短肽作為疫苗佐劑的應用及疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種短肽作為疫苗佐劑的應用及以上述短肽作為疫苗佐劑的疫苗，該短肽制備簡單、簡便地與抗原物理混合后即可有效增強抗原免疫應答的能力。所述短肽作為疫苗佐劑的應用中，所述短肽以基團X封端，所述短肽序列為X?GFF，或所述短肽包含序列FFY。優(yōu)選的，所述包含序列FFY的短肽序列為X?FFY、X?GFFY、X?GFFYK、X?GFFYE或X?GFFYG；優(yōu)選的，所述短肽為D構型。上述短肽可以作為免疫佐劑來增強抗原的免疫原性，使得主體發(fā)生強烈的抗原特異性的細胞免疫和體液免疫應答，且所述短肽能適用于各類抗原；所述短肽易于制備、成份單一可控。
【專利說明】
短肽作為疫苗佐劑的應用及疫苗
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種短肽作為疫苗佐劑的應用及疫苗。
【背景技術】
[0002] 隨著免疫學的不斷深入研究、日益成熟的基因工程技術以及合成技術的飛速發(fā) 展，人類已研制出多種DNA重組疫苗、短肽疫苗等新型疫苗。這些新興的疫苗雖然有很多優(yōu) 點，例如易于合成、提純、抗原特異性強，但其較弱的免疫原性卻成為其致命的缺點，導致其 不能誘發(fā)強有力的免疫反應，限制了其在臨床上的使用。在實際應用中，其往往需用免疫佐 劑來增強其免疫原性或增強宿主對抗原的特異性應答。截止到目前為止，鋁佐劑是唯一通 過FDA批準的能用于人的佐劑，然而它只能激發(fā)相應的體液免疫，不能誘導機體產(chǎn)生相應的 細胞免疫，而細胞免疫在很多疾病(病毒感染、腫瘤等)的免疫治療方面又是必不可少的，因 此鋁佐劑對許多病毒、疾病等抗原無免疫佐劑性效果，這就使得開發(fā)新型的能夠用于人體 的治療性免疫佐劑顯得迫在眉睫。
[0003] 除了 Π )Α批準的應用于人體的鋁佐劑，現(xiàn)在研究中或者可以應用于動物的佐劑主 要有弗氏佐劑、脂質(zhì)體、單磷酰脂質(zhì)Α、細胞因子、CpG免疫調(diào)節(jié)序列等等。然而，這些免疫佐 劑不是安全性差，就是造價太高、不易于合成純化，或者增強抗原免疫應答的能力差，尚不 能滿足它們在臨床使用的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的
[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種短肽作為疫苗佐劑的應用，該短肽制備簡單、簡便 地與抗原物理混合后即可有效增強抗原免疫應答的能力。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種以上述短肽作為疫苗佐劑的疫苗。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種短肽作為疫苗佐劑的應用，所述短肽 以基團X封端，所述短肽序列為X-GFF，或所述短肽包含序列FFY。所述基團X可選擇本領域常 用的含芳香環(huán)封端基團，例如Nap。
[0009] "短肽"為本領域常用術語，指由3-9個氨基酸殘基組成的短鏈肽。
[0010] 優(yōu)選的，所述包含序列FFY的短肽序列為X-FFY、X-GFFY、X-GFFYK、X-GFFYESX-GFFYG0
[0011 ] 優(yōu)選的，所述短肽為D構型，例如所述短肽 GdFdFdYdK、X-GdF dFdYdE 或 X-GdFdFdYdG 〇
[0012]優(yōu)選的，X 為Nap、PTZ、Bio 或Fmoc，更優(yōu)選為Nap。
[0013]進一步優(yōu)選的，所述短肽序列為Nap-DFDFDY、Nap-G DFDFDY、Nap-GDFDF DYDK或Nap-GdFdFdY dG ;最優(yōu)選的，所述短肽序列為Nap-GDFDFDYDK 〇
[0014]以下為上述部分優(yōu)選的短肽的結構式：


[0018] 本發(fā)明中所述氨基酸序列如未特別說明，則對其構型無限制。
[0019] 所述短肽可采用公知的FMOC-固相合成方法合成。
[0020] 所述短肽作為疫苗佐劑應用時可選用多種物理形式，對其增強免疫應答的能力不 會產(chǎn)生實質(zhì)性影響，例如可以與水混合均勻后與抗原混合得到疫苗，或者，由于所述短肽具 有良好的成膠性能，也可以以短肽水凝膠的形式進行應用，具體的，所述短肽的水混合物經(jīng) 加熱冷卻的方法形成短肽水凝膠，然后與抗原混合，靜置后形成的水凝膠用作疫苗。作為本 領域常識，所述短肽的水混合物應具備良好的生物相容性，因此，需要將短肽與具有良好生 物相容性的水溶液混合得到所述短肽的水混合物。常見的，所述具有良好生物相容性的水 溶液可以是生理鹽水或PBS溶液。這種疫苗制備方法簡單實用、成分可控。所述形成水凝膠 的加熱冷卻方法為公知方法，具體為:使用電吹風或者油浴鍋等加熱裝置加熱短肽的水混 合物至短肽完全溶解(一般需要加熱到到90°C以上），冷卻之后形成凝膠(一般冷卻至20-40 °C即可）。成膠與否通過倒置瓶子的方法判斷，保留在瓶子底部為水凝膠，如果是流動的則 為液體。
[0021] 所述疫苗可以為蛋白疫苗、細胞疫苗或短肽疫苗。
[0022] 所述短肽的用量可以由本領域技術人員經(jīng)簡單實驗確定，一般用于蛋白疫苗和短 肽疫苗時，所述短肽與抗原的質(zhì)量比為5:1-30:1，更優(yōu)選為5:1-20:1，用于細胞疫苗時，所 述短肽的最終濃度為0.5-5mg/mL。
[0023] 在本發(fā)明的第二方面，還提供了一種以上述短肽作為疫苗佐劑的疫苗。所述短肽 可以方便地與抗原物理混合得到疫苗。
[0024] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述短肽可以作為免疫佐劑來增強抗原的免疫原性，使得主體發(fā)生 強烈的抗原特異性的細胞免疫和體液免疫應答，且所述短肽能適用于各類抗原;所述短肽 易于制備、成份單一可控。
[0025] 本發(fā)明增加了免疫佐劑的種類，為開發(fā)能應用于人體的免疫佐劑提供了有價值的 信息。
【附圖說明】
[0026] 圖1:蛋白疫苗vac-1、vac-2、0VA、Alum-0VA引發(fā)免疫反應的抗體滴度；
[0027] 圖2:蛋白疫苗vac-2、vac_3、vac_4、vac-5、OVA、Alum-OVA引發(fā)免疫反應的抗體滴 度；
[0028] 圖3:蛋白疫苗 vac-2、vac-6、vac-7、vac-8、vac_9、0VA、Alum-0VA 引發(fā)免疫反應的 抗體滴度；
[0029] 圖4:蛋白疫苗似(3-2、似(3-10、似(3-11、似(3-12、0￥厶引發(fā)免疫反應的抗體滴度；
[0030] 圖 5:細胞疫苗 ￥&(3-13、￥&(3-14、乂1'(：、1^161、0飛61刺激〇)8+正1丫+1'細胞增殖的效 果（圖5a))以及它們的腫瘤抑制效果（圖5b));
[0031 ]圖6:短肽疫苗vac-15、epitope、Alum_epitope引發(fā)免疫反應的抗體滴度。
【具體實施方式】
[0032]下面用實施例進一步描述本發(fā)明，但所述實施例僅用于本發(fā)明而不是限制本發(fā) 明。
[0033] 以下實施例中，通過本領域常用的倒置小瓶的方法檢驗水凝膠的形成與否。
[0034] 以下實施例中所涉及制劑來源如下：
[0035] 培養(yǎng)基，RMPI 1640,購自賽默飛世爾科技(ThermoFisher Scientific)，無菌；
[0036] 胎牛血清，購自賽默飛世爾科技(ThermoFisher Scientific)，無菌；
[0037] 2-cl-Trt樹脂購自天津南開和成科技有限公司，活性1.2mmol/mL;
[0038] N，N-二異丙基乙胺（以下用DIEPA表示），購自西格馬奧德里奇公司（Sigma-Aldrich)，純度99%;
[0039]苯并三氮唑，，^^'-四甲基脲六氟磷酸酯丨以下用冊扣表示八購自吉爾生化 (上海)有限公司，純度98%;
[0040] 三氟乙酸（以下用TFA表示），購自西格馬奧德里奇公司（Sigma-Aldrich)，純度 99% ；
[0041 ] 三異丙基硅烷（以下用TIS表示），購自西格馬奧德里奇公司（Sigma-Aldrich)Ji 度 99 %;
[0042] L構型及D構型氨基酸購自吉爾生化(上海)有限公司，純度98%;
[0043] 無內(nèi)毒素的雞卵清蛋白（以下簡稱OVA蛋白）購自InvivoGen公司，純度99% ;
[0044] 錯佐劑購自賽默飛世爾科技(ThermoFisher Scientific)，純度99% ;
[0045] 萘乙酸、氟代吩噻嗪、生物素購自西格馬奧德里奇公司（Sigma-Aldrich，純度 99% ；
[0046] 短肽B+T epitope購自吉爾生化(上海)有限公司，純度98%;
[0047]癌細胞EG7購自上海歌凡生物，并按以下步驟培養(yǎng)：
[0048] 1)把水浴鍋提前升溫至37°C，將培養(yǎng)基（RPMI 1640)、胎牛血清等放入水浴鍋預 熱，并且同時打開超凈臺紫外燈照射半小時；
[0049 ] 2)從液氮罐中取出凍存的癌細胞EG7，迅速放置在37 °C的水浴鍋中使細胞解凍，之 后迅速轉(zhuǎn)移到超凈臺里進行如下操作:把含細胞的溶液用移液器小心地轉(zhuǎn)移到含有培養(yǎng)基 的離心管中，離心5分鐘，去上清，用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移到含有10%胎牛 血清的培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，然后放入37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0050] 3)第二天觀察細胞狀態(tài)，待細胞狀態(tài)良好后，傳一代以后進行下面的實驗；
[00511 4)收集細胞培養(yǎng)液，吸入到離心管中，1000 rpm轉(zhuǎn)速下離心4min，之后棄掉溶液，加 入新鮮的培養(yǎng)基用槍吹打均勻，用細胞計數(shù)板計數(shù)為5 X IO7個每毫升。
[0052] 所述OVA蛋白溶液為自制，將OVA蛋白溶于I3BS溶液(pH = 7.0)得到5mg/mL的OVA蛋 白溶液；
[0053]所述5 X IO7個每毫升的X光輻照后的癌細胞為自制:取1.5毫升5 X IO7個每毫升的 癌細胞EG7，在輻照儀中以320伏電壓、12.5安的電流輻照8.5分鐘，輻照兩次。
[0054]其余試劑均為市售分析純試劑。
[0055] 制備實施例1
[0056] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠負載OVA蛋白的疫苗vac-Ι的制備 [0057] (1)用FMOC-固相合成方法合成L構型短肽Nap-GFFY，具體步驟如下：
[0058] 1)稱取0.5mmol 2-cl-Trt樹脂于固相合成器中，加入IOmL的無水二氯甲燒（以下 用DCM表示），放置在搖床上搖晃5min，使2-cl-Trt樹脂充分溶脹；
[0059] 2)用洗耳球把DCM從裝有2-cl-Trt樹脂的固相合成器中壓除干凈；
[0060] 3)將0 · 75mmol Fmoc保護的氨基酸溶解在IOmL的無水DCM里，加入0 · 75mmol的 DIEPA，然后轉(zhuǎn)移到上述固相合成器中，再補加0.75mmol的DIEPA，在室溫下反應Ih;
[0061] 4)封閉：用洗耳球除去固相合成器中的反應液，然后用無水DCM洗滌，每次DCM用量 10mL、洗滌時間Imin，共洗5次，加入配好的體積比為無水DCM: DIEPA:甲醇=17:1: 2的溶液 20mL，在室溫下反應10min;
[0062] 5)用洗耳球除去固相合成器中的反應液，先用無水DCM洗滌，每次DCM用量I OmL、洗 滌時間Imin，共洗5次，再用N，N-二甲基甲酰胺（以下用DMF表示)洗滌，每次DMF用量I OmL、洗 滌時間Imin，共洗5次，加入IOmL含體積百分比為20 %的哌啶的DMF，反應25min，再用IOmL含 體積百分比為20 %的哌啶的DMF反應5min，然后用DMF洗滌，每次DMF用量IOmU洗滌時間 Imin，共洗5次，進行下一步反應；
[0063] 6)加入第二個Fmoc保護的氛基酸lmmol、HBTU 1 · 5mmol、DIEPA 2mmol和lOmlDMF， 把配好的溶液加入到上述固相合成器中，反應2h;
[0064] 7)重復步驟5)和6)的方法依次加入需要的氨基酸或封端基團；然后用DMF洗滌5 遍，二氯甲烷洗5遍，進行下步反應；
[0065] 8)按9 5 % TFA，2.5 % TIS，2.5 % H2O體積百分比組成的溶液I OmL加入到上述固相合 成器中，反應半小時(或者TFA與DCM的體積比為1:99，配制成體積百分比濃度為1 %的TFA溶 液，取該TFA溶液每次3mL加入到上述固相合成器中，共加十次，每次反應時間為Imin)，把產(chǎn) 物從2-cl-Trt樹脂上切下，真空濃縮，除去溶劑，得到粗品，之后用HPLC分離提純。
[0066]它的結構表征數(shù)據(jù)如下：
[0067] 4^^(40010^,01^0)38.29((1,1 = 7.3^,110,8.23(^ = 5.7^,111),8.17((1,1 = 7.9Hz,lH) ,8.02(d,J = 8.6Hz,lH) ,7.89-7.79(m,3H) ,7.75(s,lH),7.49-7.39(m,3H), 7.26-7.11(m,12H) ,7.08(d,J = 7.9Hz,2H),4.60-4.40(m,4H) ,3.71(dd,J=16.9,4.9Hz, 2H)，3·57(dd，J=16·4,5·6Ηζ，3Η),2.99-2.85(m，5H),2.81-2.74(m，lH)，2.69-2.62(m, 1H).
[0068] (2)取Img L構型短肽Nap-GFFY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升PBS溶液(pH =7.0 )，用碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0，加熱至沸騰使化合物完全溶解，冷卻到室溫之 后即得短肽水凝膠。
[0069] (3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到（2)中制得的水凝膠中，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，進行物理混合，靜置10分鐘后成膠，得到蛋白疫苗vac-1(最終短肽 的濃度為2mg/mL，OVA蛋白濃度為0 · 2mg/mL)。
[0070] 制備實施例2
[0071] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠負載OVA蛋白的疫苗vac-2的制備 [0072] (1)用FMOC-固相合成方法合成Nap-GWY，具體步驟如下：
[0073] 1)稱取0.5mmol 2-cl-Trt樹脂于固相合成器中，加入IOmL的DCM，放置在搖床上搖 晃5min，使2-cl-Trt樹脂充分溶脹；
[0074] 2)用洗耳球把DCM從裝有2-cl-Trt樹脂的固相合成器中壓除干凈；
[0075] 3)將0 · 75mmol Fmoc保護的氨基酸溶解在IOmL的無水DCM里，加入0 · 75mmol的 DIEPA，然后轉(zhuǎn)移到上述固相合成器中，再補加0.75mmol的DIEPA，在室溫下反應Ih;
[0076] 4)封閉：用洗耳球除去固相合成器中的反應液，然后用無水DCM洗滌，每次DCM用量 10mL、洗滌時間Imin，共洗5次，加入配好的體積比為無水DCM: DIEPA:甲醇=17:1: 2的溶液 20mL，在室溫下反應10min;
[0077] 5)用洗耳球除去固相合成器中的反應液，先用無水DCM洗滌，每次DCM用量I OmL、洗 滌時間Imin，共洗5次，再用DMF洗滌，每次DMF用量10mL、洗滌時間Imin，共洗5次，加入IOmL 含體積百分比為20 %的哌啶的DMF，反應25min，再用IOmL含體積百分比為20 %的哌啶的DMF 反應5min，然后用DMF洗滌，每次DMF用量IOmU洗滌時間Imin，共洗5次，進行下一步反應；
[0078] 6)加入第二個Fmoc保護的氛基酸lmmol、HBTU 1 · 5mmol、DIEPA 2mmol和lOmlDMF， 把配好的溶液加入到上述固相合成器中，反應2h;
[0079] 7)重復步驟5)和6)的方法依次加入需要的氨基酸或封端基團；然后用DMF洗滌5 遍，二氯甲烷洗5遍，進行下步反應；
[0080] 8)按9 5 % TFA，2.5 % TIS，2.5 % H2O的體積比組成的溶液I OmL加入到上述固相合成 器中，反應半小時（或者TFA與DCM的體積比為1:99，配制成體積百分比濃度為1 %的TFA溶 液，取該TFA溶液每次3mL加入到上述固相合成器中，共加十次，每次反應時間為Imin)，把產(chǎn) 物從2-cl-Trt樹脂上切下，真空濃縮，除去溶劑，得到粗品，之后用HPLC分離提純。
[0081] 它的結構表征數(shù)據(jù)如下：
[0082] 4^^(40010^,01^0)38.29((1,1 = 7.3^,110,8.23(^ = 5.7^,111),8.17((1,1 = 7.9Hz,lH) ,8.02(d,J = 8.6Hz,lH) ,7.89-7.79(m,3H) ,7.75(s,lH),7.49-7.39(m,3H), 7.26-7.11(m,12H) ,7.08(d,J = 7.9Hz,2H),4.60-4.40(m,4H) ,3.71(dd,J=16.9,4.9Hz, 2H),3.57(dd,J=16.4,5.6Hz,3H),2.99-2.85(m,5H),2.81-2.74(m,lH),2.69-2.62(m, 1H).
[0083] (2)取Img Nap-GDFDFDY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升I 3BS溶液(pH=7.0)， 用碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0,加熱至沸騰使化合物完全溶解，冷卻到室溫之后即得短 肽水凝膠。
[0084] (3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到（2)中制得的水凝膠中，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，進行物理混合，靜置8分鐘后成膠，得到蛋白疫苗vac-2(最終短肽的 濃度為2mg/mL，OVA蛋白濃度為0.2mg/mL)。
[0085] 以下制備實施例所制備的其余短肽采用與制備實施例1-2相同的合成方法，區(qū)別 僅在于根據(jù)其序列選擇相應的氨基酸原料和封端基團。
[0086] 制備實施例3
[0087] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠負載OVA蛋白的疫苗vac-3的制備 [0088] (1)用FMOC-固相合成方法合成PTZ-GdF dFdY,它的結構表征數(shù)據(jù)如下：
[0089] 咕匪1?(4001取，0150)38.46(^ = 5.9泡，1!1)，8.21((1(1，了=15.7,8.0泡，2!1)， 8.11(d,J = 8.4Hz,lH),7.30-7.06(m,13H),7.03(d,J = 8.0Hz,2H),6.99-6.92(m,2H) ,6.74 (d,J = 8.5Hz,lH) ,6.66(d,J = 7.8Hz,2H) ,4.60-4.51(m,4H) ,4.38(dd,J=14.2,7.3Hz, 1H) ,3.81(dd,J=16.6,5.9Hz,lH),3.66(dd,J=17.5,5.0Hz,lH),3.05-2.64(m,8H),2.54 (s,lH).
[0090] (2)取Img PTZ-GdFdFdY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升I 3BS溶液(pH=7.0)， 用碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0,加熱至沸騰使化合物完全溶解，冷卻到室溫之后即得短 肽水凝膠。
[0091] (3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到（2)中制得的水凝膠中，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，進行物理混合，靜置15分鐘后成膠，得到蛋白疫苗vac-3(最終短肽 的濃度為2mg/mL，OVA蛋白濃度為0 · 2mg/mL)。
[0092] 制備實施例4
[0093] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠負載OVA蛋白的疫苗vac-4的制備 [0094] (1)用FMOC-固相合成方法合成Bi〇-GDF DFDY，它的結構表征數(shù)據(jù)如下：
[0095] 4^^(40010^,01^0)38.17((1(1,1=17.0,7.8^,210,7.93((1(1,1=14.4,6.9?, 2H)，7· 19(dd，J= 18.0,12.4Hz，9H)，7.02(d，J = 8. IHz，2H)，6.66(d，J = 7.7Hz，2H)，6· 39 (d，J = 23.8Hz，2H)，4 ·58-4·43(ι?，2H)，4.37(dd，J= 13 ·6,7· 5Hz，lH) ,4.32-4.26(m，lH)， 4.14-4.07(m,lH),3.67(dd ,J=16.1,5.4Hz,lH),3.52(dd ,J=16.2,5.4Hz,lH),3.11-2.89 (m,4H),2.88-2.63(m,4H),2.57(d,J=12.6Hz,lH) ,2.08(t,J = 7.3Hz,2H),1.63-1.22(m, 7H).
[0096] (2)取Img Bi〇-GDFDFDY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升1^溶液(？!1=7.0)， 用碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0,加熱至沸騰使化合物完全溶解，冷卻到室溫之后即得短 肽水凝膠。
[0097] (3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到（2)中制得的水凝膠中，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，進行物理混合，靜置18分鐘后成膠，得到蛋白疫苗vac-4(最終短肽 的濃度為2mg/mL，OVA蛋白濃度為0 · 2mg/mL)。
[0098] 制備實施例5
[0099] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠負載OVA蛋白的疫苗vac-5的制備 [0100] (1)用FMOC-固相合成方法合成Fihoc-GdF dFdY，它的結構表征數(shù)據(jù)如下：
[0101]咕匪1?(4001取，0150)38.19((1(1，了=13.8,8.3泡，2!1)，7.90(^ = 8.0取，3!1)， 7.69(d ,J = 7.5Hz,2H) ,7.47(t ,J = 6.5Hz , 1H), 7.41 (t ,J = 7.3Hz , 2H), 7.31 (t ,J = 7.6Hz , 2H) ,7.27-7.10(m,9H) ,7.02(d,J = 7.9Hz,2H),6.66(d,J = 7.7Hz,2H),4.59-4.46(m,2H), 4.37(dd ,J=14.2,7.4Hz,lH),4.28-4.17(m,3H),3.59(dd ,J=17.1,5.3Hz,lH),3.48(dd J =17.2,5.9Hz,1H),3.05-2.88(m,3H),2.76(m,4H).
[0102] (2)取Img Fm〇C-GDFDFDY置于I. 5毫升的玻璃瓶中，加入400微升PBS溶液（pH = 7.0 )，用碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0，加熱至沸騰使化合物完全溶解，冷卻到室溫之后 即得短肽水凝膠。
[0103] (3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到（2)中制得的水凝膠中，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，進行物理混合，靜置18分鐘后成膠，得到蛋白疫苗vac-5(最終短肽 的濃度為2mg/mL，OVA蛋白濃度為0 · 2mg/mL)。
[0104] 制備實施例6
[0105] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠負載OVA蛋白的疫苗vac-6的制備 [0106] (1)用FMOC-固相合成方法合成Nap-DF，結構式如下所示：
[0107]
[0108] 它的結構表征數(shù)據(jù)如下：
[0109] 1H MMR(400MHz，DMS0)S8.47(d，J = 8.1Hz，lH)，7.87(d，J = 7.6Hz，lH)，7.79(t，J = 7.5Hz,2H) ,7.66(s,lH) ,7.51-7.43(m,2H) ,7.27(d,J = 8.4Hz,lH) ,7.20(s,5H) ,4.45 (dd ,J = 13.1,8.5Hz,lH),3.59(q ,J = 14.0Hz,2H),3.07(m,lH),2.88(m,lH).
[0110] (2)取Img Nap-DF置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升?85溶液(？!1=7.0)，用碳 酸鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0,加熱至沸騰使化合物完全溶解，冷卻到室溫之后即得短肽水 凝膠。
[0111] (3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到（2)中制得的水凝膠中，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，進行物理混合，靜置50分鐘后成膠，得到蛋白疫苗vac-6(最終短肽 的濃度為2mg/mL，OVA蛋白濃度為0 · 2mg/mL)。
[0112] 制備實施例7
[0113] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠負載OVA蛋白的疫苗vac-7的制備
[0114] (1)用FMOC-固相合成方法合成Nap_DFDF，結構式如下所示：
[0115]
[0116] 它的結構表征數(shù)據(jù)如下：
[0117] 4^^(40010^,01^0)38.35((1,1 = 7.71^,110,8.29((1,1 = 8.6^,111),7.85((1,1 = 7.3Hz,lH),7.76(dd J=13.8,8.1Hz,2H),7.58(s,lH),7.51-7.42(m,2H),7.28-7.11(m, llH),4.62-4.54(m,lH),4.45(dd ,J=14.0,8.0Hz,lH),3.57(d ,J=13.9Hz,lH),3.48(d J =13.8Hz,lH),3.11-2.87(m,4H),2.73(m,lH).
[0118] (2)取Img Nap-DFDF置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升I3BS溶液(pH = 7.0)，用 碳酸鈉溶液將其PH值調(diào)節(jié)至7.0，加熱至沸騰使化合物完全溶解，冷卻到室溫之后即得短肽 水凝膠。
[0119] (3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到（2)中制得的水凝膠中，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，進行物理混合，靜置37分鐘后成膠，得到蛋白疫苗vac-7(最終短肽 的濃度為2mg/mL，OVA蛋白濃度為0 · 2mg/mL)。
[0120] 制備實施例8
[0121] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠負載OVA蛋白的疫苗vac-8的制備
[0122] (1)用FMOC-固相合成方法合成Nap_GDFDF，它的結構表征數(shù)據(jù)如下：
[0123] 1H MMR(400MHz，DMS0)S8.36(d，J = 7.5Hz，lH)，8· 24(t，J = 5 .IHz，1H)，8.04((1, J = 8.5Hz，lH)，7.89-7.79(m，3H)，7.75(s，lH)，7.46(dt，J = 21.4,8.3Hz，3H)，7.29-7.13(m， 10H)，4.55(m，lH)，4.43(dd，J=13.9,7.7Hz，lH)，3.73(dd，J=16.5,5.7Hz，lH)，3.64-3.53 (m，3H)，3.09-2.87(m，3H)，2.68(dd，J = 13.2,9.7Hz，lH).
[0124] (2)取Img Nap-GDFDF置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升PBS溶液(pH=7.0)，用 碳酸鈉溶液將其PH值調(diào)節(jié)至7.0，加熱至沸騰使化合物完全溶解，冷卻到室溫之后即得短肽 水凝膠。
[0125] (3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到（2)中制得的水凝膠中，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，進行物理混合，靜置23分鐘后成膠，得到蛋白疫苗vac-8(最終短肽 的濃度為2mg/mL，OVA蛋白濃度為0 · 2mg/mL)。
[0126] 制備實施例9
[0127] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠負載OVA蛋白的疫苗vac-9的制備
[0128] (1)用FMOC-固相合成方法合成Nap-WY，它的結構表征數(shù)據(jù)如下：
[0129] 1H MMR(400MHz，DMS0)S8.27(d，J = 7.3Hz，lH)，8.21(t，J = 5.7Hz，lH)，8.15(d，J = 7·9Ηζ，1Η)，8.04(d，J = 8.6Hz，lH) ,7.89-7.77(m，3H)，7.74(s，1H) ,7.47-7.37(m，3H)， 7.26-7.11(m,llH) ,7.08(d,J = 7.9Hz,2H),4.60-4.40(m,4H) ,3.71(dd,J=16.9,4.9Hz, 2H),3.59(dd,J=16.4,5.6Hz,2H),2.99-2.83(m,4H),2.82-2.76(m,lH),2.73-2.67(m, 1H).
[0130] (2)取Img Nap-WY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升I3BS溶液(pH = 7.0)， 用碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0，加熱至沸騰使化合物完全溶解，冷卻到室溫之后即得短 肽水凝膠。
[0131] (3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到（2)中制得的水凝膠中，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，進行物理混合，靜置16分鐘后成膠，得到蛋白疫苗vac-9(最終短肽 的濃度為2mg/mL，OVA蛋白濃度為0 · 2mg/mL)。
[0132] 制備實施例10
[0133] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠負載OVA蛋白的疫苗vac-10的制備
[0134] (1)用FMOC-固相合成方法合成Nap_GDFDF DYDK，它的結構表征數(shù)據(jù)如下：
[0135] 1H MMR(400MHz，DMS0)S8.28((1, J = 6.3Hz，2H)，8.18((1, J = 8.3Hz，lH)，8.08(dd，J =8.0,4.0Hz,2H),7.89-7.72(m,7H),7.51-7.39(m,3H),7.24-7.05(m,13H),6.65(d,J= 8.4Hz,2H) ,4.49(dt,J = 21.4,10.8Hz,3H),3.72(dd,J=16.8,5.8Hz,lH) ,3.65-3.53(m, 3H),3.01-2.88(m,3H),2.70(m,6H),1.66-1.49(m,3H),1.41-1.28(m,3H).
[0136] (2)取111^他？-6叩叩吟\置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升？85溶液(？!1 = 7.0) ，用碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0，加熱至沸騰使化合物完全溶解，冷卻到室溫之后 即得短肽水凝膠。
[0137] (3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到（2)中制得的水凝膠中，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，進行物理混合，靜置16分鐘后成膠，得到蛋白疫苗vac-10(最終短肽 的濃度為2mg/mL，OVA蛋白濃度為0 · 2mg/mL)。
[0138] 制備實施例11
[0139] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠負載OVA蛋白的疫苗vac-11的制備
[0140] (1)用FMOC-固相合成方法合成Nap-GDFDF DYDE，它的結構表征數(shù)據(jù)如下：
[0141] 1H MMR(400MHz，DMS0)S8.25(d，J = 5.6Hz，2H)，8· 15-8.09(m，2H)，8.01(d，J = 8·9Ηζ，1Η)，7.89-7.80(m，3H)，7.74(s，lH)，7.50-7.45(m，2H)，7.41(dd，J=8.5，1.6Hz， 1H) ,7.25-7.10(m,9H) ,7.07(d,J = 8.5Hz,2H),6.64(d,J = 8.5Hz,2H),4.54-4.44(m,3H), 3.70(dd,J=16.9,6.5Hz,lH),3.61(s,2H),3.01-2.89(m,3H),2.71(m,5H),2.34-2.25(m, 2H),2.00(d ,J = 7.2Hz,3H).
[0142] (2)取111^他？-6叩叩吟％置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升？85溶液(？!1 = 7.0) ，用碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0，加熱至沸騰使化合物完全溶解，冷卻到室溫之后 即得短肽水凝膠。
[0143] (3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到（2)中制得的水凝膠中，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，進行物理混合，靜置40分鐘后成膠，得到蛋白疫苗vac-11(最終短肽 的濃度為2mg/mL，OVA蛋白濃度為0 · 2mg/mL)。
[0144] 制備實施例12
[0145] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠負載OVA蛋白的疫苗vac-12的制備
[0146] (1)用FMOC-固相合成方法合成Nap_GDFDF DYDG，它的結構表征數(shù)據(jù)如下：
[0147] 4^^(40010^,01^0)38.25((1(13=12.1,5.9^,210,8.13((1(1,1 = 21.0,8.2?, 2H),8.04(d,J=8.3Hz,lH),7.89-7.80(m,3H),7.75(s,lH),7.52-7.39(m,3H),7.25-7.10 (m,llH) ,7.05(d,J = 8.4Hz,2H),6.64(d,J = 8.4Hz,2H),4.54-4.45(m,3H),3.79-3.67(m, 3H),3.64-3.56(m,3H),3.01-2.88(m,3H),2.80-2.61(m,4H).
[0148] (2)取111^他？-6叩叩吟％置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升？85溶液(？!1 = 7.0) ，用碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0，加熱至沸騰使化合物完全溶解，冷卻到室溫之后 即得短肽水凝膠。
[0149] (3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到（2)中制得的水凝膠中，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，進行物理混合，靜置18分鐘后成膠，得到蛋白疫苗vac-12(最終短肽 的濃度為2mg/mL，OVA蛋白濃度為0 · 2mg/mL)。
[0150] 制備實施例13
[0151] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠負載輻照后的癌細胞的疫苗vac-13的制備
[0152] (1)取Img制備實施例1中制備的L構型Nap-GFFY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400 微升PBS溶液(pH= 7.0)，用碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0，加熱至沸騰使化合物完全溶 解，冷卻到室溫之后即得短肽水凝膠。
[0153] (2)取100微升5X IO7個每毫升的X光輻照后的癌細胞加入到（1)中制得的水凝膠 中，進行物理混合，靜置13分鐘后成膠，得到細胞疫苗vac-13(最終短肽的濃度為2mg/mL，輻 照后的癌細胞的濃度為I X IO7個每毫升）。
[0154] 制備實施例14
[0155] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠負載輻照后的癌細胞的疫苗vac-14的制備
[0156] (1)取Img制備實施例2中制備的Nap-GWY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微 升PBS溶液(pH = 7.0)，用碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0，加熱至沸騰使化合物完全溶解， 冷卻到室溫之后即得短肽水凝膠。
[0157] (2)取100微升5X IO7個每毫升的X光輻照后的癌細胞加入到（1)中制得的水凝膠 中，進行物理混合，靜置10分鐘后成膠，得到細胞疫苗vac-14(最終短肽的濃度為2mg/mL，輻 照后的癌細胞的濃度為I X IO7個每毫升）。
[0158] 制備實施例15
[0159] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠負載B+T epitope短肽的疫苗vac-15的制備
[0160] (1)取Img制備實施例10中制備的Nap-GDFDFDYDK置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400 微升PBS溶液(pH= 7.0)，用碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0，加熱至沸騰使化合物完全溶 解，冷卻到室溫之后即得短肽水凝膠。
[0161] (2)取25微升20mg/mL B+T epitope短肽(500微克）的加入到（1)中制得的水凝膠 中，進行物理混合，用PBS溶液(pH=7.0)定容于500微升，靜置14分鐘后成膠，得到短肽疫苗 vac-15(最終短肽的濃度為2mg/mL，B+T epitope短肽的濃度為lmg/mL)。
[0162] B+T epitope短肽結構式如下所示：
[0163]
[0164] 對比制備例1
[0165] 取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升，用I3BS溶液(pH = 7.0)定容至500微升，得到不含 佐劑的蛋白疫苗OVA(最終OVA蛋白濃度為0.2mg/mL)。
[0166] 對比制備例2
[0167] (1)取40mg/mL的鋁佐劑62 · 5微升，用PBS溶液(pH= 7 · 0)定容至250微升，得到鋁佐 劑分散液。
[0168] (2)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到（1)中制得的鋁佐劑分散液，用PBS溶液 (pH = 7.0)定容于500微升，進行物理混合，得到的混合物為含鋁佐劑的蛋白疫苗Alum-OVA (最終鋁佐劑的濃度為5mg/mL，OVA蛋白濃度為0.2mg/mL)。
[0169] 對比制備例3
[0170] 取100微升5 X IO7個每毫升的X光輻照后的細胞，用I3BS溶液(pH = 7.0)定容至500 微升，得到不含佐劑的細胞疫苗XTC(最終輻照后的癌細胞的濃度為IX IO7個每毫升）。
[0171] 對比制備例4
[0172] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠L-gel的制備
[0173] 取Img制備實施例1制備的L構型短肽Nap-GFFY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400 微升PBS溶液(pH= 7.0)，用碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0，加熱至沸騰使化合物完全溶 解，冷卻到室溫之后形成水凝膠，用PBS溶液(pH=7.0)定容于500微升，靜置10分鐘后成膠， 即為水凝膠L-gel (最終短肽的濃度為2mg/mL)。
[0174] 對比制備例5
[0175] pH 7.0和室溫20°C下短肽水凝膠D-gel的制備
[0176] 取Img制備實施例2制備的Nap-GDFDFDY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升I 3BS 溶液(pH=7.0)，用碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0，加熱至沸騰使化合物完全溶解，冷卻到 室溫之后形成水凝膠，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，靜置8分鐘后成膠，即為水凝膠 D-gel (最終短肽的濃度為2mg/mL)。
[0177] 對比制備例6
[0178] 取25微升20mg/mL B+T epitope短肽（500微克），用PBS溶液(ρΗ = 7·0)定容至500 微升，得到不含佐劑的短肽疫苗epitope(最終B+T epitope短肽的濃度為lmg/mL)。
[0179] 對比制備例7
[0180] (1)取40mg/mL的鋁佐劑62 · 5微升，用PBS溶液(pH= 7 · 0)定容至250微升，得到鋁佐 劑分散液。
[0181] (2)取25微升20mg/mL短肽B+T epitope(500微克)加入到（1)中制得的鋁佐劑分散 液，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，進行物理混合，得到的混合物為含鋁佐劑的短肽 疫苗Alum-epitope 〇
[0182] 免疫實施例1
[0183] (1)小鼠第一次免疫
[0184] 取6-8周的小鼠，以第一次注射時間記為0天，取制備實施例1、制備實施例2、對比 制備例1、對比制備例2中制得的蛋白疫苗以渦旋儀將水凝膠打散成粘稠溶液后分別以每只 老鼠1 〇〇微升的劑量在小鼠腹股溝處進行皮下注射。
[0185] (2)小鼠第二次免疫
[0186]在第14天的時間點，取制備實施例1、制備實施例2、對比制備例1、對比制備例2中 制得的蛋白疫苗以渦旋儀將水凝膠打散成粘稠溶液后分別以每只老鼠100微升的劑量在小 鼠腹股溝處進行皮下注射。
[0187] (3)抗體滴度的測量
[0188] 在第21天的時候取小鼠血清，使用BioTek酶標儀，用Elisa的方法進行相應抗體滴 度的測量。結果如圖1所示。
[0189] 從圖1中的結果看出：其中IgG代表總的抗體滴度;IgG 1是其中一個表型，表示體液 免疫應答；IgG2a和IgG2b也是其中一個表型，表示細胞免疫水平。與不含佐劑的OVA蛋白組 (對比制備例1)對比，使用L構型多肽水凝膠和OVA蛋白的組(制備實施例1)可提高IgG抗體 滴度60倍，使用D構型多肽水凝膠和OVA蛋白的組(制備實施例2)可提高580倍，而使用鋁佐 劑和OVA蛋白的組(對比制備例2)僅可提高165倍;與不含佐劑的OVA蛋白組(對比制備例1) 對比，使用L構型多肽水凝膠和OVA蛋白的組(制備實施例1)可提高IgGl抗體滴度167倍，使 用D構型多肽水凝膠和OVA蛋制備2)僅可提高135倍;與不含佐劑的OVA蛋白組(對比制備例 1) 對比，使用L構型多肽水凝膠和OVA蛋白的組(制備實施例1)可提高IgG2a抗體滴度10倍， 使用D構型多肽水凝膠和OVA蛋白的組(制備實施例2)可提高60倍，而使用鋁佐劑和OVA蛋白 的組(對比制備例2)僅可提高12倍;與不含佐劑的OVA蛋白組(對比制備例1)對比，使用L構 型多肽水凝膠和OVA蛋白的組(制備實施例1)可提高I gG2b抗體滴度30倍，使用D構型多肽水 凝膠和OVA蛋白的組(制備實施例2)可提高90倍，而使用鋁佐劑和OVA蛋白的組(對比制備例 2) 僅可提高60倍。
[0190] 免疫實施例2
[0191] (1)小鼠第一次免疫
[0192] 取6-8周的小鼠，以第一次注射時間記為0天，取制備實施例2-5、對比制備例1、對 比制備例2中制得的蛋白疫苗以渦旋儀將水凝膠打散成粘稠溶液后分別以每只老鼠100微 升的劑量在小鼠腹股溝處進行皮下注射。
[0193] (2)小鼠第二次免疫
[0194] 在第14天的時間點，取制備實施例2-5、對比制備例1、對比制備例2中制得的蛋白 疫苗以渦旋儀將水凝膠打散成粘稠溶液后分別以每只老鼠100微升的劑量在小鼠腹股溝處 進行皮下注射。
[0195] (3)抗體滴度的測量
[0196] 在第21天的時候取小鼠血清，使用BioTek酶標儀，用Elisa的方法進行相應抗體滴 度的測量。結果如圖2所示。
[0197] 從圖2中的結果看出：與不含佐劑的OVA蛋白組(對比制備例1)對比，使用D構型多 肽水凝膠和OVA蛋白的組(制備實施例2)可提高I gG抗體滴度141倍，而制備實施例3，4，5分 別提高了 70.5，35，70.5倍，而使用鋁佐劑和OVA蛋白的組(對比制備例2)僅可提高64倍。
[0198] 免疫實施例3
[0199] (1)小鼠第一次免疫
[0200] 取6-8周的小鼠，以第一次注射時間記為0天，取制備實施例2、制備實施例6-9、對 比制備例1、對比制備例2中制得的蛋白疫苗以渦旋儀將水凝膠打散成粘稠溶液后分別以每 只老鼠100微升的劑量在小鼠腹股溝處進行皮下注射。
[0201] (2)小鼠第二次免疫
[0202] 在第14天的時間點，取制備實施例2、制備實施例6-9、對比制備例1、對比制備例2 中制得的蛋白疫苗以渦旋儀將水凝膠打散成粘稠溶液后分別以每只老鼠100微升的劑量在 小鼠腹股溝處進行皮下注射。
[0203] (3)抗體滴度的測量
[0204] 在第21天的時候取小鼠血清，使用BioTek酶標儀，用Elisa的方法進行相應抗體滴 度的測量。結果如圖3所示。
[0205]從圖3中的結果看出：與不含佐劑的OVA蛋白組(對比制備例1)對比，使用D構型多 肽水凝膠和OVA蛋白的組(制備實施例2)可提高IgG抗體滴度273倍，而制備實施例6，7，8，9 分別提高了 0.32,0.63,64,284倍，而使用鋁佐劑和OVA蛋白的組(對比制備例2)僅可提高 100 倍。
[0206]免疫實施例4 [0207] (1)小鼠第一次免疫
[0208]取6-8周的小鼠，以第一次注射時間記為0天，取制備實施例2、制備實施例10-12、 對比制備例1、對比制備例2中制得的蛋白疫苗以渦旋儀將水凝膠打散成粘稠溶液后分別以 每只老鼠100微升的劑量在小鼠腹股溝處進行皮下注射。
[0209] (2)小鼠第二次免疫
[0210]在第14天的時間點，取制備實施例2、制備實施例10-12、對比制備例1、對比制備例 2中制得的蛋白疫苗以渦旋儀將水凝膠打散成粘稠溶液后分別以每只老鼠100微升的劑量 在小鼠腹股溝處進行皮下注射。
[0211] (3)抗體滴度的測量
[0212] 在第21天的時候取小鼠血清，使用BioTek酶標儀，用Elisa的方法進行相應抗體滴 度的測量。結果如圖4所示。
[0213]從圖4中的結果看出：與不含佐劑的OVA蛋白組(對比制備例1)對比，使用D構型多 肽水凝膠和OVA蛋白的組(制備實施例2)可提高IgG抗體滴度126倍，而實施例10,11，12分別 提高了 233,49,150倍。
[0214] 免疫實施例5
[0215] (1)小鼠第一次免疫
[0216]取6-8周的小鼠，以第一次注射時間記為0天，取無內(nèi)毒素、無菌的PBS溶液以及制 備實施例13-14、對比制備例3-5中制得的細胞疫苗以渦旋儀將水凝膠打散成粘稠溶液后分 別以每只老鼠100微升的劑量在小鼠背部進行皮下注射。
[0217] (2)小鼠第二次免疫
[0218]在第14天的時間點，取無內(nèi)毒素、無菌的PBS溶液以及制備實施例13-14、對比制備 例3-5中制得的細胞疫苗以渦旋儀將水凝膠打散成粘稠溶液后分別以每只老鼠100微升的 劑量在小鼠背部進行皮下注射。
[0219] ⑶小鼠第三次免疫
[0220] 在第21天的時間點，取無內(nèi)毒素、無菌的PBS溶液以及制備實施例13-14、對比制備 例3-5中制得的細胞疫苗以渦旋儀將水凝膠打散成粘稠溶液后分別以每只老鼠100微升的 劑量在小鼠背部進行皮下注射。
[0221] (4)小鼠刺激CD8+IFN- γ +T細胞增殖的測試
[0222] 在第28天取小鼠脾細胞，通過使用BD FACS Calibur流式細胞儀進行流式檢測。結 果如圖5a)所示。
[0223] (5)小鼠腫瘤抑制實驗
[0224] 在第28天用未輻照的癌細胞接種小鼠背部，接種量IX IO6個癌細胞，隨著腫瘤生 長，在小鼠背部出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤，定期測試腫瘤大小，以此評價腫瘤抑制效果。測試方 法如下：用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長(最長徑）和寬（垂直于最長徑方向的寬度），腫瘤體 積按照公式【長X寬X (長+寬)/2】計算。結果如圖5b)所示。
[0225] 細胞免疫應答對于腫瘤的治療相當關鍵。實驗結果顯示，被Nap_GDFDFDY水凝膠負 載輻照后癌細胞免疫的小鼠相比于其他實驗組展示出了更強的CDS+IFN-γ+增強效果（如 圖5a))，這表明它能提高細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的表達，CTL有利于腫瘤抑制。如圖5b)， 在PBS組和水凝膠組〇1 61、1^61，腫瘤生長曲線沒有明顯差別，但是在接種細胞疫苗父1^ (圖中實心正方形表示）、vac_5(圖中實心菱形表示）、vac-6(圖中空心三角形表示）的實驗 組腫瘤生長得到抑制并且延長了小鼠的生存周期。其中D構型水凝膠負載輻照后的癌細胞 (vac-6)的免疫效果最為明顯。這些結果與之前的蛋白疫苗的實驗結果一致。
[0226] 免疫實施例6
[0227] (1)小鼠第一次免疫
[0228] 取6-8周的小鼠，以第一次注射時間記為0天，取制備實施例15、對比制備例6、對比 制備例7中制得的短肽疫苗以渦旋儀將水凝膠打散成粘稠溶液后分別以每只老鼠100微升 的劑量在小鼠腹股溝處進行皮下注射。
[0229] (2)小鼠第二次免疫
[0230]在第14天的時間點，取制備實施例15、對比制備例6、對比制備例7中制得的短肽疫 苗以渦旋儀將水凝膠打散成粘稠溶液后分別以每只老鼠100微升的劑量在小鼠腹股溝處進 行皮下注射。
[0231] (3)抗體滴度的測量
[0232] 在第21天的時候取小鼠血清，使用BioTek酶標儀，用Elisa的方法進行相應抗體滴 度的測量。結果如圖6所示。
[0233] 從圖6中的結果看出：與不含佐劑的短肽疫苗組(對比制備例6)對比，以D構型多肽 水凝膠Nap-GDF DFDYDK負載短肽B+T epitope組（制備實施例15)可提高IgG抗體滴度26倍，而 含鋁佐劑的短肽疫苗組(對比制備例7)沒有提高。
【主權項】
1. 一種短肽作為疫苗佐劑的應用，其特征在于，所述短肽以基團X封端，所述短肽序列 為X-GFF，或所述短肽包含序列FFY。2. 如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述短肽序列為X-FFY、X-GFFY、X-GFFYK、X-GFFYE或X-GFFYG〇3. 如權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述短肽為D構型。4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述短肽序列為X-GdFdF、X-dF dFdY、X-GdFdFdY、 X-GdFdFdYdK、X-GdF dFdYdE 或 X-GdFdFdYdG 〇5. 如權利要求1-4中任一項所述的應用，其特征在于，X為Nap、PTZ、Bio或Fmoc，優(yōu)選為 Nap06. 如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述短肽序列為Nap-DFDFDY、Nap-G DFDFDY、 Nap-GDFDFDYDK 或 Nap-GDFDFDYDG。7. 如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述短肽序列為Nap-GDFDFDY DK。8. 如權利要求1-7中任一項所述的應用，其特征在于，所述短肽的水混合物經(jīng)加熱冷卻 的方法形成短肽水凝膠，然后與抗原混合，靜置后形成的水凝膠用作疫苗。9. 如權利要求1-8中任一項所述的應用，其特征在于，所述疫苗為蛋白疫苗。10. 如權利要求1-8中任一項所述的應用，其特征在于，所述疫苗為細胞疫苗。11. 如權利要求1-8中任一項所述的應用，其特征在于，所述疫苗為短肽疫苗。12. 以權利要求1-11中任一項所述應用中短肽作為疫苗佐劑的疫苗。13. 如權利要求12所述的疫苗，其特征在于，所述短肽與抗原物理混合得到疫苗。
【文檔編號】A61K39/39GK105944097SQ201610396554
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】楊志謀, 王玲, 楊成彪, 王懷民
【申請人】南開大學