抗菌肽誘導劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種可發(fā)揮人所具備的自身生物體防御機制、新型、安全、無副作用的、抗菌肽誘導劑。提供一種含乳酸菌作為有效成分的新型抗菌肽誘導劑。該乳酸菌可以以活菌的形式直接攝取其菌體，也可以以使該乳酸菌發(fā)酵后的所謂混有乳酸菌的活菌的原材料的形式攝取。通過攝取本發(fā)明的抗菌肽的體內分泌誘導劑，在體內誘導該抗菌肽，從而可以期待提高因各種感染防御而產生的免疫力、以及抗衰老、延長健康壽命等。
【專利說明】
抗菌肽誘導劑
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種抗菌肽誘導劑。
【背景技術】
[0002] 以人為首的哺乳動物因被病原性細菌和真菌、病毒等感染，而導致這些菌或病毒 侵入生物體內進行增殖和固著，從而引起腹瀉、胃腸疾病、發(fā)熱等，當其癥狀嚴重時，有時還 會導致死亡。哺乳動物的這種感染癥即使在醫(yī)療發(fā)達的現(xiàn)代也無法杜絕，例如是人類過上 健康生活方面的重大課題。
[0003] 與健康成人相比，倒是以感染防御功能為代表的抵抗力弱的高齡者、嬰幼兒、小兒 等容易罹患這些感染癥。例如，高齡者隨著年齡的增加，其自身的感染防御功能下降，從而 容易感染在健康成人中不會感染的常在細菌(例如存在于鼻粘膜等處的黃色葡萄球菌等）。 例如，嬰幼兒或小兒的免疫組織尚未成熟，自身的感染防御功能低，因此被認為與健康成人 相比罹患感染癥的可能性大。在抵抗力如此弱的對象者集體生活的設施中，當發(fā)現(xiàn)個別的 感染癥時，為了防止感染癥的擴散，會強制采取以下等措施:對罹患了該感染癥的患者進行 物理隔離，或者，封閉已發(fā)生感染癥的患者滯留或訪問過的設施。
[0004] 作為感染癥的處理方法，通常是采取先確定感染癥的病因、然后再給予具有抗菌 作用的藥物(抗菌藥)的療法。然而，在對患者給予抗菌藥時，該抗菌藥不僅對作為感染癥病 因的特定的菌或病毒產生作用，還會對不是感染癥病因的原本就固著在體內的所謂無病原 性的雙歧乳桿菌等腸內細菌或常在菌產生作用，因此還存在著發(fā)生腹瀉或其他病原體的感 染癥等副作用的可能性。另外，通過反復給予、或者長期給予相同種類的抗菌藥，會提供作 為感染癥病因的病原性細菌、真菌和病毒本身耐受該藥物的機會，從而導致其感染癥的治 療有時會變得困難。
[0005] 本來，已知生物為了防止作為感染癥病因的病原性細菌或真菌、病毒的侵入或固 著，在該生物自身的體內分泌具有抗菌作用的各種肽(抗菌肽）?？咕氖?0~100個氨基酸 結合而成的肽，已由包括人在內的各種生物中分離。另外，由于抗菌肽來自宿主，所以沒有 如給予上述抗菌藥時一樣的副作用，不會出現(xiàn)耐藥菌。即，如果能夠在體內促進抗菌肽的分 泌，則可以期待理想的感染防御。
[0006] 來自人的抗菌肽例如有防衛(wèi)素家族(α-防衛(wèi)素、β-防衛(wèi)素等）、(^他61丨(^虹11〇^-37)、(^^(^虹11、1^4?-1(鐵調素）、1^4?-2、乳鐵蛋白、（屬于)再生胰島衍生家族的肽(1^ 8 肽)等。這些抗菌肽的分子結構或分泌的臟器不同，顯示抗菌作用的靶物質也不同。
[0007] 如果可以人為地使這些抗菌肽在人體內表達或分泌，則可以期待預防感染癥或減 輕癥狀。例如，有人提出了如下的技術：以有機酸作為有效成分的人即方衛(wèi)素的分泌促進技 術(專利文獻1)、以來自酵母的不溶性組分作為有效成分的抗菌肽的基因的表達誘導技術 (專利文獻2)、以含有來自酵母的甘露聚糖的成分作為有效成分的抗菌肽的表達誘導技術 (專利文獻3)、作為HI-CHEW(譯者注：日本森永制果公司生產的一種果汁軟糖)用濃縮酸乳、 甜酒提取物、燒酒糟、米糠醬濃縮物等的有效成分的抗菌肽的表達誘導技術(專利文獻4)、 以來自發(fā)芽糙米和/或糙米糠的留醇糖苷作為有效成分的α-防衛(wèi)素等抗菌肽的分泌誘導技 術(專利文獻5)、以白藜蘆醇作為有效成分的α-防衛(wèi)素等抗菌性肽的分泌誘導技術(專利文 獻6)等。
[0008] 現(xiàn)有技術文獻
[0009] 專利文獻
[0010] 專利文獻1:國際公開第2005/027893號；
[0011] 專利文獻2:日本特開2003-000262號公報；
[0012] 專利文獻3:日本特開2006-241023號公報；
[0013] 專利文獻4:日本特開2005-270117號公報；
[0014] 專利文獻5:日本特開2013-074821號公報；
[0015] 專利文獻6:日本特開2013-237643號公報。

【發(fā)明內容】

[0016] 發(fā)明所要解決的課題
[0017] 本發(fā)明的課題在于:提供一種能夠發(fā)揮人體內存在的自身生物體防御機制的、安 全、無副作用的、抗菌肽的體內分泌誘導劑。
[0018] 用于解決課題的方法
[0019] 鑒于上述課題，本發(fā)明人進行了深入研究，獲得了以下的認知。即，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn) 了：證實了，通過攝取乳酸菌可誘導表達防衛(wèi)素的基因或Reg肽的基因表達，解決了上述課 題。另外，由于作為本發(fā)明的有效成分的乳酸菌、及其下位概念的使乳酸菌發(fā)酵后的原材料 作為發(fā)酵食品等還具有長年的食用習慣，因此本發(fā)明的抗菌肽的體內分泌誘導劑安全，副 作用的風險非常小。
[0020] 而且，通過攝取本發(fā)明的抗菌肽的體內分泌誘導劑，在體內誘導該抗菌肽，可以期 待著維持、提高因各種感染防御而產生的免疫力、或抗衰老、延長健康壽命等。其中，可以期 待預防和/或治療由機會性致病菌(Opportunistic pathogens)引起的感染癥、由病原細菌 和真菌引起的感染癥、幽門螺旋桿菌感染癥、細菌易位、腸粘膜炎癥的持續(xù)、腸內菌群平衡 的變化(腸內菌群平衡的紊亂等）、以及由這些炎癥誘導的疾病、克羅恩病、潰瘍性大腸炎等 炎癥性大腸炎、調節(jié)性T細胞分化所誘導的過剩的炎癥或過敏癥狀等。另外，還可以期待降 低免疫功能尚未成熟的嬰幼兒或小兒、免疫力低下的高齡者、以及患有各種疾病的患者的 感染風險，抑制炎癥，預防或減輕過敏或慢性疾病等。
[0021] 如上所述，乳酸菌具有誘導防衛(wèi)素或Reg肽或這兩種抗菌肽的基因表達的作用。因 此，本發(fā)明提供一種抗菌肽誘導劑或其誘導用組合物或其兩者，所述抗菌肽誘導劑的特征 在于：以乳酸菌或經乳酸菌發(fā)酵的原材料或其兩者作為有效成分，誘導抗菌肽的基因表達。 本發(fā)明還提供:乳酸菌在制備抗菌肽誘導劑中的應用。此外，本發(fā)明還提供:乳酸菌在制備 抗菌肽誘導用組合物中的應用。
[0022] 即，本
【發(fā)明內容】
如下。
[0023] (1)-種抗菌肽誘導劑，其特征在于：以乳酸菌或經乳酸菌發(fā)酵的原材料或其兩者 作為有效成分，誘導抗菌肽的基因表達。
[0024] (2) (1)所述的抗菌肽誘導劑，其特征在于:抗菌肽為防衛(wèi)素或再生胰島衍生家族 肽(Reg肽)或其兩者。
[0025] (3)(1)或(2)所述的抗菌肽誘導劑，其特征在于:乳酸菌為乳桿菌屬乳酸菌或鏈球 菌屬乳酸菌或其兩者。
[0026] (4)-種抗菌肽誘導用組合物，其中含有權利要求1~3中任一項所述的抗菌肽誘 導劑。
[0027] (5)(4)所述的抗菌肽誘導用組合物，其中，乳酸菌是選自乳桿菌屬乳酸菌的一種 或兩種或多于兩種的菌株和選自鏈球菌屬乳酸菌的一種或兩種或多于兩種的菌株的組合。
[0028] (6)(4)所述的抗菌肽誘導用組合物，其特征在于:誘導用組合物的每單位包裝含 有1億個以上的乳酸菌。
[0029] (7)(1)~(6)中任一項所述的抗菌肽誘導用組合物，其特征在于:上述乳酸菌為活 菌。
[0030] (8) -種具有感染預防作用的食品/藥品組合物，其中，（4)~(7)所述的抗菌肽誘 導用組合物誘導抗菌肽的基因表達。
[0031] (9)(8)所述的具有感染預防作用的食品/藥品組合物，其中，上述食品/藥品組合 物是通過經口攝取、經腸攝取來進行誘導。
[0032] (10)作為誘導抗菌肽的基因表達的有效成分的乳酸菌或經乳酸菌發(fā)酵的原材料 或其兩者在制備抗菌肽誘導劑中的應用。
[0033] (11)作為誘導抗菌肽的基因表達的有效成分的乳酸菌或經乳酸菌發(fā)酵的原材料 或其兩者在制備含有抗菌肽誘導劑的抗菌肽誘導用組合物中的應用。
[0034] (12)作為誘導抗菌肽的基因表達的有效成分的乳酸菌或經乳酸菌發(fā)酵的原材料 或其兩者在制備含抗菌肽誘導劑的具有感染預防作用的食品/藥品組合物中的應用。
[0035] 發(fā)明效果
[0036] 本發(fā)明可以提供一種可發(fā)揮人體內存在的自身生物體防御機制的、安全、無副作 用的、抗菌肽的體內分泌誘導劑。
【具體實施方式】
[0037] 下面，詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于各種方式。
[0038] 本發(fā)明的乳酸菌是指在分類學上被認定為乳酸菌的所有細菌的總稱，或者是指雙 歧乳桿菌等其全部類似細菌的總稱，對菌種或菌株等沒有限定。另外，根據乳酸菌的來源， 有時還會將其分為植物來源和動物來源，但本發(fā)明的乳酸菌可以使用植物來源也可以使用 動物來源。其中，選自乳桿菌屬乳酸菌的一種或兩種或多于兩種的菌株和選自鏈球菌屬乳 酸菌的一種或兩種或多于兩種的菌株的組合通過酸乳等發(fā)酵乳在飲食習慣上具有實效，因 此優(yōu)選。另外，更優(yōu)選乳桿菌屬乳酸菌為被稱作保加利亞菌或保加利亞乳桿菌的德氏乳桿 菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii ssp .bulgaricus)、而鏈球菌屬乳酸菌為被 稱作嗜熱菌（Thermophi Ius)或嗜熱鏈球菌的唾液鏈球菌嗜熱亞種（Streptococcus salivarius ssp·thermophiIus)〇
[0039] 本發(fā)明的乳酸菌可以使用活菌或死菌的任一種狀態(tài)。另外，關于本發(fā)明的乳酸菌 的形態(tài)，即使是進行了凍結或冷凍干燥的乳酸菌也可使用。而且，本發(fā)明的乳酸菌不僅是乳 酸菌菌體的形態(tài)，還可以是在乳酸菌的菌體中包含菌體以外的成分(例如凍結保護劑或冷 凍干燥保護劑等）的形態(tài)，也可以是分散在作為藥品的原材料或飲食品的原材料等具有使 用實效的淀粉或水等各種介質中的狀態(tài)。
[0040] 本發(fā)明的抗菌肽誘導劑是指通過讓以人為首的哺乳動物攝取而在體內誘導基因 等、并可以產生來自該基因的抗菌肽的制劑。需要說明的是，這里所說的攝取只要是進入人 體內的攝取即可，對給藥途徑沒有限定，例如口服給藥、經管給藥、經腸給藥等公知的所有 給藥方法均可。此時，典型地可以列舉經由消化道的經口攝取、經腸攝取，但優(yōu)選經口攝取， 更優(yōu)選通過飲食攝取。
[0041] 本發(fā)明的抗菌肽是指，將不是來自體內的外部細菌進行滅菌、殺菌、靜菌而具有防 御感染的作用的肽。作為抗菌肽，可以例示：防衛(wèi)素家族（α_防衛(wèi)素、防衛(wèi)素等）、 cathelicidin(LL_37)、dermcidin、LEAP_l(鐵調素）、LEAP_2、乳鐵蛋白、Reg肽等?？咕目?以是相應的肽本身，也可以是將特定部位水解活化的所謂的前體形態(tài)。
[0042] 本發(fā)明的誘導是指，增加用于表達抗菌肽的基因在生物體內的表達，隨之使抗菌 肽表達。對該基因沒有特別限定，但作為優(yōu)選的基因，可以例示RegI、R egII、RegIIIa、 RegIIIi3、RegIII γ、和表達防衛(wèi)素的基因等。
[0043]作為本發(fā)明的另一方案，涉及由防衛(wèi)素家族和/或Reg肽引起的各種疾病的預防 和/或治療劑。各種疾病是指：由機會性致病菌引起的感染癥、由病原細菌、真菌、病毒引起 的感染癥、幽門螺旋桿菌感染癥、細菌易位、腸粘膜炎癥的持續(xù)、腸內菌群平衡的變化(腸內 菌群平衡的紊亂等）、以及由這些炎癥誘導的疾病、克羅恩病、潰瘍性大腸炎等炎癥性大腸 炎、調節(jié)性T細胞分化所誘導的過剩的炎癥或過敏癥狀等，與本發(fā)明的申請日和/或以優(yōu)先 日為基準的日期的前后無關，是指由防衛(wèi)素家族和/或Reg肽引起的疾病、癥狀、綜合征、以 及暗示這些情況的所有情形。
[0044] 本發(fā)明的經乳酸菌發(fā)酵的原材料，只要是將身為藥品的原材料、飲食品的原材料 等、且具有以人為首的哺乳動物攝取的習慣的原材料經乳酸菌發(fā)酵而獲得的物質即可，沒 有特別限定。其中，可以例示通過乳酸菌使乳、大豆、小豆、谷類、野菜類、肉類、魚類、以及它 們的混合物發(fā)酵而獲得的原材料。
[0045] 作為通過乳酸菌使乳發(fā)酵而獲得的原材料之一例，可以例示:調合原料乳、乳產品 和原料水，使乳脂肪分達到3.0重量％、無脂乳固體分達到9.5重量％，再根據需要進行用于 調節(jié)乳脂肪球的均質化處理，在相當于65°C下保持30分鐘的殺菌條件下進行加熱殺菌，在 40~45°C下冷卻后，添加作為乳桿菌屬乳酸菌的德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜 熱亞種的混合引子，在40~45°C下發(fā)酵2~12小時，調整成0.6~1.2重量％的乳酸酸度的原 材料。此時，對德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種的菌株沒有限定，可任意添 加這兩個菌種以外的乳酸菌(例如乳桿菌屬、雙岐桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬等）、以及 其他的對發(fā)酵或健康有用的微生物或原材料或添加劑。需要說明的是，這里所說的原料乳 并不限于由牛、山羊、羊、水牛等擠出的被稱為生乳或原乳的乳、以及與該生乳或原乳的組 成相同的還原乳，還可以加入(強化)乳脂肪分和/或無脂乳固體分(乳蛋白、乳糖、灰分），或 者，例如除去乳脂肪分而制成低脂肪乳或無脂肪乳，以及面向具有乳糖不耐受傾向的人而 制成脫乳糖乳或乳糖分解乳。而且，為了面向鈉等礦物質的攝取受限的患者和/或為了緩和 攝取時的鹽味而制成脫鹽乳或推薦攝取鈣等礦物質的患者，還可制成鈣強化乳。
[0046] 本發(fā)明的抗菌肽誘導劑只要含有乳酸菌即可，對其菌數沒有特別限定，優(yōu)選每單 位包裝中存在1億個以上的乳酸菌，更優(yōu)選存在5億個以上的乳酸菌，進一步優(yōu)選存在10億 個以上的乳酸菌。乳酸菌的菌數越多，則越能期待本發(fā)明的效果，但考慮到乳酸菌的正常增 殖，上限為10兆個。另外，例如在含有乳桿菌屬乳酸菌和鏈球菌屬乳酸菌時，優(yōu)選乳桿菌屬 乳酸菌為0.1億個以上、且鏈球菌屬乳酸菌為1億個以上，更優(yōu)選乳桿菌屬乳酸菌為0.5億個 以上、且鏈球菌屬乳酸菌為5億個以上，進一步優(yōu)選乳桿菌屬乳酸菌為1億個以上、且鏈球菌 屬乳酸菌為10億個以上，最優(yōu)選乳桿菌屬乳酸菌為5億個以上、且鏈球菌屬乳酸菌為50億個 以上。乳桿菌屬乳酸菌和鏈球菌屬乳酸菌的菌數越多，則越能期待本發(fā)明的效果，但考慮到 乳酸菌的正常增殖，上限是保加利亞乳桿菌為1兆個、嗜熱鏈球菌為10兆個。而且，例如在含 有德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種時，優(yōu)選德氏乳桿菌保加利亞亞種為 0.1億個以上、且唾液鏈球菌嗜熱亞種為1億個以上，更優(yōu)選德氏乳桿菌保加利亞亞種為0.5 億個以上、且唾液鏈球菌嗜熱亞種為5億個以上，進一步優(yōu)選德氏乳桿菌保加利亞亞種為1 億個以上、且唾液鏈球菌嗜熱亞種為10億個以上，最優(yōu)選德氏乳桿菌保加利亞亞種為5億個 以上、且唾液鏈球菌嗜熱亞種為50億個以上。德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜熱 亞種的菌數越多，則越能期待本發(fā)明的效果，但考慮到乳酸菌的正常增殖，上限是德氏乳桿 菌保加利亞亞種為1兆個、唾液鏈球菌嗜熱亞種為10兆個。
[0047] 本發(fā)明的抗菌肽誘導劑，對每單位包裝的重量沒有限定，在每Ig的抗菌肽誘導劑 中存在1億個以上的乳酸菌時，每單位包裝的重量優(yōu)選為10~500g，更優(yōu)選為25~250g，進 一步優(yōu)選為50~200g，最優(yōu)選為75~150g。另外，本發(fā)明的單位包裝不僅是指每袋、每箱、每 個容器，還可以是其中所包含的每次的單位包裝形態(tài)，也可以是每天的單位包裝形態(tài)?？梢?制成將適合多天、例如1周的攝取的數量一并包裝而成的產品、或包含多個獨立包裝的產品 等。
[0048] 在本發(fā)明的一個方案中，為了提高抗菌肽誘導、分泌促進效果，希望持續(xù)攝取乳酸 菌和/或其培養(yǎng)物、以及包含這些成分的抗菌肽誘導劑達3周以上、優(yōu)選5周以上、更優(yōu)選8周 以上。
[0049] 由于乳酸菌和/或其培養(yǎng)物可以安全地進行攝取，因此對攝取期間的上限沒有特 別限定，可以永久地持續(xù)攝取。從獲得充分有效的抗菌肽誘導效果的角度考慮，也可以以持 續(xù)攝取達8周左右作為標準。
[0050] 本發(fā)明的乳包含乳、乳產品、乳蛋白中的至少一種以上。例如，可以列舉:牛乳、羊、 山羊等的獸乳;或其加工品、滅菌乳、脫脂乳、全脂奶粉、部分脫脂乳、脫脂奶粉、全脂濃縮 乳、脫脂濃縮乳、奶油、黃油、酪乳、乳清、乳清蛋白濃縮物(WPC)、乳清蛋白分離物(WPI)、a_ 乳清蛋白（α-La)、β_乳球蛋白（β-Lg)、α-酪蛋白、β-酪蛋白、K-酪蛋白、非蛋白態(tài)氮等。
[0051] 本發(fā)明的乳酸菌還可用作藥品或飲食品。含有本發(fā)明的乳酸菌的藥品或飲食品在 具有抗菌肽表達促進效果方面有用，特別是，可以用作微生物感染預防或感染治療用的藥 品或飲食品。將本發(fā)明的乳酸菌用作藥品或飲食品時，可以使用單獨的菌株，或者可以組合 兩種或多于兩種的菌株進行使用。
[0052]將本發(fā)明的乳酸菌用于上述藥品或飲食品時，對其狀態(tài)沒有限定。例如，本發(fā)明的 乳酸菌無論是活菌、死菌或處理物，均可用于上述藥品或飲食品。例如，在上述藥品或飲食 品中可以使用本發(fā)明的乳酸菌的培養(yǎng)物、其濃縮物、加工成膏狀的膏化物、噴霧干燥物、冷 凍干燥物、真空干燥物、鼓干燥物、分散在介質中的液態(tài)物、經稀釋劑稀釋的稀釋物、將干燥 物用磨粉機等破碎而獲得的破碎物等。
[0053] 而且，本發(fā)明的飲食品還可用于保健功能食品或患者用食品。保健功能食品制度 是依據內外的動向、以及與一直以來的特定保健用食品制度的整合性，不僅以普通食品、還 以形成了片劑、膠囊等形狀的食品為對象而設定的制度，包括特定保健用食品（個別許可 型）和營養(yǎng)功能食品（規(guī)格基準型)這兩種類型。通過對人等動物給予本發(fā)明的乳酸菌作為 特定保健用食品等特別用途食品或營養(yǎng)功能食品，可以預防各種感染。
[0054] 在本發(fā)明的一個方案中，優(yōu)選在本發(fā)明的抗體效價提高劑中標示其用途、效能、功 能、有效成分的種類、功能性成分的種類、攝取方法等的說明。"標示"可以是在藥品、準藥 品、保健功能食品、特定保健用食品、營養(yǎng)功能食品、普通食品、健康輔助食品、健康食品、補 品、經腸營養(yǎng)劑、口腔化妝品和飼料中分別適用的標示。
[0055] 在本申請說明書中，"標示"包括用于使需要者了解上述說明的所有標示，只要是 使人想起/類推上述標示內容的標示，則不管標示的目的、標示的內容、標示的對象物/介質 等如何，所有的標示均包括在內。例如可以列舉:在產品的包裝/容器上標示上述說明；在與 產品有關的廣告、價格表或契約書類中標示上述說明以進行展示或頒布;或者，通過電磁的 (互聯(lián)網等)方法提供以上述各項為內容的信息。
[0056] 作為本發(fā)明的一個方案，當采用了本發(fā)明的抗菌肽的表達增強、抗菌肽的分泌促 進、感染癥的預防/減輕的方法的包裝而成的產品是例如采用了抗菌肽的表達增強方法的 飲食品時，優(yōu)選制成標示為用于增強抗菌肽的用途的飲食品、例如標示為"抗菌肽增強用" 的具有抗菌肽的表達增強效果的飲食品、標示為"抗菌肽增強用"的含乳酸菌的飲食品、或 者標示為"感染癥預防用"的含乳酸菌的飲食品等。
[0057]需要說明的是，用于進行如上所述的標示的文字，并不限于例如"抗菌肽增強用" 或"感染癥預防用"這樣的文字，可以是其以外的文字，只要是表示能量代謝活化效果的文 字，則當然包括在本發(fā)明的范圍內。作為這樣的文字，例如還可以是基于使需要者了解抗菌 肽的增強或感染癥預防效果等的各種用途的標示。
[0058] 將本發(fā)明的乳酸菌用作飲食品時，對飲食品的種類沒有特別限定。例如，可以加工 成各種飲食品（牛乳、加工乳、清涼飲料、發(fā)酵乳、酸乳、奶酪、其他乳產品、面包、餅干、薄脆 餅干、比薩餅皮、配方奶粉、流食、患者用食品、嬰幼兒用奶粉等食品、孕婦/產婦用奶粉等食 品、營養(yǎng)食品等）。在制造這樣的飲食品時，可以依照將本發(fā)明的乳酸菌或其處理物直接使 用、或者與其他飲食品或食品成分混合等普通食品組合物中的制法。另外，對飲食品的形狀 也沒有特別限定，只要是通常使用的飲食品的形狀即可。例如可以是固體狀(包括粉末、顆 粒狀）、膏狀、液態(tài)、懸浮狀等任一種形狀，但并不限于這些。此時，更優(yōu)選乳飲料、發(fā)酵乳、清 涼飲料、果凍飲料、片劑、粉末食品，進一步優(yōu)選酸乳。
[0059] 在含有本發(fā)明的乳酸菌的飲食品中，只要是水、蛋白、糖質、脂質、維生素類、礦物 質類、有機酸、有機堿、果汁、香精、功能性成分、食品添加劑等普通食品中所含的成分，均可 包含在內。在上述飲食品的制造中，作為蛋白源，可以使用例如全脂奶粉、脫脂奶粉、部分脫 脂奶粉、酪蛋白、乳清粉、乳清蛋白、乳清蛋白濃縮物、乳清蛋白分離物、酪蛋白、β_酪蛋 白、K-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、乳鐵蛋白、大豆蛋白、雞蛋蛋白、肉蛋白等動植物性 蛋白、它們的水解物等在食品制造中通常使用的蛋白或含蛋白的原材料。作為糖類的供給 源的例子，可以列舉加工淀粉(除了糊精以外，還有可溶性淀粉、英國淀粉、氧化淀粉、淀粉 酯、淀粉醚等）、食物纖維等。作為脂質源，例如可以列舉:豬油、魚油等、它們的分餾油、氫化 油、酯交換油等動物性油脂;棕櫚油、紅花油、玉米油、菜籽油、椰子油、它們的分餾油、氫化 油、酯交換油等植物性油脂等。作為維生素類，例如可以列舉維生素 A、胡蘿卜素類、維生素 B 群、維生素 C、維生素 D群、維生素 E、維生素 K群、維生素 P、維生素 Q、尼克酸、煙酸、泛酸、生物 素、肌醇、膽堿、葉酸等，作為礦物質類，例如可以列舉1丐、鉀、鎂、鈉、銅、鐵、猛、鋅、硒等。作 為有機酸，例如可以列舉蘋果酸、枸櫞酸、乳酸、酒石酸等。作為功能性成分，例如可以列舉 寡糖、葡萄糖胺、膠原、神經酰胺、蜂王漿、多元酚等。作為食品添加劑，例如可以列舉乳化 劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、凝膠化劑、甜味劑、酸味料、保存劑、抗氧化劑、pH調節(jié)劑、著色劑等。黃 油、乳性礦物質、奶油、乳清、非蛋白態(tài)氮、唾液酸、磷脂、乳糖等各種來自乳的成分等是可適 用于制造含有本發(fā)明的乳酸菌的飲食品的成分例。
[0060] 這些成分可以組合兩種以上進行使用。另外，上述原材料可以使用天然物、天然物 加工品、合成品和/或含有大量的這些材料的食品的任意一種。
[0061] 本發(fā)明的乳酸菌可以制成感染預防或治療用藥品。制備上述藥品時，本發(fā)明的雙 歧乳桿菌或乳酸菌可以以活菌、或者在殺菌后進行破碎或未粉碎的處理物的形式使用。另 外，使用的菌可以是單獨的菌，也可以是多種菌。
[0062] 上述藥品中的本發(fā)明的乳酸菌的量可以根據其目的、用途(預防劑、治療劑等)任 意確定。作為含量的一個例子，可以例示相對于總量為0.001~100% (W/V)、特別是0.1~ 100%，但本發(fā)明并不限于此。
[0063] 以本發(fā)明的乳酸菌作為有效成分的藥品的給藥量可以考慮給藥途徑、包括人在內 的給藥對象動物的年齡、體重、癥狀等各種因素而適當設定。作為適當的給藥量之一例，可 以列舉以有效成分計為1~l〇〇〇 mg/kg/天，但本發(fā)明并不限于此。例如，在為了預防的目的 而長期攝取時，可以是比上述范圍少的量。另外，由于該有效成分沒有發(fā)現(xiàn)安全性的問題， 因此認為即使使用量多于上述范圍也沒關系。
[0064] 為了使本發(fā)明的乳酸菌到達腸內，上述藥品的劑型優(yōu)選為可以進行口服給藥的劑 型。作為本發(fā)明的藥品的優(yōu)選劑型的例子，例如可以列舉錠劑、包衣片、膠囊劑、顆粒劑、散 劑、液劑、糖漿劑、片劑等。上述的各種制劑可以是按照常規(guī)方法在作為主藥的本發(fā)明的菌 體和/或處理物中使用賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑、矯味矯臭劑、助溶劑、懸浮 劑、包衣劑等藥品制劑技術領域中通常能夠使用的輔助劑而制成制劑。
[0065] 將本發(fā)明的抗菌肽誘導劑用作藥品時，例如在口服給藥時，可以直接給予(攝?。?乳酸菌或將乳酸菌發(fā)酵而獲得的原材料，例如可以按照藥品的常規(guī)制備方法制成片劑、顆 粒劑、粉末劑、膠囊劑、散劑后使用。
[0066] 本發(fā)明的抗菌肽誘導劑可以在消化道的所有部位期待其效果，消化道可以例示即 口腔、咽喉、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸、盲腸、直至肛門的一系列部位。這里，雖然例示 了代表性的消化道的名稱，但如果是例如結腸（小腸下部）、回腸、空腸（小腸上部）、上腹部 消化道、下腹部消化道、大腸上位部、大腸下位部等公知和/或技術常識范疇的名稱的消化 道，則在攝取(投與)本發(fā)明的抗菌肽誘導劑時也可以期待同樣的效果。
[0067] 本發(fā)明的抗菌肽誘導劑對以人為首的所有哺乳動物均有效，因此還可用作攝取 (給予）該抗菌肽誘導劑的各種疾病的治療和/或預防方法。這里所說的哺乳動物是指人、 牛、豬、綿羊、海豚、鯨、虎、獅子、獵豹、河馬、長頸鹿、胳盤、羊盤、狗、貓、猴、狐、絡、熊、松鼠、 海狗、海豹、熊貓、野豬、鹿、馬、猩猩、袋鼠等公知的家畜、寵物、觀賞動物、野生動物等，相當 于分類為哺乳類的所有動物。另外，即使在哺乳動物以外的動物中，對于具有消化道的動 物、例如昆蟲、爬蟲類、鳥類、魚類、兩棲類、軟體動物等，也可應用本發(fā)明的抗菌肽誘導劑的 給藥和/或攝取方法。這里所說的各種疾病只要是通過誘導抗菌肽可以進行治療和/或預防 的疾病即可。沒有限定，例如有由機會性致病細菌引起的感染癥、由病原細菌、真菌引起的 感染癥、幽門螺旋桿菌感染癥、細菌易位、腸粘膜炎癥的持續(xù)、腸內菌群平衡的變化(腸內菌 群平衡的紊亂等）、以及由這些炎癥誘導的疾病、克羅恩病、潰瘍性大腸炎等炎癥性大腸炎、 調節(jié)性T細胞分化所誘導的過剩的炎癥或過敏癥狀。實施例
[0068] 下面，列舉實施例，以進一步詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受實施例的限定。
[0069] (試驗例1)
[0070] (實驗動物）
[0071] 研究了乳酸菌的攝取對大齡小鼠的抗菌肽誘導的影響。購入8月齡的ICR雄性小鼠 (日本SLC株式會社)作為大齡小鼠制作組，馴養(yǎng)1周。此時，為了防止打斗和緊張，將紙制的 蔽所放入籠子內。馴養(yǎng)后，從尾靜脈采血，通過離心分離采集血漿，作為因感染而增加的代 表性的細胞因子，通過ELISA法測定了血漿IL-Ιβ濃度、血漿IL-6濃度和血漿TNFa濃度。以體 重和上述的各細胞因子濃度相等的方式分成兩組(兩組中ri = 39)。以幼齡小鼠作為對照組， 使用3月齡的ICR雄性小鼠。
[0072](使乳發(fā)酵而得到的原材料）
[0073]調合原料乳、乳產品和原料水，使乳脂肪分達到3.0重量％、無脂乳固體達到9.5重 量％，加熱至70°C左右，之后在15MPa的壓力下進行均質化處理，使乳脂肪球徑達到一定的 大小，通過在95 °C下保持2分鐘進行加熱殺菌。殺菌后，在40~45 °C下冷卻，之后添加由市售 的"明治保加利亞（文少力'酸乳"分離的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的混合引子，在 40~45°C下發(fā)酵4小時，調整成0.9重量％的乳酸酸度，冷卻至10°C以下，以所得物質作為通 過乳酸菌使乳發(fā)酵而獲得的原材料，將其作為試驗樣品。在Ig試驗樣品中存在1億個德氏乳 桿菌保加利亞亞種和10億個唾液鏈球菌嗜熱亞種。
[0074](針對實驗動物的給藥方法）
[0075]對小鼠給予該試驗樣品時，在作為基本飼料的AIN-93M(酪蛋白為14重量％、L-胱 氨酸為0.18重量％、玉米淀粉為46.5692重量％、α化玉米淀粉為15.5重量％、蔗糖為10重 量％、大豆油為4重量％、纖維素粉末為5重量％)預-931礦物質混合物為3.5重量％)預-93維生素混合物為1重量％、重酒石酸膽堿為0.25重量％、叔丁基氫醌為0.0008重量％ )中 加入該試驗樣品和水進行混合，形成團狀后進行給藥。對大齡小鼠制作組中的一組給予混 有該試驗樣品的飼料，將該組方便地稱作試驗樣品大齡小鼠制作組(試驗樣品給藥組）。另 外，對大齡小鼠制作組的一組給予不含該試驗樣品的基本飼料，稱作基本飼料大齡小鼠制 作組（陰性組）。再對幼齡小鼠對照組給予不含該試驗樣品的基本飼料，稱作基本飼料幼齡 小鼠對照組(基本飼料幼齡組）。給藥期間如下:試驗樣品給藥組和陰性組為20個月、基本飼 料幼齡組為2個月。而且，各飼料的給藥量為20g/kg體重/天。在給藥期間定期測定體重和攝 食量，再每隔2個月采集150yL血，采集血漿。給藥期間結束后，開腹采集空腸、回腸、結腸，將 這些組織中的一部分在作為RNA提取用的組織用樣品的10倍容量的RNAlater試劑(Ambion 公司）中、在4°C下處理一夜，之后在-80°C下保存。除此以外的組織在液氮中快速凍結，之后 在-80°C下保存。
[0076] (DNA微陣列分析）
[0077]由通過上述獲得的各組的組織提取了RNA。在該提取中，使用了RNeasy試劑盒 (Qiagen公司）。將來自同一組小鼠的總RNA分別等量混合，調制了 DNA微陣列分析用樣品。在 具體的調制方法中，使用了Affymetrix公司推薦的試劑。對于各總RNA樣品，使用3'IVT'表 達試劑盒，通過包含T7啟動子序列的引物合成cDNA，之后以其為模板，通過T7RNA聚合酶合 成cRNA，與此同時用生物素進行了標記。使生物素標記后的cRNA與小鼠基因組4302.0陣列 (Affymetrix公司）雜交。雜交時，使用雜交用烘箱（GeneChip? Hybridization Oven 630、 Affymetrix公司），在45°C下雜交了 16小時。再用自動清洗/染色裝置(GeneChip? Fluidics Station 450、Affymetrix公司）清洗陣列，之后利用鏈霉親和素-藻紅蛋白對陣列上結合的 單鏈cRNA進行了熒光標記。需要說明的是，自動清洗/染色裝置的控制采用了設備控制軟件 (Affymetrix? GeneChip? Command Console? Software第2版（以后記作AGCC)、 Affymetrix公司）。
[0078] 使用激光掃描儀(GeneChip? Scanner 30007G、Affymetrix公司）對焚光標記操作 后的陣列進行掃描，得到了圖像數據。尚需說明的是，使用激光掃描儀獲得圖像數據時是利 用AGCC軟件來進行的。使用分析軟件(Expression Console? 1 · 1版、Affymetrix公司），將 所采集的圖像數據進行標準化，再使用GeneSpringGX分析軟件（GeneSpring GX 11版， Agilent TechnoIogies公司）或GCOS(Affymetrix公司），對各組間的基因表達量進行了比 較分析。關于所得的試驗樣品給藥組和陰性組的基因表達量，算出了以基本飼料幼齡組的 各基因表達量為1.0時的基因表達量的相對值。
[0079] 對各組的空腸和結腸的樣品進行DNA微陣列分析，提取了因加齡或給予試驗樣品 而受到影響的抗菌肽基因。
[0080] 空腸中屬于作為抗菌肽之一的Reg肽家族的RegIIIa基因、RegIII γ基因的表達量 在陰性組中有所降低，屬于作為抗菌肽之一的防衛(wèi)素家族的防衛(wèi)素 rs基因、防衛(wèi)素 rs7基因 在陰性組中顯著降低。在試驗樣品給藥組中，上述4種基因表達量較陰性組高2倍以上，接近 基本飼料幼齡組的值。另外，關于空腸中RegII基因的表達量，陰性組較基本飼料幼齡組高， 但在試驗樣品給藥組中看到了更高的趨勢(表1)。
[0081] 回腸中屬于作為抗菌肽之一的防衛(wèi)素家族的防衛(wèi)素 W的表達量在陰性組中有所 降低。在試驗樣品給藥組中，看到了該基因表達量較陰性組和基本飼料幼齡組有所增加的 趨勢(表2)。
[0082]結腸中屬于作為抗菌肽之一的Reg肽家族的RegI基因和RegIII γ的相對表達量在 陰性組中顯著降低。在試驗樣品給藥組中，看到了這兩種基因的相對表達量比陰性組高的 趨勢(表3)。由此可知：除小腸（消化道）的RegII以外，抗菌肽的基因表達因老化而降低。認 為通過攝取該乳酸菌的樣品，可抑制抗菌肽的基因表達因老化而降低。
[0083][表1]
[0084] 空腸中的抗菌肽基因的表達量
[0092] (試驗例2)
[0093] (定量PCR分析）
[0094] 使用實時RT-PCR用轉錄試劑盒Takara Prime Script RTMasterMix(TAKARABK)公 司），由通過上述得到的組織中提取的各組的RNA樣品合成了cDNA。以所合成的cDNA為模板， 使用實時PCR試劑SYBRPremix Ex TaqlKTli RNaseH Plus)(TAKARABIO公司），通過熱循環(huán) 儀Thermal Cycler Dice Real Time System(TAKARABK)公司）進行了定量的PCR反應和檢 測。另外，此次為了定量RegIIΙβ和RegIII γ的表達量，通過使用持家基因的Actb作為內源 性對照的相對定量，以相對表達量的形式算出了這些基因的表達量。需要說明的是，統(tǒng)計處 理方法采用了Mann-Whitney U-檢驗或G-檢驗。當ρ值不足0.05時，判定為存在顯著差異。 [0095]比較了上述的試驗樣品給藥組、陰性組、基本飼料幼齡組的RegIIIfi和RegIII γ的 相對表達量。在陰性組中，基本飼料幼齡組的RegIIie和RegIII γ的相對表達量明顯低。相 對于此，在試驗樣品給藥組和基本飼料幼齡組中沒有差別，RegIIΙβ和RegIII γ的相對表達 量相同。
[0096] 產業(yè)實用性
[0097]本發(fā)明可以提供一種可發(fā)揮人所具備的自身生物體防御機制的、安全、無副作用 的、抗菌肽的體內分泌誘導劑。而且，通過攝取本發(fā)明的抗菌肽的體內分泌誘導劑，在體內 誘導該抗菌肽，從而可以期待提高因各種感染防御而產生的免疫力、或抗衰老、延長健康壽 命等。
【主權項】
1. 一種抗菌肽誘導劑，其中，以乳酸菌或經乳酸菌發(fā)酵的原材料或其兩者作為有效成 分，誘導抗菌肽的基因表達。2. 根據權利要求1所述的抗菌肽誘導劑，其中，抗菌肽為防衛(wèi)素或再生胰島衍生家族肽 (Reg肽)或其兩者。3. 根據權利要求1或2所述的抗菌肽誘導劑，其中，乳酸菌為乳桿菌屬乳酸菌或鏈球菌 屬乳酸菌或其兩者。4. 一種抗菌肽誘導用組合物，其中含有權利要求1~3中任一項所述的抗菌肽誘導劑。5. 根據權利要求4所述的抗菌肽誘導用組合物，其中，乳酸菌是選自乳桿菌屬乳酸菌的 一種或兩種或多于兩種的菌株和選自鏈球菌屬乳酸菌的一種或兩種或多于兩種的菌株的 組合。6. 根據權利要求4所述的抗菌肽誘導用組合物，其中，誘導用組合物的每單位包裝含有 1億個以上的乳酸菌。7. 根據權利要求1~6中任一項所述的抗菌肽誘導用組合物，其中，所述乳酸菌是活菌。8. -種具有感染預防作用的食品或藥品組合物，其中，權利要求4~7所述的抗菌肽誘 導用組合物誘導抗菌肽的基因表達。9. 根據權利要求8所述的具有感染預防作用的食品或藥品組合物，其中，所述食品或藥 品組合物通過經口攝取、經腸攝取而被誘導。10. 作為誘導抗菌肽的基因表達的有效成分的乳酸菌或經乳酸菌發(fā)酵的原材料或其兩 者在制備抗菌肽誘導劑中的應用。11. 作為誘導抗菌肽的基因表達的有效成分的乳酸菌或經乳酸菌發(fā)酵的原材料或其兩 者在制備含有抗菌肽誘導劑的抗菌肽誘導用組合物中的應用。12. 作為誘導抗菌肽的基因表達的有效成分的乳酸菌或經乳酸菌發(fā)酵的原材料或其兩 者在制備含抗菌肽誘導劑的具有感染預防作用的食品或藥品組合物中的應用。
【文檔編號】A61P31/04GK105960244SQ201480074970
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2014年12月10日
【發(fā)明人】淺見幸夫, 萩原智子
【申請人】株式會社明治