組織工程血管化肝小葉的制造方法
【專利摘要】一種組織工程血管化肝小葉的制造方法，包括以下步驟：用3D打印機(jī)打印肝小葉的相容性支持性邊框，在所述邊框插入七根毛細(xì)玻璃管構(gòu)成肝小葉的成型模具；按細(xì)胞濃度10^6cells/mL將HepG2細(xì)胞與溫敏性水凝膠溶液混勻，填加到所述模具中，用紫外光照射30s?200s，固化交聯(lián)膠原后抽出毛細(xì)玻璃管，形成毛細(xì)管道；配置濃度為1*10^7cells/mL的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，注入到所述毛細(xì)管道中并培養(yǎng)，使其長滿毛細(xì)管道內(nèi)壁，從而制得血管化的肝小葉。本方法制得的肝小葉生物相容性好，可用于肝臟類藥物的藥物篩選、疾病機(jī)理研究以及藥物在肝臟中代謝過程的研究。
【專利說明】
組織工程血管化肝小葉的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種組織工程血管化肝小葉的制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002]3D打印技術(shù)又稱增材制造，其加工過程簡單，無需原胚和模型，可以直接利用計算機(jī)建模，將想要的結(jié)構(gòu)直接打印出來，相比于傳統(tǒng)的加工方式，3D打印具有快速、精準(zhǔn)、易于加工的特點。目前生物模具加工一般采用注塑成型、機(jī)床車銑刨磨等技術(shù)手段，加工的精度差，且費時費力。對于有特殊結(jié)構(gòu)要求的結(jié)構(gòu)無法進(jìn)行加工。
[0003]肝功能衰竭是一種常見的人類殺手，常見的治療方法是人工肝，人工肝是指通過體外的機(jī)械、理化或生物裝置，清除各種有害物質(zhì)，補(bǔ)充必需物質(zhì)，改善內(nèi)環(huán)境，暫時替代衰竭肝臟部分功能的一套完整的個體化治療方法，能為肝細(xì)胞再生、肝功能恢復(fù)創(chuàng)造條件或等待機(jī)會進(jìn)行肝移植。在需要進(jìn)行肝移植的病例中，通常沒有足夠的肝源可以供患者移植，因此，如果可以通過組織工程的方法制造活的組織工程肝臟，將為解決肝功能衰竭提供新的思路。人的肝臟組織大約有50萬個肝臟小葉的基本單元組成，每個肝小葉均成六棱柱結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)比較均一，因此，如果可以制造出單個肝小葉，將為制造整個肝臟提供新的研究思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種組織工程血管化肝小葉的制造方法。
[0005]—種組織工程血管化肝小葉的制造方法，所述肝小葉包括六棱柱形的主體和從該主體的端面貫穿該主體的六個小孔和一個大孔，所述大孔位于所述端面的中心，六個小孔環(huán)形分布在大孔周圍，所述制造方法包括以下步驟:
[0006]用3D打印機(jī)打印肝小葉的相容性支持性邊框，在所述邊框插入七根毛細(xì)玻璃管構(gòu)成肝小葉的成型模具；
[0007]按細(xì)胞濃度l(T6Cells/mL將HepG2細(xì)胞與溫敏性水凝膠溶液混勻，填加到所述模具中，用紫外光照射30s-200s，固化交聯(lián)膠原后抽出毛細(xì)玻璃管，形成毛細(xì)管道；
[0008]配置濃度為l*l(T7CellS/mL的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，注入到所述毛細(xì)管道中并培養(yǎng)，使其長滿毛細(xì)管道內(nèi)壁，從而制得血管化的肝小葉。
[0009]在上述的組織工程血管化肝小葉的制造方法中，優(yōu)選地，所述六棱柱形的主體厚2毫米、寬3毫米，小孔的內(nèi)徑為250微米，大孔的內(nèi)徑為500微米。
[0010]在上述的組織工程血管化肝小葉的制造方法中，優(yōu)選地，所述溫敏性水凝膠為GelMA、膠原、明膠、聚N-異丙基丙基酰胺、泊洛沙姆407、普羅尼克F123/F127中的一種。
[0011]在上述的組織工程血管化肝小葉的制造方法中，優(yōu)選地，所述溫敏性水凝膠溶液按以下方法制得:按濃度l_50wt/V%將溫敏性水凝膠溶解到I3BS中，按濃度0.0l-lwt/ν%加入紫外引發(fā)劑Irgacure 2959，充分混勻之后用離心機(jī)離心除去氣泡，然后采用0.22微米的濾膜過濾除去細(xì)菌。
[0012]在上述的組織工程血管化肝小葉的制造方法中，優(yōu)選地，用硅膠、聚二甲基硅氧烷或PLA作為打印材料。
[0013]在上述的組織工程血管化肝小葉的制造方法中，優(yōu)選地，細(xì)胞的培養(yǎng)在37攝氏度5 % 二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程包括:先靜置培養(yǎng)兩個小時，再翻轉(zhuǎn)后培養(yǎng)兩個小時，然后將未貼壁的細(xì)胞用PBS清洗除去，在管道內(nèi)注入新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)三天。
[0014]本發(fā)明采用3D打印技術(shù)和組織工程技術(shù)結(jié)合的方法，用HepG2細(xì)胞作為肝臟的實質(zhì)細(xì)胞來表達(dá)肝功能，用HUVEC細(xì)胞來構(gòu)造肝臟內(nèi)部的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)避免肝小葉形成壞死中心，制造出血管化的肝小葉。制得的肝小葉生物相容性好，可用于肝臟類藥物的藥物篩選、疾病機(jī)理研究以及藥物在肝臟中代謝過程的研究。所制的肝小葉尺寸與真正肝小葉相似。
【附圖說明】
[0015]圖1為構(gòu)造的肝小葉成型模具的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0016]圖2為制得的血管化肝小葉結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0018]本實施例組織工程血管化肝小葉的制造方法包括以下步驟:
[0019]步驟I，打印肝小葉的支持性PDMS邊框和制造肝小葉的模具。具體過程如下:
[0020]采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)打印支持性的邊框。將PDMS按照基底和交聯(lián)劑質(zhì)量比1比I混合均勻，加入到3D打印機(jī)的針筒中，按照設(shè)定的路徑打印出PDMS邊框。在PDMS邊框中插入七根毛細(xì)玻璃管，即構(gòu)成肝小葉的成型模具，如圖1所示。將其用高溫高壓滅菌處理后待用。
[0021 ] 步驟2，按細(xì)胞濃度l(T6CellS/mL將HepG2細(xì)胞與溫敏性水凝膠溶液混勻，填加到所述模具中，用紫外光照射30s-200s，固化交聯(lián)膠原后抽出毛細(xì)玻璃管，形成毛細(xì)管道。具體過程如下:
[0022]2-1，采用以下方法配置GeIMA(—種溫敏性水凝膠):
[0023]a)豬皮A型明膠，在60攝氏度溶解至IjPBS當(dāng)中，形成10?八％的溶液；
[0024]b)注滴加入甲基丙烯酸酐8v/v%，50攝氏度反應(yīng)四個小時；
[0025]c)為了使反應(yīng)停止，加入PBS使溫度降低到40攝氏度；
[0026]d)用截留分子量是12Kda_l 4Kda的透析袋透析，每天換水三次，透析兩周；
[0027]e)用凍干機(jī)凍干透析完畢的溶液，得到海綿狀的GelMA。
[0028]2-2，購買sciencel I四代的HepG2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，采用10 %FBS+90 %DMEM高糖培養(yǎng)基+1%雙抗培養(yǎng)。每周換液兩次到三次，待細(xì)胞長滿平平底即可傳代;用磷酸緩沖液清洗細(xì)胞，用胰酶消化細(xì)胞，消化完畢的細(xì)胞重懸于細(xì)胞培養(yǎng)基中，用離心機(jī)收集細(xì)胞。
[0029]2-3，將HepG2細(xì)胞和溫敏性水凝膠GeIMA混合。具體如下:
[0030]將海綿狀的GelMA溶解至IjPBS中，濃度為15wt/v%，加入0.3的八％的巴斯夫紫外引發(fā)劑Irgacure 2959，充分混勾之后用離心機(jī)離心除去氣泡。采用0.22微米的濾膜過濾，除去細(xì)菌，得到Ge IMA溶液；
[0031]將離心機(jī)收集的HepG2細(xì)胞用GelMA溶液混勻，使?jié)舛葹?0~6cellS/mL，從而制得包裹有H印G2細(xì)胞的GelMA溶液。
[0032]2-4，將包裹有HepG2細(xì)胞的GelMA溶液加入到插有毛細(xì)玻璃管的肝小葉支持性邊框PDMS的間隙當(dāng)中，采用波長365nm的紫外光照射60s，交聯(lián)。
[0033]2-5，抽出毛細(xì)玻璃管，留下中空的管道(即毛細(xì)管道)。
[0034]步驟3，配置濃度為l*l(T7CellS/mL的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，注入到所述毛細(xì)管道中并培養(yǎng)，使其長滿毛細(xì)管道內(nèi)壁，從而制得血管化的肝臟小葉。具體過程如下:
[0035]3-1，配置濃度為l*l(T7cells/mL的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。
[0036]購買sciencell四代的HUVEC細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，采用10%FBS+90%DMEM高糖培養(yǎng)基+1 %雙抗培養(yǎng)。每周換液兩次到三次，待細(xì)胞長滿平平底即可傳代。用磷酸緩沖液清洗細(xì)胞，用胰酶消化細(xì)胞，消化完畢的細(xì)胞重懸于細(xì)胞培養(yǎng)基中，用離心機(jī)收集HUVEC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為l*10~7cells/mL。
[0037]3-2，將濃度為l*l(T7Cells/mL的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞注入到抽出毛細(xì)玻璃管留下的中空管道中，靜置培養(yǎng)兩個小時使細(xì)胞貼壁，再反轉(zhuǎn)肝小葉結(jié)構(gòu)，靜置培養(yǎng)兩個小時使細(xì)胞在另一面貼壁。然后將未貼壁的細(xì)胞用PBS清洗除去，在孔道內(nèi)注入新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行三天的培養(yǎng)。待細(xì)胞傳代長滿內(nèi)壁，中空管道即形成毛細(xì)血管，從而制得血管化肝小葉。
[0038]如圖2所示，最終制得的血管化肝小葉包括六棱柱形的主體和從該主體的端面貫穿該主體的六個小孔和一個大孔，所述大孔位于所述端面的中心，六個小孔環(huán)形分布在大孔周圍。六棱柱形的主體厚2毫米、寬3毫米，小孔的內(nèi)徑為250微米，大孔的內(nèi)徑為500微米。所制的肝小葉尺寸與真正肝小葉相似。
【主權(quán)項】
1.一種組織工程血管化肝小葉的制造方法，其特征在于，所述肝小葉包括六棱柱形的主體和從該主體的端面貫穿該主體的六個小孔和一個大孔，所述大孔位于所述端面的中心，六個小孔環(huán)形分布在大孔周圍，所述制造方法包括以下步驟: 用3D打印機(jī)打印肝小葉的相容性支持性邊框，在所述邊框插入七根毛細(xì)玻璃管構(gòu)成肝小葉的成型模具； 按細(xì)胞濃度10~6cells/mL將HepG2細(xì)胞與溫敏性水凝膠溶液混勻，填加到所述模具中，用紫外光照射30s-200s，固化交聯(lián)膠原后抽出毛細(xì)玻璃管，形成毛細(xì)管道； 配置濃度為l*l(T7CellS/mL的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，注入到所述毛細(xì)管道中并培養(yǎng)，使其長滿毛細(xì)管道內(nèi)壁，從而制得血管化的肝小葉。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程血管化肝小葉的制造方法，其特征在于，所述六棱柱形的主體厚2毫米、寬3毫米，小孔的內(nèi)徑為250微米，大孔的內(nèi)徑為500微米。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程血管化肝小葉的制造方法，其特征在于，所述溫敏性水凝膠為GelMA、膠原、明膠、聚N-異丙基丙基酰胺、泊洛沙姆407、普羅尼克F123/F127中的一種。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程血管化肝小葉的制造方法，其特征在于，所述溫敏性水凝膠溶液按以下方法制得:按濃度l_50wt/V %將溫敏性水凝膠溶解到PBS中，按濃度0.01-lwt/v%W入紫外引發(fā)劑Irgacure 2959，充分混勾之后用離心機(jī)離心除去氣泡，然后采用0.22微米的濾膜過濾除去細(xì)菌。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程血管化肝小葉的制造方法，其特征在于，用硅膠、聚二甲基硅氧烷或PLA作為打印材料。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程血管化肝小葉的制造方法，其特征在于，細(xì)胞的培養(yǎng)在37攝氏度5 % 二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程包括:先靜置培養(yǎng)兩個小時，再翻轉(zhuǎn)后培養(yǎng)兩個小時，然后將未貼壁的細(xì)胞用PBS清洗除去，在管道內(nèi)注入新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)三天。
【文檔編號】A61F2/02GK105963050SQ201610248688
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年4月20日
【發(fā)明人】李勃, 朱朋飛, 許國軍, 王進(jìn), 周濟(jì)
【申請人】清華大學(xué)深圳研究生院