一種腎小球靶向的蛋白納米顆粒藥物組合物及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種腎小球靶向蛋白納米顆粒藥物組合物及其用途，所述蛋白納米顆粒藥物組合物主要由蛋白成分、藥理活性物質(zhì)、穩(wěn)定劑制成，其粒徑在10nm?170nm之間。該藥物組合物實(shí)現(xiàn)了腎小球系膜細(xì)胞被動(dòng)靶向遞藥，顯著提高了藥物在腎小球中的聚集濃度或延長(zhǎng)了藥物在腎小球中的聚集時(shí)間，使其在顯著提高療效的同時(shí)，極大地降低了藥物在非靶向部位的毒副作用。
【專利說(shuō)明】
一種腎小球靶向的蛋白納米顆粒藥物組合物及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種腎小球靶向的蛋白納米顆粒藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用，屬 于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 腎小球類(lèi)疾病，常見(jiàn)的有原發(fā)性和繼發(fā)性腎小球腎炎，是目前引起慢性腎衰竭和 終末期腎病最主要的原因，正嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)，導(dǎo)致終末期腎病的病 因中，腎小球類(lèi)疾病占54.4%，其中腎小球腎炎又占了48.1%。多數(shù)腎小球類(lèi)疾病屬于免疫介 導(dǎo)性炎癥疾病，因此，免疫調(diào)節(jié)療法是治療免疫介導(dǎo)性腎小球炎癥疾病的重要手段，目前臨 床主要以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等方法治療為主，但這兩種藥物都具有明顯的毒副作 用，如激素造成的股骨頭壞死、柯興氏綜合征，免疫抑制劑造成的終生不愈、肝臟損害、骨髓 抑制，給患者造成了終生損害。
[0003] 近期研究表明，腎小球系膜細(xì)胞在腎小球類(lèi)疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重 要的作用。腎小球系膜細(xì)胞是腎小球的三種固有細(xì)胞之一，具有分泌產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)、收 縮、吞噬、維持基質(zhì)正常代謝等多種生理功能。當(dāng)腎小球損傷時(shí)，腎小球系膜細(xì)胞是最易被 激活的腎臟固有細(xì)胞，多種免疫反應(yīng)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子以及非免疫產(chǎn)物均可導(dǎo)致腎 小球系膜細(xì)胞活化。活化的腎小球系膜細(xì)胞可發(fā)生明顯的增殖，并釋放多種炎癥介質(zhì)，促進(jìn) 細(xì)胞外基質(zhì)積聚，從而形成惡性循環(huán)，加劇腎小球損傷，最終發(fā)生腎小球硬化乃至腎功能衰 竭。因此，將腎小球系膜細(xì)胞作為靶細(xì)胞，研究開(kāi)發(fā)腎小球系膜細(xì)胞靶向遞藥系統(tǒng)，以提高 系膜細(xì)胞處藥物濃度、降低藥物全身毒副作用，對(duì)于治療腎小球類(lèi)疾病具有重大意義。
[0004] 腎小球系膜組織是位于腎小球毛細(xì)血管袢之間的一種特殊間充質(zhì)，由系膜細(xì)胞和 系膜基質(zhì)組成，其與毛細(xì)血管之間僅隔著具孔隙的內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞的孔隙約為SOnm-170nm。此外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道腎小球過(guò)濾膜對(duì)納米顆粒的有效截留粒徑大小約為10nm，因此，理 論上講，流經(jīng)腎小球毛細(xì)血管粒徑為l〇nm-170nm的納米顆粒均可通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞的孔隙進(jìn)入 到腎小球系膜從而實(shí)現(xiàn)腎小球系膜細(xì)胞的靶向作用。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)CN103690957A公開(kāi)了一種腎小球靶向微粒給藥系統(tǒng)及其制備方法， 雖然其通過(guò)對(duì)微粒(脂質(zhì)體、納米粒、膠束)進(jìn)行PEG化脒修飾后成功構(gòu)建了腎小球靶向微粒 給藥系統(tǒng)，但是現(xiàn)有技術(shù)仍存在很多不足:首先，其制得的微粒給藥系統(tǒng)屬于陽(yáng)離子微粒給 藥系統(tǒng)，存在體內(nèi)毒性的風(fēng)險(xiǎn)，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)，作為載體的陽(yáng)離子脂質(zhì)體本身會(huì)對(duì) 多種細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，且?guī)щ娏吭礁叨拘栽酱?，顯然這種微粒給藥系統(tǒng)在安全性 方面存在一定缺陷，不利于臨床用藥;其次，這種微粒給藥系統(tǒng)的成分復(fù)雜，制備過(guò)程繁瑣， 制備成本較高，尚無(wú)法進(jìn)行工業(yè)化大生產(chǎn)。綜上，申請(qǐng)者認(rèn)為這種腎小球靶向微粒給藥系統(tǒng) 缺乏安全可靠性，應(yīng)用于臨床尚不可行。
[0006] 由于蛋白成分具有生物相容性好、安全無(wú)毒、無(wú)免疫原性、可生物降解性等優(yōu)點(diǎn)， 使其作為藥用載體在藥物傳遞系統(tǒng)中得到了廣泛應(yīng)用。本發(fā)明試圖以蛋白成分作為藥用載 體構(gòu)建腎小球靶向給藥系統(tǒng)。雷公藤紅素是一種醌甲基三萜，主要存在于衛(wèi)矛科雷公藤屬 及南蛇藤屬植物中，是治療腎炎、類(lèi)風(fēng)濕等疾病雷公藤片和雷公藤多苷片等制劑的主要有 效成分之一。據(jù)大量文獻(xiàn)報(bào)道，雷公藤紅素具有顯著的抗炎、免疫抑制等活性。因此，雷公藤 紅素被選作為本發(fā)明具體實(shí)施例之一蛋白納米顆粒藥物組合物的模型藥物?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) CN103356492A公開(kāi)了一種以白蛋白為藥用載體的雷公藤紅素藥物組合物，但其制備方法為 傳統(tǒng)的去溶劑化法，該方法先通過(guò)脫水劑一一無(wú)水乙醇的去溶劑化作用除去白蛋白的水化 膜，使白蛋白變性析出，再用戊二醛交聯(lián)固化。顯而易見(jiàn)，此種傳統(tǒng)方法制備所得的蛋白納 米粒的生物降解性差，毒性大，特別是殘留的戊二醛等有機(jī)溶劑會(huì)造成生物活性大分子失 活，增加機(jī)體毒副作用風(fēng)險(xiǎn)。而且該方法繁瑣復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，尤其是交聯(lián)固化需要24 h以上， 時(shí)間成本高。綜上，申請(qǐng)者認(rèn)為這種以白蛋白為藥用載體的雷公藤紅素藥物組合物應(yīng)用于 腎小球靶向給藥系統(tǒng)尚不可行。
[0007]因此，制備一種安全、有效、可靠的腎小球靶向給藥系統(tǒng)迫在眉睫。發(fā)明人經(jīng)過(guò)大 量實(shí)驗(yàn)研究，選用蛋白成分作為藥用載體，通過(guò)一種安全綠色的基于二硫鍵形成的蛋白納 米顆粒制備技術(shù)，成功構(gòu)建了高效低毒的腎小球靶向的蛋白納米顆粒藥物組合物，并在腎 臟疾病中取得了顯著療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的之一，提供了一種腎小球靶向的蛋白納米顆粒藥物組合物，主要包 含蛋白成分、穩(wěn)定劑及藥理活性物質(zhì)。
[0009] 本發(fā)明的目的之一，提供了一種蛋白納米顆粒(藥物組合物)在制備腎小球靶向的 藥物中的用途。
[0010] 本發(fā)明的目的之一，提供一種基于二硫鍵形成的蛋白納米顆粒制備技術(shù)，該技術(shù) 以藥物納米顆粒為核心，蛋白以二硫鍵部分交聯(lián)在納米顆粒表面，一方面保留了蛋白的全 部生物學(xué)特征，另一方面避免了使用交聯(lián)劑造成的醛類(lèi)物質(zhì)殘留引起毒副作用等問(wèn)題。而 且，此種制備技術(shù)簡(jiǎn)單易操作，生產(chǎn)成本低，制備得到的制劑穩(wěn)定性好，適宜于工業(yè)化大生 產(chǎn)，方便臨床使用。
[0011] 本發(fā)明所述的腎小球靶向的蛋白納米顆粒藥物組合物，含有藥理活性物質(zhì)和蛋白 的蛋白納米顆粒藥物組合物粒徑在10nm-170nm之間，其在流經(jīng)腎小球時(shí)能夠被腎小球過(guò)濾 膜有效截留，使其可通過(guò)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的孔隙(80-170nm)進(jìn)入到腎小球系膜區(qū)。
[0012] 由于腎小球系膜細(xì)胞自身的類(lèi)巨噬細(xì)胞樣性質(zhì)，賦予其具有對(duì)胞外納米顆粒的主 動(dòng)吞噬作用，于是在腎小球自身生理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和腎小球系膜細(xì)胞主動(dòng)攝取的雙重作用下， 使得更多含有藥理活性物質(zhì)和蛋白的蛋白納米顆粒藥物組合物能夠被動(dòng)靶向而濃集于腎 小球系膜細(xì)胞處，從而實(shí)現(xiàn)了腎小球系膜細(xì)胞的靶向遞藥。
[0013] 本發(fā)明所述的腎小球靶向蛋白納米顆粒藥物組合物，蛋白納米顆粒藥物組合物由 于對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的被動(dòng)靶向作用，大大提高了腎小球系膜細(xì)胞處的藥物濃度，于是在 顯著提高治療效果的同時(shí)，使得非靶部位藥物濃度有效降低，有助于降低藥物的毒副作用。
[0014] 由此制得的蛋白納米顆粒藥物組合物具有高載藥量和高包封率，使得藥物治療劑 量大大減少，且其能在靶部位緩釋藥物，長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮療效，使得給藥次數(shù)大大減少，從而進(jìn) 一步降低了藥物的毒副作用。
[0015] 本發(fā)明所述的腎小球靶向蛋白納米顆粒藥物組合物的蛋白成分，具有生物相容性 好、安全無(wú)毒、無(wú)免疫原性、可生物降解性等優(yōu)點(diǎn)。
[0016] 本發(fā)明所述的蛋白納米顆粒藥物組合物的粒徑要求在10nm-170nm，優(yōu)選在60nm-150nm，最優(yōu)選在 80nm_l OOnm。
[0017] 本發(fā)明所述的蛋白成分包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、羊血清白蛋白、驢血清 白蛋白、馬血清白蛋白、兔血清白蛋白、豬血清白蛋白、疏水蛋白、糖蛋白、脂蛋白或其他種 類(lèi)蛋白以及類(lèi)似物和衍生物;優(yōu)選自人血清白蛋白。
[0018] 本發(fā)明所述的穩(wěn)定劑包括大豆油、中鏈油、椰子油、橄欖油、紅花油、棉籽油、芝麻 油、橙油、大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、氫化豆磷脂、二月桂酰卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、 二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰膽 堿、二硬脂酰磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、十二烷基硫酸鈉、Solutol HS-15、月 桂酸、棕櫚酸、油酸、鯨蠟醇硫酸鈉、硬脂醇硫酸鈉、脂肪酸磺酸化物、烷基芳基磺酸化物、司 盤(pán)、吐溫、賣(mài)澤、芐澤、泊洛沙姆188、壬基酚、辛基酚、辛基甲酚、平平加0和類(lèi)似化合物的一 種或其混合物。優(yōu)選自大豆油、中鏈油、油酸、蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、Solutol HS-15、泊 洛沙姆188中一種或其混合物。
[0019] 本發(fā)明所述的藥理活性物質(zhì)包含但不僅限于預(yù)防和/或治療腎臟疾病的藥物。
[0020] 本發(fā)明所述的預(yù)防和/或治療腎臟疾病的藥物包括但不僅限于:抗炎藥、免疫抑制 劑、直接或間接抗腎小球系膜細(xì)胞增生和/或系膜基質(zhì)沉積藥物、NF-kB抑制劑、腎小球過(guò)濾 膜保護(hù)劑、抗腫瘤藥物、抗微生物藥、抗病毒藥等。
[0021] 本發(fā)明所述的抗炎藥包含但不僅限于:吲哚美辛、布洛芬、可的松、地塞米松、氫化 可的松、氫化潑尼松、潑尼松、潑尼松龍、倍他米松以及類(lèi)似物和衍生物。
[0022] 本發(fā)明所述的免疫抑制劑包含但不僅限于:雷公藤堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素、 雷公藤內(nèi)酯甲、雷公藤甲素、雷公藤乙素、環(huán)孢素 A、他克莫司、雷帕霉素、霉酚酸，以及類(lèi)似 物和衍生物。
[0023] 本發(fā)明所述的直接或間接抗腎小球系膜細(xì)胞增生和/或系膜基質(zhì)沉積藥物包含但 不僅限于:肝素、厚樸酚、和厚樸酚、丹參酮、曲尼斯特、雙嘧達(dá)莫、己酮可可堿、荷包牡丹堿、 哌唑嗪、多沙唑嗪、伊馬替尼、伐地那非、抗血小板源生長(zhǎng)因子抗體、抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子抗體以 及類(lèi)似物和衍生物。
[0024] 本發(fā)明所述的NF-kB抑制劑包含但不僅限于:DHMEQ、N-乙酰半胱氨酸、維生素 EJA 壞血酸、吡咯烷二硫基甲酸鹽、小白菊內(nèi)酯、白葉藤素生物堿以及類(lèi)似物和衍生物。
[0025] 本發(fā)明所述的腎小球過(guò)濾膜保護(hù)劑包含但不僅限于:黃芪皂苷、黃柏堿、大黃酸、 茯苓酸、茯苓酸甲酯、丹參酮等中草藥中主要活性成分以及類(lèi)似物和衍生物。
[0026] 本發(fā)明所述的抗腫瘤藥物包含但不僅限于:氟尿嘧啶、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、美 法侖、異溶肉瘤素，以及類(lèi)似物和衍生物。
[0027] 本發(fā)明所述的抗微生物藥包含但不僅限于:頭孢菌素類(lèi)如頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、 頭孢拉定類(lèi)似物和衍生物;青霉素類(lèi)如氨比西林、阿莫西林、環(huán)己西林類(lèi)似物和衍生物；四 環(huán)素類(lèi)如:鹽酸四環(huán)素、多西環(huán)素以及類(lèi)似物和衍生物，以及類(lèi)似物和衍生物。
[0028] 本發(fā)明所述抗病毒藥包含但不僅限于:齊多夫定、鹽酸金剛烷胺以及類(lèi)似物和衍 生物。
[0029] 本發(fā)明所述的蛋白納米顆粒藥物組合物，其中所述藥物包含以上藥物的一種或多 種組合物。
[0030] 作為本發(fā)明的具體實(shí)施方案之一，所述的蛋白納米顆粒藥物組合物，主要包含基 于重量份計(jì)，蛋白成分5~1000份、穩(wěn)定劑0.02~500份及藥理活性物質(zhì)0.02~40份;進(jìn)一步優(yōu) 選地，蛋白成分50~500份、穩(wěn)定劑10~200份及藥理活性物質(zhì)2~20份。
[0031] 本發(fā)明的目的之一，提供一種能夠不加凍干保護(hù)劑而直接凍干的腎小球靶向蛋白 納米顆粒藥物組合物。
[0032] 作為具體的實(shí)施方案，本發(fā)明組合物中也可額外加入凍干保護(hù)劑和其他藥學(xué)上可 接受輔料，冷凍干燥制成粉末。
[0033] 本發(fā)明中，所述的凍干保護(hù)劑包括但不僅限于:葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露 糖、海藻糖、甘氨酸、右旋糖酐、纖維二糖、肌糖、棉籽糖、麥芽糖糊精、麥芽多糖、肝素、甘油、 甘露醇、肌醇、山梨醇、硫醇、聚乙二醇、氨基酸等一種或多種。優(yōu)選蔗糖、甘露糖、麥芽糖、海 藻糖、乳糖。
[0034] 本發(fā)明中，所述的其他輔料可為等滲調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、防腐劑、pH調(diào)節(jié)劑等藥劑 學(xué)上必要輔料。
[0035] 本發(fā)明中，制備所得的凍干蛋白納米顆粒藥物組合物可在任何合適的時(shí)間在適宜 的水性介質(zhì)中再分散以得到能用于注射給藥的納米膠體體系，且粒度分布與冷凍干燥前幾 乎無(wú)改變。所述的水性介質(zhì)有生理鹽水、5%葡萄糖溶液、緩沖生理鹽水、緩沖的水性介質(zhì)、氨 基酸溶液、維生素溶液或類(lèi)似的介質(zhì)之一或多種混合物。
[0036] 本發(fā)明的藥物活性物質(zhì)優(yōu)選為雷公藤紅素和潑尼松龍;蛋白成分優(yōu)選人血清白蛋 白；穩(wěn)定劑優(yōu)選自大豆油、中鏈油、油酸、蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、So Iuto I HS-15、泊洛沙 姆188中一種或其混合物。
[0037] 所述穩(wěn)定劑根據(jù)其溶解性，水不溶性穩(wěn)定劑優(yōu)先加入至雷公藤紅素或潑尼松龍+ 有機(jī)溶劑形成的油相中，水溶性穩(wěn)定劑優(yōu)先加入至蛋白+水形成的水相中。所述穩(wěn)定劑根據(jù) 需要可只加入水不溶性穩(wěn)定劑或水溶性穩(wěn)定劑或兩種類(lèi)型穩(wěn)定劑均加入。
[0038]所述有機(jī)溶劑可選二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、二氧六 環(huán)、乙酸乙酯、乙腈、甲基吡咯烷酮、甲醇、乙醇、中鏈醇或類(lèi)似溶劑，以及2種或2種以上這些 溶劑的混合物，優(yōu)先選擇二氯甲烷、乙酸乙酯或二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶劑。
[0039] 本發(fā)明的目的之一，提供的腎小球靶向蛋白納米顆粒藥物組合物，其特征在于，可 通過(guò)注射給藥、口服給藥、體內(nèi)局部給藥、黏膜吸收給藥等方式給藥，優(yōu)先選擇注射給藥。
[0040] 本發(fā)明所述的注射給藥是指采用靜脈、皮下、肌內(nèi)、腹內(nèi)、腹膜內(nèi)或其他途徑進(jìn)行 注射給藥，優(yōu)先選擇靜脈給藥。
[0041 ]本發(fā)明的目的之一，提供的腎小球靶向蛋白納米顆粒藥物組合物，其特征在于，可 用于預(yù)防和/或治療腎臟疾病，但不僅限于：腎小球類(lèi)疾病、腎小球類(lèi)疾病誘發(fā)的腎小管間 質(zhì)疾病以及腎小球類(lèi)疾病誘發(fā)的腎血管疾病、腎腫瘤及腎移植后的抗排斥反應(yīng)以及其他腎 臟疾病。
[0042]本發(fā)明所述的腎小球類(lèi)疾病包含但不僅限于:按臨床表現(xiàn)分類(lèi)有急慢性腎小球腎 炎、隱匿性腎小球疾病、IgA腎病、膜性腎病、腎病綜合征、腎功能衰竭、腎功能不全、終末期 腎病、高血壓腎病、糖尿病腎病、紫斑性腎炎、狼瘡性腎炎、淀粉樣變腎病、小兒腎病;按病理 分類(lèi)有微小病變型腎病、局灶性腎小球腎炎、局灶性腎小球硬化、毛細(xì)血管內(nèi)增殖性腎小球 腎炎、內(nèi)皮系膜性腎小球腎炎、系膜增殖性腎小球腎炎、膜性腎小球腎炎、膜一增殖性腎小 球腎炎、新月體性腎小球腎炎、毛細(xì)血管外性腎小球腎炎、終末期固縮腎等。
[0043] 本發(fā)明的目的之一，提供一種蛋白納米顆粒藥物組合物的制備方法，選擇基于二 硫鍵形成的蛋白納米顆粒制備技術(shù)，例如:超聲法、高壓均質(zhì)法、微射流法等，但不僅限于這 幾種方法。
[0044] 該技術(shù)以藥物納米顆粒為核心，蛋白以二硫鍵部分交聯(lián)在納米顆粒表面，一方面 保留了蛋白的全部生物學(xué)特征，另一方面避免了使用交聯(lián)劑造成的醛類(lèi)物質(zhì)殘留引起毒副 作用等問(wèn)題。而且，此種制備技術(shù)簡(jiǎn)單易操作，耗時(shí)短，生產(chǎn)成本低，制備得到的制劑穩(wěn)定性 好，適宜于工業(yè)化大生產(chǎn)。通過(guò)本發(fā)明制備得到的蛋白納米顆粒用藥物組合物，保留了蛋白 的優(yōu)良生物活性，安全性高，在體內(nèi)可被代謝為氨基酸而充分利用。
[0045] 作為具體實(shí)施方案，本發(fā)明提供的制備一種制備蛋白納米顆粒組合物采用的超聲 法、高壓均質(zhì)法、微射流法，其特征包括以下步驟： (1)將活性物質(zhì)與水不溶性穩(wěn)定劑溶于有機(jī)溶劑中作為油相，必要時(shí)可用超聲輔助溶 解。
[0046] (2)將蛋白成分、水溶性穩(wěn)定劑溶于水中作為水相，必要時(shí)可在30-40°C，優(yōu)選37°C 下加熱溶解。
[0047] (3)根據(jù)需要，（1)和（2)中穩(wěn)定劑可只加入水不溶性穩(wěn)定劑或水溶性穩(wěn)定劑或兩 種類(lèi)型穩(wěn)定劑均加入。
[0048] (4)油相與水相混合，對(duì)于超聲法，混合后直接在超聲功率400-800w(3S/5 S)，0-10 °(：冰浴條件下超聲5-15min，即得納米乳劑;對(duì)于高壓均質(zhì)法和微射流法，混合后先在0-10 °C冰浴條件下探頭超聲10-15次，得到的混懸液轉(zhuǎn)移到高壓均質(zhì)機(jī)和微射流內(nèi)，在3000-30000Psi壓力范圍內(nèi)循環(huán)均化10-15次即得納米乳劑。
[0049] (5)得到的納米乳劑，減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，即得蛋白納米顆粒組合物。
[0050] 本發(fā)明中，制得的納米乳劑中的有機(jī)溶劑于減壓下蒸發(fā)，形成由蛋白包衣活性藥 物顆粒和蛋白組成的膠體系統(tǒng)。蒸發(fā)方法包括使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、降膜蒸發(fā)器、噴霧干燥器、 冷凍干燥器和類(lèi)似設(shè)備。本發(fā)明優(yōu)選旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。
[0051] 本發(fā)明的目的之一，提供了一種腎小球靶向的蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物的 制備方法。
[0052] 本發(fā)明的目的之一，提供了一種腎小球靶向的蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物的制 備方法。
[0053] 本發(fā)明所述的腎小球靶向蛋白納米顆粒組合物在制備雷公藤紅素或潑尼松龍藥 物中的用途，所述藥物顯著提高了雷公藤紅素或潑尼松龍?jiān)谌I、腎皮質(zhì)以及腎小球中的 聚集濃度或延長(zhǎng)了其在全腎、腎皮質(zhì)以及腎小球中的聚集時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了腎小球系膜細(xì)胞靶 向遞藥，顯著提高了雷公藤紅素或潑尼松龍對(duì)腎小球腎炎等腎臟疾病的治療效果。
[0054] 作為具體實(shí)施例之一，本發(fā)明提供的蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物和蛋白納米 顆粒潑尼松龍組合物粒徑，最優(yōu)選超聲法，制備得到的蛋白納米顆粒藥物組合物粒徑在 80nm-100nm〇
[0055] 發(fā)明益處 (1)本發(fā)明選擇安全無(wú)毒、無(wú)免疫原性、可生物降解、生物相容性的蛋白成分作為載體 材料，將藥理活性物質(zhì)與蛋白成分通過(guò)一種簡(jiǎn)單易行、安全可靠的制備方法(超聲法、高壓 均質(zhì)法、微射流法)制得了粒徑在I Onm-170nm的高包封率、高載藥量、高穩(wěn)定性的蛋白納米 顆粒藥物組合物。
[0056] (2)本發(fā)明制得的蛋白納米顆粒藥物組合物在自身粒徑特點(diǎn)、腎小球生理結(jié)構(gòu)特 點(diǎn)以及腎小球系膜細(xì)胞類(lèi)巨噬細(xì)胞樣特點(diǎn)三重作用下，實(shí)現(xiàn)了腎小球系膜細(xì)胞的被動(dòng)靶向 作用。
[0057] (3)本發(fā)明人以雷公藤紅素或潑尼松龍為模型藥物，優(yōu)先選擇的蛋白成分為人血 清白蛋白，優(yōu)先選擇的穩(wěn)定劑為大豆油、中鏈油、油酸、蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、SoIutol HS-15、泊洛沙姆188中一種或其混合物，優(yōu)先選擇本領(lǐng)域常規(guī)的超聲法、高壓均質(zhì)法、微射 流法制備了含有雷公藤紅素或潑尼松龍和人血清白蛋白的納米顆粒藥物組合物，其粒徑在 10-170nm。通過(guò)大鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，相比于雷公藤紅素或潑尼松龍?jiān)幎?，尾靜 脈注射的人血清白蛋白納米顆粒藥物組合物顯著提高了雷公藤紅素或潑尼松龍?jiān)谌I、腎 皮質(zhì)以及腎小球中的濃度，其腎小球相對(duì)攝取率Re值分別為2.39、3.67，峰濃度比Ce值分別 為3.80、2.58。
[0058] (4)本發(fā)明制得的蛋白納米顆粒藥物組合物，可利用其腎小球靶向遞藥，增加藥物 在腎小球處的蓄積，利于藥物發(fā)揮在預(yù)防和/或治療腎臟疾病的作用，同時(shí)顯著降低藥物對(duì) 其他非靶向組織的毒副作用。
[0059] (5)本發(fā)明制得的蛋白納米顆粒藥物組合物，由于其腎小球靶向遞藥顯著提高了 藥物在預(yù)防和/或治療腎臟疾病的作用，同時(shí)由于蛋白納米顆粒藥物組合物具有緩釋作用， 能夠持續(xù)在靶部位發(fā)揮療效，因而可以在保證藥效的同時(shí)大大減少給藥劑量，減少給藥次 數(shù)，從而進(jìn)一步降低藥物的毒副作用。
[0060] (6)本發(fā)明制得的蛋白納米顆粒藥物組合物由于載體材料安全無(wú)毒、制備工藝簡(jiǎn) 單可靠以及腎小球系膜細(xì)胞靶向遞藥三方面的顯著優(yōu)點(diǎn)，使得蛋白納米顆粒藥物組合物成 為一種高效、低毒、具有良好臨床應(yīng)用價(jià)值的腎小球靶向給藥系統(tǒng)。
【附圖說(shuō)明】
[0061] 以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中： 圖1表示超聲法制得的人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物透射電鏡圖。
[0062] 圖2表示超聲法制得的人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物透射電鏡圖。
[0063] 圖3表示人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物及雷公藤紅素原藥尾靜脈給藥 5min后，在各組織臟器濃度分布圖（n=5)。
[0064] 圖4表示人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物及雷公藤紅素原藥尾靜脈給藥 后在腎臟的經(jīng)時(shí)分布圖（ri=5)。
[0065] 圖5表示人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物及雷公藤紅素原藥尾靜脈給藥 后在腎皮質(zhì)的經(jīng)時(shí)分布圖（n=5)。
[0066] 圖6表示人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物及潑尼松龍?jiān)幬察o脈給藥5min 后，在各組織臟器濃度分布圖（n=5)。
[0067] 圖7表示人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物及潑尼松龍?jiān)幬察o脈給藥后在 腎臟的經(jīng)時(shí)分布圖（ri=5)。
[0068] 圖8表示人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物及潑尼松龍?jiān)幬察o脈給藥后在 腎皮質(zhì)的經(jīng)時(shí)分布圖（ri=5)。
[0069] 圖9表示人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物及雷公藤紅素原藥尾靜脈給藥 后在腎小球的經(jīng)時(shí)分布圖（n=5)。
[0070] 圖10表示人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物及潑尼松龍?jiān)幬察o脈給藥后 在腎小球的經(jīng)時(shí)分布圖（n=5)。
[0071 ]圖11表示人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物相較于雷公藤紅素原藥顯著 降低了腎小球腎炎大鼠尿蛋白含量(n=5)。
[0072] 圖12表示人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物相較于潑尼松龍?jiān)庯@著降低 了腎小球腎炎大鼠尿蛋白含量(n=5)。
【具體實(shí)施方式】
[0073] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但絕不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。下面參照 實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施 例以及使用的制備方法。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行等同 替換、組合、改良或修飾，但這些都將包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0074] 實(shí)施例1 超聲法制備人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物和人血清白蛋白納米顆粒潑尼 松龍組合物及其表征 將雷公藤紅素7mg或潑尼松龍20mg以及水不溶性穩(wěn)定劑大豆油50mg溶于2mL二氯甲烷： 乙酸乙酯(7:3，V/V)中，后與IOmL人血清白蛋白雙蒸水溶液(2%W/V)混合，在冰浴中，超聲功 率500W(3s/5s)條件下超聲8min，后在37°C下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)混合溶劑，即得人血清 白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物和人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物。通過(guò)馬爾文 粒徑儀測(cè)量粒徑和電位，透射電鏡進(jìn)行形態(tài)表征，并通過(guò)葡聚糖凝膠柱法測(cè)定包封率。
[0075] 結(jié)果： 如表1，制得的人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物和人血清白蛋白納米顆粒潑 尼松龍組合物分別在8 5nm、9 5nm左右，均帶負(fù)電，包封率均大于90%。如圖1和圖2，所得的人 血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物和人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物呈類(lèi)圓 形，且粒徑均一。
[0076] 表1:人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物和人血清白蛋白納米顆粒潑尼松 龍組合物的性質(zhì)(n=3)
高壓均質(zhì)法制備人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物和人血清白蛋白納米顆粒 潑尼松龍組合物 將雷公藤紅素7mg或潑尼松龍20mg溶于2mL二氯甲燒：乙酸乙酯(7:3，V/V)，后與IOmL人 血清白蛋白（2%W/V)以及水溶性穩(wěn)定劑Solutol HS-15 40mg的雙蒸水溶液混合，在冰浴中 探頭超聲15次，得到的混懸液轉(zhuǎn)移到高壓均質(zhì)機(jī)內(nèi)，在15000Psi壓力范圍內(nèi)循環(huán)均化15次 即得納米乳劑，后在37 °C下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)混合溶劑，即得人血清白蛋白納米顆粒 雷公藤紅素組合物和人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物，平均粒徑均在IOOnm左右， PDI均在0.2以下。
[0077] 實(shí)施例3 微射流法制備人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物和人血清白蛋白納米顆粒潑 尼松龍組合物 將雷公藤紅素7mg或潑尼松龍20mg以及水不溶性穩(wěn)定劑中鏈油50mg溶于2mL二氯甲烷： 乙酸乙酯（7 : 3，V/V )，后與I OmL人血清白蛋白（2%W/V )以及水溶性穩(wěn)定劑So I u to I HS-15 40mg的雙蒸水溶液混合，在冰浴中探頭超聲15次，得到的混懸液轉(zhuǎn)移到高壓均質(zhì)機(jī)內(nèi)，在 20000Psi壓力范圍內(nèi)循環(huán)均化15次即得納米乳劑，后在37°C下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)混合 溶劑，即得人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物和人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組 合物，平均粒徑均在90nm左右，PDI均在0.2以下。
[0078] 試驗(yàn)例1 人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物和人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物 大鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn) 取120只健康SD大鼠（體重200±20g，雌雄各半），隨機(jī)分為四大組，每組各30只。第一組 為雷公藤紅素原藥組，分為6個(gè)小組(每組5只），按lmg/kg尾靜脈注射給藥;第二組為人血清 白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物組，分為6個(gè)小組(每組5只），按lmg/kg尾靜脈注射給藥； 第三組為潑尼松龍?jiān)幗M，分為6個(gè)小組(每組5只），按8mg/kg尾靜脈注射給藥;第四組為人 血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物組，分為6個(gè)小組(每組5只），按8mg/kg尾靜脈注射給 藥。
[0079] 給藥后0.08311，0.2511，0.511，111，211，411分別取血后處死，立即分離心、肝、脾、 肺、全腎、腎皮質(zhì)、腦，生理鹽水洗，濾紙吸干，稱重，然后加入兩倍量的生理鹽水勻漿，然后 置于-40°C冰箱冷凍待用。全血于7000r/min離心5min，吸取血漿后置于-40°C冰箱待用。解 凍保存的組織勻漿及血漿后，分別按照對(duì)應(yīng)的生物樣品處理方法和體內(nèi)含量測(cè)定方法對(duì)組 織樣品中雷公藤紅素或潑尼松龍進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)而對(duì)原藥與人血清白蛋白納米顆粒藥物組合 物的體內(nèi)分布情況進(jìn)行比較。
[0080]雷公藤紅素生物樣品處理方法及其對(duì)應(yīng)LC-MS/MS體內(nèi)含量測(cè)定方法如下:精密吸 取IOOyL血漿或組織勻漿液于1.5mL EP管中，加入9.42yg/mL甘草次酸甲醇溶液IOyU渦旋 振蕩30s，再精密加入ImL乙酸乙酯，漩禍振蕩6min，離心（12500r/min, 5min)，取上清液 0.8mL于1.5mL EP管中，殘?jiān)偌尤隝mL乙酸乙酯同法萃取一次。合并上清液，用氮吹儀吹 干，殘?jiān)?00yL甲醇溶解，離心（13500r/min，IOmin)，取上清液過(guò)0.22μπι微孔濾膜后IyL進(jìn) 樣。LC-MS/MS方法：（1)色譜部分:Diamonsil ODS柱：（250 X 4.6 mm, 3 μπι);流動(dòng)相：乙 腈:0.5%甲酸水溶液=80: 20;流速:0.4 ml/min;進(jìn)樣量：IyL。（ 2)質(zhì)譜部分：用于定量分析 的離子反應(yīng)分別為111/2 451.34111/2 201.1(雷公藤紅素），111/2 471.44111/2 317.4(內(nèi)標(biāo):甘 草次酸）。
[0081 ]潑尼松龍生物樣品處理方法及其對(duì)應(yīng)LC-MS/MS體內(nèi)含量測(cè)定方法如下:精密吸取 IOOyL血漿或組織勻漿液于1.5mL EP管中，加入50yL甲醇和250yL乙腈混勻，渦旋IOmin，離 心（13500rpm，IOmin)，取上清液過(guò)0.22μπι微孔濾膜后IyL進(jìn)樣。LC-MS/MS方法：（1)色譜部 分：Diamonsil ODS柱：（250 X 4.6 mm, 3 μπι);流動(dòng)相：甲醇：0 · 1% 甲酸水溶液=65: 35; 流速:0.4 ml/min;進(jìn)樣量：1μΙ^(2)質(zhì)譜部分:用于定量分析的離子反應(yīng)為m/z 361.2-m/z 147.1(潑尼松龍)。
[0082] 結(jié)果： 人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物和人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物 提高了對(duì)應(yīng)原藥在全腎、腎皮質(zhì)中藥物含量，如圖3至圖8所示。
[0083] 圖3結(jié)果表明人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物尾靜脈給藥后，在全腎、腎 皮質(zhì)的雷公藤紅素濃度均高于雷公藤紅素原藥組，5min的雷公藤紅素濃度分別是其1.85 倍、2.31倍。
[0084] 圖4結(jié)果表明人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物尾靜脈給藥后不同時(shí)間點(diǎn) (0.083h，0.25h，0.5h，Ih，2h，4h)，在全腎的藥物濃度均高于雷公藤紅素原藥組，分別是雷 公藤紅素原藥的1.85倍、1.94倍、2.56倍、1.65倍、1.61倍、1.45倍。
[0085] 圖5結(jié)果表明人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物尾靜脈給藥后不同時(shí)間點(diǎn) (0.083h，0.25h，0.5h，Ih，2h，4h)，在腎皮質(zhì)的藥物濃度均高于雷公藤紅素原藥組，分別是 雷公藤紅素原藥的2.31倍、2.23倍、1.91倍、2.31倍、2.27倍、2.81倍。
[0086] 圖6結(jié)果表明人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物尾靜脈給藥后，在全腎、腎皮 質(zhì)的潑尼松龍遠(yuǎn)高于潑尼松龍?jiān)幗M，5min的潑尼松龍分別是其1.66倍、2.08倍。
[0087] 圖7結(jié)果表明人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物尾靜脈給藥后不同時(shí)間點(diǎn) (0.083h，0.25h，0.5h，Ih，2h，4h)，在全腎的藥物濃度均高于潑尼松龍?jiān)幗M，分別是潑尼 松龍?jiān)幍?.66倍、2.04倍、2.84倍、2.52倍。在給藥2h后，潑尼松龍?jiān)幵谀I臟的濃度已經(jīng) 低于檢測(cè)限，但人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物還有較高濃度。
[0088] 圖8結(jié)果表明人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物尾靜脈給藥后不同時(shí)間點(diǎn) (0.083h，0.25h，0.5h，Ih，2h，4h)，在腎皮質(zhì)的藥物濃度均高于潑尼松龍?jiān)幗M，分別是潑 尼松龍?jiān)幍?.08倍、2.68倍、2.67倍、5.60倍。在給藥2h后，潑尼松龍?jiān)幵谀I皮質(zhì)的濃度 已經(jīng)低于檢測(cè)限，但人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物還有較高濃度。
[0089] 綜上所述，本發(fā)明通過(guò)將雷公藤紅素和潑尼松龍制備成其相應(yīng)的人血清白蛋白納 米顆粒藥物組合物，可以實(shí)現(xiàn)其對(duì)腎臟、腎皮質(zhì)靶向遞藥，能夠顯著提高藥物在全腎、腎皮 質(zhì)的聚集濃度或延長(zhǎng)藥物在全腎、腎皮質(zhì)的聚集時(shí)間。
[0090] 試驗(yàn)例2 人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物和人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物 腎小球靶向性評(píng)價(jià) 為了進(jìn)一步探究本發(fā)明制備的人血清白蛋白納米顆粒藥物組合物在腎小球內(nèi)的分布 情況，發(fā)明人對(duì)其在腎小球中藥物濃度進(jìn)行了測(cè)定和分析。
[0091] 按照試驗(yàn)例1中進(jìn)行分組給藥，給藥后0.083,0.25, 0.5，1，2,4h分別取血后處 死，立即分離腎臟，生理鹽水洗，濾紙吸干，剝離腎被膜，然后用手術(shù)小刀小心剪去腎皮質(zhì)， 置于-40Γ冰箱冷凍待用。解凍保存的腎皮質(zhì)，按照腎小球分離及鑒定的方法進(jìn)行處理。 [0092]腎小球分離及鑒定的方法：1、取腎皮質(zhì)：給藥后處死大鼠。用生理鹽水沖凈腎臟組 織表面血跡，剝離腎被膜，剪取腎皮質(zhì)，將獲取的腎皮質(zhì)混在一起剪成ImmX ImmX Imm小塊。 2、 篩網(wǎng)研磨:依次放入3層不銹鋼篩網(wǎng)?？讖椒謩e為250μπι(60目），110μπι( 120目），75μπι(200 目）。在最上層篩網(wǎng)上用消毒針筒輕碾腎皮質(zhì)，同時(shí)用生理鹽水沖洗使其濾入下層篩網(wǎng)（110 μπι)。用生理鹽水沖洗第二層篩網(wǎng)（同時(shí)輕碾組織）。到75μπι這層篩網(wǎng)時(shí)，盡量只沖洗不碾磨。 3、 驗(yàn)證純度:在第三層篩網(wǎng)上，用一次性吸管吸取少量于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察， 若見(jiàn)純凈腎小球達(dá)95%以上，即可停止沖洗。4、收集腎小球：用一次性吸管吸取少量生理鹽 水分多次轉(zhuǎn)移第三層篩網(wǎng)面上的腎小球至2mLEP管中。2000rpm 4°C離心5min，緩慢棄上清， 沉淀即為腎小球。收集得到的腎小球置于_40°C冰箱冷凍待用。解凍保存的腎小球，按照腎 小球樣品處理方法對(duì)其進(jìn)行處理。
[0093]腎小球樣品處理方法:解凍保存的腎小球，精密加入150uL生理鹽水，在超聲波細(xì) 胞粉碎機(jī)下破碎腎小球(參數(shù)為:超聲時(shí)間5s;間隔時(shí)間：5s ;超聲總時(shí)間：3min;超聲功率 150W)，破碎液于倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)全為細(xì)胞碎片，無(wú)完整的腎小球球形結(jié)構(gòu)，說(shuō)明腎 小球在此超聲條件下已被徹底破碎。得到的腎小球破碎液，一部分按照實(shí)施例4中雷公藤紅 素或潑尼松龍生物樣品處理方法及其對(duì)應(yīng)LC-MS/MS體內(nèi)含量測(cè)定方法進(jìn)行藥物含量測(cè)定， 另外精密吸取2yL腎小球破碎液用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。藥物在腎小球中含量表示 為:藥物含量(ng/mg)=腎小球中藥物濃度(ng) /腎小球中蛋白濃度(mg) 為了對(duì)藥物腎小球靶向性進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，使用下列參數(shù):相對(duì)攝取率(Re)、峰濃度比 (Ce)進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中Re用于評(píng)價(jià)藥物是否具有靶向性，大于1表示藥物具有腎小球靶向性， Re愈大靶向效果愈好，等于或小于1表示無(wú)靶向性;Ce值表示藥物對(duì)腎小球靶向分布的效 果，Ce值愈大，在腎小球靶向分布的效果愈明顯，計(jì)算公式分別為:Re=(AUC)$_/(AUC)願(yuàn)j;Ce = (Cmax)$_/(Cmax)臟。運(yùn)用DAS2.1 · 1統(tǒng)計(jì)軟件分別計(jì)算靜脈給藥后腎小球中的AUCo-t (ng/ mg-h)、Cmax(ng/mg) 〇
[0094] 結(jié)果： 人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物和人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物 提高了對(duì)應(yīng)原藥在腎小球中藥物含量，結(jié)果如圖9、圖10及表2所示。
[0095] 圖9結(jié)果表明人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物尾靜脈給藥后不同時(shí)間點(diǎn) (0.083h，0.25h，0.5h，Ih，2h，4h)，在腎小球的藥物濃度均高于雷公藤紅素原藥組，分別是 雷公藤紅素原藥的3.80倍、3.25倍、1.81倍、1.53倍、1.51倍、1.82倍。
[0096] 圖10結(jié)果表明人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物尾靜脈給藥后不同時(shí)間點(diǎn) (0.083h，0.25h，0.5h，Ih，2h，4h)，在腎小球的藥物濃度均高于潑尼松龍?jiān)幗M，分別是潑 尼松龍?jiān)幍?.58倍、4.60倍、3.33倍、5.60倍。在給藥2h后，潑尼松龍?jiān)幵谀I小球的濃度 已經(jīng)低于檢測(cè)限，但人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物還有較高濃度。
[0097] 如表2，人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物和人血清白蛋白納米顆粒潑尼 松龍組合物在腎小球中的Re值、Ce值均大于1，說(shuō)明本發(fā)明制備的人血清白蛋白納米顆粒雷 公藤紅素組合物和人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物具有腎小球靶向作用。
[0098 ]表2:尾靜脈給藥后藥物在腎小球中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)以及腎小球祀向評(píng)價(jià)指標(biāo)(n=5 )
綜上所述，本發(fā)明制備的粒徑在80nm-100nm的人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合 物和人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物能夠被腎小球有效截留，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其對(duì)腎小球 的靶向遞藥，能夠顯著提高藥物在腎小球的聚集濃度或延長(zhǎng)藥物在腎小球的聚集時(shí)間。
[0099] 試驗(yàn)例3 人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物和人血清白蛋白納米顆粒潑尼松龍組合物 的藥效學(xué)評(píng)價(jià) 抗Thyl. 1抗體可特異性識(shí)別大鼠腎小球系膜細(xì)胞表面Thyl. 1分子，導(dǎo)致補(bǔ)體依賴性系 膜溶解、腎小球內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、顯著的蛋白尿，以及急性或進(jìn)展性系膜損傷，包括系膜細(xì) 胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積等。據(jù)報(bào)道，單次注射該抗體所引發(fā)的大鼠可逆性抗Thyl. 1抗體 腎炎模型腎臟病理學(xué)特征基本類(lèi)似于人類(lèi)系膜增生性腎炎的早期病變。本發(fā)明采用的是抗 Thyl. 1單克隆抗體，通過(guò)單次靜脈注射抗Thyl. 1抗體(5mg/kg)給SD大鼠建立急性系膜增生 性腎小球腎炎，藥物治療從給完抗體2h之后開(kāi)始。
[0100]動(dòng)物分組及給藥方案： 1)正常組一(n=5):按5mg/kg給予生理鹽水，2h后，按lmg/kg給予生理鹽水，之后每隔一 天按lmg/kg給予生理鹽水，共給3次。
[0101 ] 2)模型組一(n=5):按5mg/kg給予抗Thyl. 1抗體，2h后，按lmg/kg給予生理鹽水，之 后每隔一天按lmg/kg給予生理鹽水，共給3次。
[0102] 3)雷公藤紅素組(n=5):按5mg/kg給予抗Thyl · 1抗體，2h后，按lmg/kg給予雷公藤 紅素原液，之后每隔一天按lmg/kg給予雷公藤紅素原液，共給3次。
[0103] 4)雷公藤紅素白蛋白納米粒組(n=5):按5mg/kg給予抗Thyl. 1抗體，2h后，按Img/ kg給予雷公藤紅素白蛋白納米粒，之后每隔一天按lmg/kg給予雷公藤紅素白蛋白納米粒， 共給3次。
[0104] 5)正常組二(n=5):按5mg/kg給予生理鹽水，2h后，按8mg/kg給予生理鹽水，之后每 隔一天按8mg/kg給予生理鹽水，共給3次。
[0105] 6)模型組二(n=5):按5mg/kg給予抗Thyl · 1抗體，2h后，按8mg/kg給予生理鹽水，之 后每隔一天按8mg/kg給予生理鹽水，共給3次。
[0106] 7)潑尼松龍組(n=5):按5mg/kg給予抗Thyl · 1抗體，2h后，按8mg/kg給予潑尼松龍 原液，之后每隔一天按8mg/kg給予潑尼松龍?jiān)?，共給3次。
[0107] 8)潑尼松龍白蛋白納米粒組(n=5):按5mg/kg給予抗Thyl · 1抗體，2h后，按8 mg/kg 給予潑尼松龍白蛋白納米粒，之后每隔一天按8 mg/kg給予潑尼松龍白蛋白納米粒，共給3 次。
[0108] 藥效評(píng)價(jià)： I)尿蛋白檢測(cè)，在實(shí)驗(yàn)第6天采集24h尿樣本檢測(cè)尿蛋白含量，以mg/day表示。
[0109] 2)腎臟生化指標(biāo)測(cè)定，在實(shí)驗(yàn)第7天對(duì)各實(shí)驗(yàn)組大鼠眼眶取血，全血4500r/min離 心5min后取上清液，使用日立7020型生化儀生化測(cè)定血肌酐(CREA)和尿素氮(BUN)。
[0110] 3)腎臟病理檢查，在實(shí)驗(yàn)第7天處死各實(shí)驗(yàn)組大鼠，取腎組織用10%福爾馬林緩沖 液固定48h，石蠟包埋，按標(biāo)準(zhǔn)方法制備4μπι厚的切片，進(jìn)行PAS染色，利用顯微鏡及電子圖像 分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)每張切片30個(gè)腎小球總有核細(xì)胞數(shù)，然后以150個(gè)腎小球取平均值表示腎小 球的增殖程度。
[0111] 以腎小球內(nèi)PAS染色程度表示系膜基質(zhì)沉積程度，具體評(píng)價(jià)方法(半定量評(píng)分法） 如下:每張免疫組化切片讀取30個(gè)腎小球，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組讀取150個(gè)腎小球，根據(jù)每個(gè)腎小球 病變累及程度分為0~4+。0級(jí):0分，腎小球內(nèi)免疫組化染色陰性；1+級(jí)：1分，腎小球內(nèi)部分 系膜區(qū)少量染色陽(yáng)性，病變累及不超過(guò)25% ;2+級(jí):2分，腎小球內(nèi)系膜區(qū)染色陽(yáng)性面積不超 過(guò)50% ;3+級(jí):3分，腎小球的大部分出現(xiàn)明顯團(tuán)塊樣染色陽(yáng)性區(qū)域，病變約占腎小球面積的 75% ;4+級(jí):4分，主要在接近硬化的腎小球內(nèi)呈現(xiàn)彌漫性染色強(qiáng)陽(yáng)性，染色區(qū)域占腎小球面 積的75~100%。每張切片總評(píng)分=(0\勵(lì)+1\肌+2\吧+3\吧+4\財(cái))/(勵(lì)+附+吧+似+財(cái)）， 其中NO: 0級(jí)的腎小球數(shù);Nl: 1+級(jí)的腎小球數(shù):Ν2:2+級(jí)的腎小球數(shù);Ν3:3+級(jí)的腎小球數(shù)； N4:4+級(jí)的腎小球數(shù)。
[0112] 結(jié)果： 相比原藥組，雷公藤紅素白蛋白納米粒組和潑尼松龍白蛋白納米粒組顯著降低了抗 Thyl. 1腎小球腎炎大鼠的蛋白尿病理情況。結(jié)果如圖11、圖12所示。
[0113] 相比原藥組，雷公藤紅素白蛋白納米粒組和潑尼松龍白蛋白納米粒組組顯著改善 了抗Thyl. 1腎小球腎炎大鼠腎臟生化指標(biāo)BUN和Crea，結(jié)果如表3、表4所示。
[0114] 表3,雷公藤紅素及雷公藤紅素白蛋白納米粒改善了抗Thyl. 1腎小球腎炎大鼠的 BUN和Crea血液指標(biāo)。（n=5)
相比原藥組，雷公藤紅素白蛋白納米粒組和潑尼松龍白蛋白納米粒組組顯著改善了抗 Thyl. 1腎小球腎炎大鼠的腎小球系膜損傷情況。結(jié)果如表5、表6所示。
[0115] 表5,雷公藤紅素及雷公藤紅素白蛋白納米粒改善了抗Thyl. 1腎小球腎炎大鼠腎 小球系膜區(qū)病理變化(n=5)
表6,潑尼松龍及潑尼松龍白蛋白納米粒改善了抗Thyl. 1腎小球腎炎大鼠腎小球系膜 區(qū)病理變化(n=5)
綜上可知，本發(fā)明制備的人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物和人血清白蛋白納 米顆粒潑尼松龍組合物通過(guò)腎小球系膜細(xì)胞靶向遞藥，顯著提高了藥物治療抗Thyl. 1系膜 增生性腎小球腎炎的療效。
[0116] 試驗(yàn)例4 人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物的心臟毒性評(píng)價(jià) 由以上試驗(yàn)例可知，本發(fā)明制備的人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物通過(guò)腎小 球靶向作用，顯著提高了雷公藤紅素在腎小球處的聚集，同時(shí)降低了心臟中的雷公藤紅素 的濃度。據(jù)報(bào)道，雷公藤紅素具有很強(qiáng)的心臟毒性，在微摩爾級(jí)別濃度便會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎 心臟中毒。因此，發(fā)明人通過(guò)測(cè)定血清中的肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)來(lái)對(duì)雷公藤紅 素和人血清白蛋白納米顆粒雷公藤紅素組合物的心臟毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較。
[0117] 動(dòng)物分組及給藥方案：1)生理鹽水組(n=5):每隔一天按lmg/kg給予生理鹽水共給 3次;2)雷公藤紅素組(n=5):每隔一天按lmg/kg給予雷公藤紅素原液，共給3次;3)雷公藤紅 素白蛋白納米粒組(n=5):每隔一天按lmg/kg給予雷公藤紅素白蛋白納米粒，共給3次。于末 次給藥24小時(shí)后取血清，并使用日立7020全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中的CK和LDH水平。
[0118] 結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，雷公藤紅素白蛋白納米粒組各項(xiàng)指標(biāo)的水 平與生理鹽水組沒(méi)有顯著性差異，而雷公藤紅素組的CK和LDH都顯著高于生理鹽水組，具有 顯著性差異(P<〇.001)。說(shuō)明雷公藤紅素具有一定的心臟毒性，但是制成白蛋白納米粒之 后毒性顯著降低。
[0119] 表7,雷公藤紅素及雷公藤紅素白蛋白納米粒給藥處理后大鼠血清CK和LDH水平(/3 =5)
注:與生理鹽水組比較，#P<〇. 001。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種腎小球靶向蛋白納米顆粒藥物組合物，其特征在于主要由蛋白成分、藥理活性 物質(zhì)、穩(wěn)定劑制成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述藥物組合物，其特征在于其粒徑為1〇111]1-17()111]1，優(yōu)選為6〇111]1-150nm，更優(yōu)選為 80nm-100nm。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述蛋白成分選自人血清白蛋白、 牛血清白蛋白、羊血清白蛋白、驢血清白蛋白、馬血清白蛋白、兔血清白蛋白、豬血清白蛋 白、疏水蛋白、糖蛋白、脂蛋白或其他種類(lèi)蛋白以及類(lèi)似物和衍生物中的一種或多種組合； 所述穩(wěn)定劑選自大豆油、中鏈油、椰子油、橄欖油、紅花油、棉籽油、芝麻油、橙油、大豆 卵磷脂、蛋黃卵磷脂、氫化豆磷脂、二月桂酰卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷 脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷 脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、十二烷基硫酸鈉 、Solutol HS-15、月桂酸、棕櫚酸、 油酸、鯨蠟醇硫酸鈉、硬脂醇硫酸鈉、脂肪酸磺酸化物、烷基芳基磺酸化物、司盤(pán)、吐溫、賣(mài) 澤、芐澤、泊洛沙姆188、壬基酚、辛基酚、辛基甲酚、平平加0和類(lèi)似化合物的一種或其混合 物； 所述藥理活性物質(zhì)選自預(yù)防和/或治療腎臟疾病的藥物，包括但不僅限于:抗炎藥、免 疫抑制劑、直接或間接抗腎小球系膜細(xì)胞增生和/或系膜基質(zhì)沉積藥物、NF-kB抑制劑、腎小 球過(guò)濾膜保護(hù)劑、抗腫瘤藥物、抗微生物藥、抗病毒藥等，優(yōu)選包括吲哚美辛、布洛芬、可的 松、地塞米松、氫化可的松、氫化潑尼松、潑尼松、潑尼松龍、倍他米松、雷公藤堿、雷公藤次 喊、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)醋甲、雷公藤甲素、雷公藤乙素、環(huán)抱素 A、他克旲司、雷帕霉素、霉 酚酸、肝素、厚樸酚、和厚樸酚、己酮可可堿、哌唑嗪、多沙唑嗪、伊馬替尼、伐地那非、DHMEQ、 黃芪皂苷、黃柏堿、大黃酸、茯苓酸、茯苓酸甲酯、丹參酮、氟尿嘧啶、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、 美法侖、異溶肉瘤素以及它們的類(lèi)似物和衍生物。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于制備成適用于注射給藥、口 服給藥、體內(nèi)局部給藥的藥物制劑。5. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的蛋白納米顆粒在制備腎小球靶向的藥物中的應(yīng)用。6. -種腎小球革El向蛋白納米顆粒藥物組合物的制備方法，其特征在于選自超聲法、高 壓均質(zhì)法、微射流法，具體包括以下步驟： 一、超聲法： (1) 將藥物活性成分與水不溶性穩(wěn)定劑溶于有機(jī)溶劑中作為油相，必要時(shí)可用超聲輔 助溶解； (2) 將蛋白成分、水溶性穩(wěn)定劑溶于水中作為水相，必要時(shí)可在一定溫度下加熱溶解； (3) 根據(jù)需要，（1)和（2)中穩(wěn)定劑分別可只加入水不溶性穩(wěn)定劑或水溶性穩(wěn)定劑或兩 種類(lèi)型穩(wěn)定劑均加入； (4) 將油相與水相混合，混合后直接在超聲功率400-800w(3S/5S)，0-10°C冰浴條件下 超聲5-15min，即得納米乳劑； (5) 得到的納米乳劑，減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，即得蛋白納米顆粒組合物。7. 二、高壓均質(zhì)法： (1)將藥物活性成分與水不溶性穩(wěn)定劑溶于有機(jī)溶劑中作為油相，必要時(shí)可用超聲輔 助溶解； (2) 將蛋白成分、水溶性穩(wěn)定劑溶于水中作為水相，必要時(shí)可在一定溫度下加熱溶解； (3) 根據(jù)需要，（1)和（2)中穩(wěn)定劑分別可只加入水不溶性穩(wěn)定劑或水溶性穩(wěn)定劑或兩 種類(lèi)型穩(wěn)定劑均加入； (4) 將油相與水相混合，混合后先在O-HTC冰浴條件下探頭超聲10-15次，得到的混懸 液轉(zhuǎn)移到高壓均質(zhì)機(jī)內(nèi)，在3000_30000Psi壓力范圍內(nèi)循環(huán)均化10-15次即得納米乳劑； (5) 得到的納米乳劑，減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，即得蛋白納米顆粒組合物。8. 三、微射流法： (1) 將藥物活性成分與水不溶性穩(wěn)定劑溶于有機(jī)溶劑中作為油相，必要時(shí)可用超聲輔 助溶解； (2) 將蛋白成分、水溶性穩(wěn)定劑溶于水中作為水相，必要時(shí)可在一定溫度下加熱溶解； (3) 根據(jù)需要，（1)和（2)中穩(wěn)定劑分別可只加入水不溶性穩(wěn)定劑或水溶性穩(wěn)定劑或兩 種類(lèi)型穩(wěn)定劑均加入； (4) 將油相與水相混合，混合后先在O-HTC冰浴條件下探頭超聲10-15次，得到的混懸 液轉(zhuǎn)移到微射流內(nèi)，在3000-30000Psi壓力范圍內(nèi)循環(huán)均化10-15次即得納米乳劑； (5) 得到的納米乳劑，減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，即得蛋白納米顆粒組合物。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑可選二氯甲烷、三氯甲 烷、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、二氧六環(huán)、乙酸乙酯、乙腈、甲基吡咯烷酮、甲醇、乙 醇、中鏈醇或類(lèi)似溶劑，以及2種或2種以上這些溶劑的混合物。10. 權(quán)利要求5項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物用于預(yù)防和/或治療腎臟疾病，所述 腎臟疾病包括但不僅限于：腎小球類(lèi)疾病、腎小球類(lèi)疾病誘發(fā)的腎小管間質(zhì)疾病以及腎小 球類(lèi)疾病誘發(fā)的腎血管疾病、腎腫瘤及腎移植后的抗排斥反應(yīng)以及其他腎臟疾病。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105944109SQ201610277813
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月3日
【發(fā)明人】張志榮, 龔濤, 郭玲, 孫遜
【申請(qǐng)人】四川大學(xué)