一種含egfr酪氨酸激酶的低劑量藥物組合物及其在制備預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】一種含EGFR酪氨酸激酶的低劑量藥物組合物及其在制備預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種低劑量的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物包含物質(zhì)的量比為10:1?5的熊果酸與吉非替尼。通過將具有靶向作用的吉非替尼與高效低毒的抗腫瘤天然產(chǎn)物熊果酸進(jìn)行聯(lián)合用藥，證明其對癌細(xì)胞的具有良好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，可望獲得較為安全可靠的新型候選藥物。
【專利說明】
一種含EGFR酪氨酸激酶的低劑量藥物組合物及其在制備預(yù)防 腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種低劑量用于具有抗腫 瘤轉(zhuǎn)移的藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 熊果酸即3β-羥基-熊果-12-稀_28_酸（30-hydroxy-urs-12-en-28-〇ic acid，簡 稱UA)，又名烏索酸、屬于a-香樹脂醇（a-amyrin)型五環(huán)三萜類化合物，其相對分子量為 456.68，分子式為C 3qH48O3，結(jié)構(gòu)如式I所示是自然界中分布較廣的天然活性化合物，主要以 游離或糖苷的形式存在其廣泛分布于枇杷葉、熊果、山楂、白花蛇舌草等多種天然植物中， 也是許多傳統(tǒng)中藥的主要活性成分之一，具有廣泛的藥理作用，如抗癌、保肝、抗炎、抗病 毒、抗氧化等其中以抗癌活性最為顯著，不僅對多種致癌物有抵抗作用，而且對多種腫瘤細(xì) 胞在體內(nèi)、外均有抑制作用。因其副作用小，毒性低，顯示出較大的臨床應(yīng)用潛力。近年來國 內(nèi)外對UA的抗腫瘤研究日趨深入，并發(fā)現(xiàn)其在腫瘤預(yù)防、治療以及防止晚期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等方 面有著獨(dú)特的優(yōu)勢及潛在的應(yīng)用前景。專利N201510097801.9公開了一種含有熊果酸和環(huán) 磷酰胺的藥物組合物，所述組合物既可以增強(qiáng)單組分的抗腫瘤藥效，也能降低其對正常組 織的毒性，從而提高腫瘤治療的效果，在腫瘤治療領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用前景。專利 N03150714.X公開了熊果酸對人肝癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞、人淋巴瘤細(xì)胞、人成淋巴細(xì)胞白 血病和人急性成淋巴細(xì)胞白血病、人急性早幼粒白血病及人慢性髓性白血病都有細(xì)胞毒效 應(yīng)。
[0003] 吉非替尼（化學(xué)名：N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉丙氧基)喹唑啉-4-胺），英文名:Gifitinid，結(jié)構(gòu)如式Π所示，是一種選擇性表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸 激酶抑制劑，適用于表皮生長因子受體酪氨酸激酶(EGFR TK)基因具有敏感突變的局部晚 期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的三線、二線甚至一線治療。吉非替尼為難溶性藥 物，其在水溶液中的溶解性呈pH依賴性，即在pH越低的水溶液中溶解度越大，在pH值7左右 的水中幾乎不溶；，吉非替尼對部分EGFR存在突變的患者具有一定的治療作用，但是，病人 一般在1-2年內(nèi)會發(fā)生復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移，或者產(chǎn)生新的突變而對吉非替尼產(chǎn)生耐藥，所以，即 使使用吉非替尼(酪氨酸激酶抑制劑)治療仍然不能提高非小細(xì)胞肺癌患者的五年總生存 期。專利N201210566665.X公開了一種含有吉非替尼的片劑，它其能持續(xù)、平穩(wěn)釋放有效成 分、對既往接受過化學(xué)治療的局部晚期肺癌或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌達(dá)到良好的治療效果。
[0004] 以不同癌細(xì)胞系作為研究對象，通過將熊果酸和吉非替尼聯(lián)合用藥，對不同癌細(xì) 胞系進(jìn)行體外抗癌活性測試，結(jié)果表明，熊果酸和吉非替尼的的聯(lián)合使用在低劑量的條件 下對癌細(xì)胞特別是非小細(xì)胞肺癌的增殖迀移、侵襲等具有顯著的抑制作用，且呈濃度和時 間依賴性的抑制癌細(xì)胞的增殖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是提供一種低劑量的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物組合物，通過將具有靶向 作用的吉非替尼與高效低毒的抗腫瘤天然產(chǎn)物熊果酸進(jìn)行聯(lián)合用藥，考察其聯(lián)合用藥后對 癌細(xì)胞的抗轉(zhuǎn)移作用，可望獲得較為安全可靠的新型候選藥物。
[0006] -種低劑量具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物組合物及其在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用， 其特征在于該藥物組合物包含物質(zhì)的量比為10:1-5的熊果酸與吉非替尼，兩者聯(lián)用可以起 到協(xié)同抗癌轉(zhuǎn)移的效果。
【附圖說明】
[0007] 圖1.熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h對A549細(xì)胞增殖的抑制結(jié)果； 圖2.熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h對H1975細(xì)胞增殖的抑制結(jié)果； 圖3.熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h對H1650細(xì)胞增殖的抑制結(jié)果； 圖4.熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h對A549細(xì)胞侵襲能力的抑制結(jié)果； 圖5.熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h對A549細(xì)胞侵襲的抑制率； 圖6.熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h對H1975細(xì)胞侵襲的抑制率； 圖7.熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h后對A549細(xì)胞迀移能力的抑制結(jié)果； 圖8.熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h對A549細(xì)胞迀移的抑制率； 圖9.熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h對H1975細(xì)胞迀移的抑制率； 圖10.熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用對H1975細(xì)胞RGD、ICAM-1、EGFR、 VCAM-I蛋白表達(dá)水平的影響； 圖11.熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用對H1975細(xì)胞RGD、ICAM-1、EGFR、 VCAM-I蛋白表達(dá)的情況。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明所述的 技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0009] 實(shí)施例1 熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h對不同肺癌細(xì)胞系的增殖抑制作用:采用 標(biāo)準(zhǔn)MTT比色法測定了熊果酸和吉非替尼不同聯(lián)合比例對不同肺癌細(xì)胞系的增殖抑制活 性，結(jié)果如圖1_3所不。
[0010]如圖卜3所示，當(dāng)熊果酸（10 μΜ)和吉非替尼α-5 μΜ)在低濃度范圍內(nèi)聯(lián)合用藥24 h后，其對癌細(xì)胞無明顯增殖抑制作用且對正常細(xì)胞的毒副作用小，因此后續(xù)我們選擇將安 全有效的低劑量濃度(無明顯細(xì)胞殺傷作用）的熊果酸和吉非替尼聯(lián)用，繼續(xù)研究其對肺癌 細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的抑制能力，以探索其在抗腫瘤轉(zhuǎn)移領(lǐng)域應(yīng)用的潛力。
[0011] 實(shí)施例2 熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用對A549細(xì)胞株侵襲能力的影響 A549細(xì)胞先加無血清無酚紅培養(yǎng)基饑餓過夜，消化、離心收集的細(xì)胞含不同藥物濃度 的空白培養(yǎng)基懸浮。取12孔板，在小室的上室中加入500 yL含不同藥物濃度的細(xì)胞懸浮液 (約5 X IO5/孔），下室加500 μ 1含10%小牛血清的培養(yǎng)基，藥物作用24 h，取出小室，用4%的 多聚甲醛固定20 min，用棉簽擦掉上層未迀移細(xì)胞，用PBS洗3次，用0.1 %結(jié)晶紫染色40 min，用PBS洗3次，將小室的底膜取下，封片保存，倒置顯微鏡下隨機(jī)5個視野下拍照，統(tǒng)計(jì)迀 移的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果如圖4、5所示。
[0012]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4、5所示熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用24 h后對A549細(xì) 胞株侵襲能力的檢測，結(jié)果表明，空白對照組、UA=IO μΜ和吉非替尼（5 μΜ條件下）單獨(dú)使 用組，穿過微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯高于熊果酸和吉非替尼聯(lián)合用藥組，細(xì)胞的侵襲能力減 弱，侵襲能力明顯受到了抑制。
[0013] 實(shí)施例3 熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用對Η1975細(xì)胞株侵襲能力的抑制率，步驟同 實(shí)施例2,結(jié)果如圖6所示。
[0014] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用24 h后對Η1975細(xì) 胞株侵襲能力抑制率的檢測，結(jié)果表明，空白對照組、UA(10 μΜ條件下）和吉非替尼（5 μΜ 條件下）單獨(dú)使用組，大約在百分70-80%的Η1975細(xì)胞侵襲透過小室，當(dāng)兩者聯(lián)合給藥的時 候，大約只有百分35%的Η1975侵襲透過小室，兩者聯(lián)用明顯降低了Η1975細(xì)胞的侵襲能力。
[0015] 實(shí)施例4 熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用對Α549細(xì)胞株迀移能力的影響 取對數(shù)生長期的細(xì)胞(約3 X IO6/孔)接種于該板中，置于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)24 h，待細(xì)胞接近融合后，用白色槍頭在孔板的1/4、1/2、3/4處垂直的劃三條平行線，用 PBS清洗細(xì)胞3次，在熒光顯微鏡下拍劃痕寬帶，記錄下所拍圖片的坐標(biāo)軸。加入含不同藥物 濃度的培養(yǎng)基，置于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h.在同一部位再次拍照，測定 迀移距離，對比各組兩次拍照的迀移距離，結(jié)果如圖7、8所示。
[0016] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7、8所示，熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用24 h后對A549 細(xì)胞株細(xì)胞迀移抑制率檢測，結(jié)果表明：在〇 h，給藥干預(yù)組與空白對照組對比迀移距離無 明顯影響，經(jīng)給藥24 h后，空白對照組細(xì)胞發(fā)生了很明顯的迀移，劃痕寬帶變窄；當(dāng)UA濃度 為10 μΜ的條件和吉非替尼在5 μΜ的條件下細(xì)胞也都明顯的發(fā)生了迀移;但當(dāng)兩者聯(lián)合使 用后，在吉非替尼在5 μΜ的情況下，劃痕寬帶明顯比單用吉非替尼大。因此兩者聯(lián)合用藥， 能協(xié)同抑制細(xì)胞的迀移能力，劃痕寬度與空白對照組相比差異明顯且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ〈 0·01)〇
[0017] 實(shí)施例5 熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用對Η1975細(xì)胞株迀移能力的抑制率，步驟同 實(shí)施例4,結(jié)果如圖9所示。
[0018] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用24 h后對Η1975細(xì) 胞株細(xì)胞迀移抑制率檢測，結(jié)果表明：在〇 h，給藥干預(yù)組與空白對照組對比迀移距離無明 顯影響，經(jīng)給藥24 h后，空白對照組細(xì)胞劃痕寬帶變窄，細(xì)胞明顯的發(fā)生了迀移；當(dāng)UA濃度 為10 μΜ的條件和吉非替尼在5 μΜ的條件下細(xì)胞也都明顯的發(fā)生了迀移，但迀移距離沒有 空白對照組的明顯;但當(dāng)兩者聯(lián)合使用后，在吉非替尼在5 μΜ的情況下，劃痕寬帶明顯比單 用吉非替尼和熊果酸大。因此兩者聯(lián)合用藥，能協(xié)同抑制細(xì)胞的迀移能力，劃痕寬度與空白 對照組相比差異明顯且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ〈〇.01)。
[0019] 實(shí)施例6 熊果酸和吉非替尼單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用對Η1975細(xì)胞1?0、1041-146?1?、￥0崖-1蛋白 表達(dá)水平的影響 將細(xì)胞接種至6孔板，待細(xì)胞達(dá)80 %以上加不同藥物干預(yù)細(xì)胞24 h后，棄去培養(yǎng)液，用 預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞2次，向6孔板中的每孔加入新鮮配制的細(xì)胞裂解液RIPA (radioimmunopre-cipitation assay)200 yL[l mL RIPA中加入 10 yL蛋白酶抑制劑、10 μ 1^磷酸酶抑制劑和5以1^苯甲基磺酰氟(口116117111161：1131168111；1^01171；1^11101^(16，？]\^?)]，冰上放置 30 min，每5 min搖晃一次，12000Xg 4°C離心15 min，取上清液，制備總蛋白；采用二喹啉 甲酸(bicincho-ninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，以β-actin水平作為 等量蛋白質(zhì)上樣，取20 yg蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電 泳，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙稀(polyvinylidene，PVDF)膜上，室溫下用含 5%脫脂奶粉的TBST封閉I h，加入一抗4°C反應(yīng)過夜，次日用TBST室溫下洗膜3次（10 min/ 次），再加入HRP標(biāo)記的二抗（1: 5000稀釋)在室溫下孵育I h，用TBST在室溫下再次洗膜3次 (10 min/次），最后電化學(xué)發(fā)光顯影。采用圖像分析軟件Image J對條帶進(jìn)行灰度值分析，結(jié) 果如圖10、11所示。
[0020] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10、11所示，空白對照組不影響RGD、I CAM-1、EGFR、VCAM-1蛋白水平 的表達(dá);UA濃度0 μΜ和吉非替尼在5 μΜ的條件下，對1?^、扣41-^6?1?、￥041-1蛋白表達(dá)水 平的影響不大;但當(dāng)兩者聯(lián)合給藥，就能起到協(xié)同增效的作用，能夠明顯的抑制1?^、1〇八1-1、EGFR、VCAM-1蛋白表達(dá)水平，通過下調(diào)RGD、I CAM-1、EGFR及VCAM-1的水平進(jìn)而抑制癌細(xì)胞 的增殖、抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物組合物，其特征在于包含物質(zhì)的量比為?ο: 1-5的熊果酸 和吉非替尼。2. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P35/04GK105963302SQ201610519495
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月5日
【發(fā)明人】邵敬偉, 鄭桂容
【申請人】福州大學(xué)