用抗vegf darpin治療眼病的方法
【專利摘要】本文公開了用于治療患有滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性和其它視網(wǎng)膜病癥的患者的方法，所述方法是通過施用包含錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白實現(xiàn)，其中首先施用2至5次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間間隔25至35天，然后施用另外的劑量，并且劑量之間間隔更長時間。
【專利說明】用抗VEGF DARPIN治療眼病的方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2014年6月24日提交的美國臨時申請?zhí)?2/016,620及2013年11月5日 提交的美國臨時申請?zhí)?1 /900，246的權(quán)益。這些申請的完整內(nèi)容通過引用并入本文。
[0003] 背景
[0004] 視網(wǎng)膜是內(nèi)襯于眼睛后壁內(nèi)表面的一薄層的神經(jīng)組織。視網(wǎng)膜由各種類別的神經(jīng) 元組成，其中最熟悉的是負責視覺的光感受器:對光較為敏感的視桿細胞，及對顏色較為敏 感的錐體細胞。錐體細胞主要集中在黃斑(視網(wǎng)膜的較小的中心部分）中。眼睛的這一部分 負責中心的高敏銳度視覺。
[0005] 在發(fā)達國家，視網(wǎng)膜，特別是黃斑的疾病是引起年齡超過50歲的人視覺障礙和失 明的主導(dǎo)原因。這些疾病包括年齡相關(guān)性黃斑變性、近視性黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、 糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞及視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞。黃斑變性也可能在兒 童中發(fā)生。
[0006] 這些疾病中有一些可以用抑制一種稱為血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)的蛋白質(zhì)的 藥劑進行治療。VEGF-A刺激血管的生長。在滲出性(或血管性)年齡相關(guān)性黃斑變性中，異常 高含量的VEGF刺激黃斑中新血管的生長，使得光感受器不可逆地受損;此外，這些新形成的 血管將血液和蛋白質(zhì)滲漏到視網(wǎng)膜中，導(dǎo)致在先前被光感受器占據(jù)的區(qū)域中形成瘢痕。抑 制VEGF-A將阻止這些新血管的形成，并且阻止血液和蛋白質(zhì)的滲漏，由此保護視覺。
[0007] 目前僅有少數(shù)藥物被用于抑制眼中的VEGF-A:貝伐單抗(bevacizumab)、蘭尼單抗 (ranibizumab)、阿柏西普（af Iibercept)及哌加他尼（pegaptanib)。蘭尼單抗是抑制VEGF-A的抗體片段；貝伐單抗是也抑制VEGF-A的人源化單株抗體并且源自于與蘭尼單抗相同的 親本抗體。阿柏西普是包含人VEGF受體1和2的細胞外結(jié)構(gòu)域與人IgGl的Fc部分的融合物的 重組融合蛋白。哌加他尼不如蘭尼單抗、貝伐單抗或阿柏西普有效，因此不常使用。
[0008] 實際上，僅有兩種療法可以用于抑制眼中的VEGF:貝伐單抗/蘭尼單抗和阿柏西 普。因此，本領(lǐng)域中需要能夠治療視網(wǎng)膜疾病的療法，這些療法比可用的少數(shù)療法更有效， 或提供與這些少數(shù)療法不同的益處。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的方法可以用于治療患者的滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性和 其它視網(wǎng)膜病癥，并且?guī)硪馔獾囊嫣?。在一個實施方案中，該方法包括遞送頻繁劑量的重 組結(jié)合蛋白，隨后遞送不太頻繁的劑量。
[00?0]因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，向患者施用約〇.25mg至約4mg結(jié)合蛋白，然后 在25至35天后施用相同劑量;接著可以任選地施用結(jié)合蛋白多至三次以上，并且劑量之間 具有相同間隔。在這些初始的頻繁劑量之后，繼續(xù)施用結(jié)合蛋白，給予至少一次另外的劑 量，但每次另外的劑量之間間隔50至115天。以此方式繼續(xù)治療，以50至115天的間隔施用結(jié) 合蛋白，持續(xù)患者需要的時間。
[0011]此處是實例：
[0014] 這一方法可以用于改善患有視網(wǎng)膜疾病的患者的視力，減少視網(wǎng)膜中的異常液體 并減小異常視網(wǎng)膜厚度。
[0015] 以下更詳細地描述這些和其它實施方案。
[0016] 附圖簡述
[0017] 圖1示出了在第1天及第4周和第8周接受Img和2mg根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合蛋白 abicipar的滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性（"AMD"）患者以及在第1天及第4周、第8周、第12周 和第16周接受0.5mg蘭尼單抗的患者在基線時及在第1周、第4周、第8周、第12周、第16周和 第20周時的最佳矯正視力（"BCVA"）。圖2-7還顯示出從以此方式治療的患者得到的數(shù)據(jù)。
[0018] 圖2示出了在上述三組患者中BCVA具有15或更多個字母的改善的患者的比例。在 所顯示的每周的一組三個條柱中，2.Omg abicipar是左側(cè)的條柱；I.Omg abicipar是中間 的條柱;并且0.5mg蘭尼單抗是右側(cè)的條柱。
[0019]圖3示出了以不到15個字母的BCVA損失評估的達到穩(wěn)定視力的患者的比例。在所 顯示的每周的一組三個條柱中，2.Omg abicipar是左側(cè)的條柱；I.Omg abicipar是中間的 條柱;并且0.5mg蘭尼單抗是右側(cè)的條柱。
[0020] 圖4示出了接受2 .Omg abicipar、1.0 mg abicipar及0.5mg蘭尼單抗的患者的平均 中心視網(wǎng)膜厚度。
[0021]圖5示出了視網(wǎng)膜內(nèi)液體、視網(wǎng)膜內(nèi)囊腫及視網(wǎng)膜下液體(全部三個隔室)在治療 后得到解決的患者的比例。在所顯示的每周的一組三個條柱中，2.Omg abicipar是左側(cè)的 條柱；1.0 mg abicipar是中間的條柱;并且0.5mg蘭尼單抗是右側(cè)的條柱。
[0022]圖6示出了基線視力（Snellen)是20/320+1并在基線(第1天)時及第4周和第8周時 用2mg abicipar治療的88歲白種男性的視網(wǎng)膜圖像。顯示了基線圖像（圖6A)和之后每四周 的圖像（圖6B-6G)。
[0023]圖7示出了基線視力（Snellen)是20/63+1并在基線（第1天）時及第4周和第8周時 用2mg abicipar治療的75歲西班牙女性的視網(wǎng)膜圖像。顯示了基線（圖7A)和之后每四周 (圖7B-7G)的圖像。
[0024]圖8和9示出了在研究的175名滲出性AMD患者中，在第1天然后在第16周或更早時 間（如果其滿足某些再治療標準）給予患者4.2mg abicipar、3.Omg abicipar及0.5mg蘭尼 單抗治療之后視網(wǎng)膜內(nèi)液體、視網(wǎng)膜內(nèi)囊腫及視網(wǎng)膜下液體得到解決的患者的比例。圖8示 出了全部三個隔室中的液體都得到解決的患者的比例；在所顯示的每周的一組三個條柱 中，4.2mg abicipar是左側(cè)條柱;3.Omg abicipar是中間條柱;并且蘭尼單抗是右側(cè)條柱。 圖9示出了這些隔室中的一個、兩個、全部三個的液體都得到解決或都未得到解決的患者的 比例。
[0025]發(fā)明詳細說明
[0026] 重組結(jié)合蛋白
[0027] 本發(fā)明的方法施用包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括設(shè)計的錨蛋 白重復(fù)結(jié)構(gòu)域。此類結(jié)合蛋白及其包含的設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的實例描述于美國專利 號7，417,130、美國專利號8,110,653及美國專利申請公布號2011/0207668中，全部三項專 利的完整內(nèi)容都通過引用并入本文中。
[0028] 術(shù)語"重復(fù)蛋白質(zhì)"是指包含一個或多個重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。在一個實施方案 中，重復(fù)蛋白質(zhì)各自包含最多四個重復(fù)結(jié)構(gòu)域。在另一實施方案中，重復(fù)蛋白質(zhì)各自包含最 多兩個重復(fù)結(jié)構(gòu)域。在另一實施方案中，重復(fù)蛋白質(zhì)各自僅包含一個重復(fù)結(jié)構(gòu)域。重復(fù)蛋白 質(zhì)還可以包含另外的非重復(fù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、多肽標簽和/或多肽連接子。
[0029] 術(shù)語"重復(fù)結(jié)構(gòu)域"是指包含兩個或更多個連續(xù)重復(fù)單元(模塊)作為結(jié)構(gòu)單元的 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)單元具有相同折疊，并且緊密堆疊以產(chǎn)生例如具有共同疏水 性核心的超螺旋結(jié)構(gòu)。
[0030] 術(shù)語"設(shè)計的重復(fù)蛋白質(zhì)"和"設(shè)計的重復(fù)結(jié)構(gòu)域"分別是指由美國專利號7,417， 130和美國專利號8，110,653中解釋的程序獲得的重復(fù)蛋白質(zhì)或重復(fù)結(jié)構(gòu)域。設(shè)計的重復(fù)蛋 白質(zhì)和設(shè)計的重復(fù)結(jié)構(gòu)域是合成的而非自然界來源的。其分別是通過表達相應(yīng)設(shè)計的核酸 而獲得的人造蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域。
[0031] 哺乳動物VEGF家族由五種糖蛋白組成，稱為VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D (又稱 FIGF)及胎盤源性生長因子(PIGF，又稱PGF)。經(jīng)顯示，VEGF-A是抗血管生成療法的有效靶 (Ellis, L.M·和 Hicklin, D.J. ,Nature Rev.Cancer 8,579-591 JOOShVEGF-A 配體結(jié)合到 并且活化三種結(jié)構(gòu)類似的III型受體酪氨酸激酶，名為VEGFR-I (又稱FLTl)、VEGFR-2(又稱 KDR)及VEGFR-3(又稱FLT4KVEGF配體對于這些酪氨酸激酶受體中的每一種具有截然不同 的結(jié)合特異性，由此引起其功能的多樣性。響應(yīng)于配體結(jié)合，VEGFR酪氨酸激酶活化不同的 下游信號傳導(dǎo)路徑網(wǎng)絡(luò)。VEGFR-I和VEGFR-2主要見于血管內(nèi)皮上，而VEGFR-3主要見于淋巴 管內(nèi)皮上。這些受體都具有細胞外結(jié)構(gòu)域、單一跨膜區(qū)及間插激酶插入結(jié)構(gòu)域的共同酪氨 酸激酶序列。近來已顯示，最初被鑒別為神經(jīng)元導(dǎo)向介體臂板蛋白（semaphorin)/腦衰蛋白 (collapsin)家族的受體的神經(jīng)菌毛素(NRP-I)可充當VEGF-A的同工型特異性受體。
[0032] 已知VEGF-A的各種同工型是通過替代性剪接VEGF-A基因內(nèi)的八個外顯子而產(chǎn)生 的。所有同工型都含有外顯子1-5和末端外顯子，即外顯子8。編碼肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的外顯子 6和7可以包括或不包括在內(nèi)。由此產(chǎn)生根據(jù)氨基酸數(shù)量命名的蛋白質(zhì)家族:VEGF-A165、 VEGF-A121、VEGF-A189等等。不過，外顯子8在核苷酸序列中含有兩個3'剪接位點，這些位點 可以被細胞用于產(chǎn)生長度相同但C末端氨基酸序列不同的兩個同工型家族(Varey，A.H.R. 等人，British J·Cancer 98，1366-1379，2008)。VEGF-Axxx( "XXX"表不成熟蛋白質(zhì)的氨基 酸數(shù)量），促血管生成的同工型家族，是利用外顯子8中的最近端序列（導(dǎo)致包含外顯子8a在 內(nèi)）產(chǎn)生的。最近描述的抗血管生成VEGF-Axxxb同工型是利用遠端剪接位點(沿所述基因距 近端剪接位點66bp)產(chǎn)生的。由此導(dǎo)致剪接去除外顯子8a并且產(chǎn)生了編碼VEGF-Axxxb家族 的mRNA序列。VEGF-A165是主要的促血管生成同工型并且通常在多種人實體腫瘤中過度表 達。VEGF-A165b是最先鑒別的外顯子8b編碼的同工型并且經(jīng)顯示，其具有抗血管生成作用 (Varey等人，在上述引文中；Konopatskaya，0.等人，Molecular Visionl2,626-632，2006)。 其為VEGF-A的內(nèi)源抑制性形式，降低VEGF-A誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞增殖和迀移。盡管VEGF-A165b 可以結(jié)合到VEGFR-2,但其結(jié)合不會引起受體磷酸化或下游信號傳導(dǎo)路徑的活化。
[0033] 術(shù)語"蛋白質(zhì)"是指多肽，其中該多肽的至少一部分具有或能夠通過在其多肽鏈內(nèi) 和/或其多肽鏈間形成二級、三級或四級結(jié)構(gòu)而獲得確定的三維布置。如果一種蛋白質(zhì)包含 兩個或更多個多肽，那么個別多肽鏈可以非共價連接或例如通過兩個多肽之間的二硫鍵共 價連接。蛋白質(zhì)中獨立地具有或能夠通過形成二級或三級結(jié)構(gòu)而獲得確定的三維布置的一 部分稱為"蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域"。此類蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域的熟練從業(yè)人員眾所周知的。
[0034] 在重組蛋白、重組蛋白結(jié)構(gòu)域等中使用的術(shù)語"重組"意思指，這些多肽是利用相 關(guān)領(lǐng)域的熟練從業(yè)人員眾所周知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的。舉例來說，編碼多肽的重組DNA分 子(例如，通過基因合成產(chǎn)生）可以被克隆到細菌表達質(zhì)粒(例如PQE30,Qiagen)中。當將如 此構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒插入細菌（例如大腸桿菌）中時，這一細菌可以產(chǎn)生由這一重組DNA 編碼的多肽。相應(yīng)地產(chǎn)生的多肽稱為重組多肽。
[0035] 術(shù)語"多肽標簽"是指連接到多肽/蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其中該氨基酸序列可用 于該多肽/蛋白質(zhì)的純化、檢測或靶向，或其中該氨基酸序列改善該多肽/蛋白質(zhì)的物理化 學特性，或其中該氨基酸序列具有效應(yīng)子功能。結(jié)合蛋白的個別多肽標簽、部分和/或結(jié)構(gòu) 域可以直接彼此連接，或經(jīng)由多肽連接子彼此連接。這些多肽標簽都是本領(lǐng)域眾所周知的 并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員完全可得到的。多肽標簽的實例是小多肽序列，例如His、myc、FLAG 或Strep標簽或部分，如允許檢測多肽/蛋白質(zhì)的酶(例如，堿性磷酸酶），或可以用于靶向的 部分(如免疫球蛋白或其片段)和/或效應(yīng)分子。
[0036] 術(shù)語"多肽連接子"是指這樣一種氨基酸序列，該氨基酸序列能夠連接例如兩個蛋 白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、一個多肽標簽與一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域與一個非多肽部分(如 聚乙二醇)或兩個序列標簽。此類另外的結(jié)構(gòu)域、標簽、非多肽部分及連接子是相關(guān)領(lǐng)域的 技術(shù)人員已知的。實例的清單提供于美國專利號7,417，130和美國專利號8，110,653中。此 類連接子的實例是不同長度的甘氨酸-絲氨酸連接子和脯氨酸-蘇氨酸連接子。在一個實施 方案中，連接子的長度介于2與24個氨基酸之間；在另一個實施方案中，連接子的長度介于2 與16個氨基酸之間。
[0037] 術(shù)語"多肽"是指由通過多個(即，兩個或更多個)經(jīng)由肽鍵連接的氨基酸形成的一 條或多條鏈組成的分子。在一個實施方案中，多肽由超過八個氨基酸經(jīng)肽鍵連接而組成。 [0038]術(shù)語"聚合物部分"是指蛋白質(zhì)聚合物部分或非蛋白質(zhì)聚合物部分。在一個實施方 案中，"蛋白質(zhì)聚合物部分"是不會形成穩(wěn)定三級結(jié)構(gòu)，而當在室溫下以約〇. ImM濃度在PBS 中儲存一個月時不會形成超過10% (或不超過5%、不超過2%、不超過1 %及不超過任何可 檢測的量，如通過尺寸排阻層析法(SEC)測定）的低聚物或聚集物的多肽。當使用球狀蛋白 質(zhì)作為SEC的分子量標準品時，此類蛋白質(zhì)聚合物部分在SEC中執(zhí)行的表觀分子量高于其有 效分子量。在一個實施方案中，由SEC測定的蛋白質(zhì)聚合物部分的表觀分子量是由其氨基酸 序列計算的有效分子量的1.5倍、2倍或2.5倍。在一個實施方案中，由SEC測定的非蛋白質(zhì)聚 合物部分的表觀分子量是由其分子組成計算的有效分子量的2倍、4倍或8倍。在一個實施方 案中，如通過圓二色譜(⑶)測量法所測定，蛋白質(zhì)聚合物部分中超過50%、70%或甚至90% 的氨基酸在室溫下在PBS中濃度是約0 . ImM時不會形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。在一個實施方案 中，蛋白質(zhì)聚合物顯示出隨機螺旋構(gòu)型的典型近UV CD譜圖。此類CD分析是本領(lǐng)域技術(shù)人員 眾所周知的。也可以使用包含超過50、100、200、300、400、500、600、700或800個氨基酸的蛋 白質(zhì)聚合物部分。
[0039] 蛋白質(zhì)聚合物部分的實例是XTEN?(Amunix的注冊商標;W007/103515)多肽，或 包含脯氨酸、丙氨酸及絲氨酸殘基的多肽，如WO 08/155134中所描述。這些蛋白質(zhì)聚合物部 分可以通過使用標準DNA克隆技術(shù)，隨后進行其標準表達和純化來產(chǎn)生基因融合多肽，由此 共價連接到例如本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。包含了結(jié)合VEGF-Axxx和此類蛋白質(zhì)聚合物部分的 重復(fù)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白的實例以SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:4顯示。SEQ ID NO: 1中的1至 159位氨基酸對應(yīng)于重復(fù)結(jié)構(gòu)域并且SEQ ID NO: 1中的161至1025位氨基酸對應(yīng)于蛋白質(zhì)聚 合物部分。SEQ ID N0:4中的1至126位氨基酸對應(yīng)于重復(fù)結(jié)構(gòu)域，并且SEQ ID N0:4中的131 至640位氨基酸對應(yīng)于蛋白質(zhì)聚合物部分。
[0040] 本發(fā)明聚合物部分的分子量可能變化極大（即，從約IkDa至約150kDa)。在一個實 施方案中，聚合物部分的分子量是至少2kDa、5kDa、10kDa、20kDa、30kDa、50kDa、70kDaS IOOkDa 0
[0041] 在一個實施方案中，聚合物部分是通過多肽連接子連接到結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此類多肽 連接子的實例是SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9的氨基酸1至8。
[0042]非蛋白質(zhì)聚合物部分的實例是羥乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚 氧化烯。術(shù)語"聚乙二醇化"意思指，PEG部分共價連接到例如本發(fā)明的多肽。在重復(fù)結(jié)構(gòu)域 與C末端Cys殘基之間含有多肽連接子的可用于結(jié)合非蛋白質(zhì)聚合物部分的重復(fù)蛋白質(zhì)的 實例是SEQ ID NO: 2、3、5、6及7。在一些實施方案中，如果使用PEG，那么其可以呈線性或分 支布置。
[0043]在一個具體實施方案中，PEG部分或任何其它非蛋白質(zhì)聚合物可以例如經(jīng)由馬來 酰亞胺連接子與半胱氨酸硫醇偶聯(lián)，其中半胱氨酸經(jīng)由肽連接子與本文所描述的結(jié)合結(jié)構(gòu) 域(例如SEQ ID N0:3)的N末端或C末端偶聯(lián)。
[0044] 術(shù)語"結(jié)合蛋白"是指包含一個或多個結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且在一個實施方案中包含一 個或多個聚合物部分（以下進一步解釋）的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，結(jié)合蛋白包含最多 四個結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，結(jié)合蛋白包含最多兩個結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在另一實施方案 中，結(jié)合蛋白僅具有一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此外，任何此類結(jié)合蛋白都可以包含另外的蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)域，這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域不是結(jié)合結(jié)構(gòu)域、多聚化部分、多肽標簽、多肽連接子和/或單一 Cys殘基。多聚化部分的實例是配對以提供功能性免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白重鏈 恒定區(qū)，以及亮氨酸拉鏈或包含游離硫醇的多肽，該游離硫醇在兩個此類多肽之間形成分 子間二硫鍵?？梢允褂脝我?Cy s殘基，例如通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的馬來酰亞胺 化學將其它部分與多肽偶聯(lián)。
[0045] 在一個實施方案中，結(jié)合蛋白包含最多四個聚合物部分。在另一實施方案中，結(jié)合 蛋白包含最多兩個聚合物部分。在另一實施方案中，結(jié)合蛋白僅具有一個聚合物部分。
[0046] 在一個實施方案中，當使用球狀蛋白質(zhì)作為分子量標準品，在室溫下，利用SEC以 在I3BS中0.1 mM濃度分析時，結(jié)合蛋白的表觀分子量是約IOkDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、 35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、55kDa、60kDa、65kDa、70kDa、75kDa、80kDa、85kDa、90kDa、 951^0&、1001^0&、2001^0&、3001^0&、4001^0&、5001^0&、6001^0&、7001^0&、8001^0&、9001^0&或1， OOOkDa。在一個實施方案中，結(jié)合蛋白的表觀分子量是34kDa。
[0047] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解本文使用的各種程度術(shù)語的含義。舉例來說，如本文在提 到量的上下文中所使用，術(shù)語"約"表示接近于并且包括所陳述的量的那些量，這些量也執(zhí) 行所希望的功能或達到所希望的結(jié)果，例如"約lmg"包括Img以及合理地接近于Img并且也 執(zhí)行所希望的功能或達到所希望的結(jié)果的那些量。
[0048] 術(shù)語"結(jié)合結(jié)構(gòu)域"意思指展現(xiàn)與蛋白質(zhì)骨架相同的"折疊"（三維布置)并且具有 預(yù)定特性(如下文所定義)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。此類結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以通過本領(lǐng)域中已知的合理 或更通常地，組合蛋白質(zhì)工程改造技術(shù)獲得(Skerra，2000，在上述引文中；Binz等人，2005， 在上述引文中）。舉例來說，具有預(yù)定特性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以通過以下方法獲得，該方法包 括以下步驟：（a)提供展現(xiàn)與蛋白質(zhì)骨架(如下文進一步定義)相同的折疊的一組不同蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)域;及(b)篩選該不同組和/或從該不同組中選擇以獲得至少一個具有預(yù)定特性的蛋 白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。該組不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域可以根據(jù)所使用的篩選和/或選擇系統(tǒng)，通過若干方 法提供，并且可以包括使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，如噬菌體展示或核糖體展示。
[0049] 術(shù)語"蛋白質(zhì)骨架"意思指具有高度可耐受氨基酸插入、取代或缺失的暴露表面區(qū) 域的蛋白質(zhì)。可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)骨架的實例是抗體或其片段，如 單鏈Fv或Fab片段、來自金黃葡萄球菌的蛋白質(zhì)A、來自大菜粉蝶(Pieris brassicae)的膽 色素結(jié)合蛋白或其它脂鈣蛋白、錨蛋白重復(fù)蛋白質(zhì)或其它重復(fù)蛋白質(zhì)，及人纖連蛋白。蛋白 質(zhì)骨架是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(Binz等人,2005,在上述引文中；Binz等人,2004,在上述 引文中）。
[0050] 術(shù)語"預(yù)定特性"是指如結(jié)合到靶、阻斷靶、活化靶介導(dǎo)的反應(yīng)、酶促活性及相關(guān)其 它特性等特性。取決于所希望的特性的類型，普通技術(shù)人員將能夠鑒別出用于執(zhí)行對具有 所希望特性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的篩選和/或選擇的方式和必要步驟。優(yōu)選地，預(yù)定特性是結(jié)合到 靶。
[0051] 在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域不包含如在抗體中存在的免疫球蛋白折 疊，和/或纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域。免疫球蛋白折疊是一種常見的全蛋白質(zhì)折疊，該折疊由 以兩個折疊布置的約7個反平行β鏈構(gòu)成的2層夾層組成。免疫球蛋白折疊是本領(lǐng)域技術(shù) 人員眾所周知的。舉例來說，這些包含免疫球蛋白折疊的結(jié)合結(jié)構(gòu)域描述于WO 07/080392 或WO 08/097497 中。
[0052]在另一實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域不包含如在VEGFR-I或VEGFR-2中所發(fā)現(xiàn) 的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。此類結(jié)合結(jié)構(gòu)域描述于WO 00/075319中。
[0053]在一個實施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含70個氨基酸至300個氨基酸;在另一實施方案 中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含100個氨基酸至200個氨基酸。
[0054]在一個實施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域不含游離Cys殘基。游離Cys殘基不涉及二硫鍵的 形成。在另一實施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域不含任何Cys殘基。
[0055] 在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白可以在真核或原核細胞(如細菌細胞）中表 達，或通過使用無細胞體外表達系統(tǒng)表達。
[0056] 術(shù)語"結(jié)構(gòu)單元"是指由沿多肽鏈彼此鄰近的兩個或更多個二級結(jié)構(gòu)區(qū)段之間的 三維相互作用形成的多肽的局部有序部分。此類結(jié)構(gòu)單元展現(xiàn)結(jié)構(gòu)基元。術(shù)語"結(jié)構(gòu)基元" 是指至少一個結(jié)構(gòu)單元中存在的二級結(jié)構(gòu)元件的三維布置。結(jié)構(gòu)基元是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾 所周知的。僅僅結(jié)構(gòu)單元不能夠獲得確定的三維布置;不過，其連續(xù)的布置，例如重復(fù)結(jié)構(gòu) 域中的重復(fù)模塊，使相鄰單元相互穩(wěn)定，從而產(chǎn)生超螺旋結(jié)構(gòu)。
[0057]術(shù)語"重復(fù)單元"是指構(gòu)成一種或多種天然存在的重復(fù)蛋白質(zhì)的重復(fù)序列基元的 氨基酸序列，其中"重復(fù)單元"以多個拷貝存在，并且展現(xiàn)決定該蛋白質(zhì)的折疊的所有基元 共有的確定的折疊拓撲結(jié)構(gòu)。此類重復(fù)單元的實例是犰狳重復(fù)單元、富含亮氨酸的重復(fù)單 元、錨蛋白重復(fù)單元、三十四肽重復(fù)單元、HEAT重復(fù)單元及富含亮氨酸的變體重復(fù)單元。含 有兩個或更多個此類重復(fù)單元的天然存在的蛋白質(zhì)稱為"天然存在的重復(fù)蛋白質(zhì)"。重復(fù)蛋 白質(zhì)的個別重復(fù)單元的氨基酸序列當彼此比較時可能具有相當多的突變、取代、添加和/或 缺失，同時仍基本上保留重復(fù)單元的一般模式或基元。
[0058]術(shù)語"重復(fù)序列基元"是指由一個或多個重復(fù)單元推導(dǎo)出的氨基酸序列。在一個實 施方案中，重復(fù)單元來自對相同靶具有結(jié)合特異性的重復(fù)結(jié)構(gòu)域。
[0059] 術(shù)語"折疊拓撲結(jié)構(gòu)"是指重復(fù)單元的三級結(jié)構(gòu)。折疊拓撲結(jié)構(gòu)將由形成α螺旋或 折疊的至少一部分的氨基酸鏈，或形成線性多肽或環(huán)的氨基酸鏈，或者螺旋、β_折疊 和/或線性多肽/環(huán)的任何組合確定。
[0060] 術(shù)語"連續(xù)"是指重復(fù)單元或重復(fù)模塊串聯(lián)布置的一種布置。在設(shè)計的重復(fù)蛋白質(zhì) 中，存在至少2個重復(fù)單元，但通常存在約2個重復(fù)單元至6個重復(fù)單元，而且還可能存在6個 或更多個重復(fù)單元，或者20個或更多個重復(fù)單元。在大多數(shù)情況下，重復(fù)單元將展現(xiàn)高度的 序列同一性(在相應(yīng)位置具有相同氨基酸殘基)或序列相似性(氨基酸殘基不同，但具有相 似的物理化學特性），并且一些氨基酸殘基可能是在天然存在的蛋白質(zhì)中所發(fā)現(xiàn)的不同重 復(fù)單元中高度保守的關(guān)鍵殘基。然而，天然存在的蛋白質(zhì)中所發(fā)現(xiàn)的不同重復(fù)單元之間由 氨基酸插入和/或缺失，和/或取代引起的高度序列變化性將是可能的，只要維持共同的折 疊拓撲結(jié)構(gòu)即可。
[0061 ]通過物理化學方式，如X射線結(jié)晶法、匪R或CD譜法直接確定重復(fù)蛋白質(zhì)的折疊拓 撲結(jié)構(gòu)的方法是本領(lǐng)域熟練從業(yè)人員眾所周知的。用于鑒別和確定重復(fù)單元或重復(fù)序列基 元或用于鑒別包含此類重復(fù)單元或基元的相關(guān)蛋白質(zhì)家族的方法，如同源搜索(BLAST等）， 是生物信息學領(lǐng)域中充分確定的，并且是本領(lǐng)域從業(yè)人員眾所周知的。改進初始重復(fù)序列 基元的步驟可以包括迭代過程。
[0062] 術(shù)語"重復(fù)模塊"是指設(shè)計的重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重復(fù)氨基酸序列，這些氨基酸序列最初 源自于天然存在的重復(fù)蛋白質(zhì)的重復(fù)單元。重復(fù)結(jié)構(gòu)域中包含的每一重復(fù)模塊是源自于天 然存在的重復(fù)蛋白質(zhì)家族或亞家族(例如犰狳重復(fù)蛋白質(zhì)或錨蛋白重復(fù)蛋白質(zhì)家族）的一 個或多個重復(fù)單元。
[0063] "重復(fù)模塊"可以包含氨基酸殘基存在于相應(yīng)重復(fù)模塊的所有拷貝中的位置（"固 定位置"）及具有不同或"隨機"氨基酸殘基的位置（"隨機位置"）。
[0064] 術(shù)語"加帽模塊"是指與重復(fù)結(jié)構(gòu)域的N末端或C末端重復(fù)模塊融合的多肽，其中該 加帽模塊與該重復(fù)模塊形成緊密的三級相互作用，由此提供了在不與連續(xù)重復(fù)模塊接觸的 一側(cè)處保護重復(fù)模塊的疏水性核心免受溶劑影響的帽。N末端和/或C末端加帽模塊可以是， 或者可以源自于加帽單元或在天然存在的重復(fù)蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的鄰近重復(fù)單元的其它結(jié)構(gòu) 域。術(shù)語"加帽單元"是指天然存在的折疊的多肽，其中該多肽確定了通過N末端或C末端與 重復(fù)單元融合的特定結(jié)構(gòu)單元，其中該多肽與重復(fù)單元形成緊密的三級相互作用，由此提 供了在一側(cè)保護重復(fù)單元的疏水性核心免受溶劑影響的帽。此類加帽單元可能與重復(fù)序列 基元具有序列相似性。加帽模塊和加帽重復(fù)序列描述于美國專利號7,417,130和美國專利 號8,110,653中。舉例來說，SEQ ID NO: 2的N末端加帽模塊是由1至32位的氨基酸編碼。此類 N末端加帽模塊在5位具有甘氨酸或天冬氨酸殘基也是優(yōu)選的。
[0065] 術(shù)語"祀"是指個別分子，如核酸分子、多肽或蛋白質(zhì)、碳水化合物，或任何其它天 然存在的分子，包括此類個別分子的任何部分，或此類分子中兩個或更多個的復(fù)合物。靶可 以是全細胞或組織樣品，或其可以是任何非天然的分子或部分。優(yōu)選地，靶是天然存在或非 天然的多肽或含有化學修飾，例如通過天然或非天然磷酸化、乙酰化或甲基化修飾的多肽。 在一些實施方案中，靶是VEGF-Αχχχ或VEGFR-2。
[0066] 術(shù)語"共同序列"是指這樣一種氨基酸序列，其中該共同序列是通過多個重復(fù)單元 的結(jié)構(gòu)和/或序列比對獲得。使用兩個或更多個結(jié)構(gòu)和/或序列比對的重復(fù)單元，并且在該 比對中允許空位，有可能確定在每一位置處的最常見的氨基酸殘基。共同序列是包含在每 一位置處最常出現(xiàn)的氨基酸的序列。如果在單一位置處呈現(xiàn)兩個或更多個氨基酸超過平均 值，那么共同序列可能包括一小組所述氨基酸。兩個或更多個重復(fù)單元可能來自單一重復(fù) 蛋白質(zhì)中所包含的重復(fù)單元，或來自兩種或更多種不同的重復(fù)蛋白質(zhì)。
[0067] 共同序列及其測定方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
[0068] "共同氨基酸殘基"是在共同序列中的某一位置處發(fā)現(xiàn)的氨基酸。如果在兩個或更 多個重復(fù)單元中以類似概率發(fā)現(xiàn)兩個或更多個，例如三個、四個或五個氨基酸殘基，那么共 同氨基酸可能是最常發(fā)現(xiàn)的氨基酸之一，或者兩個或更多個氨基酸殘基的組合。
[0069] 在一個實施方案中，還可以使用非天然存在的結(jié)合蛋白或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0070] 術(shù)語"非天然存在"意思指合成的或非自然界來源的，例如人造的。術(shù)語"非天然存 在的結(jié)合蛋白"或"非天然存在的結(jié)合結(jié)構(gòu)域"意思指，該結(jié)合蛋白或結(jié)合結(jié)構(gòu)域是合成的 (即，由氨基酸通過化學合成而產(chǎn)生)或重組的并且不是自然界來源的。"非天然存在的結(jié)合 蛋白"或"非天然存在的結(jié)合結(jié)構(gòu)域"分別是通過表達相應(yīng)地設(shè)計的核酸而獲得的人造蛋白 質(zhì)或結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，該表達是在真核細胞或細菌細胞中進行，或是通過使用無細胞體外表 達系統(tǒng)進行。此外，該術(shù)語意思指，所述結(jié)合蛋白或結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列不是作為非人工序列 條目存在于序列數(shù)據(jù)庫，例如GenBank、EMBL-Bank或Swiss-Prot中。這些數(shù)據(jù)庫和其它類似 的序列數(shù)據(jù)庫是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
[0071 ] 結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以通過結(jié)合到VEGF-Αχχχ或通過結(jié)合到VEGFR-2來抑制VEGF-Αχχχ與 VEGFR-2的結(jié)合，其方式是使VEGF-Axxx與VEGFR-2之間的表觀解離常數(shù)(Kd)增加超過IO2倍。 在其它實施方案中，解離常數(shù)增加超過IO 3倍、超過IO4倍、超過IO5倍或超過IO6倍。在一個實 施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域與VEGF-Αχχχ或VEGFR-2相互作用的Kd低于10 7M、低于IO8M,或低于 109M、低于101()M，或低于10 nM。測定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的解離常數(shù)的方法，如基于表面 等離子體共振(SPR)的技術(shù)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
[0072] 結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合VEGF-Αχχχ。在一個實施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合人VEGF-A165。在 其它實施方案中，其可以結(jié)合其它VEGF-A同工型。
[0073]在一個實施方案中，結(jié)合蛋白和/或結(jié)合結(jié)構(gòu)域在37°C下于含有IOOmM二硫蘇糖醇 (DTT)的I3BS中孵育1或10小時之后不會喪失其天然三維結(jié)構(gòu)。如此處所使用，"PBS"意思指 含有137mM NaCUlOmM磷酸鹽和2.7mM KCl并且pH值是7.4的磷酸鹽緩沖水溶液。
[0074] 在一個實施方案中，結(jié)合蛋白包含抑制VEGF-Αχχχ與VEGFR-2的結(jié)合并且具有中點 變性溫度和不聚集特性(如以上所定義）的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中該結(jié)合蛋白抑制HUVEC球體的 血管再生，并且IC5Q值低于ΙΟΟηΜ。
[0075] 術(shù)語"HUVEC"是指人臍靜脈內(nèi)皮細胞，這些細胞可以從正常人臍靜脈分離并且對 VEGF-A刺激起反應(yīng)。
[0076] 測量HUVEC球體血管再生的測定是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
[0077] IC5q值是在體外抑制實驗確定的參數(shù)(如HUVEC球體的血管再生)達到50 %所需的 物質(zhì)（如結(jié)合蛋白或結(jié)合結(jié)構(gòu)域）的濃度。IC5Q值易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員測定(Korff T.和 Augustin H.G.J.Cell Biol.l43(5)，1341-52，1998)。
[0078] 在一個實施方案中，結(jié)合蛋白和/或結(jié)合結(jié)構(gòu)域抑制HUVEC球體的血管再生，其中 IC50值低于10nM、低于InM、低于0.1 nM或低于0.05nM。
[0079] 在另一實施方案中，可以使用抑制HUVEC球體的血管再生的單體結(jié)合蛋白和/或結(jié) 合結(jié)構(gòu)域，其中IC5q值低于蘭尼單抗、貝伐單抗、阿柏西普或哌加他尼的相應(yīng)IC 5Q值。
[0080] 在一個實施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域與VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF或roGF相互作用 的Kd大于InM、大于10nM、大于10 2nM、大于103nM或大于104nM。
[0081 ]在一個實施方案中，VEGF-Αχχχ 是狗 VEGF-A 164 或猿 VEGF-A165 或人 VEGF-A165,并 且 VEGF-Axxxb 是狗 VEGF-A 164b 或猿 VEGF-A 165b 或人 VEGF-A 165b。
[0082] 另一實施方案是包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重組結(jié)合蛋白，其中該結(jié)合結(jié)構(gòu)域抑制VEGF-Axxx與VEGFR-2的結(jié)合并且其中該結(jié)合結(jié)構(gòu)域是重復(fù)結(jié)構(gòu)域或設(shè)計的重復(fù)結(jié)構(gòu)域。此類重 復(fù)結(jié)構(gòu)域可以包含參與結(jié)合到VEGF-Axxx的一個、兩個、三個或更多個內(nèi)部重復(fù)模塊。在一 個實施方案中，此類重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含N末端加帽模塊、兩個至四個內(nèi)部重復(fù)模塊及一個C末 端加帽模塊。在一個實施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域是錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié) 構(gòu)域。
[0083] 在一個實施方案中，結(jié)合蛋白包含如本文所描述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其與聚乙二醇 (PEG)部分綴合。在一個實施方案中，PEG部分與結(jié)合結(jié)構(gòu)域的單一 Cys殘基偶聯(lián)。Cys殘基可 以通過遺傳方式引入結(jié)合結(jié)構(gòu)域的C末端。然后，可以通過化學方式，例如通過使用本領(lǐng)域 技術(shù)人員眾所周知的馬來酰亞胺化學來偶聯(lián)PEG部分。
[0084]另一實施方案是包含至少一個對VEGF-Axxx具有結(jié)合特異性的重復(fù)結(jié)構(gòu)域的如以 上所定義的重組結(jié)合蛋白，其中該重復(fù)結(jié)構(gòu)域與選自SEQ ID N0:1至7的重復(fù)結(jié)構(gòu)域的組的 重復(fù)結(jié)構(gòu)域競爭結(jié)合到VEGF-Axxx。在一個實施方案中，該重復(fù)結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO: 1或3的 重復(fù)結(jié)構(gòu)域競爭結(jié)合到VEGF-Axxx。在另一實施方案中，該重復(fù)結(jié)構(gòu)域與SEQ ID N0:3的重 復(fù)結(jié)構(gòu)域競爭結(jié)合到VEGF-Axxx。
[0085]術(shù)語"競爭結(jié)合"意思指兩種不同的本發(fā)明結(jié)合結(jié)構(gòu)域無法同時結(jié)合到同一靶，但 兩者能夠個別地結(jié)合同一靶。因此，這兩個結(jié)合結(jié)構(gòu)域競爭結(jié)合到靶。確定兩個結(jié)合結(jié)構(gòu)域 是否競爭結(jié)合到靶的方法，如競爭ELISA或競爭SPR測量法（例如，通過使用來自BioRad的 Proteon儀器），是本領(lǐng)域從業(yè)人員眾所周知的。
[0086]與所選重復(fù)蛋白質(zhì)競爭結(jié)合到VEGF-Axxx的重組結(jié)合蛋白可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人 員眾所周知的方法，如競爭酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)鑒別。
[0087]另一實施方案是包含對VEGF-Axxx具有結(jié)合特異性的重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重組結(jié)合蛋 白，該重復(fù)結(jié)構(gòu)域選自由SEQ ID NO: 1至7的重復(fù)結(jié)構(gòu)域組成的組。在一個實施方案中，該重 復(fù)結(jié)構(gòu)域選自SEQ ID NO: 2或3的重復(fù)結(jié)構(gòu)域。在另一實施方案中，該重復(fù)結(jié)構(gòu)域是SEQ ID NO: 3的重復(fù)結(jié)構(gòu)域。
[0088] 在一個實施方案中，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含具有以下錨蛋白重復(fù)序列基元的重復(fù) 模塊
[0089] 1D23G4TPLHLAA56GHLEIVEVLLK7GADVNA(SEQ ID NO:10)
[0090] 其中 1、2、3、4、5、6及7彼此獨立地表示選自組A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W 及Y的氨基酸殘基。
[0091] 在另一實施方案中，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含具有以下錨蛋白重復(fù)序列基元的重復(fù) 模塊
[0092] 1D23GWTPLHLAA45GHLEIVEVLLK6GADVNA(SEQ ID NO:11)
[0093] 其中1表示選自由？、1\11?、￥^、1、1(、〇、5及￥組成的組的氨基酸殘基；在一個實施 方案中，1是F、T、N、R或V;而在另一實施方案中，1是F或T;2表示選自由W、Y、H及F組成的組的 氨基酸殘基；在另一實施方案中，2是W、Y或H; 3表示選自由M、I、F及V組成的組的氨基酸殘 基;在另一實施方案中，3是M或1;4表示選自由!1^、1(、6^、11'、￥、1及￥組成的組的氨基酸 殘基;在另一實施方案中，4是H、A或K;5表示選自由E、Y、F、V、H、I、L、N及R組成的組的氨基酸 殘基;在另一實施方案中，5是E、Y、F、V或Η;在另一實施方案中，5是E、Y、F或V;并且6表示選 自由A、N、Y、H及R組成的組的氨基酸殘基。
[0094]在另一實施方案中，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含具有以下錨蛋白重復(fù)序列基元的重復(fù) 模塊
[0095] 1D23G4TPLHLAA56GHLEIVEVLLK7GADVN8(SEQ ID NO:12)
[0096] 其中1表示選自由1^、六、0、？、1(、1〇、1?、5、1及￥組成的組的氨基酸殘基;在另一實 施方案中，1是T或E;2表示選自由￥、？、￥、六、!1、1、1(、1?、1'及1組成的組的氨基酸殘基;在另一實 施方案中，2是V、F或Y;3表示選自由S、A、N、F及M組成的組的氨基酸殘基;在另一實施方案 中，3是S、A或N;在另一實施方案中，3是S或A;4表示選自由Y、F、S及W組成的組的氨基酸殘 基;5表示選自由A、S、L及Y組成的組的氨基酸殘基;在另一實施方案中，5是A或S; 6表示選自 由D、N、M、A、I、K及Y組成的組的氨基酸殘基;在另一實施方案中，6是D、N或M;在另一實施方 案中，6是D或N;7表示選自由A、Y、H、N及D組成的組的氨基酸殘基;并且8表示氨基酸殘基T或 A0
[0097] 在另一實施方案中，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含具有以下錨蛋白重復(fù)序列基元的重復(fù) 模塊
[0098] 1D23GWTPLHL4ADLG5LEIVEVLLK6GADVN7(SEQ ID NO:13)
[0099] 其中1表示選自由K、T及Y組成的組的氨基酸殘基;2表示氨基酸殘基N或Μ; 3表示氨 基酸殘基T或F; 4表示氨基酸殘基S或A; 5表示氨基酸殘基H或R; 6表示選自由Α、Υ、Η及N組成 的組的氨基酸殘基;并且7表示氨基酸殘基AST。
[0100] 在另一實施方案中，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含具有以下錨蛋白重復(fù)序列基元的重復(fù) 模塊
[0101] 1D23G4TPLHLAA56GH7EIVEVLLK8GADVNA(SEQ ID NO:14)
[0102] 其中1表示選自由六^^^^^~^^^及找且成的組的氨基酸殘基:在另一 實施方案中，1是A、N、R、V或Y;在另一實施方案中，1是A或R;2表示選自由S、A、N、R、D、F、L、P、 T及Y組成的組的氨基酸殘基;在另一實施方案中，2是S、A、N或R;3表示選自由T、V、S、A、L及F 組成的組的氨基酸殘基;在另一實施方案中，3是T、V、S、A或L;在另一實施方案中，3是T、V或 S; 4表示選自由W、F及H組成的組的氨基酸殘基;5表示選自由P、I、A、L、S、Τ、V及Y組成的組的 氨基酸殘基;在另一實施方案中，5是P或I;6表示選自由W、F、I、L、T及V組成的組的氨基酸殘 基;7表示氨基酸殘基L或P;并且8表示選自由A、H、N及Y組成的組的氨基酸殘基。
[0103] 在另一實施方案中，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含具有以下錨蛋白重復(fù)序列基元的重復(fù) 模塊
[0104] 1D23G4TPLHLAA56GHLEIVEVLLK7GADVNA(SEQ ID NO:15)
[0105] 其中1表示選自由!1、〇^、1(、1?、0、1^、1￥及￥組成的組的氨基酸殘基;在另一實 施方案中，1是H、Q、A、K或R;在另一實施方案中，1是A或R;2表示選自由Y、F及H組成的組的氨 基酸殘基；3表示選自由Q、F及T組成的組的氨基酸殘基;4表示選自由W、M、G、H、N及T組成的 組的氨基酸殘基;優(yōu)選W和M;5表示選自由T、A、M、L及V組成的組的氨基酸殘基;在另一實施 方案中，5是T、A或M;6表示選自由I、L、V、D及T組成的組的氨基酸殘基;在另一實施方案中，6 是I、L或V;并且7表示選自由A、H、N及Y組成的組的氨基酸殘基。
[0106] 在另一實施方案中，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含具有以下錨蛋白重復(fù)序列基元的重復(fù) 模塊
[0107] 1D23GWTPLHLAA45GHLEIVEVLLK6GADVNA(SEQ ID NO:16)
[0108] 其中1表示選自由K、M、N、R及V組成的組的氨基酸殘基;2表示選自由Y、H、M及V組成 的組的氨基酸殘基;3表示選自由F、L、M及V組成的組的氨基酸殘基;4表示選自由R、H、V、A、K 及N組成的組的氨基酸殘基;優(yōu)選R、H、V及A; 5表示選自由F、D、H、T、Y、M及K組成的組的氨基 酸殘基;在另一實施方案中，5是F、D、H、T或Υ;并且6表示選自由Α、Η、Ν及Y組成的組的氨基酸 殘基。
[0109] 在另一實施方案中，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含具有以下錨蛋白重復(fù)序列基元的重復(fù) 模塊
[0110] 1D23G4TPLHLAA56GHLEIVEVLLK7GADVN8(SEQ ID NO:17)
[0111] 其中1表示選自由T、A、H、I、N及S組成的組的氨基酸殘基；2表示選自由F、I、Q、R、V 及N組成的組的氨基酸殘基;3表示選自由A、G、N、Q及V組成的組的氨基酸殘基;4表示氨基酸 殘基W或Y;5表示選自由A、S、T及M組成的組的氨基酸殘基;6表示選自由N、V、S、F、M及W組成 的組的氨基酸殘基;7表示選自由A、H、N及Y組成的組的氨基酸殘基;并且8表示氨基酸殘基T 或A。
[0112] 在另一實施方案中，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含具有以下錨蛋白重復(fù)序列基元的重復(fù) 模塊
[0113] 1D23G4TPLHL5A67GHLEIVEVLLK8GADVNA(SEQ ID NO:18)
[0114] 其中1表示選自由K、A、V及N組成的組的氨基酸殘基;2表示選自由N、I及Y組成的組 的氨基酸殘基；3表示選自由T、F、Y及W組成的組的氨基酸殘基;4表示選自由W、D及Y組成的 組的氨基酸殘基；5表示氨基酸殘基S或A; 6表示選自由D、I及M組成的組的氨基酸殘基；7表 示選自由L、T及Y組成的組的氨基酸殘基;并且8表示選自由A、H、Y及N組成的組的氨基酸殘 基。
[0115] 在另一實施方案中，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含具有以下錨蛋白重復(fù)序列基元的重復(fù) 模塊
[0116] 1DFK2DTPLHLAA34GH5EIVEVLLK6GADVNA(SEQ ID NO:19)
[0117] 其中I表示選自由L、S及T組成的組的氨基酸殘基;2表示選自由G、S及C組成的組的 氨基酸殘基;在另一實施方案中，2是G或S; 3表示氨基酸殘基S或A; 4表示選自由Q、S、M及N組 成的組的氨基酸殘基;在另一實施方案中，4是Q或S; 5表示選自由L、M及Q組成的組的氨基酸 殘基;并且6表示選自由A、H、N、Y及D組成的組的氨基酸殘基。
[0118] 在另一實施方案中，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含具有以下錨蛋白重復(fù)序列基元的重復(fù) 模塊
[0119] 1D2L34TPLHLA567GHLEIVEVLLK8GADVNA(SEQ ID NO:20)
[0120] 其中1表示選自由Y、H、F、I、L及W組成的組的氨基酸殘基;優(yōu)選Y和Η; 2表示選自由 1、0、1^組成的組的氨基酸殘基;在另一實施方案中，2是1或0;3表示選自由6、5及￥組成 的組的氨基酸殘基;4表示氨基酸殘基W或F; 5表示選自由A、G及T組成的組的氨基酸殘基;6 表示氨基酸殘基D或W;7表示氨基酸殘基L或F;并且8表示選自由A、H、N及Y組成的組的氨基 酸殘基。
[0121] 在另一實施方案中，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含具有以下錨蛋白重復(fù)序列基元的重復(fù) 模塊
[0122] 1D23G4TPL5LAA67GHLEIVEVLLK8GADVNA(SEQ ID NO :21)
[0123] 其中1表示選自由K、S、I、N、T及V組成的組的氨基酸殘基;在另一實施方案中，1是K 或S;2表示選自由K、N、W、A、H、M、Q及S組成的組的氨基酸殘基;優(yōu)選K和N;3表示選自由F、Q、 L、 H及V組成的組的氨基酸殘基;優(yōu)選F、Q及L;4表示氨基酸殘基F或T;5表示氨基酸殘基Q或 Η; 6表示氨基酸殘基Y或S; 7表示選自由N、H、Y及M組成的組的氨基酸殘基;在另一實施方案 中，7是N或Η;并且8表示選自由Α、Η、Ν及Y組成的組的氨基酸殘基。
[0124] 在另一實施方案中，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含具有以下錨蛋白重復(fù)序列基元的重復(fù) 模塊
[0125] 1D23GWT4LHLAADLG5LEIVEVLLK6GADVNA(SEQ ID NO:22)
[0126] 其中1表示選自由F、Y、H及W組成的組的氨基酸殘基;優(yōu)選F、Y及H;2表示選自由I、 M、 D及V組成的組的氨基酸殘基;在另一實施方案中，2是I、M或D; 3表示氨基酸殘基F或L; 4表 示氨基酸殘基L或P;5表示選自由H、L及Y組成的組的氨基酸殘基;并且6表示選自由A、H、N、C 及Y組成的組的氨基酸殘基。
[0127] 可以將一個或多個聚乙二醇部分連接于結(jié)合蛋白中的不同位置，并且此連接可以 通過與胺、硫醇或其它適合反應(yīng)性基團反應(yīng)來實現(xiàn)。聚乙二醇部分的連接(聚乙二醇化)可 以是定點的，其中將適合的反應(yīng)性基團引入蛋白質(zhì)中以產(chǎn)生優(yōu)先發(fā)生聚乙二醇化的位點， 或適合反應(yīng)性基團原本存在于結(jié)合蛋白中。硫醇基可以存在于半胱氨酸殘基中；而胺基可 以例如是在多肽N末端處所見的伯胺，或存在于如賴氨酸或精氨酸等氨基酸的側(cè)鏈中的胺 基。在一個實施方案中，結(jié)合蛋白經(jīng)過修飾而在希望的位置處具有半胱氨酸殘基，由此允許 例如通過與帶有馬來酰亞胺官能團的聚乙二醇衍生物反應(yīng)而在半胱氨酸上進行定點聚乙 二醇化。聚乙二醇部分的分子量可能變化極大（即，從約IkDa至約IOOkDa)并且可以是分支 或線性的。在一個實施方案中，聚乙二醇的分子量是約1至約50kDa;在另一實施方案中，聚 乙二醇的分子量是約IOkDa至約40kDa、約15kDa至約30kDa，或是約20kDa。此類結(jié)合蛋白及 其合成方法的實例提供于美國專利號8,710，187(另以WO 2011/135067公布）中，其完整內(nèi) 容通過引用并入本文中。
[0128] 在一個實施方案中，可以使用包含本文所描述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重組蛋白，其中該 重組蛋白在其C末端半胱氨酸硫醇處與馬來酰亞胺偶聯(lián)的PEG，如與α-[3_(3-馬來酰亞胺 基-1-氧代丙基）氨基]丙基-ω-甲氧基-聚氧乙烯（N0F，Sunbright ME-200MA(20kD)或 Sunbright ME-400MA(40kD))綴合。在一個實施方案中，可以使用包含本文所描述的結(jié)合結(jié) 構(gòu)域的重組結(jié)合蛋白，其中該結(jié)合結(jié)構(gòu)域在其C末端經(jīng)由肽鍵與SEQ ID N0:8綴合，而該SEQ ID NO:8在C末端半胱氨酸硫醇處與馬來酰亞胺偶聯(lián)的PEG，如與α-[3-(3-馬來酰亞胺基-1-氧代丙基)氨基]丙基-ω _甲氧基_聚氧乙稀(NOF，Sunbright ME_200MA(20kD)或Sunbright ME-400MA(40kD))綴合。
[0129] 在一些實施方案中，C末端半胱氨酸硫醇可以與吡啶基二硫化物偶聯(lián)的PEG、乙烯 基砜偶聯(lián)的PEG或經(jīng)由其它硫醇試劑偶聯(lián)的PEG綴合。
[0130] 在一些實施方案中，PEG和適當連接化合物的分子量是至少約2kD、5kD、10kD、 20kD、30kD、40kD、50kD、70kD或IOOkD。在一個實施方案中，馬來酰亞胺偶聯(lián)的PEG的分子量 是至少約 2kD、5kD、I OkD、20kD、30kD、40kD、50kD、70kD 或 I OOkD。
[0131] 在某些實施方案中，α-[3_(3-馬來酰亞胺基-I-氧代丙基)氨基]丙基-ω-甲氧基-聚氧乙烯的分子量是至少約20kD或至少約40kD。
[0132] 在一些實施方案中，重組結(jié)合蛋白可以在N末端氨基處與適合的含PEG連接化合物 偶聯(lián)。在此類實施方案中，PEG-乙烯試劑、PEG NHS-酯、PEG NHS-碳酸酯、PEG-對硝基苯基碳 酸酯、PEG-三嗪試劑等可以在本文所描述的適合結(jié)合蛋白的N末端處綴合。
[0133] 在另一實施方案中，本發(fā)明涉及編碼特定重組結(jié)合蛋白的核酸分子。此外，還涉及 包含該核酸分子的載體。
[0134] 另外，還涉及一種藥物組合物，該藥物組合物包含一種或多種以上提及的結(jié)合蛋 白，特別是包含重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重組結(jié)合蛋白，或編碼特定重組結(jié)合蛋白的核酸分子，及任選 的藥學上可接受的載劑和/或稀釋劑。
[0135] 配制物
[0136] 藥學上可接受的載劑和/或稀釋劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的并且將于下文更詳細 地解釋。又另外，涉及一種診斷組合物，該組合物包含一種或多種以上提及的重組結(jié)合蛋 白，特別是包含重復(fù)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白。
[0137] 藥物組合物包含以上描述的結(jié)合蛋白及藥學上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑 (Remington's Pharmaceutical Sciences 1，第六版，0sol,A.編輯[1980])。技術(shù)人員已知 的適合載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑有生理鹽水、林格氏溶液(Ringer ' s solution)、右旋糖溶液、 漢氏溶液(Hank's solution)、不揮發(fā)油、油酸乙酯、含5%右旋糖的生理鹽水、增強等滲性 和化學穩(wěn)定性的物質(zhì)、緩沖劑及防腐劑。其它適合的載劑包括本身不會誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受組 合物的個體有害的抗體的任何載劑，所述組合物如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚氨 基酸及氨基酸共聚物。藥物組合物還可以是包含另外的活性劑，如抗癌劑或抗血管生成劑 (例如人VEGF-Axxxb;優(yōu)選人VEGF-A165b)的組合配制物。
[0138] 在一個實施方案中，配制物包含以上描述的結(jié)合蛋白質(zhì)及清潔劑，如非離子型清 潔劑，包括但不限于，0.04%的聚山梨醇酯20;緩沖劑，如組氨酸、磷酸鹽或乳酸;及糖，如蔗 糖或海藻糖。配制物還可以包含PBS。
[0139]欲用于體內(nèi)施用的配制物必須是防腐或無菌的。這易于通過濾過無菌過濾膜實 現(xiàn)。
[0140] 治療方法
[0141] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括一種抑制VEGF-Axxx與VEGFR-2之間的結(jié)合 的方法，該方法是通過向需要此抑制的患者施用約〇.25mg至約4mg劑量的包含錨蛋白重復(fù) 結(jié)構(gòu)域的重組結(jié)合蛋白實現(xiàn)，其中該錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域選自由SEQ ID NO: 1至7的錨蛋白重 復(fù)結(jié)構(gòu)域組成的組。
[0142] 在一些實施方案中，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域選自由SEQ ID NO: 1至5的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu) 域組成的組。在一些實施方案中，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域選自由SEQ ID N0:2或3的錨蛋白重復(fù) 結(jié)構(gòu)域組成的組。在一個實施方案中，重組結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合VEGF-Axxx，并且Kd低于109M。
[0143] 所述方法可以用于治療某些眼部病癥，包括與缺血性視網(wǎng)膜病變、新生血管性視 網(wǎng)膜病變或缺血性視網(wǎng)膜病變與新生血管性視網(wǎng)膜病變有關(guān)的那些?？捎帽疚墓_的方法 治療的一些與缺血性視網(wǎng)膜病變有關(guān)的病癥可以包括糖尿病性黃斑水腫、中央靜脈阻塞及 分支靜脈阻塞?？梢杂帽疚墓_的方法治療的一些與新生血管性視網(wǎng)膜病變有關(guān)的病癥可 以包括增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變、滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性、病理性近視、脈絡(luò)膜新生 血管、組織胞漿菌病繼發(fā)新生血管、息肉狀脈絡(luò)膜新生血管及視網(wǎng)膜血管瘤樣增生。所述方 法可以用于治療年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、視網(wǎng)膜分支靜脈阻 塞及視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞。所述方法還可以用于治療患有以上所列疾病并且用現(xiàn)有抗VEGF 療法難治療的患者。
[0144] 如此處所使用，"治療"意思指通過醫(yī)學方法處理。其包括例如施用本發(fā)明的重組 結(jié)合蛋白以防止AMD發(fā)作以及減輕其嚴重程度。
[0145] 黃斑變性是由位于黃斑下方的脈絡(luò)膜血管的新生血管生長引起。晚期黃斑變性存 在兩種類型:滲出性和萎縮性。盡管滲出性黃斑變性僅占全部黃斑變性的15 %，但幾乎所有 的滲出性黃斑變性都會導(dǎo)致失明。一旦一只眼受到滲出性黃斑變性影響，那么該病癥幾乎 總是會影響另一只眼。滲出性黃斑變性和萎縮性黃斑變性通常稱為年齡相關(guān)性黃斑變性或 年齡相關(guān)性"濕性"黃斑變性，因為這些疾病主要見于老年人。
[0146] 如此處所使用，"抗VEGF療法難治療"是指用已知的抗VEGF療法，如蘭尼單抗、貝伐 單抗、阿柏西普或哌加他尼療法無法達到令人滿意的生理反應(yīng)。這些患者在至少3次玻璃體 內(nèi)注射蘭尼單抗、貝伐單抗或阿柏西普（或至少3次玻璃體內(nèi)注射前述療法中任一種的組 合)之后，異常中心視網(wǎng)膜厚度(黃斑中心Imm 2區(qū)域)可能例如具有不到20%減小。在一個實 施方案中，盡管利用了蘭尼單抗、貝伐單抗、阿柏西普或哌加他尼療法，但抗VEGF療法難治 療的患者仍經(jīng)歷視力的持續(xù)惡化。在另一實施方案中，盡管利用了蘭尼單抗、貝伐單抗、阿 柏西普或哌加他尼療法，但抗VEGF療法難治療的患者仍經(jīng)歷視網(wǎng)膜的增厚。在一些實施方 案中，盡管利用了蘭尼單抗、貝伐單抗、阿柏西普或哌加他尼療法，但抗VEGF療法難治療的 患者展現(xiàn)的解剖學改善可忽略。
[0147] 在一些實施方案中，經(jīng)玻璃體內(nèi)施用結(jié)合蛋白，每次注射的劑量介于約0.1 mg與約 IOmg結(jié)合蛋白之間。在一些實施方案中，施用的結(jié)合蛋白的劑量介于每次注射約0.25mg與 約5mg結(jié)合蛋白之間，介于每次注射約0.25mg與約4mg結(jié)合蛋白之間，介于每次注射約 0.25mg與約3mg結(jié)合蛋白之間，介于每次注射約0.25mg與約2mg結(jié)合蛋白之間，并且介于每 次注射約〇.25mg與約Img結(jié)合蛋白之間;在其它實施方案中，施用的結(jié)合蛋白的劑量介于每 次注射約0.5mg與約5mg結(jié)合蛋白之間，介于每次注射約0.5mg與約4mg結(jié)合蛋白之間，介于 每次注射約0.5mg與約3mg結(jié)合蛋白之間，介于每次注射約0.5mg與約2mg結(jié)合蛋白之間，并 且介于每次注射約〇.5mg與約Img結(jié)合蛋白之間；在其它實施方案中，施用的結(jié)合蛋白的劑 量介于每次注射約Img與約5mg結(jié)合蛋白之間，介于每次注射約Img與約4mg結(jié)合蛋白之間， 介于每次注射約Img與約3mg結(jié)合蛋白之間，并且介于每次注射約Img與約2mg結(jié)合蛋白之 間。
[0148] 在一個實施方案中，施用的結(jié)合蛋白的劑量是每次注射約0.Img、約0.2mg、約 0 · 25mg、約0 · 3mg、約0 · 35mg、約0 · 4mg、約0 · 45mg、約0 · 5mg、約0 · 55mg、約0 · 6mg、約0 · 65mg、約 0·7mg、約0·75mg、約0·8mg、約0·9mg、約0·95mg、約lmg、約1·lmg、約1·2mg、約1·3mg、約 1·4mg、約1·5mg、約1·6mg、約1·7mg、約1·8mg、約1·9mg、約 2mg、約2·Omg、2·Img、約 2·2mg、約 2·3mg、約 2·4mg、約 2·5mg、約 2·6mg、約 2·7mg、約 2·8mg、約 2·9mg、約 3mg、約 3·Omg、3·Img、約 3·2mg、約3·3mg、約3·4mg、約3·5mg、約3·6mg、約3·7mg、約3·8mg、約3·9mg、約4mg、約4·Omg、 4·Img、約 4·2mg、約 4·3mg、約 4·4mg、約 4·5mg、約 4·6mg、約 4·7mg、約 4·8mg、約 4·9mg、約 5mg及 約5. Omg結(jié)合蛋白。
[0149] 在一個實施方案中，施用的結(jié)合蛋白的初始劑量是2至5劑，并且每次劑量之間間 隔25至35天;也就是說，向患者的眼睛施用單次劑量的結(jié)合蛋白，然后在25至35天之后向同 一只眼施用另一次劑量，并且必要時重復(fù)這些劑量，直到該眼接受總計2至5次初始劑量。 [0150]在一個實施方案中，首先施用2次劑量的結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間間隔25至35 天。在這一實施方案中，向眼施用單次劑量的結(jié)合蛋白（例如，單次注射〇.5mg至約4mg結(jié)合 蛋白），然后在25至35天后向該眼施用相同劑量，每只所治療的眼總計2次初始劑量。
[0151]在一個實施方案中，首先施用3次劑量的結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間間隔25至35 天。在這一實施方案中，向眼施用單次劑量的結(jié)合蛋白（例如，單次注射〇.5mg至約4mg結(jié)合 蛋白），在25至35天后向該眼施用相同劑量，然后再在25至35天后施用相同劑量，每只所治 療的眼總計3次初始劑量。
[0152]在一個實施方案中，首先施用4次劑量的結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間間隔25至35 天。在這一實施方案中，向眼施用單次劑量的結(jié)合蛋白（例如，單次注射〇.5mg至約4mg結(jié)合 蛋白），在25至35天后向該眼施用相同劑量，再在25至35天后施用相同劑量，然后又再在25 至35天后施用相同劑量，每只所治療的眼總計4次初始劑量。
[0153]在一個實施方案中，首先施用5次劑量的結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間間隔25至35 天。在這一實施方案中，向眼施用單次劑量的結(jié)合蛋白（例如，單次注射〇.5mg至約4mg結(jié)合 蛋白），在25至35天后向該眼施用相同劑量，再在25至35天后施用相同劑量，并且又再在25 至35天后施用相同劑量，然后再次在25至35天后施用相同劑量，每只所治療的眼總計5次初 始劑量。
[0154] 在另一實施方案中，首先向眼施用2至5次初始劑量的結(jié)合蛋白，并且每次劑量之 間間隔25至35天，然后繼之以至少一種另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔50至130 天。
[0155] 在一個實施方案中，每次另外的劑量之間間隔50至100天、50至95天、50至90天、50 至85天、50至80天、50至75天、50至70天、50至65天及50至60天；在另一實施方案中，每次另 外的劑量之間間隔55至100天、55至95天、55至90天、55至85天、55至80天、55至75天、55至70 天、55至65天及55至60天;在另一實施方案中，每次另外的劑量之間間隔60至100天、60至95 天、60至90天、60至85天、60至80天、60至75天、60至70天及60至65天;在另一實施方案中，每 次另外的劑量之間間隔65至100天、65至95天、65至90天、65至85天、65至80天、65至75天及 65至70天;在另一實施方案中，每次另外的劑量之間間隔70至100天、70至95天、70至90天、 70至85天、70至80天及70至75天;在另一實施方案中，每次另外的劑量之間間隔75至100天、 75至95天、75至90天、75至85天及75至80天;在另一實施方案中，每次另外的劑量之間間隔 80至100天、80至95天、80至90天及80至85天;在另一實施方案中，每次另外的劑量之間間隔 85至100天、85至95天及85至90天;在另一實施方案中，每次另外的劑量之間間隔90至100天 及90至95天。在另一實施方案中，每次另外的劑量之間間隔30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或130天。
[0156] 舉例來說，在一個實施方案中，向眼施用單次劑量的結(jié)合蛋白（如單次注射0.5mg 至約4mg結(jié)合蛋白），在25至35天后向該眼施用相同劑量，然后再在25至35天后施用相同劑 量，每只所治療的眼總計3次初始劑量，之后每55至65天向該眼施用相同劑量，持續(xù)該眼需 要治療的時間。
[0157] 根據(jù)一些實施方案，根據(jù)本發(fā)明的方法接受注射重組結(jié)合蛋白的患者的異常中心 視網(wǎng)膜厚度可以展現(xiàn)自基線的20%或更高百分比減小、25%或更高百分比減小、30%或更 高百分比減小、35%或更高百分比減小、40%或更高百分比減小、45%或更高百分比減小、 50%或更高百分比減小、55%或更高百分比減小、60%或更高百分比減小、65%或更高百分 比減小、70%或更高百分比減小、75%或更高百分比減小、80%或更高百分比減小、85%或 更高百分比減小、90 %或更高百分比減小、95 %或更高百分比減小、99 %減小或100 %減小。 [0158]根據(jù)一些實施方案，抗VEGF治療，如蘭尼單抗、貝伐單抗、阿柏西普或哌加他尼難 治療的患者在接受一次或多次注射本文公開的結(jié)合蛋白之后，可以展現(xiàn)異常中心視網(wǎng)膜厚 度自基線的約20%或更高百分比減小。根據(jù)一些實施方案，患者在接受一次或多次注射本 文公開的結(jié)合蛋白之后，可以展現(xiàn)異常中心視網(wǎng)膜厚度自基線的約30%或更高百分比減 小。根據(jù)其它實施方案，患者在接受一次或多次注射本文公開的結(jié)合蛋白之后，可以展現(xiàn)異 常中心視網(wǎng)膜厚度自基線的低于40%或更高百分比減小。
[0159]舉例來說，用于治療眼部病癥，如年齡相關(guān)性黃斑變性的方法可以包括以本文所 描述的頻率玻璃體內(nèi)注射在〇. 5mg至5mg范圍內(nèi)的量的重組結(jié)合蛋白。該重組結(jié)合蛋白包含 SEQ ID N0:3的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域。
[0160]在另一實例中，用于治療抗VEGF治療如蘭尼單抗、貝伐單抗或蘭尼單抗和貝伐單 抗等難治療的患者的年齡相關(guān)性黃斑變性的方法可以包括玻璃體內(nèi)注射在〇.5mg至5mg范 圍內(nèi)的量的重組結(jié)合蛋白。該重組結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0:3的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域。在此類 實例中，接受一次或多次此類注射的患者在接受一次或多次注射之后，會經(jīng)歷異常中心視 網(wǎng)膜厚度超過20%的減小。在一些實施方案中，接受一次或多次此類注射的患者在接受一 次、兩次、三次、四次、五次或更多次注射之后不經(jīng)歷視網(wǎng)膜變厚。
[0161]在另一實例中，用于治療抗VEGF治療如蘭尼單抗、貝伐單抗或蘭尼單抗和貝伐單 抗等難治療的患者的糖尿病性黃斑水腫的方法可以包括玻璃體內(nèi)注射在〇. 5mg至5mg范圍 內(nèi)的量的重組結(jié)合蛋白。該重組結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0:3的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域。在此類實 例中，接受一次或多次此類注射的患者在接受一次、兩次、三次、四次、五次或更多次注射之 后，會經(jīng)歷異常中心視網(wǎng)膜厚度超過20%的減小。在一些實施方案中，接受一次或多次此類 注射的患者在接受一次、兩次、三次、四次、五次或更多次注射之后不經(jīng)歷視網(wǎng)膜變厚。 實施例
[0162]以下實施例進一步說明本發(fā)明。本發(fā)明人測試了abicipar pegol，這是與聚乙二 醇綴合的包含SEQ ID N0:3的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明結(jié)合蛋白（該化合物的一般名稱 是"abicipar pegol"，在本文中有時簡稱為"abicipar"）。
[0163] 麵
[0164] 本發(fā)明人在開放標記的劑量遞增安全性評估中預(yù)先測試了通過向抗VEGF療法難 治療的晚期滲出性AMD患者玻璃體內(nèi)注射而施用abicipar pegol。其遵循的研究是在未經(jīng) 過治療的滲出性A M D患者中對a b i c i p a r和蘭尼單抗進行隨機化、雙盲評價（"第2階段研 究"）。目的在于評估利用4.2mg和3mg abicipar對于視網(wǎng)膜水腫和最佳矯正視力(BCVA)的 安全性和治療作用持續(xù)時間以及表征ab i c ipar的全身藥物代謝動力學特征。
[0165] 在本實施例中，本發(fā)明人執(zhí)行了abicipar與蘭尼單抗的隨機化、雙盲比較（"第3階 段研究"）?；颊弑浑S機分入三組之一，即abiciparlmg、abicipar 2mg或蘭尼單抗0.5mg，并 跟蹤20周。所有患者在第0周、第4周及第8周時接受每月3次劑量。蘭尼單抗治療的患者在第 12周和第16周時接受另外的蘭尼單抗劑量，而abicipar患者接受空白（sham)注射。第3階段 的目標是評估用較少劑量的abicipar(3次劑量)相比蘭尼單抗(5次劑量)能對BCVA和視網(wǎng) 膜水腫實現(xiàn)類似作用還是更佳作用；比較是在最后一劑abicipar后8周和12周與在第四劑 和第五劑蘭尼單抗后4周之間進行。
[0166] 第3階段中的主要功效變量是第16周（第三次注射之后8周）時研究眼的BCVA自基 線的平均變化。相較于蘭尼單抗治療的患者增加5.3個字母(第四次注射后4周），用2mg和 Img abicipar治療的患者分別增加8.2和6.3個字母。關(guān)鍵的次要功效變量是視網(wǎng)膜內(nèi)液體 的消除。如通過光學相干斷層掃描術(shù)所評估，玻璃體內(nèi)液體是以視網(wǎng)膜內(nèi)水腫、視網(wǎng)膜內(nèi)囊 腫及視網(wǎng)膜下液體表征。在第12周（第三劑治療后4周）時，在abicipar 2mg組、abicipar Img組及蘭尼單抗組中無視網(wǎng)膜內(nèi)液體的患者比例是78%、68%及50%。在第16周（第三劑 abicipar后8周和第四劑蘭尼單抗后4周）時，在abicipar 2mg組、abicipar Img組及蘭尼單 抗組中無視網(wǎng)膜內(nèi)液體的患者比例分別是52 %、44 %及19 %。視網(wǎng)膜內(nèi)液體的存在引起視 網(wǎng)膜中神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的破壞，從而導(dǎo)致視力損失。消除視網(wǎng)膜內(nèi)液體可保護視力。
[0167] 患者選擇
[0168] 將約64位患者以3:3:2的分配比隨機分入以下各組之一：
[0169] ?在基線、第4周及第8周時施用2mg abicipar(3次注射）
[0170] ?在基線、第4周及第8周時施用Img abicipar(3次注射）
[0171] ?在基線、第4周、第8周、第12周及第16周時施用0.5mg蘭尼單抗(5次注射）
[0172] 選出六十四位患者。這些患者的平均年齡是76.6歲，主要是白種人并且大多數(shù)是 女性。在基線時，平均BCVA在58.5個字母至60.4個字母范圍內(nèi)（相當于約20/6331^11611)。平 均基線中心視網(wǎng)膜厚度（"CRT"）范圍介于463與526μπι之間。對于人口統(tǒng)計或基線特征中的 任一種來說，治療組之間無顯著差異（表1)，不過主要患有經(jīng)典病變的患者的比例在 813；[(^口312.011^組中明顯高于其它治療組。
[0173] BCVA 是通過使用 Arch Ophthalmol. ,119(10) :1417-36(2001)中所描述的修改的 ETDRS方法定量。BCVA測試是在需要與眼接觸的任何檢查之前進行，并且執(zhí)行以下屈光度檢 測。
[0174]屈光度檢測是在4米處執(zhí)行，除非降低視力(在此情形中，該檢測是在1米處執(zhí)行）。 首先測定右眼的屈光度，隨后是左眼。將試鏡架放在患者臉上并加以調(diào)整，以使得鏡框與眼 眶的前平面平行并集中在瞳孔的前面。將鏡框調(diào)整成與角膜呈適當距離。不測定屈光度的 眼通過用折疊織物掩蓋并在該眼上施加黑色遮光板來進行阻擋。將由開始的近似屈光度檢 測獲得的矯正鏡片插入試鏡架中。鏡片通過插入最接近眼睛的隔板中進行定位;將柱面矯 正鏡片放到球面矯正鏡前面的隔室中并調(diào)整中軸。鼓勵患者使用偏心注視，必要時確保另 一只眼完全被遮擋住。然后測定球鏡度、柱鏡軸及柱鏡度并精調(diào)。
[0175] BVCA測試是在4米處開始。首先，測試右眼，然后測試左眼。從參與者的眼睛到視力 表的距離是4米(13英尺1.5英寸，或157.5英寸）。使參與者站立或坐下;在任一情形中，檢查 者都確保參與者是舒適地站立或坐下，頭在測試期間不會前后移動，并且參與者的眼睛保 持在4米的距離。檢查者記下參與者讀取正確或錯誤的每個字母。一旦參與者辨識出一個字 母并以肯定的單字母回答，并且讀取下一字母時，關(guān)于前一字母的更正就不被接受。如果參 與者在大聲讀取下一字母之前大聲地改變回答(例如，"這是'C'不是'0'"），則接受這一改 變。如果參與者在開始讀取下一字母之后改變回答，那么該改變就不被接受。當參與者說他 不能讀取字母時，鼓勵其進行猜測。如果參與者將一個字母辨識為兩個或更多個字母之一， 則要求其選出一個字母，并且必要時進行猜測，即使其讀出下一個字母。盡管要求進行讀取 或猜測，但當明顯無法進一步作出有意義的讀取(通常是參與者無法猜出一個字母)時，檢 查者停止對該眼的測試。鼓勵參與者進行猜測是出于若干原因：參與者陳述其無法辨識一 個字母通常是不可靠的；鼓勵其猜測有助于使參與者盡最大努力;此舉有助于確保在不同 診所執(zhí)行的程序間的均一性;而且此舉可以幫助防止參與者的偏差(裝?。?br>[0176] 在4米處正確地讀取19個或更少字母的眼睛在1米處進行測試。在1米處測試之前， 在試鏡架上的4米矯正鏡上增加+0.75的球鏡以補償更近的測試距離。盡管參與者在4米測 試時可以站立或坐下，但參與者在1米測試時只能坐下。要求參與者在1米處僅讀取前6行， 得出在該距離處的最高評分30。
[0177] 右眼測試完成后，對左眼重復(fù)該測試，從4米處開始。
[0178] 表1:人口統(tǒng)計和基線特性(第3階段，mITT)
[0180] 關(guān)鍵安全性變量
[0181] ?不良事件(AE)和嚴重不良事件(SAE)
[0182] . BCVA
[0183] ?-般體檢
[0184] ?血液化學檢查、血常規(guī)和尿分析
[0185] ?注射后評價
[0186] 免疫原性和全身藥物代謝動力學測量:
[0187] · abicipar的全身(血清)水平
[0188] ?針對abicipar的結(jié)合抗體和中和抗體
[0189] 功效測量
[0190] ?利用早期糖尿病性視網(wǎng)膜病變治療研究(ETDRS)視力方案評估的BCVA
[0191] ?自基線的平均變化
[0192] OBCVA反應(yīng)者分析：
[0193] 1.自基線多15個字母的改善(視力改善）
[0194] 2.自基線損失小于15個字母(穩(wěn)定視力）
[0195] ?通過光學相干斷層掃描術(shù)(OCT)測量并通過中央讀取中心(CRC)評價的視網(wǎng)膜 水腫或視網(wǎng)膜中心厚度(小凹中心Imm 2區(qū)域;CRT)
[0196] ?如通過CRC測量并利用OCT評價視網(wǎng)膜內(nèi)液體、視網(wǎng)膜內(nèi)囊腫及視網(wǎng)膜下液體。
[0197] OCT是提供視網(wǎng)膜的高分辨率光學截面圖像的一種基于激光的無創(chuàng)診斷系統(tǒng)。由 Heidelberg Engineering使用Spectral is譜域OCT(SD-0CT)或由 Carl Zeiss使用Cirrus譜 域OCT捕捉研究眼中視網(wǎng)膜中心Imm子域的厚度。在固定于黃斑上的情況下，Spectralis OCT裝置在6 · Omm X 6 · Omm下通過512A掃描和49B掃描捕捉容積掃描并在6 · Omm掃描長度和 768分辨率下通過水平和垂直B掃描捕捉交叉線掃描。該裝置用1.6.2.0版Heidelberg Eye Explorer及5.1.2.0版或更高版本的HRA2/Spectralis Family Acquisition Module運行。 在固定于黃斑上的情況下，Cirrus OCT裝置在6. Omm X 6. Omm下通過512A掃描和128B掃描捕 捉黃斑立方體掃描并在6. Omm掃描長度和1024A掃描下通過水平和垂直B掃描捕捉交叉線掃 描。該裝置運行4.5版或更高版本的Cirrus軟件。
[0198] 通過CRC復(fù)查在篩選隨訪時從患者收集的電子OCT圖像以確定患者的資格。將在所 有研究隨訪時從所有患者收集的電子OCT圖像傳送到CRC以評估治療對視網(wǎng)膜液體解決的 影響。
[0199] 在整個研究中使用相同OCT系統(tǒng)（即，Spectral is或Cirrus)評價任何給定患者的 CRT。
[0200]用于確定疾病復(fù)發(fā)的數(shù)據(jù)包括根據(jù)研究眼的中央讀取中心分級的BCVA和CRT。將 研究人員所評價的新出血或超過1.25mm2的現(xiàn)有出血收集在再治療病例報告單(CRF)上。捕 集在此CRF上的陽性反應(yīng)用于確定存在新出血或現(xiàn)有出血增加。
[0201]如果在第三次注射研究藥物(第12周)之后存在活動性疾病的跡象，那么Abicipar 治療的患者可以退出護理療法標準（S0C);蘭尼單抗治療的患者以4周的間隔接受重復(fù)注 射，而不管活動性疾病的跡象如何。
[0202] 活動性疾病的跡象
[0203] 本發(fā)明人的方案提出，在第12周及隨后時間，在OCT上呈現(xiàn)視網(wǎng)膜液體的眼應(yīng)當加 以治療，除非以4周間隔連續(xù)3次注射之后眼中的視網(wǎng)膜液體未減少。對于此類眼，可能的情 形是持續(xù)治療可能是無效的，并且眼科專家和患者可以選擇延緩治療。如果在OCT上視網(wǎng)膜 液體增加（相對于當治療停止時的隨訪），那么在稍后的隨訪時可以對這些眼重新進行治 療。如果在OCT上無視網(wǎng)膜液體，但存在活動性CNV的其它征象，則該眼應(yīng)當予以治療。這些 征象包括新出現(xiàn)的視網(wǎng)膜下或視網(wǎng)膜內(nèi)出血、持續(xù)的視網(wǎng)膜下或視網(wǎng)膜內(nèi)出血、沒有其它 原因?qū)е碌囊暳ο鄬τ谧詈笠淮坞S訪下降、在熒光素血管造影術(shù)(FA)上病變大小相對于最 后一次血管造影片有所增加，或在FA上存在滲漏。
[0204] 關(guān)鍵隨訪
[0205] ?第1階段:第 3天、第1、2、4、8、12、16、20、24周/退出
[0206] ?第2階段:第3 天、第1、2、4、6、8、12、16、20、24、28及32周/退出
[0207] ?第3階段:第3天、第1、4、8、12、16、20周/退出
[0208]
[0209] ^不良事件分析安全群體，并且針對安排、人口統(tǒng)計特征、基線特征、中心視網(wǎng) 膜厚度及BCVA分析調(diào)整意向治療(mITT)群體;在患者接受S0C(例如蘭尼單抗、阿柏西普、貝 伐單抗)治療后，使用CRT和BCVA末次觀察值結(jié)轉(zhuǎn)（last-observation-carried-forward， L0CF)輸入數(shù)據(jù)。
[0210] 安全性
[0211]不管成因如何，研究眼中的最常見（多2次事件/組)不良事件(AE)在abicipar組中 是視網(wǎng)膜出血、玻璃體懸浮物、玻璃體脫離及眼痛，而在蘭尼單抗組中是黃斑瘢痕和視網(wǎng)膜 出血(表2)。任一組中都未報告嚴重不良事件。在2mg治療的患者中有2位及在Img治療的患 者中有3位出現(xiàn)炎癥相關(guān)AE(表2)。在第一次研究注射后未出現(xiàn)不良事件;在第二次注射后 出現(xiàn)脈絡(luò)膜炎和葡萄膜炎AE;在第三次注射后出現(xiàn)虹膜炎和玻璃體炎AE。在蘭尼單抗治療 組中未報告眼部炎癥。
[0212]表2:研究眼中的不良事件(不管成因如何;發(fā)生率多2次事件/組)和眼部炎癥(任 何事件）
[0215]靈
[0216] 在2mg和Img abicipar組中，所有患者都接受SOC，直到第12周。在2mg組中，有3位 患者在第12周時退出S0C，有5位患者在第16周時退出。在Img組中，有5位患者在第12周時退 出，并且有6位患者在第16周時退出。在第12周后有活動性疾病跡象的蘭尼單抗治療的患者 繼續(xù)用蘭尼單抗再治療;有6位蘭尼單抗治療的患者在第12周時滿足SOC標準，并且有3位在 第16周時滿足該標準。
[0217]最佳矯正視力(BCVA)
[0218]在所有組中，平均BCVA自基線的變化都有所改善;在第12周(最后一劑abicipar后 4周）時，在2mg治療組、Img治療組及蘭尼單抗治療組中，BCVA自基線的變化分別是8.9、6.2 及5.3個字母。在第16周時，主要終點，即BCVA自基線的變化在對應(yīng)組中是8.2、6.3及5.3個 字母，如圖1中所示。因此，abicipar治療組與蘭尼單抗治療組之間的差異雖然在統(tǒng)計學上 并不顯著，但仍是相當大的(在圖1及圖2、3和4中，接受護理標準之后的數(shù)據(jù)被認為缺失;缺 失值使用LOCF輸入）。
[0219] 相較于蘭尼單抗組，在2mg abicipar組中BCVA的15個或更多個字母改善的患者的 比例在數(shù)字上更高。在第12周時，2mg abicipar組、Img abicipar組及蘭尼單抗組中改善15 個或更多個字母的患者比例分別是22%、8%及13%。在第16周時，這些值是22%、12%及 13 % (圖2)。在abi cipar組中沒有患者而在蘭尼單抗組中有1位患者在20周研究期間損失15 個或更多個字母。
[0220] 穩(wěn)定視力是以BCVA損失少于15個字母來評估。abicipar組中的所有患者都達到穩(wěn) 定視力;蘭尼單抗組中有一位患者未達到（圖3)。
[0221]中心視網(wǎng)膜厚度
[0222] 基線CRT值在2mg abicipar治療組與蘭尼單抗治療組之間相當，而Img abicipar 組中增厚約60μπι。到第12周時，CRT減小在三個治療組中分別是140μπι、19 5μπι及126μπι。在第 16周，這些值是ΙΙΙμηι、161μηι及127μηι; 2 .Omg abicipar治療組與蘭尼單抗治療組在任何時 間都不存在顯著差異。相較于蘭尼單抗組，在第1周至第16周時，abicipar組中CRT減小到或 低于正常值的上限的患者的比例在數(shù)字上較高，并且在第8周時差異在Img組中明顯更高(p = 0.041)。在第12周時，CRT減小到或低于正常值的上限的患者的比例在三個治療組中分別 是57 %、64 %及44%。在第16周時，這些值是48 %、52 %及44%。圖4示出了整個研究的平均 CRT 值。
[0223] 治療對液體解剖學解決的影響
[0224] 在sdOCT圖像中視網(wǎng)膜內(nèi)液體、視網(wǎng)膜內(nèi)囊腫及視網(wǎng)膜下液體的存在被讀取中心 評為活動性滲出性病變的量度。全部3個液體隔室在第一劑、第二劑及第三劑后4周都得到 解決(全干）的患者的比例在2mg abicipar組中是52%、74%及78%，在Img abicipar組中 是40 %、52 %及68 %，而在蘭尼單抗組中是13 %、19 %及50 %。在第16周（第三次注射 abicipar 2.0mg和I .Omg之后8周，及第四次注射蘭尼單抗后4周），這些值在2mg abicipar 組、Img abicipar組及蘭尼單抗組中分別是52%、44%及19%。圖5示出了視網(wǎng)膜內(nèi)液體、視 網(wǎng)膜內(nèi)囊腫及視網(wǎng)膜下液體（全部三個隔室）在治療后得到解決的患者的比例。用2mg abicipar治療的患者的兩個實施例示于圖6和7中。如通過中心視網(wǎng)膜中異常液體解決所證 實，這些患者的中心視網(wǎng)膜厚度明顯減小。
[0225] 與先前發(fā)現(xiàn)的比較
[0226] 根據(jù)較高劑量對這些疾病進展量度的影響，意外地發(fā)現(xiàn)，可以使用1.0 mg和2. Omg ab i c i par在開始治療后4周、8周或12周有效減少視網(wǎng)膜內(nèi)液體、視網(wǎng)膜內(nèi)囊腫及視網(wǎng)膜下 液體。在以175位未經(jīng)過治療的滲出性AMD患者進行的臨床試驗中，發(fā)現(xiàn)4.2mg和3 . Omg abicipar解決視網(wǎng)膜液體的功效在初始劑量之后與蘭尼單抗相當。如果患者滿足某些再治 療標準，那么在第1天，隨后在第16周或更早時間對患者給藥。圖8示出了視網(wǎng)膜內(nèi)液體、視 網(wǎng)膜內(nèi)囊腫及視網(wǎng)膜下液體(全部三個隔室)都得到解決的患者的比例；圖9示出了這些隔 室中的一個、兩個、全部三個的液體都解決或都未解決的患者的比例。
[0227] 盡管已在某些實施方案和實施例的上下文中公開本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了 解，本發(fā)明將具體公開的實施例擴展到其它替代性實施方案和/或本發(fā)明的應(yīng)用及其明顯 修改和等效內(nèi)容。此外，盡管已經(jīng)詳細顯示和描述多種變化，但基于此公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技 術(shù)人員將易于了解在本發(fā)明的范圍內(nèi)的其它修改。另外，預(yù)期可以提出實施方案的具體特 征和方面的各種組合或子組合并且仍在本發(fā)明范圍內(nèi)。因此，應(yīng)了解，所公開的實施方案的 各種特征和方面可以彼此組合或取代，以便執(zhí)行所公開的發(fā)明的不同模式。因此，預(yù)期本文 公開的本發(fā)明的范圍不應(yīng)受特別公開的上述實施方案的限制，而應(yīng)當僅通過清楚地閱讀權(quán) 利要求書來決定。
【主權(quán)項】
1. 一種抑制VEGF-Αχχχ與VEGFR-2之間的結(jié)合的方法，所述方法包括以下步驟：向需要 此抑制的患者施用約〇.25mg至約4mg的包含錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重組結(jié)合蛋白，其中施用2 至5次劑量的所述重組結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間間隔25至35天。2. -種治療黃斑變性的方法，所述方法包括以下步驟：向需要此治療的患者施用約 0.25mg至約4mg的包含錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重組結(jié)合蛋白，其中施用2至5次劑量的所述重 組結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間間隔25至35天。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述黃斑變性是滲出性黃斑變性。4. 一種改善患有視網(wǎng)膜疾病的患者的視力的方法，所述方法包括以下步驟：向需要此 改善的患者施用約〇.25mg至約4mg的包含錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重組結(jié)合蛋白，其中施用2至 5次劑量的所述重組結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間間隔25至35天。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述視網(wǎng)膜疾病選自滲出性黃斑變性、息肉狀脈絡(luò)膜 血管病變、視網(wǎng)膜血管瘤樣增生、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視及視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞。6. -種減少視網(wǎng)膜中的液體的方法，所述方法包括以下步驟：向需要此減少的患者施 用約0.25mg至約4mg的包含錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重組結(jié)合蛋白，其中施用2至5次劑量的所 述重組結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間間隔25至35天。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述液體選自視網(wǎng)膜內(nèi)液體、視網(wǎng)膜下液體及視網(wǎng)膜 內(nèi)囊腫內(nèi)的液體。8. -種減小視網(wǎng)膜厚度的方法，所述方法包括以下步驟：向需要此減小的患者施用約 0.25mg至約4mg的包含錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重組結(jié)合蛋白，其中施用2至5次劑量的所述重 組結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間間隔25至35天。9. 如權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中施用2次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次 劑量之間間隔25至35天。10. 如權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中施用3次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次 劑量之間間隔25至35天。11. 如權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中施用4次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次 劑量之間間隔25至35天。12. 如權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中施用5次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次 劑量之間間隔25至35天。13. 如權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述方法另外包括在所述2至5次劑量之 后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔25至115天。14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中施用2次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔50至115天。15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中施用2次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔50至90天。16. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中施用2次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔50至60天。17. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中施用2次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔80至90天。18. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中施用2次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔105至115天。19. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中施用3次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔50至115天。20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中施用3次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔50至90天。21. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中施用3次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔50至60天。22. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中施用3次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔80至90天。23. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中施用3次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔105至115天。24. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中施用4次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔50至115天。25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中施用4次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔50至90天。26. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中施用4次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔50至60天。27. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中施用4次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔80至90天。28. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中施用4次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔105至115天。29. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中施用5次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔50至115天。30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中施用5次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔50至90天。31. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中施用5次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔50至60天。32. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中施用5次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔80至90天。33. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中施用5次劑量的所述結(jié)合蛋白，并且每次劑量之間 間隔25至35天，隨后施用另外的劑量，并且每次另外的劑量之間間隔105至115天。34. 如權(quán)利要求1至33中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合蛋白另外包含分子量是至少 5kDa的聚乙二醇部分。35. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述聚乙二醇部分的分子量選自由5kDA、IOkDA及 20kDa組成的組。36. 如權(quán)利要求1至35中任一項所述的方法，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的N末端加帽 模塊在5位包含Asp殘基。37. 如權(quán)利要求1至36中任一項所述的方法，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域選自由以下組 成的組：SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID N0:7的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域。38. 如權(quán)利要求1-37中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合蛋白包含含有SEQ ID N0:3的 氨基酸1至126的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域。39. 如權(quán)利要求1-37中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合蛋白包含含有重復(fù)模塊的錨 蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域，所述重復(fù)模塊具有選自由以下組成的組的錨蛋白重復(fù)序列基元：SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21及SEQ ID N0:22〇40. 如權(quán)利要求1至39中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域以低于IO9M的Kd結(jié)合 VEGF-Axxx041. 如權(quán)利要求1至40中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合蛋白抑制VEGF-Axxx與 VEGFR-I的結(jié)合。42. 如權(quán)利要求1至41中任一項所述的方法，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域在其C末端經(jīng) 由肽鍵與多肽連接子和C末端Cys殘基綴合，其中所述C末端Cys的硫醇進一步與馬來酰亞胺 偶聯(lián)的聚乙^?醇綴合。43. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述馬來酰亞胺偶聯(lián)的聚乙二醇是α-[3_(3-馬來 酰亞胺基-1-氧代丙基)氨基]丙基-ω-甲氧基-聚氧乙烯。44. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述多肽連接子由2至24個氨基酸組成。45. 如權(quán)利要求1至44中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合蛋白與藥學上可接受的載劑 和/或稀釋劑一起施用。46. 如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述載劑是PBS。47. 如權(quán)利要求45或46所述的方法，其中所述結(jié)合蛋白通過玻璃體內(nèi)注射施用。48. 如權(quán)利要求1至47中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合蛋白以約0.25mg、約0.5mg、 約Img、約2mg、約3mg或約4mg的劑量施用。49. 如權(quán)利要求1和9-48中任一項所述的方法，其中所述方法有效治療患病患者的黃斑 變性、息肉狀脈絡(luò)膜血管病變、視網(wǎng)膜血管瘤樣增生、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、視網(wǎng) 膜分支靜脈阻塞或視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞。50. 如權(quán)利要求1-49中任一項所述的方法，其中所述患者的最佳矯正視力在開始治療 12周之后改善至少15個字母。51. 如權(quán)利要求1至50中任一項所述的方法，其中所述患者在開始治療4、8或12周之后 經(jīng)歷中心視網(wǎng)膜中的液體減少約20%、約25%、約30 %、約35 %、約40%、約45%、約50 %、約 55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約 100%。52. 如權(quán)利要求1至51中任一項所述的方法，其中所述患者在開始治療4、8或12周之后 經(jīng)歷視網(wǎng)膜內(nèi)水腫、視網(wǎng)膜內(nèi)囊腫及視網(wǎng)膜下液體中的一種或多種減少約20 %、約25 %、約 30%、約 35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約 75%、約80%、約 85%、約90%、約95%或約 100%。53. 如權(quán)利要求1至51中任一項所述的方法，其中所述患者在開始治療4、8或12周之后 經(jīng)歷視網(wǎng)膜內(nèi)水腫、視網(wǎng)膜內(nèi)囊腫及視網(wǎng)膜下液體中的一項或多項減少至少約20%、至少 約25 %、至少約30 %、至少約35 %、至少約40 %、至少約45 %、至少約50 %、至少約55 %、至少 約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少 約95 %或至少約99 %。54. 如權(quán)利要求52或53所述的方法，其中所述減少通過譜域OCT評估。55. 如權(quán)利要求1至54中任一項所述的方法，其中所述患者在開始治療4、8或12周之后 經(jīng)歷以下各項中至少兩項，或至少三項，或全部減少：中心視網(wǎng)膜厚度、視網(wǎng)膜內(nèi)水腫、視網(wǎng) 膜內(nèi)囊腫及視網(wǎng)膜下液體。56. 如權(quán)利要求1至55中任一項所述的方法，其中所述患者是蘭尼單抗、貝伐單抗、阿柏 西普或哌加他尼療法難治療的。57. 如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述患者在3次玻璃體內(nèi)注射蘭尼單抗、貝伐單抗 或阿柏西普之后黃斑中心Imm2區(qū)域減小少于20%。58. 如權(quán)利要求56或57所述的方法，其中所述患者是三次劑量、四次劑量、五次劑量或 六次劑量的蘭尼單抗療法難治療的。59. 如權(quán)利要求56或57所述的方法，其中所述患者是三次劑量、四次劑量、五次劑量或 六次劑量的貝伐單抗療法難治療的。60. 如權(quán)利要求56或57所述的方法，其中所述患者是三次劑量、四次劑量、五次劑量或 六次劑量的阿柏西普療法難治療的。61. 如權(quán)利要求56或57所述的方法，其中所述患者是三次劑量、四次劑量、五次劑量或 六次劑量的哌加他尼療法難治療的。
【文檔編號】A61K38/17GK105960247SQ201480060463
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2014年11月4日
【發(fā)明人】T·霍曼, J·奇塔姆, S·惠特卡普, E·利帕
【申請人】阿勒根公司