作用。 特異性抗人CK-18的表達用于檢測MenSCs移植到小鼠肝臟后，MenSCs是否有部分細胞分化 成肝樣細胞。結(jié)果表明，MenSCs并未分化成肝樣細胞。
[0062]實施例6:移植經(jīng)血干細胞改善小鼠的肝纖維化 [0063]實施例6.1 :小鼠尾靜脈移植
[0064]使細胞濃度為5X106/mL，用ImL微型注射器通過尾靜脈注射到已經(jīng)構(gòu)建好的纖維 化模型小鼠中（每只小鼠移植約5 X IO5細胞/100μυ。將GFP+MenSCs/MenSCs移植到肝纖維化 模型小鼠命名為GFP+MenSCs組/MenSCs組，同時將只注射等量PBS的肝纖維化模型小鼠命名 為PBS組。為了防止發(fā)生小鼠纖維化自發(fā)性恢復的情況，在干細胞移植的兩周中，小鼠持續(xù) 注射CC14。
[0065] 實施例6.2:SR染色
[0066] 在干細胞移植到小鼠后的第1周和第2周，分別麻醉并脫頸處死小鼠，分別取 MenSCs組(MenSCs IW和MenSCs 2W)和PBS組(PBS IW和PBS 2W)小鼠的肝臟，每個組別有6個 樣品(n = 6)。具體的組織處理步驟如下：
[0067] (1)固定:組織加入到10%的中性福爾馬林中，固定大概1天；
[0068] (2)脫水:取出固定好的組織，將其依次放入梯度酒精進行脫水(分別是70%酒精 lh，80% 酒精 lh，95% 酒精 Ih 和 100% 酒精 Ih);
[0069] (3)透明：先用二甲苯I浸泡lOmim，然后用二甲苯II浸泡20min;
[0070] (4)浸蠟:先用軟蠟在60°C下lh，然后用硬蠟在60°C下2h;
[0071] (5)包埋:硬蠟包埋；
[0072] (6)切片：在石蠟切片機(HM325型輪轉(zhuǎn)式）上進行組織切片，切片的厚度大概為5μ m；
[0073] (7)烤片:在60°C條件下，烤約4h。
[0074] 將干燥的石蠟切片放置于二甲苯中，依次在梯度酒精中（100 %酒精3min，95%酒 精3min，80 %酒精3min，70%酒精3min)進行脫錯處理。用事先配好的0.1 % SR(0.1 g SR溶于 IOOmL picric acid中）進行孵育30min，使用蒸餾水沖洗1-2次，使用梯度酒精脫水，中性樹 脂進行封片，利用顯微鏡（Olympus 1X83)進行圖像采集。利用IPP 6software(Image Pro Plus 6，Media Cybernetics)分析膠原纖維面積(膠原面積/總的面積）。
[0075] MenSCs移植到纖維化小鼠1周和2周后，觀察并檢測膠原纖維面積。結(jié)果表明，盡管 MenSCs IW組（1.9%)的膠原積累面積低于PBS IW組(2.4%)，但其在統(tǒng)計學上并沒有顯著 性差異；相反，MenSCs 2W組(2.2 % )的膠原纖維面積相比于I3BS 2W組(3.4% )有明顯減少， 說明肝纖維化在MenSCs移植2周后病理指標上得到了改善。
[0076]實施例6.3:小鼠血清肝功能指標檢測
[0077] 在干細胞移植到小鼠后的第1周和第2周，分別麻醉并脫頸處死小鼠，分別收集 MenSCs組(MenSCs IW和MenSCs 2W)和PBS組(PBS IW和PBS 2W)小鼠的血清，每個組別有6個 樣品(n = 6)。具體的血清收集步驟如下：
[0078] (1)將麻醉的小鼠平穩(wěn)放置實驗臺上，使用眼科手術(shù)鑷子進行小鼠眼球取血，傾斜 小鼠，讓其血液自然流出，放入到1.5mL的EP管中；
[0079] (2)將傾斜管壁，常溫放置90min;
[0080] (3)輕柔操作，放入離心機中離心:4°C，4000rpm，15min;
[0081] (4)用IOOyL槍頭緩慢吸取上清液(注意不要碰到下層的血塊）；
[0082] (5)將上清液冰浴2min，然后-20°C凍存?zhèn)溆茫?br>[0083] 利用南京建成試劑盒，檢驗血清學中肝功能常見指標(ALT，AST，ALB，AIi^PTBIL)。 [0084] MenSCs細胞移植到纖維化小鼠1周和2周后，分別取樣檢測血清ALT，AST，ALB，ALP 和TBIL(表1)。結(jié)果表明，除了ALT之外，MenSCs IW組(相比于I3BS IW組）的血清學指標并沒 有顯著性差異;相反，MenSCs 2W組(相比于PBS 2W組)的血清學指標有較顯著的降低(ALB除 外），說明肝纖維化在生理指標上得到了改善。
[0085]表1小鼠常見肝功能血清指標檢測
[0087]注:ALT，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;AST，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;ALB，白蛋白；ALP，堿性磷 酸酶;TBIL，總膽紅素。代表P〈0.05，"#"代表P〈0.01。
[0088]實施例6.4:HSCs活化指標及促纖維化因子檢測 [0089] 實施例6.4.1 :qRT_PCR檢測HSCs活化相關(guān)基因表達
[0090] 實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)檢測MenSCs移植 后肝臟中HSCs活化相關(guān)標志基因 α-SMA和促纖維化因子TGF-βΙ的表達變化。
[0091] 在a-SMA表達中，肝纖維化模型組的表達量(6.6倍，相對于注射了橄欖油的正常小 鼠組，下同）相比于注射了橄欖油的正常小鼠組有極顯著上升;將MenSCs移植至肝纖維化小 鼠模型后一周（7.1倍）的表達量相比于將PBS移植至肝纖維化小鼠模型后1周的PBS IW組 (8.1倍)有顯著下降趨勢，同樣，將MenSCs移植至肝纖維化小鼠模型后2周的MenSCs 2W組 (9.1倍)的表達量相比于將PBS移植至肝纖維化小鼠模型后2周的PBS 2W組（12.3倍)也有顯 著下調(diào)趨勢。類似地，在TGF-βΙ表達中，肝纖維化模型組的表達量(2.2倍)相比于注射了橄 欖油的正常小鼠組有極顯著上升;將MenSCs移植至肝纖維化小鼠模型后1周的MenSCs IW組 和將PBS移植至肝纖維化小鼠模型后1周的PBS IW組的表達并沒有顯著性差異，然而，將 MenSCs移植至肝纖維化小鼠模型后兩周后(4.6倍）的表達相比于將PBS移植至肝纖維化小 鼠模型后2周的PBS 2W組(3倍)有顯著的下調(diào)。
[0092] 實施例6.4.2:免疫組織化學檢測a-SMA和TGF-βΙ的蛋白表達水平
[0093]在經(jīng)血干細胞移植到小鼠后的第1周和第2周，分別麻醉并脫頸處死小鼠，分別取 MenSCs組(MenSCs IW和MenSCs 2W)和PBS組(PBS IW和PBS 2W)小鼠的肝臟，每個組別有6個 樣品(η = 6)。將肝臟組織制作成干燥的石蠟切片(參照2.1.3.3.2.2)，利用EnVi s ion (Dako) 二步法來檢測α-SM和TGF-βΙ的表達情況。免疫組織化學具體的操作步驟如下：
[0094] (1)脫蠟:先用二甲苯I浸泡lOmim，然后用二甲苯II浸泡IOmin;
[0095] (2)將干燥的石蠟切片放置于二甲苯中，依次在梯度酒精中（100%酒精3min，95% 酒精3min，80 %酒精3min，70 %酒精3min)進行脫錯處理，然后水洗2min;
[0096] (3)抗原修復：切片放入到已經(jīng)預熱好的0.0IM(mo 1/L)檸檬酸緩沖液(PH = 6.0) 中，將其煮沸(約20min)，然后取出切片讓其自然的冷卻；
[0097] (4)阻斷內(nèi)源性過過氧化氫(H2O2)酶:加入3%的H 2〇2(約IOmin)，然后用蒸餾水進 行水洗3min，之后再用PBS(0.01M PH=7.5)清洗切片三次(每次約5min);
[0098] (5)滴加 α-SMA和TGF-βΙ-抗，工作濃度為1:100，將切片放置在濕盒中，于4°C冰箱 內(nèi)孵育過夜；
[0099] (6)PBS清洗切片三次（每次約5min)，然后滴加 HRP共輒的抗鼠或抗兔IgG二抗 (EnVision工作液），將其放置于室溫30min;
[0100] (7)PBS清洗切片三次(每次約5min)，然后加入DAB顯色液孵育20min;
[0101] (8)蒸餾水洗，終止顯色；
[0102] (9)用Harris蘇木精來復染切片30s，然后用蒸餾水清洗切片（約lOmin，是為了進 行蘭化）；
[0103] (10)依次在梯度酒精中（100%酒精3min，95%酒精3min，80%酒精3min，70%酒精 3min)處理，然后用二甲苯透明，接著用中性樹脂進行封片；
[0104] (11)瞭干，在顯微鏡（1X83 ,Olympus)下觀察并拍照。
[0105] 分別收集四個組(CCl4組，Vehicle組，MenSCs組和PBS組)小鼠的肝組織，利用免疫 組化檢測α-SMA和TGF-βΙ的蛋白表達情況。纖維化模型組命名為CCl4組;將只注射橄欖油的 正常組小鼠命名為Vehicle組;將MenSCs移植到肝纖維化模型小鼠命名為MenSCs組；以及將 PBS注射到肝纖維化模型小鼠命名為PBS組。在Vehicle組中a-SMA的表達僅限于血管平滑肌 細胞和中央靜脈周圍；而在CCU組中a-SMA能夠表達于竇周間隙，表明HSCs被激活了。 MenSCs移植到纖維化小鼠1周和2周后，MenSCs IW組（相比于PBS IW組）和MenSCs 2W組（相 比于PBS 2W組）的a-SMA表達明顯受到了抑制，說明MenSCs移植能夠降低HSCs的激活。類似 地，在Vehicle組中TGF-βΙ表達于細胞漿中且?guī)缀跞勘磉_，而在CCl 4組中TGF-βΙ的表達也 是全部表達于所有細胞中，但是其表達量明顯增強。MenSCs移植到纖維化小鼠1周和2周后， MenSCs IW組的TGF-βΙ表達與PBS IW組相比，并沒有顯著性差異，而MenSCs 2W組（相比于 PBS 2W組）的TGF-βΙ表達強度明顯減弱。
[0106] 實施例6.4.3:Western blot檢測a-SMA的蛋白表達
[0107] 麻醉處死小鼠后，分別收集四個組(CC14組，Vehi cle組，MenSCs組和PBS組，各組的 命名同實施例6.4.2)小鼠的肝臟組織，取米粒大小的肝臟，用小型勻漿器破碎組織。首先加 入500yL的蛋白裂解液(按照比例RIPA裂解液:PMSF= 100 :1進行配制），然后在冰上進行裂 解(約60min)，接著4°C離心（12000rpm，5min)，將離心所得的上清液轉(zhuǎn)移到1.5mL的EP管中。 利用BCA試劑盒測定肝組織樣品的蛋白濃度，做好記錄并保存于-80°C冰箱備用。
[0108] 每個組別取20yg蛋白上清液，western blot實驗檢測a-SMA蛋白表達。具體步驟如 下：
[0109] (1)蛋白上清液按照 1:4的比例混合于4X loading buffer(Life Technologies) 中，將混合后的樣品放入到98°C金屬加熱儀(加熱5min)，使樣品中的蛋白質(zhì)得到充分的變 性；
[0110] (2)把10%預制膠(Life Technologies)放入電泳槽中，將樣品加入新鮮的電泳緩 沖液(Life Technologies)中跑膠，以電壓為120V的強度進行電泳(大約70min，以藍色指示 劑到達預制膠3/4處為宜）；
[0111] (3)用專門的切膠器進行切膠，然后依次鋪上三層海綿，四層過濾濾紙，切下來的 凝膠，PVDF膜(Millipore)，四層過濾濾紙，三層海綿，隨后將配制好的轉(zhuǎn)膜緩沖液倒入 western blot電泳槽(Life Technologies)中，接著將其轉(zhuǎn)入4°C冰箱中且以恒定的電流 (200mA)進行轉(zhuǎn)膜Ih;
[0112] (4)用0.5%的BSA溶液(生工生物科技有限公司），并放置于搖床上室溫平搖封閉 Ih左右；
[0113] (5)用TBST洗膜2次(每次洗膜約10min，置于搖床上進行），然后加入一抗于4°C孵 育過夜；
[0114] (6) -抗回收，用TBST洗膜3次(每次洗膜約10min，置于搖床上進行）；
[0115] (7)加入相應的二抗，然后在室溫下放置于搖床中孵育Ih;
[0116] (8)用TBST洗膜3次（每次洗膜約IOmin，置于搖床上進行），加入ECL化學發(fā)光液 (Bio-Rad)，在全自動凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-4500智能轉(zhuǎn)換型）下進行掃膜并拍照。
[0117] 其中，轉(zhuǎn)膜緩沖液的配方:甘氨酸為2 · 9g，Tris為5 · 8g，SDS為0 · 37g，甲醇200mL，加 CldH2O定容至1000 mL; TBST的配方：Tris-base為24.4g和NaCl為80g，用濃HCl調(diào)整PH至7.4 (PH 指示劑），然后加 0.〇5% 的 Tween2O(Sigma)0
[0118] 結(jié)果表明，Vehicle組幾乎不表達a-SMA，CCl4組的表達量呈顯著上升;MenSCs IW 組的蛋白表達量相比于PBS IW組有顯著下降趨勢，同樣地，MenSCs 2W組的蛋白表達量相比 于PBS 2W組也有顯著下調(diào)趨勢。
[0119] 為了進一步調(diào)查經(jīng)血干細胞是如何改善肝纖維化，本發(fā)明的發(fā)明人進行了一下實 施例。
[0120] 實施例7:MenSCs和LX-2細胞Transwell模型的建立
[0121] 為了研究MenSCs對LX-2細胞的影響，利用Transwel 1小室(濾膜直徑:24mm，濾膜孔 徑:0.4ym;Crning)，將本研究分為3個組別，即LX-2組(n = 4)，2X IO5ZVell的LX-2細胞鋪于 Transwell小室的下層；MenSC組（n = 4)，2 X 105/well的MenSCs鋪于Transwell小室的上層； 共培養(yǎng)組（co-culture組）（n = 4)，2 X 105/'\^11的1^(-2細胞鋪于1'瓜118￥611小室的下層并且 2 X IOVwell的MenSCs鋪于Transwell小室的上層。每個小室均加3mL的DMEM培養(yǎng)基（10% FBS )。
[0122] 實施例8 :MenSCs對LX-2細胞增殖的影響
[0123] 為了研究MenSCs對LX-2細胞增殖的影響，采CCK-8(Dojindo)試劑盒檢測LX-2組和 共培養(yǎng)組(co-culture組）中LX-2細胞增殖情況，具體的實驗步驟如下：
[0124] (I )LX_2 組(n = 4)和共培養(yǎng)組（co-culture 組）（n = 4)共培養(yǎng) 24h，48h 和 72h;
[0125] (2)按照說明書，分別向其底層加入一定量的CCK-8試劑(同時設定空白對照組；
[0126] (3)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h(視情況l_3h);
[0127] (4)用多功能酶標儀（SpectraMax M5，Molecular Devices)測定在450nm處的OD 值；
[0128] (5)計算，將所得到的OD值減去相應的空白對照。所得結(jié)果即為該組別的OD450。
[0129] 2 · 2 · 4 · IMenSCs抑制LX-2細胞增殖
[0130] 在共培養(yǎng)實驗進行之前，驗證了 LX-2細胞。通過細胞免疫熒光染色技術(shù)，發(fā)現(xiàn)LX-2 細胞幾乎全部表達a_SMA(>95 % )，同時放大400倍后發(fā)現(xiàn)細胞生長狀態(tài)良好，基本骨架清晰 正常。說明LX-2細胞已經(jīng)處于激活狀態(tài)，能夠作為后續(xù)的共培養(yǎng)實驗。
[0131] 在共培養(yǎng)實驗中，觀測了LX-2組和共培養(yǎng)組(co-culture組)在共培養(yǎng)24h，48h和 72h之后，LX-2細胞的細胞形態(tài)和數(shù)目。發(fā)現(xiàn)，雖然在細胞培養(yǎng)24h后，LX-2組和共培養(yǎng)組 (co-culture組）中的LX-2細胞數(shù)目差異不顯著;在細胞共培養(yǎng)48h和72h后，共培養(yǎng)組(C 0-culture組）中的LX-2細胞的數(shù)目明顯少于LX-2組。更進一步，用CCK-8實驗檢測并驗證了 LX-2細胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)48h和72h的共培養(yǎng)后，共培養(yǎng)組(co-culture組）中的OD值明顯低 于LX-2組，也就是說共培養(yǎng)使得LX-2細胞的生長和增殖明顯受到抑制。
[0132] 實施例9 =MenSCs對LX-2細胞周期的影響
[0133] 為了研究MenSCs對LX-2細胞周期的影響，利用細胞周期試劑盒(Sigma)檢測LX-2 組和共培養(yǎng)組(co-culture組）中LX-2細胞培養(yǎng)48h和72h的細胞周期情況。具體的細胞周期 實驗步驟如下：
[0134] (I )LX_2 組(n = 4)和共培養(yǎng)組（co-culture 組）（n = 4)共培養(yǎng) 48h 和 72h;
[0135] (2)將細胞消化于15mL離心管中，用70 %預冷的乙醇固定，隨后室溫沉淀細胞 (1000 rpm，5min)，去上清；
[0136] (3)加 lmL7令PBS重懸細胞，隨后沉淀細胞（1000印111，51^11)，倒掉?83;
[0137] (4)配制PI染色液，按照下列比例配制，包括緩沖液(475yL)，20XPI染色液(25yL) 和50XRNAase A(IOyL);
[0138] (5)每管細胞加入500yL的PI染色液，然后緩慢并充分地重懸細胞；
[0139] (6)37°C避光孵育30min，然后用300目的細胞篩過濾細胞，利用流式細胞儀 (Beckman)檢測細胞周期。
[0140] 通過流式細胞術(shù)檢測了LX-2組和共培養(yǎng)組(co-culture組）中LX-2細胞48h和72h 的細胞周期情況。共培養(yǎng)48h后，LX-2組和共培養(yǎng)組(co-culture組）中的LX-2細胞G0/G1期， S 期和 G2/M 期分別是 47 ± 2 % (G0/G1)，35±3%(S)，18±1% (G2/M)和 62 ± 3 % (G0/G1)，23 土 2 % (S)，15 ± 1 % (G2/M)。類似地，共培養(yǎng)72h后，LX-2組和共培養(yǎng)組(co-cul ture組）中的LX-2細胞 G0/G1 期，S期，G2/M 期分別是 71±3%(G0/G1)，15±2%(S)，14±1%(G2/MWP83±3% (60/61)，8±2%(5)，9±1%(62/]\〇。也就是說在4811和7211時，共培養(yǎng)組((3〇-(3111加代組）中， 處于G0/G1期的LX-2細胞顯著高于LX-2組。說明MenSCs能夠?qū)X-2細胞阻滯于G0/G1期，并 能抑制其增殖。
[0141 ]實施例10:抗體芯片檢測細胞上清液的蛋白表達
[0142] 為了進一步探究MenSCs分泌哪些因子來對LX-2細胞增殖產(chǎn)生抑制效應，利用人細 胞因子G1000芯片(AAH-CYT-G1000 ,RayBiotech)來檢測LX-2組，MenSC組和共培養(yǎng)組（coculture 組) 培養(yǎng) 72h 后 120 個細胞因子的上清。細胞上清采用上下層培養(yǎng)液混合后統(tǒng)一收集 的方式。具體的實驗步驟如下：
[0143] (1)將新的玻片芯片(保存于-20°C)從盒子中取出來，在室溫下平衡30min，然后將 芯片放置于干燥器中2h，以保證芯片完全干燥；
[0144] (2)每個芯片孔中加入IOOyL的I X封閉液，然后在室溫搖床上孵育30min(主要是 為了避免產(chǎn)生氣泡而影響實驗結(jié)果）；
[0145] (3)將封閉液倒掉，在每個孔中添加 IOOyL細胞上清樣品（LX-2組，MenSC組和共培 養(yǎng)組(co-culture組），n = 4)，一個陣列加入一個樣品(n = 4)，將芯片平穩(wěn)放置并于4°C孵育 過夜；
[0146] (4)使用Thermo Scientific Wellwash Versa芯片洗板機清洗玻片；
[0147] (5)配制生物素標記的抗體，然后快速離心標記有生物素抗體的小管，每個小管中 加入300yL的IX封閉液，混合均勻后再每孔加入70yL的生物素標記抗體；
[0148] (6)每孔加入等量的（70yL)熒光劑-鏈霉親和素（1500倍稀釋比例），然后快速離心 并加入1.5mL的封閉液到小管中，接著用密封條將玻璃芯片貼住，然后再用鋁箱紙包住玻璃 芯片并在避光條件下室溫孵育2h;
[0149] (7)焚光檢測：米用激光掃描儀(GenePix 4000B Microarray Scanner)掃描信號， 采用數(shù)據(jù)分析軟件對因子進行相關(guān)的數(shù)據(jù)分析（具體篩選因子的條件：共培養(yǎng)組（coculture組) 與 LX-2組/MenSC 組均有顯著性差異 ，熒光強度值不低于 300)。
[0150] 2.2.4.3抗體芯片檢測差異表達的因子
[0151] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCP-I，IL-6，HGF，GR0, IL-8和OPG高表達于共培養(yǎng)組（co-culture組） (相比較LX-2組和MenSC組）。此外，對所有差異表達的因子(詳見表2)進行了熱圖分析。進一 步確信MCP-I，IL-6，HGF，GR0, IL-8和OPG是這些差異因子中更為顯著的。這些因子中，MCP-I 和IL-6的上升倍數(shù)最顯著，其次是HGF，GR0和IL-8。有趣的是，OPG因子在MenSC組和共培養(yǎng) 組(co-culture組)均能高表達，而在LX-2組幾乎不表達。
[0152] 表2差異表達的因子和編號
[0154] 實施例11 :ELISA檢測細胞上清液以及細胞裂解液的蛋白表達
[0155] 為了進一步驗證這些抗體芯片中得到的差異較明顯的因子(MCP-1，IL-6，HGF， GR0，IL-8和0PG)，利用ELISA試劑盒（RayBiotech)，定量檢測LX-2組，MenSC組和共培養(yǎng)組 (co-culture組)培養(yǎng)72h后細胞上清液以及細胞的蛋白表達量。細胞的測定是通過細胞裂 解液(CST)來收集并檢測，其中的共培養(yǎng)-LX-2代表共培養(yǎng)組(co-culture組）中下層的LX-2 細胞;共培養(yǎng)-MenSC代表共培養(yǎng)組(co-culture組）中上層的MenSCs。具體的ELI SA實驗步驟 如下：
[0156] (1)將芯片放置在試劑盒以及樣品平衡至室溫（18-25Γ)，所有標準品以及樣品使 用單孔檢測；
[0157] (2)將已經(jīng)包被抗體的ELISA板放置于室溫下平衡30min，隨后在對應的孔中加入 IOOyL配制好的標準品（Raybiotech)及樣品（細胞上清或細胞裂解液），接著用封板膜封住 板條并于4°C孵育過夜；
[0158] (3)將配制好的IX洗液放置于洗板機上，用洗板機來清洗板條（清洗4次，每次 IOmin)，隨后在每個芯片孔中加入300yL的洗液；
[0159] (4)將洗板清洗干凈后，再在每個芯片孔中加入IOOyL配制好的檢測抗體(用生物 素抗體進行標記)并于室溫下孵育Ih;
[0160] (5)每個芯片孔中加入IOOyL配制好的HRP-鏈霉親和素并于室溫下孵育45min，然 后繼續(xù)清洗板條步驟同（3);
[0161 ] (6)加入IOOyL TMB(3,3'，5,5'_Tetramethylbenzidine)顯色液到每個芯片孔中 并于室溫下避光孵育30min;
[0162] (7)加入50yL終止液到每個芯片孔中，然后用多功能酶標儀(Molecular Devices) 測定在450nm處的OD值，采用Sigmaplot 12.0軟件來計算樣品中的蛋白濃度值。
[0163] 為了進一步驗證這些抗體芯片中得到的差異較明顯的因子(MCP-1，IL-6，HGF， GRO，IL-8和OPG)，利用ELI SA定量檢測LX-2組，MenSC組和共培養(yǎng)組(co-cul ture組)培養(yǎng)72h 后細胞上清液以及細胞的蛋白表達量。在細胞上清的結(jié)果中，其表達量雖然和抗體芯片不 一致，但是其趨勢和抗體芯片一致，進一步確認MCP-I，IL-6，HGF，GRO，IL-8和OPG因子的重 要作用（圖1A)。
[0164] 此外，為了確認這些因子中的主要分泌者是MenSCs還是LX-2細胞，使用細胞ELISA 來進一步驗證。三個組別的細胞(LX-2組，LX-2細胞;共培養(yǎng)組(co-cul ture組），共培養(yǎng)-LX-2和共培養(yǎng)-MenSC; MenSC組，MenSCs)用細胞裂解液進行裂解，然后進行ELI SA檢測。從結(jié)果 可知（圖 1B)，共培養(yǎng)-MenSC組相比于單一的MenSC組：MCP-l(361±33vs.29±5pg/mg;12 倍），11-6(967±10切8.90±23口8/11^;11倍），邪卩（927±20扣8.176±48口 8/11^;5倍），61?0 (432±96丫8.224±69口8/11^ ;2倍），11^-8(1033±163￥8.403±75口8/11^;3倍）和0?6(1338± 27(^8.510±103?8/11^ ;3倍）。類似地，共培養(yǎng)-1^-2組相比于單一的1^-2組：61?0(94± 25vs · 12 ± 6pg/mg; 8倍）和IL-8 (165 ± 46vs · 24 ± 9pg/mg; 7倍），而剩下的MCP-I，IL-6，HGF和 OPG無顯著性差異。
[0165] 實施例12:白介素 -8(IL_8)改善小鼠的肝纖維化
[0166] 如實施例6.1和6.2所示，以1.5mg/Kg的劑量通過尾靜脈注射重組人白介素-8(IL-8) (R&D Systems公司）到已經(jīng)構(gòu)建好的纖維化模型小鼠中（白介素-8(IL-8)組），對照為只 注射等量PBS的肝纖維化模型小鼠（PBS組）。在注射后的第1周和第2周，處死小鼠并進行SR 染色，觀察并檢測膠原纖維面積。結(jié)果表明，盡管在第1周白介素-8(IL-8)組（1.8%)的膠原 積累面積低于PBS組(2.4%)，但其在統(tǒng)計學上并沒有顯著性差異；相反，在第2周白介素-8 (IL-8)組（1.3%)的膠原纖維面積相比于PBS組(3.4%)有明顯減少，說明肝纖維化在白介 素-8(IL-8)的作用下，其狀況得到了顯著改善。
[0167] 與此同時，發(fā)明人按照實施例6.4進行了免疫組織化學檢測α-SMA和TGF-βΙ的蛋白 表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射白介素 -8(IL-8)到纖維化小鼠 1周和2周后，相對于PBS組而言白 介素_8( IL_8)組的α-SMA和TGF-βΙ的表達明顯受到了抑制。這進一步驗證了白介素-8(IL-8)在改善或治療肝纖維化方面的作用。
[0168] 實施例13:白介素-8(IL-8)和骨保護素(OPG)的組合改善小鼠的肝纖維化
[0169] 如實施例6.1和6.2所示，分別以1.51^/敁和511^/敁的劑量通過尾靜脈注射重組人 白介素-8(IL-8)(R&D Systems公司）和重組人骨保護素(R&D Systems公司）到已經(jīng)構(gòu)建好 的纖維化模型小鼠中（聯(lián)合組），對照為注射等量重組人白介素-8(IL-8)和與重組人骨保護 素等量的PBS的肝纖維化模型小鼠（對照組）。在注射后的第1周和第2周，處死小鼠并進行SR 染色，觀察并檢測膠原纖維面積。結(jié)果表明，在第1周聯(lián)合組(1.0%)的膠原積累面積顯著低 于對照組(2.0%)，在第2周聯(lián)合組(0.6%)的膠原纖維面積相比于對照組（1.3%)有明顯減 少，說明肝纖維化在白介素-8(IL-8)和骨保護素(OPG)聯(lián)合作用下肝纖維化狀況得到了更 顯著改善。
[0170] 與此同時，發(fā)明人按照實施例6.4進行了免疫組織化學檢測α-SMA和TGF-βΙ的蛋白 表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組相對于對照組而言a-SMA和TGF-βΙ的表達受到了更明顯的抑 制。這進一步驗證了白介素-8(IL-8)和骨保護素(OPG)的組合在改善或治療肝纖維化方面 的更加優(yōu)異的作用。
[0171] 實施例14:白介素-8(IL-8)和單核細胞趨化蛋白I (MCP-1)的組合改善小鼠的肝纖 維化
[0172] 如實施例6.1和6.2所示，分別以1.51^/敁和411^/敁的劑量通過尾靜脈注射重組人 白介素-8(IL-8) (R&D Systems公司）和重組人單核細胞趨化蛋白I (MCP-1) (R&D Systems公 司）到已經(jīng)構(gòu)建好的纖維化模型小鼠中（聯(lián)合組），對照為注射等量重組人白介素-8(IL-8) 和與重組人單核細胞趨化蛋白I(MCP-I)等量的PBS的肝纖維化模型小鼠（對照組）。在注射 后的第1周和第2周，處死小鼠并進行SR染色，觀察并檢測膠原纖維面積。結(jié)果表明，在第1周 聯(lián)合組（1.5%)的膠原積累面積顯著低于對照組(2.1%)，在第2周聯(lián)合組(0.9%)的膠原纖 維面積相比于對照組（1.4%)有明顯減少，說明肝纖維化在白介素-8(IL-8)和單核細胞趨 化蛋白I(MCP-I)聯(lián)合作用下肝纖維化狀況得到了更顯著改善。
[0173] 與此同時，發(fā)明人按照實施例6.4進行了免疫組織化學檢測a-SMA和TGF-βΙ的蛋白 表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組相對于對照組而言a-SMA和TGF-βΙ的表達受到了更明顯的抑 制。這進一步驗證了白介素-8(IL-8)和單核細胞趨化蛋白I(MCP-I)的組合在改善或治療肝 纖維化方面的更加優(yōu)異的作用。
[0174] 實施例15:白介素-8(IL-8)和肝細胞生長因子(HGF)的組合改善小鼠的肝纖維化
[0175] 如實施例6.1和6.2所示，分別以1.5mg/Kg和lmg/Kg的劑量通過尾靜脈注射重組人 白介素_8(IL_8) (R&D Systems公司）和重組人HGF蛋白（R&D Systems公司）至Ij已經(jīng)構(gòu)建好的 纖維化模型小鼠中（聯(lián)合組），對照為注射等量重組人白介素-8(IL-8)和與重組人HGF蛋白 等量的PBS的肝纖維化模型小鼠（對照組）。在注射后的第1周和第2周，處死小鼠并進行SR染 色，觀察并檢測膠原纖維面積。結(jié)果表明，在第1周聯(lián)合組(0.9%)的膠原積累面積顯著低于 對照組（2.0%)，在第2周聯(lián)合組（0.5%)的膠原纖維面積相比于對照組（1.4%)有明顯減 少，說明肝纖維化在白介素-8(IL-8)和HGF聯(lián)合作用下肝纖維化狀況得到了更顯著改善。
[0176] 與此同時，發(fā)明人按照實施例6.4進行了免疫組織化學檢測a-SMA和TGF-βΙ的蛋白 表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組相對于對照組而言a-SMA和TGF-βΙ的表達受到了更明顯的抑 制。這進一步驗證了白介素-8(IL-8)和HGF的組合在改善或治療肝纖維化方面的更加優(yōu)異 的作用。
[0177] 實施例16:白介素 -8(IL-8)和腫瘤生長相關(guān)因子(GRO)的組合改善小鼠的肝纖維 化
[0178] 如實施例6.1和6.2所示，分別以1.51^/敁和211^/敁的劑量通過尾靜脈注射重組人 白介素-8(IL_8)(R&D Systems公司）和重組人GROa蛋白（R&D Systems公司）到已經(jīng)構(gòu)建好 的纖維化模型小鼠中（聯(lián)合組），對照為注射等量重組人白介素-8(IL-8)和與重組人GRO蛋 白等量的PBS的肝纖維化模型小鼠（對照組）。在注射后的第1周和第2周，處死小鼠并進行SR 染色，觀察并檢測膠原纖維面積。結(jié)果表明，在第1周聯(lián)合組(1.0%)的膠原積累面積顯著低 于對照組(2.1%)，在第2周聯(lián)合組(0.6%)的膠原纖維面積相比于對照組（1.3%)有明顯減 少，說明肝纖維化在白介素-8(IL-8)和GRO聯(lián)合作用下肝纖維化狀況得到了更顯著改善。
[0179] 與此同時，發(fā)明人按照實施例6.4進行了免疫組織化學檢測a-SMA和TGF-βΙ的蛋白 表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組相對于對照組而言a-SMA和TGF-βΙ的表達受到了更明顯的抑 制。這進一步驗證了白介素-8(IL-8)和GRO的組合在改善或治療肝纖維化方面的更加優(yōu)異 的作用。
[0180] 用重組人GRO0蛋白（R&D Systems公司）和重組人GROy蛋白（R&D Systems公司）分 別替換上述的重組人GROa蛋白（R&D Systems公司），也均顯示出肝纖維化在白介素-8(IL_ 8)和GRO聯(lián)合作用下肝纖維化狀況得到了更顯著改善（其中與重組人GR0i3蛋白的聯(lián)合下效 果最優(yōu)），以及a-SMA和TGF-βΙ的表達受到了更明顯的抑制。
[0181] 這說明了白介素-8(IL-8)和不同形式的重組人GRO蛋白的組合在改善或治療肝纖 維化方面的作用。
[0182] 實施例17:白介素-8(IL-8)和白介素-6(IL-6)的組合改善小鼠的肝纖維化
[0183] 如實施例6.1和6.2所示，分別以1.51^/敁和1.511^/敁的劑量通過尾靜脈注射重組 人白介素 _8(IL_8)(R&D Systems公司）和重組人IL-6蛋白（R&D Systems公司）至Ij已經(jīng)構(gòu)建 好的纖維化模型小鼠中（聯(lián)合組），對照為注射等量重組人白介素-8(IL-8)和與重組人IL-6 蛋白等量的PBS的肝纖維化模型小鼠（對照組）。在注射后的第1周和第2周，處死小鼠并進行 SR染色，觀察并檢測膠原纖維面積。結(jié)果表明，在第1周聯(lián)合組（1.0%)的膠原積累面積顯著 低于對照組(2.3%)，在第2周聯(lián)合組(0.3%)的膠原纖維面積相比于對照組（1.6%)有明顯 減少，說明肝纖維化在白介素-8(IL-8)和IL-6聯(lián)合作用下肝纖維化狀況得到了更顯著改 善。
[0184] 與此同時，發(fā)明人按照實施例6.4進行了免疫組織化學檢測a-SMA和TGF-βΙ的蛋白 表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組相對于對照組而言a-SMA和TGF-βΙ的表達受到了更明顯的抑 制。這進一步驗證了白介素-8(IL-8)和IL-6的組合在改善或治療肝纖維化方面的更加優(yōu)異 的作用。
[0185] 雖然用上述實施方式描述了本發(fā)明，應當理解的是，在不背離本發(fā)明的精神的前 提下，本發(fā)明可進行進一步的修飾和變動，且這些修飾和變動均屬于本發(fā)明的保護范圍之 內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種用于治療肝纖維化的藥物，其含有白介素-8,以及任選地，藥學上可接受的載 體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其中所述的藥物還含有選自由單核細胞趨化蛋白1、肝 細胞生長因子、腫瘤生長相關(guān)因子GRO和白介素-6組成的組中的1個、2個、3個或4個。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其為適于注射、輸注或口服的劑型。4. 根據(jù)權(quán)利要求2的藥物，其中藥物的包裝形式適于白介素-8和其他活性成分被同時 施用或按序先后施用。5. 白介素-8在制備用于治療受試者中肝纖維化的藥物中的用途。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述的藥物還含有選自由單核細胞趨化蛋白1、肝 細胞生長因子、腫瘤生長相關(guān)因子GRO和白介素-6組成的組中的1個、2個、3個或4個。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6的用途，其中所述藥物為適于注射、輸注或口服的劑型。8. 根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中藥物的包裝形式適于白介素-8和其他活性成分被同時 施用或按序先后施用。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述的受試者為哺乳動物，優(yōu)選為人。10. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的藥物或根據(jù)權(quán)利要求5-9中任一項所述的用途， 其中所述的白介素-8為天然的白介素_8或人重組白介素-8。
【文檔編號】A61K38/19GK105944086SQ201610414306
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月13日
【發(fā)明人】余艷春
【申請人】浙江生創(chuàng)精準醫(yī)療科技有限公司